专利名称：生产l-异亮氨酸的工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生产L-异亮氨酸的工程菌及其应用。
背景技术：
L-异亮氨酸(L-Ile)是人体八种必需氨基酸之一，又是三种支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。L-异亮氨酸对维持成人、婴儿、儿童的生长发育有重要作用，缺乏可导致骨骼肌萎缩和变形。L-异亮氨酸广泛应用于医药和食品领域，如果人体缺乏L-异亮氨酸，将导致食欲不振、体质下降、贫血及其它功能障碍。在医学领域，L-异亮氨酸主要用于一般营养型复合氨基酸输液、要素膳，大量用于配制治疗型特种氨基酸输液(如肝安、肾安氨基酸输液，特别是以L-异亮氨酸为主要原料生产的高支链氨基酸输液、肝安糖浆、肝灵口服液)，对治疗各种肝脏疾病具有显著疗效，其用量逐年增长。近年来L-异亮氨酸在运动食品行业也得到广泛关注，将L-异亮氨酸作为运动食品的添加剂，有助于增进肌肉的生长发育。L-异亮氨酸的主要生产方法有提取法、化学合成法、发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制、生产成本高、污染环境，难以实现工业化生产。微生物发酵法生产L-异亮氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产 L-异亮氨酸最主要的方法。直接发酵法借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过菌株的选育，以解除代谢调节中的反馈抑制和阻遏，达到过量积累L-异亮氨酸的目的，也是微生物发酵法当中工业应用最为广泛的。国际上，L-异亮氨酸目前合计年产量约达900 吨。鉴于生产的高难度，L-异亮氨酸一直是高价氨基酸。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产L-异亮氨酸的工程菌及其应用。本发明保护将重组质粒导入黄色短杆菌得到的重组菌；所述重组质粒为将ilvBN 蛋白(乙酰羟酸合成酶)的编码基因和11^^蛋白(抗终产物异亮氨酸反馈抑制的苏氨酸脱水酶)的编码基因的表达盒插入出发载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述黄色短杆菌的CICC编号为23655 ;所述ilvBN蛋白由多肽甲和多肽乙组成；所述多肽甲如序列表的序列I自N末端第I至562位氨基酸残基所示；所述多肽乙如序列表的序列I自N末端第 563至659位氨基酸残基所示；所述ilvAK蛋白如序列表的序列3所示。所述ilvBN蛋白的编码基因可如序列表的序列2自5’末端第I至1983位核苷酸所示；所述ilvAK蛋白的编码基因可如序列表的序列4自5’末端第191至1501位核苷酸所示。所述丨1￥^蛋白的编码基因的表达盒自上游至下游可依次包括T7启动子、所述 ilvAE蛋白的编码基因和T7终止子。所述T7启动子可如序列表的序列4自5’末端第I至 118位核苷酸所示。所述T7终止子可如序列表的序列4自5’末端第1581至1654位核苷酸所示。所述ilvAK蛋白的编码基因的表达盒具体可如序列表的序列4所示。
所述重组质粒中，自上游至下游可依次包括所述ilvBN蛋白的编码基因和所述 ilvAK蛋白的编码基因的表达盒。所述出发载体具体可为载体PXMJ19。所述重组质粒具体可为将所述iIvBN蛋白的编码基因插入所述载体pXMJ19的Pst I和BamHI酶切位点之间，所述ilvAK蛋白的编码基因的表达盒插入所述载体pXMJ19的 EcoRI酶切位点得到的重组质粒。所述重组菌为具体可为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)MFBF_04。黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)MFBF_04简称黄色短杆菌MFBF-04,已于2012年3月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC ;地址中国武汉，武汉大学；邮编430072)，保藏编号为 CCTCC NO M 2012050。以上任一所述重组菌均可用于生产L-异亮氨酸。本发明还保护一种生产L-异亮氨酸的方法，包括如下步骤将以上任一所述的重组菌进行发酵，得到L-异亮氨酸。所述发酵采用的发酵培养基的制备方法具体如下取150g葡萄糖、10g(NH4)2S04、
I.5g KH2PO4 3H20、3g K2HPO4 3H20、0. 5g MgSO4 7H20、0. 015g FeSO4 7H20、
