专利名称：一种乙醛脱氢酶基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乙醛脱氢酶基因启动子及其应用，特别涉及一种来源于玉米，且具有根表达特异性的乙醛脱氢酶基因启动子及其应用。
背景技术：
随着人口增长和经济发展，我国的粮食需求仍将呈现持续刚性增长。在当前耕地面积持续减少和粮食种植面积扩大潜力非常有限的形式下，大幅度提高粮食单产成为保障国家粮食安全的必由之路。通过优化施肥技术、分阶段精确调控施肥量等栽培耕作措施，可以显著提高作物产量。同时，利用作物自身吸收利用养分的遗传潜力，选育氮高效品种或转基因品种，也是解决粮食问题的有效途径之一。当前，提高作物养分效率的遗传改良和育种工作已经引起科学家的极大重视，许多国家，国际研究机构和跨国育种公司都把这项研究工作列为优先发展领域。然而，作物养分高效性状的遗传基础复杂，受环境影响很大，因此通过传统的常规育种途径培育养分高效利用的品种难度非常大，导致当前可应用于农业生产中的养分高效利用品种非常缺乏。 随着分子生物学理论和技术的不断发展，植物遗传分析和遗传工程技术的不断革新，分子育种策略大大加快了作物新品种的选育。通过转基因技术或分子标记辅助选择等技术对养分高效性状实现遗传操作，将能够快速有效地培育获得养分高效利用新品种。近年来，人们已经克隆得到了很多与养分高效利用相关的基因，比如在植物氮素的吸收利用起到重要作用的氮代谢途径关键酶的基因，这些关键酶的基因在很多物种中都有研究，比如硝酸还原酶、谷氨酸脱氢酶、GS/G0GAT途径的谷氨酰胺合成酶以及各种转氨酶，为了研究这些功能基因的作用，最后能够为实际生产提供良好的种质资源，就需要在植物体内超表达这些功能基因，以期望得到良好的表型。这些养分高效候选基因大多数由异源组成型启动子(如CaMV 35S)驱动，从而在植物中组成型表达，这可以部分达到养分高效利用的效果，在作物中比较成功的例子是在玉米中超表达ZmGSl-3基因，通过大量表达谷氨酰胺合成酶使玉米的籽粒数目与野生型相比显著增加，从而极大地提高了转基因玉米的氮素利用效率和产量(Antoine et al. , Two Cytosolic Glutamine Synthetase isoforms of maize are specifically involved in the control of grain production. Plant Cell，2006，18 :3252-3274)。不过类似的成功例子并不多见，主要原因是由于在一些非必要组织中大量表达外源蛋白，可能会无谓消耗植物体内的能源，增加植物生长负担，从而影响植物本身的优良性状。例如在拟南芥中由CaMV 35S启动表达基因AtGluR2 (谷氨酸受体的基因)，影响了植物对钙的敏感性，使地上部出现缺I丐的症状，反而对植物的产量产生影响(Sun etal. ,Overexpression of the AtGluR2 Gene Encoding an Arabidopsis Homolog of Mammalian Glutamate Receptors Impairs Calcium Utilization and Sensitivity to Ionic Stress in Transgenic Plants. Plant Cell Physiology，2001，42 :74-84) 因此，选用器官特异性启动子或诱导型启动子，使目标基因在植物特定的发育阶段、部位或特定环境下表达，将可能获得更好的转基因效果。根系是养分吸收的主要器官， 提高根系对养分的吸收效率，初级代谢效率，以及通过根系中柱鞘向地上部运输的效率是提高养分吸收高效利用的关键。因此，发现根特异性启动子，从而在植物根部特异性高表达养分高效候选基因，这对实现养分高效吸收利用可能比选用组成型启动子具有更佳的效果O
发明内容
