专利名称：生产l-苯丙氨酸的工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生产L-苯丙氨酸的工程菌及其应用。
背景技术：
L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)是人体必须的氨基酸之一,广泛应用于食品、饲料、医药和化妆品等领域。低热量、高甜度的二肽甜味剂阿斯巴甜(Aspartame)的应用日益广泛，作为合成阿斯巴甜两种原料之一的L-苯丙氨酸的市场需求量迅速增加。另外，L-苯丙氨酸也是抗肿瘤药物和氨基酸输液制剂的必需原料，随着其在医药领域的应用不断扩展，需求量也将不断增加。传统的菌株选育是从自然界中筛选有产L-苯丙氨酸能力的菌株,并建立其培养条件开始的。但是该方法所能积累的氨基酸种类有限，后来在确立突变技术和阐明氨基酸合成系统调节机制的基础上发展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的选育，但是采用常规诱变育种的方法，盲目性大，工作量繁重，不能增加基因的数量，且突变株一般都携带营养缺陷，产量进一步提高受到限制。
发明内容
本发明的目的是提供生产L-苯丙氨酸的工程菌及其应用。本发明保护将重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌；所述重组质粒为将PheA蛋白的编码基因、aroD蛋白的编码基因、aroE蛋白的编码基因和talA蛋白的编码基因插入出发载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述大肠杆菌的CICC编号为10245 ;所述pheA蛋白如序列表的序列I所不；所述aroD蛋白如序列表的序列3所不；所述aroE蛋白如序列表的序列5所不；所述talA蛋白如序列表的序列7所不。所述pheA蛋白的编码基因可如序列表的序列2所不；所述aroD蛋白的编码基因可如序列表的序列4所不；所述aroE蛋白的编码基因可如序列表的序列6所不；所述talA 蛋白的编码基因可如序列表的序列8所不。所述重组质粒中，自上游至下游可依次包括所述pheA蛋白的编码基因、所述aroD 蛋白的编码基因、所述aroE蛋白的编码基因和所述talA蛋白的编码基因。所述出发载体具体可为载体PBV220。所述重组质粒具体可为将所述pheA蛋白的编码基因插入所述载体pBV220的 BglII酶切位点、所述aroD蛋白的编码基因插入所述载体pBV220的EcoRI和BamHI酶切位点之间、所述aroE蛋白的编码基因插入所述载体pBV220的BamHI和SacI酶切位点之间、 所述talA蛋白的编码基因插入所述载体pBV220的SacI酶切位点得到的重组质粒。所述重组菌为具体可为大肠杆菌(Escherichia coli)MF0018。大肠杆菌 (Escherichia coli)MF0018简称大肠杆菌MF0018，已于2012年3月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC ;地址中国武汉，武汉大学；邮编430072)，保藏编号为CCTCC NO M 2012051。
以上任一所述重组菌均可用于生产L-苯丙氨酸。本发明还保护一种生产L-苯丙氨酸的方法，包括如下步骤将以上任一所述的重组菌进行发酵，得到L-苯丙氨酸。所述发酵的条件可为37°C、溶氧50-70%、48小时。所述发酵采用的发酵培养基具体如下由溶质和水组成；溶质及其在发酵培养基中的浓度如下=Na2HPO4 · 12H20 20g/L、柠檬酸钠8g/L、谷氨酸钠O. 5g/L、酪氨酸O. 8g/L、葡萄糖20g/L和氨苄青霉素50mg/L。所述发酵培养基的PH具体可为7。所述发酵过程中通过补加葡萄糖控制发酵体系的葡萄糖含量为 4g/L。所述重组菌具体可以以种子液的方式接种至所述发酵培养基。所述种子液是将所述重组菌接种至种子培养基进行培养得到的。所述种子液的OD61tlnm具体可为30。所述种子液与所述发酵培养基的体积配比具体可为I : 4。所述培养的条件可为37°C、溶氧50-70%、 12小时。所述种子培养基具体由溶质和水组成；溶质及其在发酵培养基中的浓度如下蛋白胨lg/100mL、氯化钠lg/100mL、酵母粉O. 5g/100mL和氨节青霉素50 μ g/mL。所述种子培养基的pH具体可为7。本发明的提供的工程菌可直接发酵得到L-苯丙氨酸，发酵48小时后，发酵液中的 L-苯丙氨酸含量高达75g/L，极具生产应用价值。
