一种采用鱼类转基因方法构建的基于鲤鱼mstn干涉载体及其构建方法
【专利摘要】一种采用鱼类转基因方法构建的基于鲤鱼MSTN干涉载体及其构建方法，它涉及一种基于鲤鱼MSTN干涉载体及其构建方法。本发明要解决传统基因敲出技术的投入大，群体大，耗时的问题。转基因供体质粒鲤鱼MSTN干涉载体(pzu6p-siMSTN)，包括鱼类启动子DNA序列和目的基因。该方法通过将真核表达载体PEGFP-C1的启动子进行改造，得到斑马鱼U6启动子的质粒pzu6p-siRNA，然后将干涉片段siMSTN与载体相连接，得到供体基因pzu6p-siMSTN(鲤鱼MSTN干涉载体)。本发明与传统的基因敲出技术相比，具有操作简单，投入少，效率高、特异性强、周期短等优点。
【专利说明】一种采用鱼类转基因方法构建的基于鲤鱼MSTN干涉载体 及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于鲤鱼MSTN干涉载体及其构建方法，具体涉及的转基因供体 质粒的构建方法，及其在养殖鱼类中的应用。本发明属于鱼类基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 随着基因组研究的不断深入和发展，越来越多的新基因得以成功克隆，对于从基 因组测序中所获得的大量未知基因功能的研究显得日益重要，这也是后基因组时代基因功 能研究的重要研究内容，也是一项复杂的系统工程。RNA干扰技术是近些年发展起来的一种 阻抑基因表达的新方法，是反映基因功能、表达调控、缺陷识别等重要手段。是通过人为地 引入与靶基因具有同源序列的dsRNA，诱导靶基因的mRNA降解，从而达到阻止基因表达、产 生"功能失活"的目的。因此，RNA干扰技术已成为一种强有力的工具，广泛应用于鱼类基因 功能研究中。
[0003] MSTN(肌肉生长抑制素）基因是动物肌肉生长发育的负调控基因，对myostatin基 因敲除或抑制其表达，都可以使动物的肌肉快速大量增长。动物肌肉发育不仅依靠激素调 节，而且某些组织特异性效应因子也影响肌肉的发育。肌肉生长抑制素是目前所知的最强 的肌肉生长抑制因子，它通过抑制成肌细胞的增值而发挥作用。抑制myostatin活性，使肌 纤维肥大，而肌肉是由肌纤维组成的，肌纤维就是肌细胞，肌纤维增大，肌纤维的直径和面 积大，肌纤维数量多，肌肉生长快，就会使肌肉不受限制的生长，达到改变鱼类肌肉质量和 重量的目的。在鱼类育种中，虽然分子辅助育种技术和基因敲出技术（反义核苷酸技术、基 因打靶技术等）等较传统的数量遗传育种都有较多的优点，但研究过程中投入大，群体大， 耗时、效率低等缺点也是有待解决的问题。RNA干扰技术已成为解决这些问题的重要手段。 与其它方法相比，RNA干扰技术在基因功能研究上具有简单易行、试验周期短、成本低、可进 行高通量基因功能分析及具有高度特异性等许多优点。为了解除MSTN基因对肌肉细胞的 抑制作用，本发明利用RNA干扰技术干扰MSTN mRNA的表达，来提高鱼类养殖品种肌肉含 量，改善肉质性状，促进鱼类养殖品种的生长。
[0004] 随着鲤鱼基因组测序工作完成，与先进的高通量、高灵敏度的转录组测序技术相 结合，将有望成为探索鱼类特定基因的功能、疾病致病机理及其防治的新途径。RNA干扰技 术能达到基因敲出的结果，从而成为研究这些基因功能的良好工具。目前广泛应用的RNAi 技术的靶标是mRNA，诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的，与传统的基 因敲出的费时费力相比较，RNA干扰技术是一种有效的研究工具，同时RNA干扰本身具有高 效、特异和传递性，它不仅可以抑制外培养细胞中目的单一基因的表达，也可以抑制体内目 的单一基因的表达。但是目前没有报道将此技术应用于鲤鱼的肉质性状改善方面。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了解决传统基因敲出技术的投入大，群体大，耗时的问题，而提 供了一种采用鱼类转基因方法构建的基于鲤鱼MSTN干涉载体及其构建方法。
[0006] 本发明的一种采用鱼类转基因方法构建的基于鲤鱼MSTN干涉载体，它包括骨架 载体和siMSTN干涉片段，所述的siMSTN干涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID No :1所 /_J、1 ο
[0007] 本发明的一种采用鱼类转基因方法构建基于鲤鱼MSTN干涉载体的方法，它是按 照以下步骤进行的：