本发明的目的是提供一种具有启动子功能的DNA分子。本发明所提供的DNA分子,名称为ZmANTp,来源于玉米(Zea mays L.)品种自交系 B73，为如下I)-3)中任一种I)序列表中序列I所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子;所述3)中的DNA分子，与I)或2)限定的DNA分子最好有95%以上的同源性。所述严格条件是在2 X SSC，O. I % SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次。每次 5min. O. 5X SSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次。每次15min。序列表中序列I由1410个核苷酸组成。含有所述DNA分子(ZmANTp)的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体中，由所述的DNA分子(ZmANTp)启动目的基因的转录。在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为在P CAMBIA3 3 OI的多克隆位点插入所述DNA分子 (ZmANTp)得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为限制性内切酶识别位点Hind III和Nco
I。所述目的基因具体为GUS基因。所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子(ZmANTp)，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子(ZmANTp)以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因。所述DNA分子(ZmANTp)在启动目的基因在植物中表达中的应用也属于本发明的保护范围。在本发明的一个实施例中，所述植物为玉米，具体为玉米品种Hi-II (自交系Hi A 和自交系Hi B的杂交后代)。所述目的基因具体为GUS基因。所述表达为根特异表达；所述根主要指根尖，更为具体的，为根尖的中柱鞘细胞。利用所述的DNA分子(ZmANTp)培育转基因植物的方法也属于本发明的保护范围。该方法包括如下步骤1)构建目的基因重组表达载体将目的基因插入到上述含有所述DNA分子(ZmANTp)的所述重组载体，使所述DNA分子(ZmANTp)启动所述目的基因表达，得到目的基因重组表达载体；2)将步骤I)构建的目的基因重组表达载体导入目的植物中，得到在根中特异表达所述目的基因的转基因植物。将所述目的基因重组表达载体导入所述目的植物的方法可为农杆菌介导法、Ti质粒法、Ri质粒法、植物病毒载体法、直接DNA转化法、显微注射法、电导法等，在本发明的实施例中具体采用的为农杆菌介导法。在本发明的一个实施例中，所述目的植物植物为玉米，具体为玉米品种Hi-II (自交系Hi A和自交系Hi B的杂交后代)。所述目的基因具体为GUS基因。所述目的基因重组表达载体具体为含有所述DNA分子(ZmANTp)的pCAMBIA3301重组质粒。本发明从玉米品种B73中克隆出了玉米乙醛脱氢酶基因启动子的相关序列，实验证实该序列很强的启动子功能，可驱动目的基因(如报告基因GUS基因)在幼苗的根中高效特异性表达，并且表达部位定位在中柱鞘，这对于进一步研究增强植物对养分高效吸收利用具有非常重要的意义。
图I为RT-PCR扩增得到ZmANTp启动子的电泳图谱。其中，泳道I和2均为用引物Antp-F和Antp-R PCR扩增得到ZmANTp启动子的电泳图谱；泳道M为DNA Marker (中科瑞泰 DNA MarkerIII 货号 5905683)，分子标准从小到大为 300bp、500bp、800bp、lOOObp、 1500bp、2000bp、3000bp、5000bp。图2为ZmANTp启动子转化玉米的过程示意图。其中，A为ZmANTp转基因玉米幼胚GUS染色图；B为ZmANTp转基因玉米幼胚诱导形成的愈伤图片；C为ZmANTp转基因玉米愈伤诱导成苗的图片。图3为部分ZmANTp转基因玉米的分子鉴定图片。其中，A为部分Ttl代转基因玉米中抗性基因-Bar基因的PCR检测图；B为部分T2代纯合转基因玉米中GUS基因的PCR检测图。A和B中，数字编号的泳道中的样品即来自对应编号的转基因玉米，Tub表示内参基因 alpha_tubulin40图4为ZmANTp启动子驱动的⑶S基因在T2代纯合转基因玉米幼苗中根和叶的⑶S 活性染色比较照片。其中，A表示编号为1-5-1的T2代纯合转基因玉米株系的根和叶的染色图表示编号为1-70的T2代纯合转基因玉米株系的根和叶的染色图。