一种摘除小鼠松果体的实验动物模型构建方法及其应用与流程

一种摘除小鼠松果体的实验动物模型构建方法及其应用，属于动物模型构建技术领域。

背景技术：

许多松果体代谢研究表明，松果体是探究生物昼夜节律的绝佳研究对象。同时，松果体在季节性调节、光依赖性繁殖等领域中所起的重要作用也已获得广泛证明。褪黑素是一种主要由松果体分泌的激素，但有约25%的褪黑素分布于松果体外。既往研究已经证实，褪黑素既是一种神经内分泌激素，也是一种免疫调节剂。现有的松果体摘除术容易伤及上矢状窦及橫窦，引起致命性大出血，实验模型构建困难，成功率低；且模型动物为大鼠、鸡等，没有小鼠模型。本发明操作简便，模型构建时间短，成功率高，所需器械经济便捷，为目前小鼠松果体去除的实验模型构建提供了一种新的快速简便方法。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术上摘除小鼠松果体过程中出血过多、术后小鼠存活率低、模型构建成功率低的问题，而提供的一种可以快速高效摘除小鼠松果体的实验动物模型构建方法及其应用。

本发明的技术方案：一种摘除小鼠松果体的实验动物模型构建方法，其外科手术步骤如下：

（1）暴露矢状缝和人字缝：取5~6周龄雄性C57BL/6小鼠麻醉、头顶部脱毛、局部消毒后固定于操作台上，在两耳正中间沿头顶部正中央，从枕骨向顶骨，沿矢状缝方向做一长10 mm的纵向切口至两眼之间；分离骨膜以暴露矢状缝和人字缝；

（2）颅骨切口：以人字缝为中心，在颅骨上用牙科机配牙科裂钻一切口ABCD，如图2所示；在此切口范围内再做一切割边EF，如图3所示；取下骨片CDEF，如图4所示；暴露硬脑膜及上矢状窦；

（3）双重结扎上矢状窦：沿AD、BC边切开硬脑膜，双重结扎上矢状窦；

（4）剪断后矢状窦，上矢状窦通过结扎的手术线以AB边为轴提起，同时带起颅骨骨片，如图5所示；

（5）灼烧松果体，如图6所示；

（6）将骨片放下，用含生理盐水棉球轻压数秒即可止血；

（7）缝合伤口，在伤口处滴加数滴青霉素钠以预防伤口感染。

所述颅骨切口，颅骨切口为一上底边AB长3mm、下底边CD长4 mm、高4 mm的等腰梯形；AB位于枕骨，CD位于顶骨，用显微镊轻轻提起CD边，将5-0号缝合线置于CD边下方，左右手分别轻轻左右拉动手术线，紧贴硬脑膜钝性分离颅骨及硬脑膜至AB边，勿要剥离骨片；用显微镊夹住CD边，并以AB边为轴轻轻抬起约45°，用眼科剪剪去距CD边1 mm处的EF边，取出骨片CDEF，将骨片ABFE轻轻放下。

所述双重结扎上矢状窦，使用缝合针钝端由CF切口紧贴硬脑膜进入，在矢状窦下方穿过小鼠硬脑膜及大脑之间，由DE切口出，勿要取出缝合针；穿入100 mm长5-0号缝合线后，缝合针钝端由DE切口原路返回穿出CF切口，同时手术线由DE切口穿入CF切口穿出，双重结扎矢状窦。

所述灼烧松果体，左手提起结扎上矢状窦的手术线60°，右手同时持铁丝或拧紧的接种环在酒精灯火焰上方将铁丝或接种环烧红，骨片提起时可见松果体被硬脑膜带起，黏附在骨片上，此时将烧红的铁丝或接种环直接在骨片上灼烧松果体，肉眼可见松果体被去除。

用所述方法摘除小鼠松果体的实验动物模型的应用，用于松果体代谢研究，褪黑素分泌的研究。

本发明的有益效果：手术时间短，整个过程10~15min，可大批量进行实验动物模型构建；通过牙科机配牙科裂钻切割颅骨，可有效提高手术效率，更好地控制切割力度及深度，避免损伤硬脑膜及静脉窦；采用等腰梯形开口切割颅骨，可视化去除松果体，避免了小鼠大脑损伤，结扎上矢状窦、加热接种环在灼烧松果体的过程中均起到了止血作用，避免了颅内大出血，也保证了松果体摘除的正确性，可信度高，同时手术器械经济便捷。

