一种exosomes装载的miR‑93‑5p在治疗类风湿性关节炎中的应用的制作方法

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种exosomes装载的mir-93-5p在治疗类风湿性关节炎中的应用，具体涉及粒细胞样髓源性抑制细胞来源exosomes装载的mir-93-5p在治疗类风湿性关节炎中的应用。

背景技术：

类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，ra)是一种病因不明的慢性进行性并累及全身多系统的自身免疫性疾病，病理特征表现多为手、足小关节对称性的滑膜慢性炎症，其造成的身体危害，严重影响人类生产和生活。ra的确切发病机制不明，免疫学与流行病上的研究认为与遗传、激素、环境、病毒感染等因素有关。目前对其治疗的主要目的在于减轻关节的炎症，抑制疾病的发展，尽可能保护关节和降低疾病的活动度。临床上对于ra的治疗主要包括药物治疗和免疫学治疗。药物治疗主要包括非甾体类药物、抗风湿类药物、糖皮质激素等，但药物带来的毒副作用较多，影响肝肾代谢功能，容易产生药物依赖，此外激素类药物可导致患者胃肠不良反应、向心性肥胖、免疫力低下、骨质疏松等。免疫学治疗主要包括免疫净化和生物靶向药物治疗，其中免疫净化可以去除类风湿性关节炎患者血中自身抗体、免疫复合物和免疫球蛋白等，但治疗成本高、操作复杂，创伤较大。生物靶向药物主要包括tnf-α拮抗剂和针对ra炎症分子的生物制剂，这些药物具有快速抑制炎症反应，修复已损伤关节的作用，但价格十分昂贵，并且存在导致潜伏结核感染的患者结核病复燃，肝损伤，罹患肿瘤等风险。另外针对ra炎症分子的生物制剂包括il-1受体拮抗剂和il-6受体拮抗剂等。传统药物治疗带来极大的毒副作用，目前免疫学治疗方法相对单一且价格昂贵，对于ra的治疗仍然有很多需要研究和改进之处。

已有研究者发现一类新的cd4⁺辅助性t细胞，由此细胞亚群特异性分泌il-17而被称为辅助t细胞17型(helpertcelltype17,th17)，它还可以分泌il-6、tnf-α等细胞因子，il-17和th17细胞在ra及其动物模型的发病中发挥重要作用。

近年来相关研究表明mdscs在自身免疫性疾病的治疗方面有巨大的潜能，已有实验利用mdscs治疗小鼠胶原诱导性关节炎(collagen-inducedarthritis，cia)，并取得一定疗效；但是，由于mdscs来源不足、储存不便及成分复杂等缺点限制了其应用。髓源性抑制细胞(myeloidderivedsuppressorcells,mdsc)是骨髓来源的异质性细胞群体，在小鼠中，mdsc是gr-1(由ly6g和ly6c组成)和cd11b双阳性的细胞，根据细胞形态及ly6g、ly6c的表达量的高低，又将mdsc分为两个亚型：cd11b⁺ly6g⁺ly6c^low粒细胞样mdsc(g-mdsc)和cd11b⁺ly6g^-ly6c^hi单核细胞样mdsc(m-mdsc)，其中g-mdscs主要通过精氨酸酶1(arginine1，arg-1)和活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)来抑制t细胞的活化和增殖，m-mdsc则主要通过arg-1和一氧化氮来发挥抑制作用。

有研究表明g-mdsc来源的exosomes(g-exosomes)对于炎症性肠病模型小鼠和cia模型小鼠均有保护作用，exosomes是由细胞内吞系统产生的具有生物活性的囊泡，exosomes内包裹各种脂质、蛋白质、核酸，并能将其携带的物质运输至受体细胞而发挥生物学作用。目前exosomes的应用主要包括药物载体和疾病诊断，以exosomes作为药物转运载体，相对于目前的脂质体载体和聚合物载体具有免疫原性低、运输效率高、稳定性好、靶向性强及跨越血脑屏障的优点，目前以exosomes作为载体的药物主要有基因类药物(sirna、mrna、mirna)和抗癌类药物(阿霉素、紫杉醇等)以及增强免疫的抗原等。由于不同疾病下不同细胞分泌的exosomes含有不同的核酸、蛋白成分，所以分析从病人体液中分离的exosomes所包含的成分可以作为疾病诊断的依据。越来越多的研究表明exosomes在自身免疫性疾病的炎症发生过程中起到重要作用，但是g-mdsc来源的exosomes成分复杂，其具体作用机制仍不清楚。

较多研究表明exosomes携带的mirna具有抑制t细胞增殖分化的作用，例如treg细胞来源exosomes携带的let-7d可以抑制th1细胞介导的炎症反应，并且在体内减轻炎症性肠病小鼠模型的疾病严重程度(okoyeis,coomessm,pellyvs,cziesos,papayannopoulosv,tolmachovat,etal.microrna-containingt-regulatory-cell-derivedexosomessuppresspathogenicthelper1cells[j].immunity.2014,41(1):89-103.)。微小rna(microrna，mirna)是一系列长度为18～22核苷酸的非编码小rna，它们主要是通过与靶基因的3’非翻译区(3’-utr)特异性结合，抑制其靶基因的翻译或诱导其mrna的降解，从而抑制靶标蛋白的表达。