[0008] 一、pzu6p_siRNA重组载体的构建
[0009] (1)提取斑马鱼尾鳍中的DNA ;
[0010] (2)根据斑马鱼U6启动子区域设计引物U6-1、U6-2和U6-3,然后以U6-1的上游 引物和U6-2下游引物为引物，以步骤一提取的DNA为模板，通过PCR，得到两端分别为asel 与bamhl酶切位点的U6启动子片段；其中，U6-1含有asel酶切位点，U6-2含有含有bamh-1 酶切位点，U6-3含有含有mlul酶切位点；
[0011] 其中，U6-1的序列：
[0012] 上游引物 5' GTCACAGAACTCATCCAATCACA3'
[0013] 下游引物 5' AACCTCTTCAGGGCAAACC3'，
[0014] U6-2 的序列：
[0015] 上游引物 5' CACAGAACTCATCCAATCACACT3'
[0016] 下游引物 5' CTTATTCAACTCATTTACCTCAAACA3'，
[0017] U6-3 的序列：
[0018] 上游引物 5' CGAGAGTCTGTGAATGTTTCG3'
[0019] 下游引物 5'CCAGCAGITTTGTGGAGGT3' ；
[0020] (3)以步骤⑵得到的U6启动子片段为模板，采用U6-1的上游引物和U6-3的下 游引物为引物，进行PCR，得到5 '端含有asel酶切位点、3'端含有bamhl和mlul酶切位点 的斑马鱼U6启动子片段；
[0021] (4)用限制性内切酶asel和mlul双酶切PEGFP-C1载体，并用限制性内切酶asel 和mlul双酶切步骤（3)获得的斑马鱼U6启动子片段，同过T4连接酶，将酶切后的PEGFP-C1 载体与酶切后的斑马鱼U6启动子片段进行连接，得连接产物；
[0022] (5)将步骤（4)得到的连接产物转化至toplO感受态细胞中，培养，挑取阳性克隆 菌落，进行PCR验证，筛选出验证为阳性的菌落，提取质粒，采用asel和mlul酶进行双酶切 验证，将验证为阳性的片段，进行测序，测序成功后的载体，即为pzu6p-siRNA重组载体；
[0023] 二、pzu6p_siMSTN重组载体的构建
[0024] (6)依据鲤鱼mstn基因的⑶S区，设计出MSTN干涉片段，MSTN干涉片段两端带有 bamhl和mlul酶切位点，将MSTN干涉片段连接到puc57载体上，构建得到puc57-siRNA重 组载体；其中，含有颈环结构的MSTN干涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID No :2所示；
[0025] (7)用限制性内切酶bamhl和mlul双酶切分别酶切步骤一构建的pzu6p-siRNA 重组载体以及puc57-siRNA重组载体，然后将酶切后回收得到的MSTN干涉片段与 pzu6p-siRNA重组载体采用T4连接酶连接；
[0026] (8)将上一步采用T4连接酶连接后的重组载体转化至toplO感受态细胞中，挑取 阳性克隆，进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆菌的质粒，进行bamhl和mlul双酶切鉴定，将 鉴定结果均为阳性的载体，命名为pzu6p-siMSTN重组载体，即完成基于鲤鱼MSTN干涉载体 载体的构建。
[0027] 本发明包含以下有益效果：
[0028] 本发明根据鲤鱼肌肉生长抑制素 myostation基因的RNA序列设计1个针对 myostation基因的siRNA序列：5'-CGCACCGCCTTTGCAACAA-3'，将其设计为中间连有9个碱 基loop环结构：5' -TTCAAGAGA-3'的发卡DNA序列，并在序列两端加入BamHl和Mlul酶切 位点，连入PEGFP-C1载体的斑马鱼U6启动子后，构建鲤鱼MSTN干涉载体（pzu6p-siMSTN)。 用人工合成的鲤鱼MSTN干涉载体通过显微注射技术将pzu6p-siMSTN基因导入野鲤受精卵 内，分析其生长发育结果。因此本发明旨在构建一种基于鲤鱼MSTN干涉载体的鱼类转基因 方法。借助于RNA干扰技术，采用通过抑制MSTN活性，提高养殖鱼类的肌肉含量，促进养殖 鱼类的生长。也进一步证实了转RNA干扰质粒技术是可行的育种技术之一。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1为鲤鱼mstn干涉片段序列图；