图I为载体PBV220的结构示意图。
图2为重组质粒pBV220-pheA的结构示意图。
图3为重组质粒pBV220-pheA_aroD的结构示意图。
图4为重组质粒pBV220-pheA-aroD-aroE的结构示意图。
图5为重组质粒pBV-pheA-aroD-aroE-talA的结构示意图。
图6为氨基酸标准溶液的HPLC谱图。
图7为发酵液的稀释液的HPLC谱图。
图8为对照液的稀释液的HPLC谱图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。大肠杆菌(Escherichia coli)获自中国工业微生物菌种保藏管理中心(www. china-cicc. org,简称CICC),编号为10245,简称大肠杆菌10245。实施例I、重组质粒 pBV-pheA-aroD-aroE-talA 的构建一、重组质粒pBV220_pheA的构建I、以大肠杆菌10245的基因组DNA为模板，用Fl和Rl组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。Fl :5’ -GAGATCTATGACATCGGAAAACCCGTTACT-3’(下划线标注 BgLII 酶切识别序列)；Rl :5’ -GAAGATCTTCAGGTTGGATCAACAGGCACTA-3> (下划线标注 BgLII 酶切识别序列)。Fl和Rl的革E序列如序列表的序列2所不(序列表的序列2所不基因即为pheA基因，编码序列表的序列I所不的pheA蛋白)。PCR扩增条件94°C预变性5分钟；94°C变性I分钟、56°C退火I分钟、72°C延伸I 分钟30秒，30个循环；72°C保温10分钟。2、回收PCR扩增产物(约1200bp)并用限制性内切酶BglII进行酶切，回收酶切产物。3、用限制性内切酶BglII酶切载体pBV220(从北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司购得，结构示意图见图I)，回收载体骨架(约3. 6kb)。4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pBV220_pheA。重组质粒pBV220-pheA的结构示意图见图2。根据测序结果，对重组质粒pBV220_pheA进行结构描述如下在载体PBV220的BglII酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的pheA基因。二、重组质粒 pBV220-pheA_aroD 的构建I、以大肠杆菌10245的基因组DNA为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。F2 5，-CGGAATTCATGAAAACCGTAACTGTAAA-3，(下划线标注 EcoRI 酶切识别序列);R2 5，-CGGGATCCTTATGCCTGGTGTAAAATAGT-3，(下划线标注 BamHI 酶切识别序列)。F2和R2的革E序列如序列表的序列4所不(序列表的序列4所不基因即为aroD基因，编码序列表的序列3所不的aroD蛋白)。PCR扩增条件94°C预变性5分钟；94°C变性I分钟、56°C退火I分钟、72°C延伸I 分钟，30个循环；72°C保温10分钟。2、回收PCR扩增产物(约800bp)并用限制性内切酶EcoRI和BamHI进行双酶切， 回收酶切产物。3、用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切重组质粒pBV220_pheA，回收载体骨架 (约 4. 9kb)。4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒 pBV220-pheA-aroDo重组质粒pBV220-pheA_aroD的结构示意图见图3。