根据g-exosomes的结构和功能特性，利用其装载的mirna应用于ra的治疗，可达到“安全性高、靶向性强”的目的，具有良好的临床应用前景，有望在维持机体免疫平衡方面发挥积极作用，为ra的治疗提供一种全新的治疗途径。本发明对g-exosomes中mirna进行人工干预，过表达后能显著提高应用效果，以获得具有更佳治疗效果的g-exosomes。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种过表达mir-93-5p的g-exosomes的制备方法及其在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。

为达到上述目的，本发明采取的技术手段如下：

本发明首先提供一种mir-93-5p在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。

本发明还提供一种mir-93-5p的筛选方法。

本发明还提供一种过表达mir-93-5p的g-exosomes的制备方法。

本发明还提供一种治疗类风湿性关节炎的药物，所述药物包含过表达mir-93-5p的g-exosomes。

具体的，采用的技术方案如下：

本发明首先分离提取m-mdsc和g-mdsc，然后提取鉴定这两种细胞所分泌的exosomes(g-exosomes和m-exosomes)，通过实验验证g-exosomes和m-exosomes对于cia模型小鼠发病的影响，结果表明，g-exosomes具有抑制cia模型小鼠的发病的作用，通过g-exosomes和m-exosomes对th17细胞进行处理，进一步表明，g-exosomes可以抑制th17细胞的分化，进而减轻小鼠发病，而m-exosomes没有明显的抑制作用。

对g-exosomes和m-exosomes进行mirna的提取测序分析，筛选出在g-exosomes和m-exosomes中含量相差的差值绝对值较大的前二十个mirna；进一步根据mirna的结构和功能特性进行筛选，筛选出9个可能对ra产生作用的mirna，分别为：mir-16-5p、mir-29a-3p、mir-93-5p、mir-22-3p、mir-26b-5p、let-7f-5p、let7g-5p、mir-221-3p、mir-92a-3p。

根据筛选出的9个mirna序列设计引物，通过qrt-pcr检测9个mirna在g-exosomes处理后的th17细胞中表达量的变化，结果筛选出g-exosomes处理后的th17细胞中表达量增加最大3个mirna为mir-16-5p、mir-29a-3p、mir-93-5p。

将筛选出的3个mirna(mir-16-5p、mir-29a-3p、mir-93-5p)相对应的mimics和mimics-阴性对照转染初始t细胞，并诱导分化th17细胞，通过qrt-pcr检测，结果显示mir-93-5p可以抑制初始t细胞向th17细胞的分化，也表明g-exosomes可能是通过其装载携带的mir-93-5p抑制th17细胞的分化。

进一步通过转染mimics和inhibors的g-mdsc，制备过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes，并通过体外实验证明，过表达mir-93-5p的g-exosomes相对于原有g-exosomes更加明显的抑制了th17细胞的分化；而阻断mir-93-5p的g-exosomes则失去了原有g-exosomes对th17细胞分化的抑制作用。结果表明g-exosomes携带的mir-93-5p体外抑制th17的分化，本发明制备的过表达mir-93-5p的g-exosomes相对于原有的g-exosomes对th17细胞分化的抑制能力更强。

本发明通过研究过表达和阻断mir-93-5p的g-exosomes对于cia模型小鼠发病的作用，发现过表达mir-93-5p的g-exosomes相对于原有g-exosomes对cia小鼠的保护作用更强了，而阻断mir-93-5p的g-exosomes则失去了原有g-exosomes对cia小鼠发病的抑制作用。结果表明g-exosomes携带的mir-93-5p减轻cia模型小鼠的发病，本发明制备的过表达mir-93-5p的g-exosomes相对于原有的g-exosomes对cia模型小鼠的保护作用更强。

本发明发现g-exosomes装载的mir-93-5p可以在体内外抑制相应受体细胞靶标蛋白stat3的表达，以此发挥对th17细胞分化的抑制作用。

本发明的优点

(1)本发明首次发现g-exosomes携带的mir-93-5p可以通过抑制th17细胞的分化减轻cia模型小鼠的发病，为ra的治疗提供了新的方法。

(2)本发明制备过表达mir-93-5p的g-exosomes的方法耗时短，操作方便，所含成分活性稳定，-80℃保存时间达1年以上；室温下结构及活性成分也稳定，有利于临床上的应用。

(3)本发明中制备的过表达mir-93-5p的g-exosomes相对于普通g-exosomes具有更强的抑制th17细胞分化以及缓解cia模型小鼠疾病严重程度的作用。