图5为ZmANTp启动子驱动的⑶S基因在T2代纯合转基因玉米幼苗根和叶的⑶S 酶活性定量比较图。图6为ZmANTp启动子驱动的⑶S酶在T2代纯合转基因玉米幼苗根尖中的⑶S染色活性图。其中，I表示转入pCAMBIA 3301载体的转基因玉米株系(正对照)；2表示非转基因玉米株系(负对照)；3表示编号为1-5-1的T2代纯合转基因玉米株系；4表示编号为 1-70的T2代纯合转基因玉米株系。图7为ZmANTp启动子驱动的⑶S酶在T2代纯合转基因玉米根不同组织中的⑶S 染色活性横切剖面图。其中，I表示转入pCAMBIA 3301载体的转基因玉米株系(正对照)； 2表示非转基因玉米株系(负对照)；3表示编号为1-5-1的T2代纯合转基因玉米株系；4 表示编号为1-70的T2代纯合转基因玉米株系。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
菌株与质粒大肠杆菌(E. coli)DH5 α、农杆菌EHA105均购自博大公司。pCAMBIA3301 (pCambia3301):参考文献李敬娜，刘亚，李翔等.抗草甘膦基因表达载体的构建及对玉米的遗传转化，华北农学报，2010，25 (4) :44-48。工具酶及生化试剂各种限制性内切酶、pGEM-T-Easy载体试剂盒购自Promega公司；高保真酶Prime-Star购自Takara公司；dNTP混合物购自上海生工；T4 DNA连接酶购自Promega公司；氨节青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、和噻孢霉素(Cef)购自欣经科公司。培养基下述培养基的溶剂均为水。LB液体培养基(I升)10g NaCl，5g酵母提取物，IOg胰蛋白胨，pH7.0。LB固体培养基(I升)1升液体LB培养基加15g琼脂，pH7. O。YEP液体培养基(I升)10g酵母提取物，IOg蛋白胨，5g NaCl, pH 7. 5。YEP固体培养基(I升)1升YEB液体培养基加15g琼脂，pH 7. 5。Inf 侵染培养基(I 升)-Ag N6 Salt (即 Chu (N6) Basal Salt Mixture 购自 sigma 公司，产品目录号为C1416)，5ml N6维生素储存液(200X)，I. 5ml 2，4-D (2，4-二氯苯氧乙酸)水溶液(lmg/ml) ,0. 7g Proline (脯氨酸)，68. 4g Sucrose (鹿糖)，36g Glucose (葡萄糖)，Iml AS(乙酰丁香酮)水溶液(100mM/ml)，pH 5. 2。CO-C 共培养培养基(I 升)2g N6 Salt (即 Chu (N6) Basal Salt Mixture 购自 sigma公司，产品目录号为C1416)，5ml N6维生素储存液(200X)，I. 5ml 2，4_D水溶液 (lmg/ml) ,0. 7g Proline (脯氨酸)，30g Sucrose (鹿糖)，8g Agar (琼脂)，Iml 经过滤的 DTT ( 二硫苏糖醇)水溶液(O. 152g/ml)，Iml AS水溶液(乙酰丁香酮)(100mM/ml), 50 μ I Silver nitrate 水溶液(硝酸银)(17mg/ml)，Iml 经过滤的 Cysteine (半胱氨酸)(0. 3g/ ml), pH 5· 8。Resting 静息培养基(I 升)4g N6 Salt (即 Chu (N6)Basal Salt Mixture 购自sigma公司，产品目录号为C1416)，，5ml N6维生素储存液(200X)，I. 5ml 2，4_D水溶液(lmg/ml) ,0. 7g Proline (脯氨酸)，30g Sucrose (鹿糖)，8g Agar(琼脂)，lml Carbenicillin (羧节青霉素)水溶液(100mg/ml), 50 μ I Silver nitrate 水溶液(硝酸银)(17mg/ml)，pH5.8。N6S 选择培养基(I 升)4g N6 Salt (即 Chu (N6) Basal Salt Mixture 购自 sigma 公司，产品目录号为C1416)，，5ml N6维生素储存液(200 X)，I. 5ml 2，4_D水溶液(lmg/ ml) ,0. 