[0030] 图2为鲤鱼MSTN干涉载体pzu6p_siMSTN图；
[0031] 图3为转鲤MSTN基因干涉载体基因鲤PCR检测结果；其中，D为正常鱼电泳图；G 为供体基因电泳图；Μ为分子量；1-39为转基因鲤实验鱼电泳图；
[0032] 图4、转鲤MSTN基因干涉载体基因鲤产物凝胶测序结果。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0033] 一：本实施方式的一种采用鱼类转基因方法构建的基于鲤鱼MSTN 干涉载体，它包括骨架载体和siMSTN干涉片段，所述的siMSTN干涉片段的核苷酸序列如序 列表Seq ID No :1所示（大小为470bp)。
【具体实施方式】 [0034] 二：本实施方式与一的不同是：所述的siMSTN干涉片 段是由MSTN干涉片段通过其两端的bamh-1和mlul酶切位点分别与斑马鱼U6启动子和骨 架载体连接而成的；其中，斑马鱼U6启动子的核苷酸序列如序列表Seq ID No :2所示（大 小为400bp) ;MSTN干涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID N〇:3所示（大小为70bp)。其 它与一相同。
【具体实施方式】 [0035] 三：本实施方式与一或二的不同是：所述的MSTN干涉 片段为中间连有5'-TTCAAGAGA-3'碱基的发卡DNA序列，并在MSTN干涉片段序列两端加入 bamh-1和mlul酶切位点。其它与一或二相同。
【具体实施方式】 [0036] 四：本实施方式与一至三之一的不同是：所述的骨架 载体为pzu6p载体。其它与一至三之一相同。
【具体实施方式】 [0037] 五：本实施方式的一种采用鱼类转基因方法构建基于鲤鱼MSTN干 涉载体的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
[0038] 一、pzu6p_siRNA重组载体的构建
[0039] (1)提取斑马鱼尾鳍中的DNA ;
[0040] (2)根据斑马鱼U6启动子区域设计引物U6-1、U6-2和U6-3,然后以U6-1的上游 引物和U6-2下游引物为引物，以步骤一提取的DNA为模板，通过PCR，得到两端分别为asel 与bamhl酶切位点的U6启动子片段；其中，U6-1含有asel酶切位点，U6-2含有含有bamh-1 酶切位点，U6-3含有含有mlul酶切位点；
[0041] 其中，U6_1的序列：
[0042] 上游引物 5' GTCACAGAACTCATCCAATCACA3'
[0043] 下游引物 5' AACCTCTTCAGGGCAAACC3'，
[0044] U6-2 的序列：
[0045] 上游引物 5' CACAGAACTCATCCAATCACACT3'
[0046] 下游引物 5, CTTATTCAACTCATTTACCTCAAACA3,，
[0047] U6-3 的序列：
[0048] 上游引物 5' CGAGAGTCTGTGAATGTTTCG3'
[0049] 下游引物 5'CCAGCAGITTTGTGGAGGT3' ；
[0050] (3)以步骤⑵得到的U6启动子片段为模板，采用U6-1的上游引物和U6-3的下 游引物为引物，进行PCR，得到5 '端含有asel酶切位点、3'端含有bamhl和mlul酶切位点 的斑马鱼U6启动子片段；
[0051] (4)用限制性内切酶asel和mlul双酶切PEGFP-C1载体，并用限制性内切酶asel 和mlul双酶切步骤（3)获得的斑马鱼U6启动子片段，同过T4连接酶，将酶切后的PEGFP-C1 载体与酶切后的斑马鱼U6启动子片段进行连接，得连接产物；
[0052] (5)将步骤（4)得到的连接产物转化至toplO感受态细胞中，培养，挑取阳性克隆 菌落，进行PCR验证，筛选出验证为阳性的菌落，提取质粒，采用asel和mlul酶进行双酶切 验证，将验证为阳性的片段，进行测序，测序成功后的载体，即为pzu6p-siRNA重组载体；
[0053] 二、pzu6p-siMSTN重组载体的构建
[0054] (6)依据鲤鱼mstn基因的⑶S区，设计出MSTN干涉片段，MSTN干涉片段两端带有 bamhl和mlul酶切位点，将MSTN干涉片段连接到puc57载体上，构建得到puc57-siRNA重 组载体；其中，含有颈环结构的MSTN干涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID No :2所示；