(4)本发明中g-exosomes装载的mir-93-5p可以在体内外抑制相应受体细胞靶标蛋白stat3的表达，作用靶点明确。

(5)以exosomes作为药物转运载体具有免疫原性低、运输效率高、稳定性好、吸收快、靶向性强的优点，本发明制备的过表达mir-93-5p的g-exosomes相对于现有治疗ra药物，具有无毒副作用，不影响正常肝肾代谢功能，制备过程简便，所需成本低的优势，此外本发明制备的过表达mir-93-5p的g-exosomes，药物作用机制明确，利于药物疗效的监测。

附图说明

图1为本发明分选制备的g-mdsc和m-mdsc的纯度鉴定结果，其中a为g-mdsc，b为m-mdsc。

图2为本发明分选制备的g-exosomes和m-exosomes的透射电镜图，其中a为g-exosomes，b为m-exosomes。

图3为本发明分选制备的g-exosomes和m-exosomes的粒径大小频数分布图，其中a为g-exosomes，b为m-exosomes。

图4为westemblot检测g-exosomes和m-exosomes的标志性蛋白表达结果。

图5为g-exosomes和m-exosomes对cia模型小鼠发病过程中平均关节炎指数的影响结果。

图6为g-exosomes和m-exosomes对cia模型小鼠足趾肿胀程度的影响结果。

图7为g-exosomes和m-exosomes体外对于th17细胞分化的影响结果，图中a为磷酸盐缓冲液对照组th17细胞比例；b为n-exosomes处理组th17细胞比例；c为m-exosomes处理组th17细胞比例；d为g-exosomes处理组th17细胞比例。

图8为g-exosomes和m-exosomes装载的mirna含量差值的绝对值排前20位的mirna。

图9为g-exosomes处理的th17细胞中mirna表达量的变化结果。

图10为转染了相应mimics到初始t细胞后，诱导分化的th17细胞中mir-93-5p、mir-16-5p、mir-29a-3p的表达量变化结果。

图11为转染了mir-93-5p、mir-16-5p、mir-29a-3p相应mimics到初始t细胞后，对诱导分化th17细胞的影响结果，图中a为mimics-阴性对照组th17细胞比例；b为mir-16-5p-mimics处理组th17细胞比例；c为mir-29a-3p-mimics处理组th17细胞比例；d为mir-93-5p-mimics处理组th17细胞比例。

图12为将mir-93-5p的mimics或者inhibitors转染到g-mdsc后对其表达mir-93-5p的影响。

图13为将mir-93-5p的mimics或者inhibitors转染到g-mdsc后，g-exosomes表达mir-93-5p的表达量结果图。

图14为过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes对th17细胞分化的影响结果,图中a为阴性对照组th17细胞比例，b为磷酸盐缓冲液对照组th17细胞比例，c为g-exosomes处理组th17细胞比例，d为mimics-nc处理组th17细胞比例，e为mimic处理组th17细胞比例，f为inhibitors-nc处理组th17细胞比例,g为inhibitors处理组th17细胞比例。

图15为过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes对th17诱导体系中细胞中mir-93-5p的表达量。

图16为过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes对cia模型小鼠关节炎指数的影响程度。

图17为过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes对cia模型小鼠足趾肿胀的影响程度直观图片。

图18为过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes处理cia模型小鼠后足趾的he染色切片结果，其中a为pbs缓冲液组，b为g-exosomes组，c为mimics-nc-exosomes组，d为mimics-exosomes组，e为inhibors-nc-exosomes组，f为inhibors-exosomes组。

图19为过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes处理cia模型小鼠后腘窝淋巴结细胞中th17细胞比例的流式结果。

图20为过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes对cia模型小鼠引流淋巴结cd4⁺t细胞中mir-93-5p表达量的结果。

图21为mir-93-5p与stat3的可能结合位点。

图22为过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes对th17诱导体系中细胞总stat3的表达量，其中，a为westernblot检测结果，b为统计分析图。

图23为过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes对cia模型小鼠引流淋巴结cd4⁺t细胞总stat3的表达量，其中，a为westernblot检测结果，b为统计分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1：g-mdsc和m-mdsc的提取及鉴定

(1)构建荷瘤小鼠模型：使用含有10％小牛血清(购于美国gibco公司)、ph7.3的dmem培养液培养(购于美国gibco公司)，37℃、5％co2条件下培养小鼠lewis肺腺癌细胞系(购于上海生命科学院)。在培养过程中密切观察细胞的形态、贴壁情况、密度、培养液颜色变化，待细胞生长至密度达到培养皿底部的85％左右时，用0.25％的胰酶(购于博士德生物工程有限公司)消化并传代。取对数生长期lewis细胞，按每只小鼠右腹部皮下注射3.0×10⁶个细胞的方法，对6-8周龄雄性c57bl/6小鼠(购于江苏大学实验动物中心)进行移植瘤的构建，模型构建过程中密切观察小鼠生活状态和肿瘤大小。