7g Prol ine(脯氨酸)，30g Sucrose (鹿糖)，3. 8g Gelrite (植物凝胶)，50 μ I Silver nitrate(硝酸银)水溶液(17mg/ml), 250 μ I Glufocinate (草丁膦)水溶液 (10mg/ml), Iml Carbenicillin (羧节青霉素)水溶液(100mg/ml), pH 5.8。N6 维生素储存液(200X)(1 升):0. 4g 甘氨酸，O. Ig 烟酸，O. 2g VBl，O. Ig VB6。RI 再生培养基(I 升)MS 盐粉末(西美杰，MURASHIGE and SKOOG BASAL MEDIUM withVITAMINS,产品目录号为 M519)，O. Ig Myo-Inositol (肌醇)，60g Sucrose (鹿糖)，3g Gelrite (植物凝胶),500 μ I Glufocinate (草丁膦)水溶液(5mg/ml) ,pH 5· 8。RII 再生培养基(I 升)MS 盐粉末(西美杰，MURASHIGE and SKOOG BASAL MEDIUM withVITAMINS,产品目录号为 M519)，O. Ig Myo-Inositol (肌醇)，30g Sucrose (鹿糖)，3g Gelrite (植物凝胶),350 μ I 6-ΒΑ (6-苄氨基腺嘌呤)水溶液(lmg/ml)，ρΗ5· 8。瓶用培养基(I升)MS 盐粉末(西美杰，MURASHIGE and SKOOG BASAL MEDIUMwithVITAMINS,产品目录号为 M519)，O. Ig Myo-Inositol (肌醇)，30g Sucrose (鹿糖)，3g Gelrite (植物凝胶)，350 μ I NAA (萘乙酸)水溶液(lmg/ml)，pH 5. 8。GUS染液100mg x-Gluc (5_溴_4_氯_3吲哚葡萄糖苷)，溶于Iml DMF( 二甲基甲酰胺)；取50ml浓度为lOOmmol/L的磷酸缓冲液(pH7. O)，加入Iml浓度为50mmol/L的铁氰化钾、Iml浓度为50mmol/L的亚铁氰化钾和O. Iml的TritonX-IOO,再加入已经溶解的 x-Gluc,加高纯水到定容至100ml。酶提取液0·05Μ磷酸缓冲液(ρΗ7·0)，0·1 % (O. lg/100ml) SDS, O. OlM EDTA(pH8. 0),20% (体积百分含量)甲醇，O. 1% (体积百分含量)Triton X-100,0. 1% (体积百分含量)巯基乙醇。以上浓度均为终浓度。实施例I、ZmANT启动子的克隆根据玉米ZmANT基因组序列的5’侧翼序列(GenBank AC196479. 3)设计了 2条引物Antp-F和Antp-R。以玉米(Zea mays L.)品种自交系B73 (国家种子库,库编号为 I1G13943)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。Antp-F 5/ -AAGCTTAAGGAGCAAAGCGACTCGGTTAC-3'(划线部分为 Hind III 的识别序列，其后的序列为序列I的第1-23位)Antp-R 5/ -CCATGGTGTCGGCGTTGGTAGGTGATGCG-3'(划线部分为 Nco I 的识别序列，其后的序列为序列I的第1386-1408位的反向互补序列)扩增体系10XPCR反应缓冲液5 μ L，dNTP混合物(每种IOmM) I μ L，引物 Antp-F (10 μ Μ) I μ L,引物 Antp-R(10 μ Μ) I μ L,高保真酶 Prime-Star (5U/ μ L) 0· 5 μ L,基因组DNA模板(浓度为IOng/ μ L) 0. 5 μ L，DMSO 2 μ L，灭菌水定容至50 μ L。扩增条件98°CImin ；94°C 20s，58。。20s，72。。2min,30 个循环；72°C IOmin ；4°C保存。结果如图I所示用引物Antp-F和Antp-R扩增得到大小约为1500bp的目的条带。将扩增条带回收纯化后连接到pGEM-T-Easy载体上，得到的重组载体命名为 pGEM-T-ZmANTp。对插入片段进行测序。测序结果表明与ZmANT基因的5’侧翼序列 (GenBank AC196479. 3))比较，一致性为100%，表明扩增正确。