根据测序结果,对重组质粒pBV220-pheA-aroD进行结构描述如下在重组质粒pBV220_pheA的EcoRI和BamHI 酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的aroD基因。三、重组质粒pBV220-pheA-aroD_aroE 的构建I、以大肠杆菌10245的基因组DNA为模板，用F3和R3组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。F3 :5’ -CGGGATCCATGGAAACCTATGCTGTTTTTGGTA-3> (下划线标注 BamHI 酶切识别序列)；R3 5，-GCGTCGACTCACGCGGACAATTCCTCCTGC-3，(下划线标注 SacI 酶切识别序列)。F3和R3的祀序列如序列表的序列6所不(序列表的序列6所不基因即为aroE基因，编码序列表的序列5所不的aroE蛋白)。PCR扩增条件94°C预变性5分钟；94°C变性I分钟、56°C退火I分钟、72°C延伸I 分钟，30个循环；72°C保温10分钟。2、回收PCR扩增产物(约800bp)并用限制性内切酶BamHI和SacI进行双酶切， 回收酶切产物。3、用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切重组质粒pBV220-pheA-aroD，回收载体骨架(约 5. 7kb)。4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒 pBV220-pheA-aroD_aroE。重组质粒 pBV220-pheA-aroD_aroE 的结构不意图见图 4。根据测序结果，对重组质粒pBV220-pheA-aroD-aroE进行结构描述如下在重组质粒 pBV220-pheA-aroD的BamHI和SacI酶切位点之间插入了序列表的序列6所示的aroE基因。四、重组质粒pBV220-pheA-aroD-aroE_talA 的构建I、以大肠杆菌10245的基因组DNA为模板，用F4和R4组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。F4 :5’ -GCGTCGACATGAACGAGTTAGACGGCAT-3，(下划线标注 SacI 酶切识别序列);R4 5，-GCGTCGACTTATAGTTTGGCGGCAAGAAG-3，(下划线标注 SacI 酶切识别序列)。F4和R4的祀序列如序列表的序列8所不(序列表的序列8所不基因即为talA基因，编码序列表的序列7所不的talA蛋白)。PCR扩增条件94°C预变性5分钟；94°C变性I分钟、56°C退火I分钟、72°C延伸I 分钟10秒，30个循环；72°C保温10分钟。2、回收PCR扩增产物(约IOOObp)并用限制性内切酶SacI进行酶切，回收酶切产物。3、用限制性内切酶SacI酶切重组质粒pBV220-pheA-aroD-aroE，回收载体骨架 (约 6. 5kb)。4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒 pBV220-pheA-aroD-aroE-talAo 重组质粒 pBV220-pheA-aroD-aroE_talA 的结构不意图见图5。根据测序结果,对重组质粒pBV220-pheA-aroD-aroE-talA进行结构描述如下在重组质粒pBV220-pheA-aroD-aroE的SacI酶切位点之间插入了序列表的序列8所示的talA基因。实施例2、工程菌的构建将重组质粒pBV220-pheA-aroD-aroE_talA电击转化大肠杆菌10245原生质体,然后用Fl和R4组成的引物对进行PCR鉴定(显示约4kb的特异条带的为PCR鉴定阳性)，得
到重组菌。将一株重组菌命名为大肠杆菌(Escherichia coli)MF0018。大肠杆菌 (Escherichia coli)MF0018简称大肠杆菌MF0018，已于2012年3月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC ;地址中国武汉，武汉大学；邮编430072)，保藏编号为CCTCC NO M 2012051。实施例3、应用大肠杆菌MFOO18生产L-苯丙氨酸