(2)分离荷瘤小鼠脾细胞：在lewis细胞注射给小鼠后的第30天，眼球取血并颈部脱臼处死小鼠，在用75％酒精浸泡小鼠5min后，超净台中解剖小鼠获取脾脏；使用0.22μm孔径的筛网过滤研磨后的脾脏，用pbs(磷酸盐缓冲液)冲洗，收集悬液在4℃、500g条件下离心5min，弃上清；在沉淀的细胞中加入5mlack红细胞裂解液(acklysisbuffer，ack)(上海锐谷生物科技有限公司)，混匀后，裂解红细胞5min；加含有10％小牛血清的rpmi-1640培养液(美国gibco公司)至10ml，混匀后在4℃、500g条件下离心5min，弃上清；在细胞重悬至10ml时留取少量细胞显微镜下计数。

(3)磁珠分选g-mdsc：每10⁸个脾细胞用350μlpbe重悬，加入50μl的fcrblockingreagent(德国美天旎公司)，混匀后置于冰上孵育10min；每10⁸个脾细胞加入40μl的anti-ly-6gbiotin(德国美天旎公司)，混匀后置于冰上孵育30min，每10min混匀一次；加入10mlpbe，混匀后将悬液在4℃、500g离心5min，弃上清；每10⁸个脾细胞加入50μlanti-ly-6g-biotinbeads(德国美天旎公司)，混匀后置于冰上孵育30min，每10min混匀一次；加入10mlpbe，混匀后将悬液在4℃、500g条件下离心5min，弃上清；加入500μlpbe，混匀；将macs分选柱装在variomacs分选器(德国美天旎公司)上，加3mlpbe润洗1次后加入脾细胞悬液，待最后一滴细胞悬液流出后，再用3mlpbe洗涤分选柱，重复3次；从分选器上撤出分选柱，将分选柱置于10ml离心管上，加入5ml预冷的pbe，推动活塞，压出分离柱中的细胞，重复1次，得到10ml的细胞悬液，即为g-mdsc，留取少量显微镜下计数。

(4)磁珠分选m-mdsc：收集分选g-mdsc时分选柱流出的细胞悬液，4℃、500g条件下离心5min，弃上清；每10⁸个脾细胞加入40μl的anti-gr-1biotin(德国美天旎公司)，混匀后置于冰上孵育30min，每10min混匀一次；加入10ml的pbe，混匀后4℃、500g离心5min，弃上清；每10⁸个脾细胞加入50μl的anti-gr-1-biotinbeads(德国美天旎公司)，混匀后置于冰上孵育30min，每10min混匀一次；加入10ml的pbe，混匀后4℃、500g条件下离心5min，弃上清；加入500μl的pbe，混匀；将macs分选柱装在分选器(德国美天旎公司)上，加3ml的pbe润洗1次，然后加入上述待分选细胞悬液，待最后一滴流尽，再加入3ml的pbe洗涤分选柱，重复3次；撤出分选柱置于10ml离心管上，加入5ml的pbe，推动活塞，压出柱中细胞，重复1次，得到10ml的细胞悬液，即为m-mdsc，留取少量显微镜下计数。

(5)g-mdsc和m-mdsc的纯度鉴定：分别取步骤(4)和步骤(5)得到的g-mdsc1×10⁶个和m-mdsc1×10⁶个于ep管中，1ml的pbs重悬，在4℃、500g条件下离心5min，弃上清后剩余约100μl的pbs；混匀后在g-mdsc的ep管中加0.5μl的抗ly-6g抗体(美国ebioscience公司)和0.5μl的抗cd11b抗体(美国ebioscience公司)，m-mdsc的ep管加0.5μl的抗ly-6c抗体(美国ebioscience公司)和0.5μl的抗cd11b抗体(美国ebioscience公司)；分别在4℃孵育30min；1ml的pbs重悬后4℃、500g条件下离心5min，弃上清，加200μl的pbs重悬，流式细胞仪(美国bd公司)检测。结果如图1所示，本发明中得到的g-mdsc纯度为97.6％，m-mdsc纯度为95.3％。

实施例2：g-exosomes和m-exosomes的提取及蛋白浓度测定

(1)将分选的g-mdsc和m-mdsc分别重悬于含10％小牛血清(美国gibco公司，血清经过4℃、100000g离心16h处理后，留取血清上层2/3，去除血清中外泌体)的rpmi-1640培养液(美国gibco公司)中，以每孔1.5×10⁶个细胞，以及每孔1ml的体积种于24孔板；在37℃、5％co2的条件下培养24小时后，收集培养上清。

(2)将收集的g-mdsc和m-mdsc的培养上清在4℃、300g条件下离心20min，收集上清；再将上清4℃、1000g离心30min，收取上清；再将上清4℃、10000g离心30min，收取上清；将上清加入到100kda超滤管(德国milipore公司)中，4℃、1000g离心30min，收取管中浓缩液。

(3)通过exoquick-tc^tmexosome试剂盒(美国sbi公司)提取exosomes：将浓缩液与exoquick-tc^tmexosome试剂按体积比5:1混合，轻微混匀，4℃冰箱内静置16h以上；在4℃、1000g条件下离心30min，弃去上清，收集沉淀物，即为g-exosomes或m-exosomes。将制备获得的exosomes用pbs溶解，分装至ep管中，-80℃保存。