[0055] (7)用限制性内切酶bamhl和mlul双酶切分别酶切步骤一构建的pzu6p-siRNA 重组载体以及puc57-siRNA重组载体，然后将酶切后回收得到的MSTN干涉片段与 pzu6p-siRNA重组载体采用T4连接酶连接；
[0056] (8)将上一步采用T4连接酶连接后的重组载体转化至toplO感受态细胞中，挑取 阳性克隆，进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆菌的质粒，进行bamhl和mlul双酶切鉴定，将 鉴定结果均为阳性的载体，命名为pzu6p-siMSTN重组载体，即完成基于鲤鱼MSTN干涉载体 载体的构建。
【具体实施方式】 [0057] 六：本实施方式与五不同的是：步骤（2)和（3)中所 述的？〇?反应程序为：941：预变性1〇1^11，941：变性3〇8,551：退火3〇8,721：延伸3〇8,30个 循环；循环后72°C延伸10min ;
[0058] PCR反应体系为25 μ L，成分如下：
[0059] 成分 川.Μ: 30?50ng/uL DNΑ 概板 I pL 10pmol4iL 引物 2pL 10XPCR buffer (10XPCR buffer ( fi Mg2' (25mmol/L) 18{iL ΙμΙ、dATP、dGTP、dTTP、dCTP 各 2mmol/L ) TaqDNA 聚爐 0.5pL 无眞水 4.5pL<>
[0060] 其它与【具体实施方式】五相同。
【具体实施方式】 [0061] 七：本实施方式与五或六不同的是：步骤（4)中限制 性内切酶asel和mlul双酶切的酶切反应条件为：37°C水浴酶切2小时，4°C保存备用；
[0062] 酶切体系为10 μ L，成分如下：
[0063] 戚分 用S 56ng/uL PEGFP-C1 载体 3,6pL asel 0,5 μ L mlul LOpL K) X Buffer LOpL dd H20 4,4μΕ〇
[0064] 其它与【具体实施方式】五或六相同。
【具体实施方式】 [0065] 八：本实施方式与五至七之一不同的是：步骤（4)中 的连接条件为：16°C循环水浴连接16h ;
[0066] 连接体系为10 μ L，成分如下：
[0067] 成分 PEGFP-C1 载体 LOpL 斑马鱼U6启动子片段 3.0pL T4 DNA m l'0pL 2xT4 Ligase Buffer 5.0μ?〇
[0068] 其它与【具体实施方式】五至七之一相同。
【具体实施方式】 [0069] 九：本实施方式与五至八之一不同的是：步骤（7)中 的限制性内切酶bamhl和mlul双酶切的酶切反应条件为：37°C水浴酶切2小时，4°C保存备 用；
[0070] 酶切体系为10 μ L，成分如下：
[0071] 成分 ）IJM: 54ng/uL ρζιι?ιρ-siRNA 我体 40pL bamh l 0.5μ? mini 1.0μ L 10X Buffer \Α)μΙ dd H2O 4.0pL〇
[0072] 其它与【具体实施方式】五至八之一相同。
【具体实施方式】 [0073] 十：本实施方式与五至九之一不同的是：步骤（8)的 PCR鉴定的PCR反应程序为：94°C预变性lOmin，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s， 38个循环；循环后72°C延伸lOmin ;
[0074] PCR反应体系为25 μ L，成分如下：
[0075] 成分 30?50ng/uL DNA 校板 IpL lOpmol/pL *J| 物 2pL 10 X PCR bufTcr ( !0 X PCR buffer (Mg21 (25mnioi/L) 18pL ?L、dATP、dGW、dTW、dCTP 各 2nimol/L ) TaqDNA 聚介_ 0.5μΙ AiW 水 4.5pL;
[0076] 其中，PCR所用的引物为siMSTN干涉片段引物，其序列为：
[0077] 上游引物：5' -CTGCGATTAATTCTTTAGCCTCCGAGAG-3'
[0078] 下游引物：5 ' -GCAAAGGCGGTGCGGGAT-3 '。
[0079] 其它与【具体实施方式】五至九之一相同。
