专利名称：PAlb-uPA慢病毒载体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别涉及PAlb-UPA慢病毒载体，还涉及PAlb-UPA慢病毒载体的制备方法和应用。
背景技术：
除人和灵长类动物外，人肝炎病毒并不存在天然的小动物感染宿主，这严重阻碍 了对人肝炎病毒感染机制和抗病毒药物的研究。目前只有黑猩猩是研究人肝炎病毒感染最好的体内实验模型，但使用受保护的稀有灵长类动物受到伦理学及经费等诸多限制。因此建立廉价易得的小动物模型是亟待解决的难题。近年发展起来的能携带人肝组织的小鼠动物模型为肝炎病毒感染机制和抗病毒药物研究提供了良好的平台。经研究发现尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型，是携带人肝组织的理想小鼠动物模型。但是通过转基因方法获得的尿激酶型纤溶蛋白酶转基因小鼠，子代新生小鼠死亡率高、筛选难度大，大大阻碍了人嵌合肝小鼠模型的构建、推广和使用。因此，急需一种PAIb-uPA慢病毒载体，既能对体内组织,又能对体外培养细胞进行感染，可以用于制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型，提供携带人肝组织的受体小鼠。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供PAIb-uPA慢病毒载体，白蛋白启动子PAlb调控四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2特异表达于肝脏中，四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2在含有四环素类化合物的条件下作用于含四环素操纵子的PTight启动子，最后通过PTight启动子调控尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达，由白蛋白启动子PAlb和四环素操纵子受双重控制，组织特异性高，调控方便，灵敏。为实现上述发明目的，技术方案为
所述PAIb-uPA慢病毒载体含有白蛋白启动子PAlb、尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA、白蛋白启动子PAlb启动的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2和启动尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达的PTight启动子，所述四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2调控所述PTight启动子；
所述白蛋白启动子PAlb的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示；所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示；编码所述四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2的核酸序列如SEQ ID NO. 10所示；PTight启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示。进一步，所述PAIb-uPA慢病毒载体具有如SEQ ID NO. 7所示核苷酸序列。本发明目的之二在于提供PAIb-uPA慢病毒载体的制备方法，其制备方法简单，其技术方案为
PAIb-uPA慢病毒载体的制备方法，具体步骤如下a.从小鼠肾脏克隆尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA，并将克隆的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA连入pLVX Tight Puro载体的PTight启动子下游，得JGY-PLV-2载体；
b.克隆白蛋白启动子PAlb，并将克隆的白蛋白启动子PAlb连入pLVX-Tet-On载体的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2的上游，得JGY-PLV-I载体；
c.从步骤b所得JGY-PLV-I载体上切下含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用子rtTA/rtTA2s-M2的片段，然后连入pLKO. I克隆载体，得JGY-PLV-A载体；
d.从步骤c所得JGY-PLV-A载体切下含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2的片段，然后连入步骤a所得JGY-PLV-2载体的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA下游，得PAIb-uPA慢病毒载体。进一步，所述步骤a中，将克隆的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA用XbaI和BamHI酶切，连入同样经XbaI和BamHI酶切的pLVX Tight Puro载体，得JGY-PLV-2载体。进一步，所述步骤a中，尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的克隆，具体为以C57小鼠肾脏第一链cDNA为模板，以SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列为引物，进行第一次PCR扩增；再以第一次PCR产物为模板，以SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列为引物进行第二次PCR扩增，得尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA。进一步，所述步骤b中，将克隆的白蛋白启动子PAlb用ClaI和BamHI酶切，连入同样经ClaI和BamHI酶切的pLVX-Tet-On载体，得JGY-PLV-I载体进一步，所述步骤b中，所述白蛋白启动子PAlb的克隆，具体为以含白蛋白启动子PAlb的质粒为模板，以SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示序列为引物进行PCR扩增，得白蛋白启动子PAlb。进一步，所述步骤c为将步骤b所得JGY-PLV-I载体用AgeI和AvrII酶切，回收含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2片段，然后连入同样经AgeI和AvrII酶切的pLKO. I克隆载体，得JGY-PLV-A载体。进一步，所述步骤d为将步骤a所得JGY-PLV-A载体用AgeI和XhoI酶切并回收含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2片段，然后连入同样经AgeI和XhoI酶切的JGY-PLV-2载体中。本发明目的之三在于提供PAIb-uPA慢病毒载体的应用，技术方案为
所述PAIb-uPA慢病毒载体在制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型中的应用。本发明有益效果在于本发明公开了 PAIb-uPA慢病毒载体，该载体能够用于构建尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型，该载体白蛋白启动子PALb控制四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2表达，由四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s_M2在四环素类抗生素诱导下与含有四环素操纵子的启动子PTight结合，启动下游尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达。白蛋白启动子PAlb特异性地表达于肝脏细胞中，从而能够选择性地表达尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA。四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2具有低反应背景，低诱导高反应特性，在无四环素类抗生素诱导时，表现出极低的“剩余”基因表达或无表达；而在有极微量的四环素类抗生素诱导时，运用的I μ g的强力霉素能引起uPA mRNA极高的表达，调控方便，获得的转基因小鼠在无四环素类化合物条件下无尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达，获得的转基因子代新生小鼠死亡率低、筛选简单；本发明还公开了 PAIb-uPA慢病毒载体的制备方法和应用，其制备方法简单，制得的PAIb-uPA慢病毒载体可以用于制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型，可以用于制备携带人肝组织的动物模型提供小鼠受体。
图I为本发明尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA和白蛋白启动子PAlb PCR扩增结果(M :表示marker ;UPA表示尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA PCR扩增条带；PAlb表示白蛋白启动子PAlb PCR扩增条带)。图2为本发明JGY-PLV-2载体图谱。图3为本发明JGY-PLV-I载体图谱。图4为本发明JGY-PLV载体图谱。图5为本发明JGYPLV慢病毒感染H2. 35小鼠肝细胞结果图(左图为未感染肝细胞，右图为感染后肝细胞)。图6为本发明荧光定量PCR检测强力霉素诱导JGYPLV慢病毒感染的H2. 35小鼠肝细胞中uPA基因的表达情况(强力霉素浓度分别为O μ g、I μ g、3 μ g、5 μ g、7 μ g、10 μ g)。图7为本发明强力霉素诱导JGYPLV慢病毒感染的H2. 35小鼠肝细胞的uPA蛋白表达结果图(强力霉素浓度分别为O μ g、l μ g、3 μ g、5 μ g、7 μ g、10 μ g)。
具体实施例方式以下将结合实施例对本发明进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。实施例I、PAIb-uPA慢病毒载体构建
本发明使用的 Lenti-X Tet-on Advanced Inducible Expression System 试剂盒购自 Clontech 公司(含有 pLVX Tight Puro 载体和 pLVX-Tet-On 载体);pMD19_T Simplevocter载体、PCR反应试剂、逆转录试剂盒、in-Fusion Dry-Down PCR克隆试剂盒和DNA聚合酶primeSTAR HS购自TaKaRa公司；RNA提取试剂盒RNAprep pure Tissue Kit和胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；质粒大抽试剂盒购自Qiagen公司；Trizol抽提液、RNase H和FV膜购自Invitrogen公司；pLK0. I克隆载体、凝聚胺Ploybrene和胰酶购自Sigma公司；DMEM培养基、乙二胺四乙酸(EDTA)和Opti-MEM培养基购自GIBCO公司；293T细胞、P-eGFP质粒和H2. 35小鼠肝细胞(ATCC)由本所保存。一、JGY-PLV-2 载体构建