(4)exosomes的溶解液与等体积的裂解液(ripa:pmsf＝250:1)混匀后，冰上放置1小时，期间每10min在震荡器上震荡1min；4℃、12000g离心15min，收集上清。按bca微量蛋白定量试剂盒(北京康为世纪有限公司)说明书的方法检测exosomes裂解上清中的蛋白浓度，以确定提取exosomes的含量。结果显示，本发明中得到的每个g-mdsc或m-mdsc在培养24h后可以提取约3×10^-6μg的exosomes。

实施例3：g-exosomes和m-exosomes的鉴定

(1)透射电镜观察g-exosomes的形态：取20μlg-exosomes或m-exosomes悬液滴加于直径3mm的载样铜网上，室温静置2min；用滤纸轻轻吸干液体，滴加ph6.8的2％磷钨酸溶液(上海君瑞科技有限公司)于铜网上，复染lmin；滤纸吸干染液，白炽灯下烤干，透射电镜(荷兰飞利浦公司)下观察，结果如图2所示，透射电子显微镜下观察到g-exosomes和m-exosomes为圆形或椭圆形的微囊结构，有完整包膜，腔内为低电子密度成分；图3分别为g-exosomes和m-exosomes的粒径大小频数分布，结果显示g-exosomes和m-exosomes的粒径主要分布在20-120nm之间。

(2)westernblot检测g-exosomes和m-exosomes包含的蛋白分子cd9、cd63和线粒体包含的钙联蛋白分子calnexin：配制5％的浓缩胶和12％分离胶，用ripa蛋白裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)裂解g-exosomes和m-exosomes，将裂解后的g-exosomes按250μg蛋白总量上样，经100v恒压电泳后；再经350ma恒流电转90min后，5％脱脂牛奶封闭pvdf膜lh；用抗cd63单克隆抗体(美国ebioscience公司)和抗calnexin单克隆抗体(美国ebioscience公司)4℃孵育过夜；取出后用tbs/t(上海经科化学科技有限公司)洗膜，10min×3次，用辣根过氧化物酶标记的二抗(美国ebioscience公司)37℃孵育30min；取出后用tbs/t(上海经科化学科技有限公司)洗膜，10min×3次；imagequantlas4000凝胶成像系统(美国ge公司)曝光显色，结果如图4所示，g-exosomes、m-exosomes特异性高表达cd9、cd63分子，但g-exosomes和m-exosomes不包含定位在细胞内质网膜上的钙联蛋白。鉴于提取的g-exosomes和m-exosomes的形态、大小、蛋白分子表达结果，证明本实施例成功提取了g-exosomes和m-exosomes。

实施例4：实验证明g-exosomes和m-exosomes的免疫抑制功能

(1)构建cia模型小鼠：

第一次免疫：用2mg/ml的牛二型胶原(美国sigma公司)与2mg/ml的弗氏完全佐剂(美国赛默飞公司)等体积混合，冰上研磨至油包水状态；对每只dba/1小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)尾根部皮下注射0.1ml的上述混合液；

第二次免疫：用2mg/ml的牛二型胶原(美国sigma公司)与2mg/ml的弗氏不完全佐剂(美国赛默飞公司)等体积混合，冰上研磨至油包水状态，在第一次免疫后的第21天对每只dba/1小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)尾根部皮下注射0.1ml的上述混合液。

(2)制备小鼠成熟中性粒细胞来源的exosomes(n-exosomes)：

对6-8周龄雄性c57bl/6小鼠(江苏大学实验动物中心)摘除眼球取血，滴加到含有edta-na2的抗凝采血管(苏州灵岩医疗器械有限公司)中，1000rpm离心眼球血10min，吸出血浆，用500μl的pbs重悬血细胞。将1ml的单个核淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限公司)加到10ml容量的玻璃试管中，将血细胞悬液沿管壁缓缓滴加到玻璃试管中，使用水平离心机，4℃、2000rpm离心15min。用吸管自上而下缓缓吸取除红细胞层外的其他细胞层并弃去，加入5mlack(上海锐谷生物科技有限公司)，吹打混匀,室温静置5min，加入5ml的含有10％小牛血清的rpmi1640培养液(美国gibico公司)终止裂解，混匀后4℃，500g离心5min。弃上清，用10mlpbe洗涤2次，得到中性粒细胞。然后按照实施例2中方法提取n-exosomes。

(3)实验分组：

pbs对照组：分别在第一次免疫后的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射pbs100μl；

n-exosomes组：分别在第一次免疫后的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射100μlpbs溶解的n-exosomes，其中100μlpbs溶解100μgn-exosomes；

g-exosomes组：分别在第一次免疫后的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射100μlpbs溶解的g-exosomes，其中100μlpbs溶解100μgg-exosomes；

m-exosomes组：分别在第一次免疫后的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注100μlpbs溶解的m-exosomes，其中100μlpbs溶解100μgm-exosomes。