【具体实施方式】 [0080] i^一 ：本实施方式与五至十之一不同的是：所述的 pzu6p-siMSTN重组载体中的siMSTN干涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID No :1所示。 其它与五至十之一相同。
[0081]
【具体实施方式】十二：本实施方式与【具体实施方式】五至i^一之一不同的是：所述的 siMSTN干涉片段是由MSTN干涉片段通过其两端的bamh-l和mlul酶切位点分别与斑马鱼 U6启动子和骨架载体连接而成的；其中，斑马鱼U6启动子的核苷酸序列如序列表Seq ID No :2所示；MSTN干涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID No :3所示。其它与具体实施方 式五至i 之一相同。
[0082]
【具体实施方式】十三：本实施方式与【具体实施方式】五至十二之一不同的是：所述的 MSTN干涉片段为中间连有5' -TTCAAGAGA-3'碱基的发卡DNA序列，并在MSTN干涉片段序 列两端加入bamh-l和mlul酶切位点。其它与【具体实施方式】五至十二之一相同。
[0083] 通过以下实施例验证本发明的有益效果：
[0084] 本实施例首先进行生物信息统计，针对物种的基因组进行RNA序列设计；然后根 据设计结果构建表达载体库；本实施例选取能够进行改造的的载体，最终选用了真核表达 载体 PEGFP-C1，长度 4. 7kb ;
[0085] 本实施例的一种采用鱼类转基因方法构建的基于鲤鱼MSTN干涉载体的方法，具 体操作步骤如下：
[0086] (l)pzu6p_siRNA重组载体的构建
[0087] 一、获取斑马鱼U6启动子，GenBank:FJ911603. 1，长度大小为414bp，用裂解法提 取斑马鱼尾鳍中的DNA，根据U6的启动子区域设计3条引物，分别命名U6-1U6-2U6-3,其中 通过U6-1中（含有asel酶切位点）与U6-2中（含有bamh-1酶切位点）从基因组DNA上 克隆U6启动子区域，斑马鱼U6启动子两端分别是asel与bamhl酶切位点；
[0088] 其中，U6-1的序列：
[0089] 上游引物 5' GTCACAGAACTCATCCAATCACA3'
[0090] 下游引物 5' AACCTCTTCAGGGCAAACC3'，
[0091] U6-2 的序列：
[0092] 上游引物 5' CACAGAACTCATCCAATCACACT3'
[0093] 下游引物 5' CTTATTCAACTCATTTACCTCAAACA3'，
[0094] U6-3 的序列：
[0095] 上游引物 5' CGAGAGTCTGTGAATGTTTCG3'
[0096] 下游引物 5'CCAGCAGITTTGTGGAGGT3' ；
[0097] PCR 反应程序为：94°C预变性 10min，94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 30s， 30个循环；循环后72°C延伸lOmin ;
[0098] PCR反应体系为25 μ L，成分如下：
[0099] 成分 IIJW 30?50ng/uL DNA 模板 .1 μι 10pmo〖4iL *j|物（U6-i 的 I:游和 U6-2 的 K游*j|物） 2pL lOXPCRlmffer (含 Mg2+-(25mmol/L》IjiL、dATP、dGTP、 18μ? dTTP, dCTP2 mmol/L ) TaqDNA 聚介Hi OJpL 无窗水 4·5μ[;
[0100] 二、以步骤一得到的U6启动子片段为模板，采用U6-1和U6-3为引物，进行二次 PCR，得到5 '端含有asel酶切位点、3'端含有bamhl和mlul酶切位点的斑马鱼U6启动子 片段；
[0101] PCR 反应程序为：94°C预变性 10min，94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 30s， 30个循环；循环后72°C延伸lOmin ;
[0102] PCR反应体系为25 μ L，成分如下：
[0103] 成分
[0104] 30......M')ng/uLDN..\ 模板 Ιμ? 10pmol~L引物（U6-1的上游和U6-3的下游引物） 2μ[ 10 X PCR buffer ( 10 X PCR bufFer ( -- Mg2' (25mmol/L) 1 Kj! i. lpL、dATP、dGTP、dTTP、dCTP 各 2mmol/L ) TaqDNA 聚浦 0.5μ? 尤菌水 4.5 μ?;