取C57小鼠肾脏并提取总RNA，将提取的总RNA用逆转录试剂盒合成第一链cDNA。根据报道的尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinaseplasminogen activator, uPA)基因序列(Genbank clone MGC: 155950)设计引物，上游引物为 5’_atctctagacggtcagcatgggaacaagtg_3，(SEQ ID NO. I),下游引物为 5，_aatggatcctaccatgaaagtctggctggc_3，(SEQ ID NO·2)。以第一链cDNA为模板，SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示序列为引物进行第一次PCR扩增，PCR扩增条件为95 °C变性30秒，60 V退火30秒，68 V延伸90秒，共30个循环，得尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA片段。经测序验证，所得尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA长度为1414bp，与报道的序列相同，因此克隆所得序列为尿激酶型纤溶酶原激 活剂基因uPA。根据扩增所得尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA设计第二次扩增引物，上游引物为5’- RcctRRaRaaRRatccRccaccatRaaaRtctRRctRRCR-3’ (SEQ ID NO. 3),划线部分在uPA扩增产物片段的5’端添加15个碱基序列，为连接载体时片段重组做准备。下游引物为5’- gcgttcgcgatctagatcagaaggccagacctttct -3’ (SEQ ID NO. 4),用上述 PCR 扩增产物为模板进行第二次PCR扩增，PCR扩增条件为95 °C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸90秒，共30个循环，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图I所示，获得长度为1340bp的PCR产物。将第二次PCR扩增产物用XbaI和BamHI酶切，回收长度为1360bp的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA酶切产物；同时用XbaI和BamHI酶切pLVX Tight Puro载体，并回收约7800bp的载体骨架，将回收的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA与pLVX Tight Puix)载体骨架用In-Fusion交换酶连接，尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA连入pLVX Tight Puro载体的含四环素操纵子的启动子PTight上游，连接条件为25°C反应15分钟，再42°C反应15分钟，然后4°C保存，得JGY-PLV-2载体，如图2所示。
二、JGY-PLV-I 载体构建
根据白蛋白启动子(albumin promoter, PAlb)设计引物,上游引物为5’ -_agatccagtttatc￡atctcgagaaccaaccaccggtgcggccgctctagcttccttag-3> (SEQ ID NO. 5)，划线部分在PAlb扩增产物片段的5’端添加的15个碱基序列，为连接载体时片段重组做准备。下游引物为 5’-tagacatggtggatcccggggttgatagga_3’ (SEQ ID NO. 6),以本实验室保存的含PAlb启动子的PMD19质粒为模板进行PCR扩增，PCR扩增条件为98°C变性10秒，55°C退火15秒，72°C延伸2. 5分钟，共30个循环，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图I所示，结果显示获得长度为2399bp的条带，经测序验证与公开的PAlb启动子序列相同，因此得PAlb启动子。将扩增所得PAlb启动子用ClaI和BamHI酶切，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收条带为2350bp的PAlb启动子；连接同样经ClaI和BamHI酶切pLVX-Tet_0n载体，连接使用In-Fusion交换酶连接,使白蛋白启动子PAlb连入pLVX_Tet_0n载体四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2 5’端，连接反应为25°C反应15分钟，再42°C反应15分钟，最后4°C保存，得JGY-PLV-I载体，如图3所示。三、PALb-uPA慢病毒载体构建
取载体JGY-PLV-I 2 ii g用AgeI和AvrII酶切，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收含PAlb启动子的3270bp片段；同时取pLKO. I克隆载体2 ii g用AgeI和AvrII酶切，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收大小约为6400bp的载体骨架，将回收的PAlb启动子和pLKO. I克隆载体骨架用T4连接酶连接，连接反应在温度为22°C条件下反应I小时，得重组载体命名为JGY-PLV-A载体。取JGY-PLV-2载体约2 y g用AgeI和XhoI酶切，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收1780bp左右片段；同时取JGY-PLV-A载体2 y g用AgeI和XhoI酶切，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收大小约为9120bp的载体骨架。将回收的产物用T4连接酶连接，连接反应在温度为22°C条件下反应I小时，得PALb-uPA慢病毒载体，命名为JGY-PLV载体，如图4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，SEQ ID NO. 7所示核酸序列中，4411-6762位核苷酸为白蛋白启动子PAlb编码区，如SEQ ID NO. 8所示；2965_4266位核苷酸为尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA JBSEQ ID NO. 9所示核酸序列；6766-7512位核苷酸为四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2编码区，如SEQ ID NO. 10所示核酸序列；2629_2952位核苷酸为PTight启动子编码区，如SEQ ID NO. 11所示。实施例2、PAlb-uPA慢病毒载体功能验证