0.015gMnS04 H20、130ug维生素H、lmg维生素BI、豆饼水解液和30g CaCO3用去离子水溶解并定容至IL ;所述豆饼水解液的制备方法为将20g豆饼磨粉，加SOOmL去离子水拌匀， 调PH值为4. 0，沸水浴煮6个小时，5000g离心lOmin，上清即为豆饼水解液。所述发酵培养基的pH具体可为7. 0-7. 2。所述发酵的条件可为30°C、溶氧50-70%、96小时。所述发酵过程中可通过补加葡萄糖控制发酵体系的葡萄糖含量为0. 7-1. 0g/100mL。所述发酵的条件还可为30°C振荡培养96小时所述重组菌具体可以以种子液的方式接种至所述发酵培养基。所述种子液是将所述重组菌接种至种子培养基进行培养得到的。所述种子液的OD6tltol具体可为28。所述培养的条件可为30°C、溶氧50-70%、14小时。所述培养的条件还可为30°C振荡培养。所述种子培养基的制备方法具体如下取30g蔗糖、2g尿素、3. 7g CH3COONH4^gKH2PO4 3H20、
0.4g MgSO4 7H20、0. Olg FeSO4 7H20、0. Olg MnSO4 H20、豆饼水解液、2mg 维生素 H 和 Img 维生素B2，用去离子水溶解并定容至IL ;所述豆饼水解液的制备方法为将16g豆饼磨粉， 加500mL去离子水拌匀，调pH值为4. 0，沸水浴煮6个小时，5000g离心lOmin，上清即为豆饼水解液。所述种子培养基的PH具体可为7. 0-7. 2。本发明的提供的工程菌可直接发酵得到L-异亮氨酸，发酵96小时后，发酵液中的 L-异亮氨酸含量高达45g/L，极具生产应用价值。
图I为重组质粒pMDilvAK的结构示意图。图2为载体pET28a的结构示意图。图3为重组质粒pETilvAK28a的结构示意图。图4为重组质粒pXMJ19_ilvBN的结构示意图。图5为重组质粒pXMJ19-ilvAKilvBN的结构示意图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)获自美国模式培养物集存库 (http://www. atcc. org/,简称 ATCC), ATCC 编号为 13032,简称谷氨酸棒杆菌 13032。黄色短杆菌(Brevibacterium fIavum)获自中国工业微生物菌种保藏管理中心 (www. china-cicc. org/,简称 CICC), CICC 编号为 23655,简称黄色短杆菌 23655。实施例I、重组表达载体的构建一、ilvA基因的克隆及定点突变I、以谷氨酸棒杆菌13032的基因组DNA为模板，用Fl和Rl组成的引物对进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物(ilvA基因片段)。Fl :5，-ATGAGTGAAACATACGTG-3，；Rl :5，-TTAGGTCAAGTATTCGTAC-3，。PCR扩增条件95°C预变性5分钟；94°C变性40秒、55°C退火I分钟、72°C延伸2 分钟，30个循环；72°C保温10分钟。2、回收步骤I的PCR扩增产物并插入载体pMD-18T (购自于宝生物工程(大连) 有限公司)，得到重组质粒pMDilvA。3、以步骤I的重组质粒pMDilvA为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增 (将ilvA基因片段进行定点突变，将定点突变后的基因命名为iIvAk基因)，得到PCR扩增产物(模板与突变后的环状质粒的混合物)。4、将步骤3的PCR扩增产物用DPN I酶处理I小时(去除模板)，得到重组质粒 pMDilvAE0根据测序结果，对重组质粒pMDilvAK进行结构描述如下在载体pMD_18T中插入了序列表的序列4自5’末端第191至1501位核苷酸所示的ilvAK基因。重组质粒pMDilvAK 的结构示意图见图I。ilvAK基因与野生型ilvA基因的差异仅在于第526位的核苷酸由G 突变为了 C(也就是序列4中的第716位核苷酸。)F2 :5，-GCAACACCGTCATC |丨 GTCAGGGCAC-3，；R2 :5， -GATGACGGTGTTGCGAGCATCGAAA-3，。二、重组质粒pETilvAK28a的构建I、用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切重组质粒pMDilvAK，回收约1300bp 的小片段。2、用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切载体pET28a(购自于宝生物工程 (大连)有限公司；结构示意图见图2)，回收约5300bp的载体骨架。3、将步骤I的小片段和步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒pETilvAK28a。根据测序结果，对重组质粒pETilvAK28a进行结构描述如下在载体pET28a的BamH I和Hind III酶切位点之间中插入了序列表的序列4自5’末端第191至1501位核苷酸所示的ilvAK 基因(编码序列表的序列3所不的ilvAR蛋白)。重组质粒pETilvAR28a的结构不意图见图3。三、重组质粒pXMJ19_ilvBN的构建I、以谷氨酸棒杆菌13032的基因组DNA为模板，用F3和R3组成的引物对进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物。