[0105] 三、用限制性内切酶asel和mlul双酶切PEGFP-C1载体，切除质粒上的CMV启动 子、egfp表达区域和sv40终止子后，获得3100bp的框架结构；并用限制性内切酶asel和 mlul双酶切上一步得到的5 '端asel酶切位点，3'端bamhl和mlul酶切位点的斑马鱼U6 启动子片段；获得带有asel和mlul粘性末端的启动子片段；通过T4DNA连接酶连接，得连 接产物；其中，限制性内切酶asel和mlul双酶切的酶切反应条件为：37°C水浴酶切2小时， 4 °C保存备用；
[0106] 酶切体系为10 μ L，成分如下：
[0107] 成分 用W: 56ng/uL PEGFP-C1 栽休 3.6μΙ asel O.SjtL mlul Ι.ΟμΙ 10 X Buffer Ι.Ομ? dd H2O 4A\ihi
[0108] 连接条件为：16°C循环水浴连接16h ;
[0109] 连接体系为10 μ L，成分如下：
[0110] 成分 丨 PEGFP-C1 钹体 1.0μΙ_ 斑.*§儀U6 )ι!动段 3.0μ? Τ4 DNA 酶 1,0 μ? 2xT4 Ligasc Buffer 5.0μ?；
[0111] 四、将上一步的连接产物转化进toplO感受态细胞中，铺板；挑取4个克隆菌液 PCR鉴定（图3)，片段大小正确，为400bp ;然后提取质粒，分别用asel和mlul双酶切，asel 和bamhl双酶切鉴定，经鉴定酶切片段大小正确；酶切条件和体系同上；
[0112] 其中，PCR验证的PCR反应程序为：94°C预变性10min，94°C变性30s，55°C退火 30s，72°C延伸30s，30个循环；循环后72°C延伸lOmin ;
[0113] PCR反应体系为25 μ L，成分如下：
[0114] 成分 用量 30?50ng/uL DNA 模扳 l|iL 10pmol/pL弓丨物（U6-1的上游和1)6-3的下游引物） 2μΙ 10 X PCR buffer ( 10 X PCR buffer (含 Mg:i (25mmol/L) 18μ? lpL, dATP, dGTP, dTTP, dCTP ^ 2 mmoi/L ) TaqDNA 聚屬 0J|iL 11 丨W 水 4.5pL:
[0115] (2) pzu6p_siMSTN重组载体的构建
[0116] 五、siRNA是作用在基因的⑶S区从而抑制基因的转录后翻译过程，因此设计 siRNA干涉片段需要从基因的⑶S区上寻找干涉片段，因此在鲤鱼mstn基因的⑶S区 (GenBank:GQ214770. 1)上通过金斯瑞公司的设计软件设计了一条含有颈环结构的MSTN干 涉片段长度为70bp，MSTN干涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID N〇:2所示；其含有bamhl 和mlul酶切位点；公司合成的MSTN干涉片段是构建在puc57载体上，命名为puc57-siRNA 重组载体；
[0117] 六、用限制性内切酶bamhl和mlul双酶切步骤五已经构建好pzu6p_siRNA重组 载体，将pzu6p-siRNA重组载体中切出了 bamhl和mlul的粘性末端，同样通过限制性内切 酶bamhl和mlul双酶切puc57-siRNA重组载体，得到MSTN干涉片段；将MSTN干涉片段与 pzu6p-siRNA用T4连接酶连接；其中，限制性内切酶asel和mlul双酶切的酶切体系和酶 切条件同上；连接体系和条件同上；
[0118] 七、将上一步T4连接酶连接的产物转化进toplO感受态细胞中，挑取克隆菌落，以 siMSTN干涉片段引物，进行菌液PCR，PCR鉴定为400bp，即为siMSTN干涉片段；表明已成 功将siMSTN干涉片段连接到pzu6p载体上；对PCR验证阳性的菌液提取质粒，进行酶切鉴 定，鉴定结果正确，表明构建成功，命名为pzu6p-siMSTN重组载体；
[0119] 其中，PCR验证的PCR反应程序为：94°C预变性10min，94°C变性30s，55°C退火 30s，72°C延伸30s，38个循环；循环后72°C延伸lOmin ;
[0120] PCR反应体系为25 μ L，成分如下：
[0121] 成分 川 30 ?50ng/uL DNA 棋板 1 μ?