(4)在第二次免疫后每3天对各组小鼠的足趾情况进行监测，记录每只小鼠的关节炎分数(arthriticscore,as),as代表每只小鼠所有病变关节分数的总和，而各关节病变分数采用5级评分法，无红肿得0分，关节红而不肿得1分，关节轻度红肿得2分，关节中度红肿得3分，关节重度红肿并伴有功能障碍得4分。计算各组小鼠的平均关节炎指数(meanarthriticindex,mai)，mai由各组小鼠as的总和除以各组小鼠的个数。如图5所示，g-exosomes处理组小鼠的平均关节炎指数相对n-exosomes处理组降低了，而pbs缓冲液、n-exosomes、m-exosomes处理组之间无明显差异；图6表示g-exosomes处理组小鼠的足趾只有轻度的红肿，关节活动正常；然而pbs缓冲液、n-exosomes、m-exosomes处理组小鼠的足趾大多红肿明显，关节活动受限，这些结果表明g-exosomes具有抑制cia模型小鼠发病的作用，而m-exosomes没有明显抑制cia模型小鼠发病的作用。

(5)建立th17细胞诱导分化体系：用含有2μg/ml抗小鼠cd3单克隆抗体(美国ebioscience公司)的包被液200μl包被24孔圆底培养板，4℃过夜；吸出各孔中的包被液，pbs洗涤1次，通过德国美天旎公司的初始t细胞分选试剂盒分选出初始t细胞，按每孔1.5×10⁶个细胞的密度将初始t细胞接种于24孔板，每孔总体积为1ml；各孔加入终浓度为2μg/ml的抗小鼠cd28单克隆抗体(美国ebioscience公司)、终浓度为5ng/ml的小鼠重组tgf-β(美国ebioscience公司)、终浓度为30ng/ml的il-6(美国ebioscience公司)、终浓度为30ng/ml的il-23(美国ebioscience公司)、终浓度为5μg/ml的anti-il-4(美国ebioscience公司)、终浓度为5μg/ml的anti-ifn-γ(美国ebioscience公司)；用含15％胎牛血清(美国gibico公司，经过100000g离心16h处理)、ph7.2-7.4的rpmi-1640细胞培养液(美国gibico公司)，37℃、5％co2条件下培养72h。

(6)实验分组：对照组：加入100μl的pbs作为对照；其余组各孔加入终浓度为60μg/ml的n-exosomes、g-exosomes和m-exosomes，如图7所示，g-exosomes处理组th17细胞的比例相对n-exosomes处理组降低了，而pbs缓冲液、n-exosomes、m-exosomes处理组之间无明显差异。这些结果表明g-exosomes相比m-exosomes在cia模型小鼠中起到减轻小鼠发病的作用，体外抑制th17细胞的分化，g-exosomes相对m-exosomes而言展现出更强大的免疫抑制功能。

实施例5：g-exosomes和m-exosomes中mirna的测序结果及分析

(1)委托广州锐博公司对g-exosomes和m-exosomes中携带的mirna进行提取测序分析，本领域技术人员公知g-exosomes和m-exosomes包含许多特定的mirna，并且在表达量上存在一定差异。根据测序结果分析，结合targetscan网站上相关mirna的信息，确定mirna的类别；如图8所示，g-exosomes和m-exosomes包含的相关mirna含量差值的绝对值前二十位为mir-148a-3p(mimat0000516)、mir-340-5p(mimat0004651)、mir-16-5p(mimat0000527)、mir-22-3p(mimat0000531)、mir-27a-3p(mimat0000537)、mir-92a-3p(mimat0000539)、mir-140-3p(mimat0000152)、mir-27b-3p(mimat0000126)、mir-24-3p(mimat0000219)、mir-26b-5p(mimat0000534)、mir-423-3p(mimat0000516)、let-7f-5p(mimat0000525)、mir-29a-3p(mimat0000535)、mir-7a-5p(mimat0000677)、mir-140-5p(mimat0000151)、let7g-5p(mimat0000121)、mir-26a-5p(mimat0000533)、mir-221-3p(mimat0000669)、mir-93-5p(mimat0000540)、mir-148b-3p(mimat0000580)，括号内编号为根据mirbase网站分析对应的编号信息，并以它们作为待筛选mirna。

(2)本发明对待筛选mirna进一步筛选，由于mir-16-5p、mir-29a-3p、mir-93-5p、let7g-5p与骨关节炎的发展和成骨细胞的增殖、分化、迁移相关；mir-22-3p和mir-26b-5p参与ra的发病；mir-29a-3p、mir-93-5p、mir-221-3p与t细胞增殖、分化、免疫应答等有关；mir-16-5p、mir-29a-3p、let-7f-5p、mir-92a-3p的潜在靶标smad7、smad6、fos、pik3r1、stat3、emos、pik3r1等与t细胞的增殖分化密切相关。由此本发明进一步筛选出mir-16-5p、mir-29a-3p、mir-93-5p、mir-22-3p、mir-26b-5p、let-7f-5p、let7g-5p、mir-221-3p、mir-92a-3p作为候选mirna。