将该片段的前1410bp命名为ZmANTp，其具体的核苷酸序列如序列表中序列I所示。实施例2、启动子(ZmANTp)功能活性验证一、含有启动子序列的重组表达载体p3301-ZmANTp-GUS的构建根据引物Antp-F和Antp-R两端设计的酶切位点，用Hind III和Nco I将ZmANTp 片段从实施例I构建所得的pGEM-T-ZmANTp重组载体上切下，把酶切后回收的ZmANTp片段与经Hind III和Nco I酶切的pCAMBIA3301载体片段相连。将连接产物转化到大肠杆菌 DH5a菌株中，提取质粒DNA，用Hind III和NcoI酶切鉴定。对初步鉴定正确的重组质粒 (有大小约为1500bp的酶切目的条带)进行测序，将测序表明含有序列I所示1410bp的重组表达载体命名为p3301-ZmANTp-GUS。在重组表达载体p3301-ZmANTp-GUS中，序列I所示的ZmANTp位于⑶S基因的上游，在适当条件下会启动⑶S基因的表达。二、转基因玉米的获得及鉴定I、转基因玉米的获得
(I)转化农杆菌大量提取步骤一构建的重组表达载体p3301-ZmANTp-GUS的质粒DNA，取20μ L(约 I μ g)转化农杆菌EHA105感受态细胞，在28°C YEP培养基(含卡那霉素100 μ g/ml，利福平125 μ g/ml)上培养两天。挑选单克隆做菌液PCR鉴定，引物为Antp-F :5' -AAGCTTAAG GAGCAAAGCGACTCGGTTAC-3'和 Antp-Rj' -CCATGGTGTCGGCGTTGGTAGGTGATGCG-3'。将扩增出大小约为1500bp目标条带的单克隆农杆菌命名为EHA105/p3301-ZmANTp-GUS。同时设置转入p3301空载体的农杆菌对照(命名为EHA105/p3301)和转入pCAMBIA3301载体的农杆菌对照(EHA105/pCAMBIA3301)。pCAMBIA3301载体自身在⑶S基因的上游有组成型启动子CaMV35S。而所述p3301空载体具体为将pCAMBIA3301载体用Hind III和Nco I双酶切 (切除了 CaMV35S启动子)后补平粘性末端后直接连接而得的载体。所述p3301空载体中不存在启动GUS基因转录的启动子。(2)农杆菌转化玉米幼胚将步骤(I)所得的农杆菌EHA105/p3301-ZmANTp-GUS、EHA105/pCAMBIA3301 或 EHA105/p3301继代2天后的单菌落，在加有相应抗生素的YEP培养基划线，于22°C的培养箱中培养3天，将菌落刮入Inf侵染培养基中至OD为O. 3-0. 4，摇3个小时后可做侵染备用。将玉米品种Hi-II (C. L. Armstrong, C. E. Green, R. L. Phillips. Development and availability of germplasm with high Type II culture formation response.In Vitro Cell. Dev Biol-Plant, 1996 (32) :179-183)的幼胚放入含有 2ml Inf 侵染培养基和 2μ I 乙酰丁香酮(100mM/ml)的离心管中，用该侵染液洗涤幼胚三次，倒掉侵染液后加入Iml的上述准备好的农杆菌悬浮液(0D600为0. 3-0. 4)到幼胚中，轻轻颠倒离心管20次，侵没幼胚垂直静止10分钟(22°C黑暗)，幼胚侵染完成。侵染完成后将离心管中的菌液吸干，将幼胚放到CO-C共培养培养基上，22°C暗培养3天。侵染后的幼胚用⑶S染色确定EHA105/ p3301-ZmANTp-GUS的瞬时转化率在50%以上，如图2中A所示。(3)转基因玉米的获得把共培养后的幼胚转入Resting静息培养基上，28°C，暗培养7_12天。使侵染后的幼胚得到充分恢复，长出新的愈伤。然后使用N6S选择培养基进行四次选择筛选。在N6S 选择培养基的基础上添加草丁膦，使四次筛选时，草丁膦筛选浓度由低到高依次为I. 5mg/ L，2. 5mg/L, 3mg/L, 3mg/L,每轮筛选时间都为14天。四轮筛选后正常生长的愈伤为抗性愈伤，如图2中B所示。将抗性愈伤诱导生苗。诱导之前需经过筛选后的恢复，恢复后膨大的细胞在光下再生成苗，所用培养基为RI再生培养基。之后再在培养基上加6-BA(即RII再生培养基)促进分化。当再生植株长到三片叶时(确定有主茎)，可将幼苗分移到含生根培养基的培养瓶中，所用培养基为瓶用培养基，28°C光照(3000Lx，16小时)培养，图2中C为成苗的图片。当幼苗长出新的根后(大约三条根)，将幼苗从瓶中取出，用自来水(室温)冲净培养基，移栽于混有营养土和蛭石(I I)的花盆中，当玉米又长出2-3片新叶移到大花盆中或大田中，为转基因玉米Ttl代，继续培养获得下一代种子。2、转基因玉米的分子检测(I)转基因玉米RNA提取及反转录