一、应用大肠杆菌MFOO18生产L-苯丙氨酸I、种子培养(采用30L全自动发酵罐，种子培养基装液量为15L)将大肠杆菌MF0018接种至种子培养基，发酵罐控制参数为37 °C、溶氧 (DO) 50-70%，培养12小时，得到种子液(种子液的OD61tlnm = 30)。种子培养基(LB培养基，pH7. O)由溶质和水组成；溶质及其在发酵培养基中的浓度如下蛋白胨lg/100mL、氯化钠lg/100mL、酵母粉O. 5g/100mL和氨节青霉素50 μ g/mL。2、发酵培养(采用30L全自动发酵罐，发酵培养基装液量15L)将I体积份种子液接种至4体积份发酵培养基；发酵罐控制参数为37°C、溶氧 (DO) 50-70%，发酵体系中的葡萄糖含量低于4g/L时，由发酵罐自动补加700g/L的葡萄糖水溶液，保持发酵体系的葡萄糖含量为4g/L ;发酵时间为48小时。发酵培养基(pH7.0)由溶质和水组成；溶质及其在发酵培养基中的浓度如下 Na2HPO4 ·12Η20 20g/L、柠檬酸钠8g/L、谷氨酸钠O. 5g/L、酪氨酸O. 8g/L、葡萄糖20g/L和氨节青霉素50mg/L。4、将步骤3的发酵体系离心(4500rpm、15min),收集上清液(发酵液)。5、将发酵液用水稀释至200倍体积后进行步骤三的液相检测。二、对照液的制备将大肠杆菌10245代替大肠杆菌MF0018进行步骤一的实验，收集上清液(对照液)。将对照液用水稀释至100倍体积后进行步骤三的液相检测。三、发酵液中L-苯丙氨酸浓度的测定L-苯丙氨酸(phe)浓度的测定方法采用氨基酸常用测定方法，即高效液相色谱(HPLC)柱前衍生化方法(Rapid, accurate, senstitive, and reprodicobLe HPLC anaLysis of amino acida. Henderson, J. W,Ricker,R. D. ,BidLingmeyer,B. A. , Woodward, C.，AgiLent TechnoLogier, MSA,2000)。样品溶液中L-苯丙氨酸浓度(μ g/mL) = fl/f2XC ；fl =样品溶液中L-苯丙氨酸的峰面积/内标的峰面积；f2 =氨基酸标准溶液中L-苯丙氨酸的面积/内标的峰面积； C =氨基酸标准溶液中的L-苯丙氨酸(μ g/mL)。色谱柱AgeLaVenysiL AA 柱，(4. 6*250mm, 5 μ m);柱温40 °C ;监测波长 254nm ；流动相A的制备方法取15. 2g无水醋酸钠，加水1850mL，溶解后用冰醋酸调pH至
6.5,然后加140mL乙腈,混勻，用0. 45 μ m滤膜过滤；流动相B :由4体积份乙腈和I体积份水组成；流速lmL/min。正亮氨酸内标溶液的制备方法取正亮氨酸(NLe) 10mg，加IOmL 0. ImoL/L盐酸水溶液，溶解。氨基酸标准溶液购买于天津博纳艾杰尔科技有限公司，其中苯丙氨酸浓度为 2.5 μmoL/mL0氨基酸标准溶液和样品溶液的衍生，依次进行如下步骤(I)分别量取氨基酸标准溶液和待测样品液各200 μ L，分别置于I. 5mL离心管
(2)每个离心管中加入正亮氨酸内标溶液20 μ L ;(3)每个离心管中加入100 μ L三乙胺乙腈溶液(1.4mL三乙胺中加入8.6mL乙腈， 混匀)和100 μ L异硫氰酸苯酯乙腈溶液(25 μ L异硫氰酸苯酯加入2mL乙腈，混匀)，混勻， 室温放置I小时；(4)每个离心管中加入400 μ L正己烷，振摇后放置IOmin ；(5)取下层溶液(PTC-苯丙氨酸)，用O. 45 μ m针式滤器过滤；(6)取滤液200 μ L，加800 μ L水稀释，摇匀，进样10 μ L。梯度洗脱过程第0-2min的洗脱液为流动相A ;第2_14min的洗脱液由流动相A 和流动相B组成，流动相A在洗脱液中的体积份数由100%线性下降至93% ;第14-29min 的洗脱液由流动相A和流动相B组成，流动相A在洗脱液中的体积份数由93%线性下降至 70 %;第29-32min的洗脱液由流动相A和流动相B组成，流动相A在洗脱液中的体积份数由 70%线性下降至50% ;第32-33min的洗脱液由流动相A和流动相B组成，流动相A在洗脱液中的体积份数由50%线性上升至100% ;第33-39min的洗脱液为流动相A ;第39_45min 的洗脱液由流动相A和流动相B组成，流动相A在洗脱液中的体积份数由100 %线性下降至 0% ;第45min的洗脱液为流动相B。