(3)检测候选mirna在g-exosomes处理后th17诱导细胞中表达量的倍数变化：收集实施例4步骤(6)中对照组与加g-exosomes处理的th17诱导细胞，用1ml的trizol(美国invitrogen公司)将1×10⁶个th17诱导细胞溶解，用移液器充分吹打混匀，加入预冷氯仿(上海化学试剂公司)200μl，立即震荡15～30s，常温静置10min；在4℃条件下，12000g离心15min；ep管中液体出现分层，吸取上层水相层(含有rna)至新的干净ep管中，加入500μl的异丙醇，使用移液器轻轻混匀，常温静置5～10min；在4℃条件下，12000g离心15min，此时rna沉于管底，呈半透明状；弃去上清，加1ml的75％乙醇(上海化学试剂公司)洗涤；在4℃条件下，7800g离心5min；室温置于超净台中吹干至rna呈半透明状；加5μl的depc(上海碧云天有限公司)水溶解；用美国赛默飞检测仪检测rna的浓度。

(4)按照日本takara逆转录试剂盒要求对步骤(3)中提取的rna进行逆转录，根据mirna序列设计引物，然后委托广州锐博公司合成mir-16-5p、mir-29a-3p、mir-93-5p、mir-22-3p、mir-26b-5p、let-7f-5p、let7g-5p、mir-221-3p、mir-92a-3p的前后向引物，通过上海bio-rad公司购买的qrt-pcr试剂盒检测候选mirna在g-exosomes处理后th17诱导细胞中的表达量变化，结果如图9所示，g-exosomes处理后th17诱导分化细胞中，候选mirna的表达量增加最大的是mir-16-5p、mir-29a-3p和mir-93-5p。

(5)通过entrancetm-r转染试剂(北京engreen公司)将mir-16-5p、mir-29a-3p和mir-93-5p的mimics和mimics-阴性对照(广州锐博生物科技有限公司)分别转染到实施例4步骤(5)分选出的初始t细胞，然后按照实施例4中方法诱导分化为th17细胞，通过qrt-pcr检测，结果如图10，转染mimics的th17细胞中mir-16-5p、mir-29a-3p和mir-93-5p表达量相应提高；如图11，转染了mir-93-5p的mimics的初始t细胞向th17细胞分化的比例明显低于转染了mimics-阴性对照的初始t细胞，而转染了mir-16-5p对应mimics和mir-29a-3p对应mimics的初始t细胞则没有明显变化。这些结果表明，外源性的mir-93-5p可以抑制初始t细胞向th17细胞的分化，这提示g-exosomes可能通过其携带的mir-93-5p抑制th17细胞的分化。

实施例6：制备过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes

(1)将mir-93-5p的mimics、mimics-阴性对照(mimics-negitivecontrol,mimics-nc)以及inhibitors、inhibitors-阴性对照(inhibitors-negitivecontrol,inhibitors-nc)的冻干粉(广州锐博生物科技有限公司)离心后，用无菌depc水溶解，吹打混匀成终浓度为20μm的储存液，分装保存于-80℃冰箱；

(2)接种细胞，在24孔板中每孔接种1×10⁶个g-mdsc，用10％小牛血清的rpmi1640培养液(美国gibico公司)补足体系为450μl；

(3)mimics、mimics-nc以及inhibitors、inhibitors-nc稀释液的制备：取干净的ep管，分别加入mimics和mimics-nc50nm，再分别加入1.25μl的mimics或mimics-nc的储存液，然后用无血清的rpmi1640培养液(美国gibico公司)补足至25μl；再取干净的ep管，分别加入inhibitors和inhibitors-nc100nm，再分别加入2.5μl的inhibitors、inhibitors-nc的储存液，然后用无血清的rpmi1640培养液(美国gibico公司)补足至25μl；

(4)entrancetm-r转染试剂稀释液的制备：取一个干净ep管，加入相应量的entrancetm-r转染试剂(北京engreen公司)，根据mimics、mimics-nc、inhibitors、inhibitors-nc的量控制转染试剂的用量，每50nm加入1μl转染试剂，然后用无血清的1640培养基(美国gibico公司)补足至25μl，室温静置5min；

(5)转染复合物的制备：将entrancetm-r转染试剂(北京engreen公司)稀释液加入到相应mimics、mimics-nc或者inhibitors、inhibitors-nc稀释液中，然后立即充分混匀，室温静置30min；

(6)将50μl的转染复合物滴加到步骤(2)中的接种细胞中，轻轻混匀；

(7)转染6个小时后观察细胞状态，如果细胞状态佳，则离心收集g-mdsc；

(8)按照实施例2中方法利用转染了mimics或者inhibitors的g-mdsc制备过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes。