取步骤I筛选得到的Ttl代转基因玉米的叶片，提取RNA。RNA提取方法参照Trizol 总RNA提取试剂盒(Invitrogen)说明书进行。对总RNA进行纯化，纯化体系为50 μ L体系， 包括 30μ g 总 RNA、5y L IOXDNase I 缓冲液、2yL DNase I (5U μ L-1)、0· 5 μ L RNA 酶抑制剂，加DEPC水至50 μ L ;37°C反应30min -M /氯仿抽提后用冷无水乙醇进行沉淀，_20°C放置Ih ;离心回收沉淀，用冷的70%乙醇清洗沉淀，真空干燥；用适量的DEPC水溶解。用紫外分光光度计测定提取的RNA在260nm，280nm及230nm处的光吸收值，确定RNA的浓度及纯度。按照IOD = 40 μ g RNA计算RNA产率。0D260/0D280在I. 8 2. O之间视为RNA的纯度很高。甲醛变性凝胶电泳，检测总RNA的完整性。RNA经反转录合成cDNA后，反转产物稀释5 10倍，作为PCR模板。(2)转基因玉米PCR检测首先，根据pCAMBIA 3301载体上的抗草丁膦基因-Bar基因序列设计一对引物 Bar-F和Bar-R，用这对引物以上述步骤(I)所得的转基因玉米Ttl代的cDNA作为模板进行 PCR扩增。以玉米持家基因alpha-tubulin4作为内参基因，其引物为Tub-F和Tub_R。同时设置如下三个对照正对照(转入pCAMBIA 3301载体的转基因植株)、负对照(非转基因玉米植株)和空白对照(以水代替cDNA作为PCR扩增模板)。Bar-R 5' -ACTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGT-3'Bar-F 5/ -GCACCATCGTCAACCACTACATCGA-3'Tub-F 5/ -GCTATCCTGTGATCTGCCCTGA-3' Tub-R 5' -CGCCAAACTTAATAACCCAGTA-3'PCR反应体系10X缓冲液2. 5 μ L，dNTP混合物(每种IOmM) O. 5 μ L，上下游引物 (浓度均为10 μ Μ)各O. 5 μ L，Taq酶(浓度为5U/ μ L) O. 5 μ L，cDNA模板(浓度为20ng/ μ L) I μ L,灭菌水定容至25 μ L。PCR检测结果如图3中A所示，正对照(转入pCAMBIA 3301载体的转基因植株) 扩增出大小为300bp左右的目的条带；负对照(非转基因玉米植株)和空白对照(以水代替cDNA作为PCR扩增模板)均没有扩增条带产生。这说明检测结果可信。转入重组表达载体p3301-ZmANTp-GUS的Ttl代转基因玉米植株中，扩增出大小约为300bp左右目的条带的植株鉴定为阳性，将其中的两个编号为1-5-1和1-70。同时，转入p3301空载体的阳性转基因植株的转基因植株的扩增目的条带大小也为300bp左右。其次，将经上述Bar基因鉴定阳性的Ttl代转基因玉米植株(包括转入 p3301-ZmANTp-GUS、p3301或pCAMBIA 3301的植株)自交授粉，获得T1代种子，将T1代种子种入大田，每个转化事件随机挑选12粒种子种I行，取幼苗叶片，用上述Bar基因的鉴定方法进行鉴定，对鉴定阳性植株进行自交授粉，获得T2代种子，单株收获，每株随机挑选12 粒种子种入大田，取幼苗叶片对其T2代植株进行Bar基因鉴定，选取12株全为阳性的后代， 说明该转化事件的T2代种子已经纯合。对这些T2代纯合的植物，选用⑶S基因引物⑶S-F 和GUS-R，用与Bar基因检测相同的方法检测GUS基因在转基因玉米中的RNA表达水平。