附图说明

图1为切口Ⅰ示意图。

图2为切口Ⅰ的ABCD示意图。

图3为剪去EF边示意图。

图4为去除骨片CDEF示意图。

图5为结扎并剪断上矢状窦示意图。

图6为松果体去除示意图。

具体实施方式

实施例1

1、麻醉：腹腔注射戊巴比妥钠 80 mg/kg。

2、脱毛：去除小鼠额顶及两耳间毛发。

3、消毒：碘伏棉球擦拭脱毛后裸露的头皮及周围。

4、固定及切口Ⅰ：将小鼠固定于操作台上，用手术刀片从小鼠两耳正中间沿头顶部正中央，从枕骨向顶骨，沿矢状缝方向做一长约10 mm的切口切开头皮，暴露人字缝，用手术刀片轻轻刮开颅骨上的骨膜（此过程小鼠会略有挣扎，需用手固定小鼠头部），暴露部位的骨膜必须去除干净，否则将影响后续开颅。

5、切口Ⅱ：在人字缝正上方，做一上边长约3 mm、底边长为4 mm、高为4 mm的等腰梯形，短边位于枕骨，长边位于顶骨，如图1所示，用牙科裂钻沿垂直于矢状缝方向、人字缝上方1 mm处切割枕骨3 mm，注意：不要切破颅骨下方的硬脑膜。再在顶骨处垂直于矢状缝、距离顶骨切口AB边4 mm并平行于AB边做一4 mm的切割边CD，矢状缝应位于AB、CD边的中间，注意：顶骨厚度约为枕骨的1/2，切割时要注意力度，切勿切破硬脑膜，经过血管上方时应稍降低牙科机压力以降低转速，增加切割次数，以免损伤硬脑膜及血管。最后切割AD、BC边，注意：经过血管上方时应稍降低牙科机压力以降低转速，增加切割次数，以免割破硬脑膜及血管。此过程可能有少量出血，用含生理盐水的医用棉球轻压数秒即可止血。此时ABCD颅骨片应完全松动，用显微镊轻轻抬起CD边（不要彻底抬起，否则小鼠会出血过多导致死亡），将5-0号缝合线放于CD边下方，双手左右缓慢拉动缝合线以钝性分离颅骨及硬脑膜至AB边，无需剥离骨片，以 AB边为轴左手向上提起缝线45°同时提起骨片，用眼科剪剪去距CD边1 mm处的EF边，如图3所示，最后将骨片轻轻放下，注意：此过程应避免损伤重要血管。

6、切口Ⅲ：用手术刀沿AD、BC边在硬脑膜上、人字缝下方做两个切口，注意：避免损伤重要血管。使用缝合针钝端由CF切口紧贴硬脑膜进入，在矢状窦下方穿过小鼠硬脑膜及大脑之间，由DE切口出，缝合针无需穿出取出，穿入100 mm长5-0号缝合线后，缝合针钝端由DE切口原路返回穿出CF切口，同时手术线由DE切口穿入CF切口穿出，双重结扎矢状窦，剪断上矢状窦，以AB边为轴，左手缓慢提起结扎的手术线60°，此时颅骨松动骨片也一同被抬起，右手持铁丝或拧紧的接种环在酒精灯火焰上方将铁丝或接种环烧红，骨片提起时可见松果体被硬脑膜带起，黏附在硬脑膜上，此时将烧红的铁丝或接种环直接灼烧松果体，如图6所示，注意：骨片与硬脑膜被提起后会出现少量出血，故一提起硬脑膜看到松果体后须马上灼烧，然后剪断结扎缝线将骨片归位，用生理盐水棉球轻压数秒即可止血。

7、5-0缝合线对齐缝合小鼠皮肤切口，在伤口处滴加数滴青霉素钠以预防感染。