氨基酸标准溶液的HPLC谱图见图6。NLe的峰面积为1301485。phe的峰面积为 3770598，保留时间为 33. 65min。发酵液的稀释液的HPLC谱图见图7。phe的峰面积为7300825。对照液的稀释液的HPLC谱图见图8。phe的峰面积为4825418。发酵液中的L-苯丙氨酸浓度为75g/L，对照液中的L-苯丙氨酸浓度为21g/L。大肠杆菌MF0018比大肠杆菌10245产L-苯丙氨酸提高约3. 6倍，具有很高的生产价值。
权利要求
1.将重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌；所述重组质粒为将PheA蛋白的编码基因、 aroD蛋白的编码基因、aroE蛋白的编码基因和talA蛋白的编码基因插入出发载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述大肠杆菌的CICC编号为10245 ;所述pheA蛋白如序列表的序列I所不；所述aroD蛋白如序列表的序列3所不；所述aroE蛋白如序列表的序列5所不； 所述talA蛋白如序列表的序列7所不。
2.如权利要求I所述的重组菌，其特征在于所述PheA蛋白的编码基因如序列表的序列2所不；所述aroD蛋白的编码基因如序列表的序列4所不；所述aroE蛋白的编码基因如序列表的序列6所不；所述talA蛋白的编码基因如序列表的序列8所不。
3.如权利要求I或2所述的重组菌，其特征在于所述重组质粒中，自上游至下游依次包括所述pheA蛋白的编码基因、所述aroD蛋白的编码基因、所述aroE蛋白的编码基因和所述talA蛋白的编码基因。
4.如权利要求I或2或3所述的重组菌，其特征在于所述出发载体为载体PBV220。
5.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述重组质粒为将所述pheA蛋白的编码基因插入所述载体PBV220的BglII酶切位点、所述aroD蛋白的编码基因插入所述载体 PBV220的EcoRI和BamHI酶切位点之间、所述aroE蛋白的编码基因插入所述载体pBV220 的BamHI和SacI酶切位点之间、所述talA蛋白的编码基因插入所述载体pBV220的SacI 酶切位点得到的重组质粒。
6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为大肠杆菌(Escherichia coli)MF0018，它的保藏编号为 CCTCC NO M 2012051。
7.权利要求I至6中任一所述的重组菌在生产L-苯丙氨酸中的应用。
8. 一种生产菌进行发酵，得到L-苯丙氨酸的方法，包括如下步骤将权利要求I至6中任一所述的重组_苯丙氨酸。
全文摘要
本发明公开了生产L-苯丙氨酸的工程菌及其应用。本发明提供了将重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌；所述重组质粒为将pheA蛋白的编码基因、aroD蛋白的编码基因、aroE蛋白的编码基因和talA蛋白的编码基因插入出发载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述大肠杆菌的CICC编号为10245；所述pheA蛋白如序列表的序列1所示；所述aroD蛋白如序列表的序列3所示；所述aroE蛋白如序列表的序列5所示；所述talA蛋白如序列表的序列7所示。本发明的提供的工程菌可直接发酵得到L-苯丙氨酸，发酵48小时后，发酵液中的L-苯丙氨酸含量高达75g/L，极具生产应用价值。
文档编号C12N1/21GK102604882SQ20121010211
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者吴伟斌, 吴松刚, 施巧琴, 林宜云, 翁雪清, 赵燕玉, 陈炳生, 黄祥峰, 黄维锦, 黄钦耿 申请人:福建省麦丹生物集团有限公司