CTS-Fj' -CAGGAAGTGATGGAGCATCAG-3'⑶S-R 5' -TCGTGCACCATCAGCACGTTA-3'⑶S基因检测结果如图3中B所示，正对照(转入pCAMBIA 3301载体的转基因植株)扩增出大小约为600bp的目的条带；负对照(非转基因玉米植株)和空白对照(以水代替cDNA作为PCR扩增模板)均没有扩增条带产生。这说明检测结果可信。转入重组表达载体p3301-ZmANTp-GUS的T2代纯合转基因玉米植株中，扩增出大小约为600bp目的条带的植株鉴定为阳性，其中编号为1-5-1和1-70的两个株系中⑶S表达水平较高。而转入 P3301空载体的T2代纯合转基因玉米植株，由于没有启动子启动GUS基因的转录，致使GUS 基因鉴定结果均为阴性，即扩增产物均没有目的条带。实施例3、ZmANTp启动子的活性检测一、ZmANTp启动子活性分析I、实验材料实施例2所得的编号为1-5-1和1-70的两个携带有ZmANTp基因的T2代纯合转基因玉米株系，转入P3301空载体的转基因玉米株系，转入pCAMBIA 3301载体的转基因玉米株系(正对照)，非转基因玉米株系(负对照)。2、实验方法(I)⑶S染色分析FAA配方(IOOml):乙醇50ml，冰醋酸5ml，甲醛10ml，高纯水35ml。取步骤I中所述的各个玉米株系，将其幼苗期的根和叶在GUS染液中37°C避光染色过夜。其中，叶在染色之前需要在丙酮中脱色30min，倒掉染色液将样品放入FAA固定液中，浸泡8h，然后转入酒精和叔丁醇中进行脱水、透明和浸蜡，包埋蜡块进行切片，观察⑶S 染色的情况，分析ZmANTp启动子的活性部位。⑶S染色结果如图4所示，实施例2所得的编号为1-5-1和1_70的两个携带有 ZmANTp基因的T2代纯合转基因玉米株系染色后，发现根被染成深蓝色，叶中表达很微弱； 而转入pCAMBIA 3301载体的转基因玉米株系(正对照)在地上部和根中都被染成深蓝色， 表达量类似；非转基因玉米株系(负对照)和转入P3301空载体的转基因玉米株系没有被染色。这一结果首先表明ZmANT基因起始密码子ATG上游1410bp的序列(ZmANTp，序列I) 可以启动报告基因⑶S在玉米中表达。其次，从表达信号来看ZmANTp驱动的⑶S基因主要表达在幼苗的根中，叶中表达非常微弱。(2)⑶S活性检测取步骤I中所述的各个玉米株系，提取其幼苗期的根和叶的总蛋白，定量检测GUS 基因编码蛋白β_葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)的活性,分析ZmANTp的组织特异性驱动活性。具体操作如下A、标准曲线的制作用反应终止液(O. 2mol/L Na2CO3)将4_MU(4_甲基伞形酮)配制成O. OOpmol,
6.25pmol、12. 50pmol、50. OOpmol>100. OOpmol>250. OOpmol>500. OOpmol 和 1000. OOpmol 的系列标准浓度，通过测定它们的荧光强度，作出一条标准曲线。B、总蛋白提取与蛋白浓度的测定I)取O. Ig材料(步骤I中所述的各个玉米株系幼苗期的根或叶)于I. 5ml离心管中，加入液氮，研成粉末。2)加600 μ L酶提取液，13000rpm 4 V离心lOmin，取上清于一新的离心管中，-20°C保存备用。3)取50 μ L上清，用考马斯亮蓝G250法测定蛋白的含量。
C、β -葡萄糖苷酸酶的酶促反应及其荧光定量I)取50 μ L步骤Β2)制备所得的含⑶S的上清，加入到450 μ L经37°C预热的检测液(2mmol/L 4-MUG溶液)中，迅速充分混匀进行反应。2)立刻从上述步骤I)的反应液中取出50yL，加入到950yL反应终止液 (O. 2mol/L Na2CO3)，将该管作为酶促反应的O点。3)分别在反应10min、20min、30min、45min和60min时,从上述步骤I)的反应液中取出50 μ L，转入950 μ L的反应终止液中。4)酶促反应结束后，用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，测定不同时间点的荧光值。5)根据步骤4)测定的荧光值，以及参与反应的总蛋白的量，计算每个样品单位时间内GUS活性。其中计算方法为根据步骤4)所测荧光值及步骤A的标准曲线，计算得到的单位时间的MU浓度变化，再用单位时间的MU浓度变化除以步骤B测得的参加反应的样品蛋白含量，求出单位质量的蛋白单位时间的MU浓度变化，即为单位时间内的GUS活性。