[0122] lOpmol/.uL *J|物（siMSTN Γ-涉片段…物.） 2μΙ 10 X PCR buffer ( 10 X PCR buffer ( ',t Mg2* (25mmol/L) Ιμ?、dATP、dGTP、dTTP、dCTP 各 2mmol/L ) TaqDNA 聚介_ 0.5μ? iilW水 4.5μΙ_:
[0123] 其中，siMSTN干涉片段引物的序列为：
[0124] 上游引物：5 ' -CTGCGATTAATTCTTTAGCCTCCGAGAG-3 '
[0125] 下游引物：5 ' -GCAAAGGCGGTGCGGGAT-3 '。
[0126] 本实施例的siMSTN干涉片段是将siRNA干涉片段与U6启动子片段连接后形成 的。
[0127] 本实施例通过鲤鱼myostatin基因序列，构建了 RNA干扰质粒载体，为了确定鲤鱼 的myostatin双链RNA是否能够刺激鲤鱼的生长，将用人工合成的转蛋白抑素（Myostatin) RNAi质粒（pZU6p-siMSTN重组载体）通过显微注射技术导入鲤鱼受精卵核区附近，获得当 年转基因鲤鱼。
[0128] 结果显示，共导入野鲤受精卵1208粒。受精卵于23°C孵化培育，72h后孵化出膜， 获得实验鱼548尾，出苗率为45. 36% ;
[0129] 对获得的实验鱼经PCR和分子杂交检测，结果表明，PCR检测后，通过凝胶电泳检 测结果显示片段大小在400bp，表明外源基因进入了部分受体鱼的基因组内；其中，PCR检 测的引物为siMSTN干涉片段引物；在所测定的40尾实验鱼中，有13?16尾显示出明确的 杂交带，阳性率为32. 5?40%，表明均有良好的扩增结果；
[0130] 将上步凝胶检测后的片段回收（Biospin胶回收试剂盒），进行测序，通过测序结 果，进一步确定了供体基因在受体鱼中的正确性；
[0131] 经一龄鱼的生长实验表明，转基因鲤比普通鲤平均体重重49. 6 %，其体高和体厚 分别平均增长18 %和20%。
[0132] 本
【发明内容】
不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个【具体实施方式】的组 合同样也可以实现发明的目的。
【权利要求】
1. 一种采用鱼类转基因方法构建的基于鲤鱼MSTN干涉载体，其特征在于它包括骨架 载体和siMSTN干涉片段，所述的siMSTN干涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID No :1所 /Jn 〇
2. 根据权利要求1所述的一种采用鱼类转基因方法构建的基于鲤鱼MSTN干涉载体，其 特征在于所述的siMSTN干涉片段是由MSTN干涉片段通过其两端的bamh-1和mlul酶切位 点分别与斑马鱼U6启动子和骨架载体连接而成的；其中，斑马鱼U6启动子的核苷酸序列如 序列表Seq ID No :2所不；MSTN干涉片段的核昔酸序列如序列表Seq ID No :3所不。
3. 根据权利要求1所述的一种采用鱼类转基因方法构建的基于鲤鱼MSTN干涉载体， 其特征在于所述的MSTN干涉片段为中间连有5'-TTCAAGAGA-3'碱基的发卡DNA序列，并在 MSTN干涉片段序列两端加入bamh-1和mlul酶切位点。
4. 根据权利要求1所述的一种采用鱼类转基因方法构建的基于鲤鱼MSTN干涉载体，其 特征在于所述的骨架载体为pzu6p载体。
5. -种采用鱼类转基因方法构建基于鲤鱼MSTN干涉载体的方法，其特征在于它是按 照以下步骤进行的： 一、 pzu6p-siRNA重组载体的构建 (1) 提取斑马鱼尾鳍中的DNA ; (2) 根据斑马鱼U6启动子区域设计引物U6-1、U6-2和U6-3,然后以U6-1的上游引物 和U6-2下游引物为引物，以步骤一提取的DNA为模板，通过PCR，得到两端分别为asel与 bamhl酶切位点的U6启动子片段；其中，U6-1含有asel酶切位点，U6-2含有含有bamh-1 酶切位点，U6-3含有含有mlul酶切位点； 其中，U6-1的序列： 上游引物 5' GTCACAGAACTCATCCAATCACA3' 下游引物 5' AACCTCTTCAGGGCAAACC3'， U6-2的序列： 上游引物 5' CACAGAACTCATCCAATCACACT3' 下游引物 