F3 :5_’ GCCTGCAG ATGGCAAGITCGGGCA-3’ (下划线标注 Pst I 酶切识别序列)R3 :5_’ GGATCC TTACTGAAAAAACACCG-3’ (下划线标注 BamHI 酶切识别序列)。F3和R3的革E序列如序列表的序列2所不(序列表的序列2所不基因即为ilvBN 基因，编码序列表的序列I所不的ilvBN蛋白)。PCR扩增条件95°C预变性5分钟；94°C变性40秒、55°C退火I分钟、72°C延伸2 分钟，循环30次；72°C保温10分钟。2、用限制性内切酶Pst I和BamH I双酶切步骤I的PCR扩增产物，回收酶切产物。3、用限制性内切酶Pst I和BamH I双酶切载体pXMJ19 (购自于Biovector Science Lab, Inc),回收约6600bp的载体骨架。4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pXMJ19_ilvBN。 根据测序结果，对重组质粒pXMJ19-ilvBN进行结构描述如下在载体PXMJ19的Pst I和 BamH I酶切位点之间中插入了序列表的序列2所示的ilvBN基因(编码序列表的序列I所示的ilvBN蛋白)。重组质粒pXMJ19-ilvBN的结构示意图见图4。四、重组质粒pXMJ19-ilvAK_ilvBN 的构建I、以重组质粒pETilvAK28a为模板，用F4和R4组成的引物对进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物。F4:5' -GAATTC TTA ATA CGA CTC ACT ATA-3'(下划线标注 EcoR I 酶切识别序列)；R4 :5' -GAATTC CAA AAA ACC CCT CAA GAC CCG TTT AG~3/ (下划线标注 EcoR I酶切识别序列)。F4和R4的靶序列如序列表的序列4所示(序列4中自5’末端第I至118位核苷酸为17启动子、第191至1501位核苷酸为ilvAK基因、第1581至1654位核苷酸为17终止子。PCR扩增条件5°C预变性5分钟；94°C变性40秒、57°C退火I分钟、72°C延伸2分钟，循环25次；72°C保温10分钟。2、用限制性内切酶EcoR I酶切步骤I的PCR扩增产物，回收酶切产物。3、用限制性内切酶EcoR I酶切重组质粒pXMJ19_ilvBN，回收约9000bp的载体骨架。4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒 pXMJ19-i lvAE-i IvBN0根据测序结果，对重组质粒pXMJ19_ilvAK_ilvBN进行结构描述如下 在重组质粒pXMJ19-ilvBN的EcoR I酶切位点插入了序列表的序列4所示的DNA分子。重组质粒pXMJ19-ilvAK-ilvBN的结构示意图见图5。实施例2、工程菌的构建将重组质粒pXMJ19_iIvAk-HvBN电击转化黄色短杆菌23655原生质体，然后用F3 和R4组成的引物对进行PCR鉴定(显示约4. Ikb的特异条带的为PCR鉴定阳性)，得到重组菌。将一株重组菌命名为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)MFBF_04。黄色短杆菌 (Brevibacterium flavum)MFBF-04简称黄色短杆菌MFBF-04,已于2012年3月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC ;地址中国武汉，武汉大学；邮编430072)，保藏编号为 CCTCC NO M 2012050。实施例3、应用黄色短杆菌MFBF-04生产L-异亮氨酸一、培养基的制备种子培养基(pH= 7. 0-7. 2)取 30g 蔗糖、2g 尿素、3. 7g CH3COONH4'3g KH2PO4 · 3Η20、0· 4g MgSO4 · 7Η20、0· Olg FeSO4 · 7Η20、0· Olg MnSO4 ·Η20、豆饼水解液(将 16g 豆饼磨粉，加500mL去离子水拌匀，加入6mol/L的盐酸调pH值为4. 0，沸水浴蒸煮6个小时，5000g离心lOmin，上清即为豆饼水解液)、2mg维生素H和Img维生素B2，用去离子水溶解并定容至IL ;115°C灭菌15min。发酵培养基(pH= 7. 0-7. 2):取 150g 葡萄糖、IOg (NH4) 2S04、I. 5g KH2PO4.3H20、3g K2HPO4 · 3Η20、0· 5g MgSO4 · 7Η20、0· 015g FeSO4 · 7Η20、0· 015g MnSO4 · H20、130ug 维生素 Η、 Img维生素BI、豆饼水解液(将20g豆饼磨粉，加800mL去离子水拌匀，加入6mol/L的盐酸调PH值为4. O，沸水浴蒸煮6个小时，5000g离心lOmin，上清即为豆饼水解液)和30g CaCO3 用去离子水溶解并定容至IL ;115°C灭菌15min。