具体公式GUS活性=单位时间内反应生成的MU/蛋白量(单位nmol4-MU. mirT1. g_1蛋白)。对实施例2所得的编号为1-5-1的携带有ZmANTp基因的T2代纯合转基因玉米株系的检测结果如图5所示，ZmANTp驱动的GUS基因在幼苗的根中表达活性是叶中的100倍。 这一结果表明ZmANTp启动子是一个在幼苗根中表达活性很强的启动子。二、ZmANTp启动子活性位点的检测为进一步说明ZmANTp (序列I)在玉米根中的活性位点，取GUS基因表达水平高的两个玉米纯合系植株，即实施例2所得的编号为1-5-1和1-70的两个携带有ZmANTp基因的T2代纯合转基因玉米株系。同时以转入pCAMBIA 3301载体的转基因玉米株系作为正对照，以非转基因玉米株系作为负对照。将其幼苗期的根在GUS染液中37°C避光染色过夜。 然后切片观察在根中不同组织中的GUS染色情况，分析ZmANTp启动子的活性位点。根⑶S染液结果如图6所示转入pCAMBIA 3301载体的转基因玉米株系(正对照)整个根都被染成了深蓝色；非转基因玉米株系(负对照)整个根均不被染色；而编号为 1-5-1和1-70的两个T2R纯合转基因玉米株系均在根尖部位被染色。这一结果表明ZmANTp 启动子在植物根尖具有很高的活性。根切片结果如图7所示，表明两个转基因纯合系幼苗根部表现的GUS活性都定位在根的中柱鞘细胞。总之，以上结果充分说明了 ZmANTp启动子是一个在玉米根尖中高表达，并且表达部位主要集中在中柱鞘细胞中。
权利要求
1.DNA分子,为如下I) -3)中任一种1)序列表中序列I所不的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子； 所述3)中的DNA分子，与I)或2)限定的DNA分子最好有95%以上的同源性。
2.含有权利要求I所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于所述重组载体中，由权利要求I所述的DNA分子启动目的基因的表达。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为在pCAMBIA3301的多克隆位点插入权利要求I所述DNA分子得到的重组质粒。
5.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于所述表达盒由权利要求I所述的DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及终止所述目的基因转录的终止序列组成。
6.权利要求I所述DNA分子在启动目的基因在植物中表达中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述植物为玉米。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于所述表达为根特异表达。
9.利用权利要求I所述的DNA分子培育转基因植物的方法，包括如下步骤1)构建目的基因重组表达载体将目的基因插入权利要求2-4中任一所述重组载体， 使权利要求I所述的DNA分子启动所述目的基因表达，得到目的基因重组表达载体；2)将步骤I)构建的目的基因重组表达载体导入目的植物中，得到在根中特异表达所述目的基因的转基因植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述目的植物为玉米。
全文摘要
本发明公开了一种乙醛脱氢酶基因启动子及其应用。本发明所提供的启动子为为如下1)-3)中任一种1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子；所述3)中的基因，与1)或2)限定的基因最好有95％以上的同源性。本发明所提供的启动子能够驱动目的基因在幼苗根中高效特异性表达，并且表达部位定位在中柱鞘，这对于进一步研究增强植物对养分高效吸收利用具有非常重要的意义。
文档编号C12N15/113GK102604956SQ20121010210
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月9日 优先权日2012年4月9日
发明者安霞, 张福锁, 袁力行, 陈范骏, 顾日良 申请人:中国农业大学