一、PAlb-uPA慢病毒载体病毒包装取生长良好的293T细胞，经消化、洗涤，并用Opti-MEM选择培养基制成细胞悬液，然后分传到不同的培养皿中继续培养，备用；然后取两支50mL无菌离心管，其中一支加入0.5mL浓度为0. 5mg/ mL的PAlb-uPA慢病毒载体JGY-PLV、I mL浓度为0. 2mg/mL的病毒包膜蛋白表达质粒PMD2.G和0. 5 mL浓度为0.2mg/ mL的病毒结构蛋白表达质粒psPAX2，再加入Opti-MEM培养基定容至18mL，备用；另一支加入0.5 mL Fran-EZ溶液和17. 5 mL Opti-MEM培养基混匀，然后加入第一支试管中，边加边摇直到完全加入，得质粒转染液。然后将所得质粒转染液滴加到细胞培养皿中，培养6小时后换成完全培养基，培养48小时后收集病毒，得慢病毒JGYPLV，并于-80°C保存。二、JGYPLV慢病毒感染
将制备的JGYPLV慢病毒感染用DMEM (低糖)培养基做适当稀释(终浓度3. OX 104)，再加入1:2000稀释的凝聚胺(ploybrene)，共同感染H2. 35小鼠肝细胞，在温度为3 3 °C、10 %的CO2的条件下培养8 -12小时后，更换新鲜培养基或含有强力霉素的培养基DMEM，强力霉素终浓度分别为0 ii g、I ii g、3 ii g、5 ii g、7 ii g、10 ii g，在温度为37 °C、5% CO2培养的条件下诱导48小时后，在荧光纤维镜下观察细胞形态，如图5所示。结果显示，经JGYPLV慢病毒感染后H2. 35小鼠肝细胞细胞形态发生改变，不再贴壁生长，表明JGYPLV慢病毒感染的小鼠肝细胞能够过量表达尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA。并用荧光定量PCR检测JGYPLV慢病毒感染的H2. 35小鼠肝细胞中尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的表达情况，检测尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的荧光定量引物为，上游引物为 uPAF :5’ - tgaagtttgaggtggagcag-3’ (SEQ ID NO. 12);下游引物为 uPAR:5，- caggcagatggtctgtatgg-3’ (SEQ ID NO. 13)；以小鼠 GAPDH 基因为内参，上游引物为5’ -acaactttggcattgtggaa-3’ (SEQ ID NO. 14)，下游引物为5’ -gatgcagggatgatgttctg-3’ (SEQ ID NO. 15)，结果如图6所示。结果表明，强力霉素诱导感染H2. 35小鼠肝细胞尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达存在量效关系，当强力霉素浓度低于5 y g时，随着浓度升高尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的表达量升高，当强力霉素浓度高于5 Ug时，uPA基因的表达进入平台增长期，其浓度升高对uPA基因的表达量影响较小。同时检测强力霉素诱导JGYPLV慢病毒感染的H2. 35小鼠肝细胞的尿激酶型纤溶酶原激活剂uPA的表达，western blot分析结果如图7所示。结果显示，JGYPLV慢病毒感染H2. 35小鼠肝细胞中尿激酶型纤溶酶原激活剂uPA表达随强力霉素诱导浓度的增加而升闻，在强力霉素浓度10 y g时uPA蛋白表达量最闻。由此可知，本发明构建的PAlb-uPA慢病毒载体经包装后感染H2. 35小鼠肝细胞，在四环素类抗生素强力霉素诱导下能够过量表达尿激酶型纤溶酶原激活剂uPA，可以用于制备PAlb-uPA转基因小鼠，获得制备尿激酶型 纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型，为制备携带人肝组织的动物模型提供小鼠受体。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.PAlb-UPA慢病毒载体，其特征在于所述PAlb-UPA慢病毒载体含有白蛋白启动子PAlb、尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA、白蛋白启动子PAlb启动的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2和启动所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达的PTight启动子，所述四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2调控PTight启动子； 所述白蛋白启动子PAlb的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示；所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示；编码所述四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2的核酸序列如SEQ ID NO. 10所示；PTight启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示。
2.根据权利要求I所述的PAlb-uPA慢病毒载体，其特征在于所述PAlb-uPA慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