5' CTTATTCAACTCATTTACCTCAAACA3'， U6-3的序列： 上游引物 5' CGAGAGTCTGTGAATGTTTCG3' 下游引物 5' CCAGCAGITTTGTGGAGGT3' ； (3) 以步骤（2)得到的U6启动子片段为模板，采用U6-1的上游引物和U6-3的下游引 物为引物，进行PCR，得到5 '端含有asel酶切位点、3'端含有bamhl和mlul酶切位点的斑 马鱼U6启动子片段； ⑷用限制性内切酶asel和mlul双酶切PEGFP-Cl载体，并用限制性内切酶asel和 mlul双酶切步骤（3)获得的斑马鱼U6启动子片段，同过T4连接酶，将酶切后的PEGFP-Cl 载体与酶切后的斑马鱼U6启动子片段进行连接，得连接产物； (5)将步骤（4)得到的连接产物转化至toplO感受态细胞中，培养，挑取阳性克隆菌落， 进行PCR验证，筛选出验证为阳性的菌落，提取质粒，采用asel和mlul酶进行双酶切验证， 将验证为阳性的片段，进行测序，测序成功后的载体，即为pzu6p-siRNA重组载体； 二、 pzu6p_siMSTN重组载体的构建 (6) 依据鲤鱼mstn基因的⑶S区，设计出MSTN干涉片段，MSTN干涉片段两端带有bamhl 和mlul酶切位点，将MSTN干涉片段连接到puc57载体上，构建得到puc57-siRNA重组载体； 其中，含有颈环结构的MSTN干涉片段的核苷酸序列如序列表Seq ID No :2所示； (7) 用限制性内切酶bamhl和mlul双酶切分别酶切步骤一构建的pzu6p-siRNA重组 载体以及puc57-siRNA重组载体，然后将酶切后回收得到的MSTN干涉片段与pzu6p-siRNA 重组载体采用T4连接酶连接； (8) 将上一步采用T4连接酶连接后的重组载体转化至toplO感受态细胞中，挑取阳性 克隆，进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆菌的质粒，进行bamh 1和mlu 1双酶切鉴定，将鉴定 结果均为阳性的载体，命名为pzu6p-siMSTN重组载体，即完成基于鲤鱼MSTN干涉载体载体 的构建。
6. 根据权利要求5所述的一种采用鱼类转基因方法构建基于鲤鱼MSTN干涉载体的方 法，其特征在于步骤（2)和（3)中所述的PCR反应程序为：94°C预变性10min，94°C变性30s， 55°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环；循环后72°C延伸IOmin ; PCR反应体系为25 μ L，成分如下：
7. 根据权利要求5所述的一种采用鱼类转基因方法构建基于鲤鱼MSTN干涉载体的方 法，其特征在于步骤（4)中限制性内切酶asel和mlul双酶切的酶切反应条件为：37°C水浴 酶切2小时，4°C保存备用； 酶切体系为10 μ L，成分如下：
8. 根据权利要求5所述的一种采用鱼类转基因方法构建基于鲤鱼MSTN干涉载体的方 法，其特征在于步骤（4)中的连接条件为：16°C循环水浴连接16h ; 连接体系为lOuL,成分如下：
9. 根据权利要求5所述的一种采用鱼类转基因方法构建基于鲤鱼MSTN干涉载体的方 法，其特征在于步骤（7)中的限制性内切酶bamhl和mlul双酶切的酶切反应条件为：37°C 水浴酶切2小时，4°C保存备用； 酶切体系为10 μ L，成分如下：
10. 根据权利要求5所述的一种采用鱼类转基因方法构建基于鲤鱼MSTN干涉载体的方 法，其特征在于步骤（8)的PCR鉴定的PCR反应程序为：94°C预变性10min，94°C变性30s， 55°C退火30s，72°C延伸30s，38个循环；循环后72°C延伸IOmin ; PCR反应体系为25 μ L，成分如下：
其中，PCR所用的引物为siMSTN干涉片段引物，其序列为： 上游引物：5 ' -CTGCGATTAATTCTTTAGCCTCCGAGAG-3 ' 下游引物：5' -GCAAAGGCGGTGCGGGAT-3'。
【文档编号】C12N15/63GK104232670SQ201410421731
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月25日 优先权日:2014年8月25日
【发明者】闫学春, 曹顶臣, 何立川 申请人:中国水产科学研究院黑龙江水产研究所