二、摇瓶发酵生产L-异亮氨酸I、应用黄色短杆菌MFBF-04生产L-异亮氨酸(I)种子培养将一环黄色短杆菌MFBF-04斜面种子接种至装有30mL种子培养基的250mL摇瓶中，8层纱布封口，30°C振荡培养(200r/min)至对数生长中后期，得到种子液(种子液的 OD600rml = 28)。(2)发酵培养将3mL种子液接种至装有27mL发酵培养基的500mL三角瓶中，8层纱布封口，30°C 振荡培养(200r/min)96小时。(3)将步骤⑵的发酵体系离心(室温25°C、5000g、15min)，收集上清液(发酵液)。2、对照液的制备将黄色短杆菌23655代替黄色短杆菌MFBF-04进行步骤I的实验，收集上清液(对照液)。3、检测L-异亮氨酸含量检测发酵液或对照液中的L-异亮氨酸含量(采用日立L-8800型氨基酸自动分析仪进行测定)。发酵液中的L-异亮氨酸浓度为7g/L，对照液中的L-异亮氨酸浓度为O. 9g/L。三、工业发酵生产L-异亮氨酸将黄色短杆菌MFBF-04 (或黄色短杆菌23655)进行30L全自动发酵罐进行补料分批发酵，具体步骤如下I、第一阶段培养
采用30L发酵罐，种子培养基的装液量为20L，培养时间为14小时，溶氧 (DO) 50-70%，温度300C ;得到种子液(种子液的OD600nm = 28)。2、第二阶段培养采用30L发酵罐，发酵培养基的装液量为20L，培养时间为96小时(通过控制流加75 %的葡萄糖水溶液，维持发酵罐中的葡萄糖含量为0. 7-1. 0g/100mL)，溶氧 (DO) 50-70%，温度 30。。。3、将步骤2的发酵体系(4°C、5000g、15min)，收集上清液(发酵液)。黄色短杆菌MFBF-04发酵液中的L-异亮氨酸浓度为45g/L，黄色短杆菌23655发酵液中的L-异亮氨酸浓度为5g/L。
权利要求
1.将重组质粒导入黄色短杆菌得到的重组菌；所述重组质粒为将ilvBN蛋白的编码基因和ilvAK蛋白的编码基因的表达盒插入出发载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述黄色短杆菌的CICC编号为23655 ;所述ilvBN蛋白由多肽甲和多肽乙组成；所述多肽甲如序列表的序列I自N末端第I至562位氨基酸残基所示；所述多肽乙如序列表的序列I自N 末端第563至659位氨基酸残基所示；所述ilvAK蛋白如序列表的序列3所示。
2.如权利要求I所述的重组菌，其特征在于所述ilvBN蛋白的编码基因如序列表的序列2所示；所述ilvAK蛋白的编码基因如序列表的序列4自5’末端第191至1501位核苷酸所示。
3.如权利要求I或2所示的重组菌，其特征在于所述ilvAK蛋白的编码基因的表达盒自上游至下游依次包括T7启动子、所述ilvAK蛋白的编码基因和T7终止子。
4.如权利要求I至3中任一所述的方法，其特征在于所述重组质粒中，自上游至下游依次包括所述ilvBN蛋白的编码基因和所述ilvAK蛋白的编码基因的表达盒。
5.如权利要求I所述的重组菌，其特征在于所述出发载体为载体PXMJ19。
6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于所述重组质粒为将所述ilvBN蛋白的编码基因插入所述载体PXMJ19的Pst I和BamH I酶切位点之间，所述ilvAK蛋白的编码基因的表达盒插入所述载体PXMJ19的EcoR I酶切位点得到的重组质粒。
7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为黄色短杆菌 (Brevibacterium f lavum) MFBF-04，它的保藏编号为 CCTCC NO M 2012050。
8.权利要求I至7中任一所述的重组菌在生产L-异亮氨酸中的应用。
9. 一种生产L-菌进行发酵，得到L-异亮氨酸的方法，包括如下步骤 -异亮氨酸。:将权利要求I至7中任一所述的重组
全文摘要
本发明公开了一种生产L-异亮氨酸的工程菌及其应用。本发明提供了将重组质粒导入黄色短杆菌得到的重组菌；所述重组质粒为将ilvBN蛋白的编码基因和ilvAR蛋白的编码基因的表达盒插入出发载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述黄色短杆菌的CICC编号为23655；所述ilvBN蛋白如序列表的序列1所示；所述ilvAR蛋白如序列表的序列3所示。本发明的提供的工程菌可直接发酵得到L-异亮氨酸，发酵96小时后，发酵液中的L-异亮氨酸含量高达45g/L，极具生产应用价值。
文档编号C12N1/21GK102604881SQ201210101460
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者吴伟斌, 吴松刚, 施巧琴, 林宜云, 翁雪清, 赵燕玉, 陈炳生, 黄钦耿 申请人:福建省麦丹生物集团有限公司