3.权利要求I或2所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下 a.从小鼠肾脏克隆尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA，并将克隆的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA连入pLVX Tight Puro载体的PTight启动子下游，得JGY-PLV-2载体； b.克隆白蛋白启动子PAlb，并将克隆的白蛋白启动子PAlb连入pLVX-Tet-On载体的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2的上游，得JGY-PLV-I载体； c.从步骤b所得JGY-PLV-I载体上切下含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用子rtTA/rtTA2s-M2的片段，然后连入pLKO. I克隆载体，得JGY-PLV-A载体； d.从步骤c所得JGY-PLV-A载体切下含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2的片段，然后连入步骤a所得JGY-PLV-2载体的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA下游，得PAlb-uPA慢病毒载体。
4.根据权利要求3所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于所述步骤a中，将克隆的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA用XbaI和BamHI酶切，连入同样经XbaI和BamHI 酶切的 pLVX Tight Puro 载体，得 JGY-PLV-2 载体。
5.根据权利要求4所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于所述步骤a中，尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的克隆，具体为以C57小鼠肾脏第一链cDNA为模板，以SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列为引物，进行第一次PCR扩增；再以第一次PCR产物为模板，以SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列为引物进行第二次PCR扩增，得尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA。
6.根据权利要求3所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于所述步骤b中，将克隆的白蛋白启动子PAlb用ClaI和BamHI酶切，连入同样经ClaI和BamHI酶切的pLVX-Tet-On 载体，得 JGY-PLV-1 载体。
7.根据权利要求6所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于所述步骤b中，所述白蛋白启动子PAlb的克隆，具体为以含白蛋白启动子PAlb的质粒为模板，以SEQ IDNO. 5和SEQ ID NO. 6所示序列为弓I物进行PCR扩增，得白蛋白启动子PAlb。
8.根据权利要求3所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于所述步骤c为将步骤b所得JGY-PLV-I载体用AgeI和AvrII酶切，回收含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2片段，然后连入同样经AgeI和AvrII酶切的pLKO. I克隆载体，得JGY-PLV-A载体。
9.根据权利要求3所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于所述步骤d为将步骤a所得JGY-PLV-A载体用AgeI和XhoI酶切并回收含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2s-M2片段，然后连入同样经AgeI和XhoI酶切的JGY-PLV-2载体中。
10.权利要求I所述PAlb-UPA慢病毒载体在制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型中的应用。
全文摘要
本发明公开了PAlb-uPA慢病毒载体，该载体含有白蛋白启动子PAlb和尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA，白蛋白启动子PAlb的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2和调控尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的PTight启动子；还公开了PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法和应用，其制备方法简单，制得的慢病毒载体能够用于制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型，为临床研究人肝炎病毒感染机制和抗病毒药物提供了有效的研究平台。
文档编号C12N15/66GK102628063SQ201210102188
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月10日 优先权日2012年4月10日
发明者李俊刚, 毛青, 白家驷 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院