实施例7：验证过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes

(1)收集实施例6步骤(6)中各处理组1×10⁶个g-mdsc，按照实施例5步骤(3)中的方法提取各处理组g-mdsc的总rna，并检测其浓度；

(2)按照实施例5中的方法对各处理组g-mdsc的mir-93-5p的含量进行荧光定量检测，结果如图12所示mir-93-5p的mimics或者inhibitors成功转染到了g-mdsc。

(3)收集实施例6步骤(8)中各处理组每3×10⁷个g-mdsc分泌的g-exosomes，用1ml的trizol(美国invitrogen公司)溶解。

(4)按照实施例5中操作方法对各组g-exosomes包含的mir-93-5p进行定量分析，如图13所示转染了mir-93-5p的mimics的g-mdsc分泌的g-exosomes中相对于mimics-nc组mir-93-5p的表达量显著提高(p<0.01)，而转染了mir-93-5p的inhibitors的g-mdsc分泌的g-exosomes中相对于inhibitors-nc组mir-93-5p的表达量降低了(p<0.05)。这些结果说明本实施例成功提取了过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes，本实施例中制备的过表达mir-93-5p的g-exosomes相对于原有的g-exosomes相比，mir-93-5p的含量大约增加了15倍。

实施例8：g-exosomes装载的mir-93-5p可以体外抑制th17细胞的分化

(1)在th17细胞诱导分化体系中加入60μg/ml过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes，如图14所示，过表达mir-93-5p的g-exosomes处理组(转染mimics组)相对于mimics-nc组th17细胞的比例明显降低了(p<0.01)，而阻断mir-93-5p的g-exosomes处理组(转染inhibitors组)相对于inhibitors-nc组th17细胞的比例增高了(p<0.05)。这些结果表明g-exosomes携带的mir-93-5p可以体外抑制th17细胞的分化，并且过表达mir-93-5p的g-exosomes对于th17细胞分化的抑制能力更强。本实施例中过表达mir-93-5p的g-exosomes相对于原有的g-exosomes相比对于th17细胞分化的抑制能力更强，th17细胞的比例减少了一倍。

(2)根据实施例5中操作方法检测过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes处理后th17诱导体系中细胞的mir-93-5p的表达量，如图15所示，过表达mir-93-5p的g-exosomes处理组与mimics-nc组相比较，可以使诱导细胞mir-93-5p表达水平明显提高(p<0.01)，阻断mir-93-5p的g-exosomes处理组mir-93-5p表达水平相对于inhibitors-nc组则显著降低了(p<0.001)。这些结果说明g-exosomes可以将其携带的mir-93-5p传递到受体细胞，从而发挥抑制功能，并且本发明制备的过表达mir-93-5p的g-exosomes传递mir-93-5p的效率更高。

实施例9：g-exosomes装载的mir-93-5p可以更加有效的抑制cia模型小鼠的发病，缓解疾病的严重程度

(1)利用实施例4中构建的cia模型小鼠；

(2)在第一次免疫后第18天和第24天对cia模型小鼠进行尾静脉注射过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes。

(3)实验分组：

pbs缓冲液组：分别在免疫的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射pbs100μl；

g-exosomes组：分别在免疫的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射100μl的pbs溶解的g-exosomes；

mimics-nc-exosomes组：分别在免疫的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射100μlpbs溶解的转染mimic-nc后g-mdsc分泌的g-exosomes；

mimics-exosomes组：分别在免疫的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射100μl的pbs溶解的转染mimic后g-mdsc分泌的g-exosomes；

inhibitors-nc-exosomes组：分别在免疫的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射100μl的pbs溶解的转染inhibitors-nc后g-mdsc分泌的g-exosomes；

inhibitors-exosomes组：分别在免疫的第18天和24天对每只小鼠尾静脉注射100μl的pbs溶解的转染inhibitors后g-mdsc分泌的g-exosomes。

上述各组中，100μlpbs中溶解100μg不同处理组的g-exosomes。

(4)如图16所示，mimics-exosomes处理组小鼠的平均关节炎指数相对mimics-nc-exosomes处理组明显降低(p<0.05)，inhibitors-exosomes处理组小鼠的平均关节炎指数相对inhibitors-nc-exosomes处理组显著升高(p<0.01)。如图17所示，g-exosomes、mimics-nc-exosomes、mimics-exosomes、inhibitors-nc-exosomes组小鼠的足趾只有轻度的红肿，关节活动正常；然而pbs缓冲液组、inhibitors-exosomes组小鼠的足趾大多红肿明显，关节活动受限。如图18所示，g-exosomes、mimics-nc-exosomes、mimics-exosomes、inhibitors-nc-exosomes组小鼠的足趾关节处骨结构相对完整，关节间隙相对正常，少有炎症性细胞浸润；然而pbs缓冲液组、inhibitors-exosomes组小鼠的足趾关节处骨结构遭到严重破坏，关节间隙减小，有大量炎症性细胞浸润。这些结果表明g-exosomes携带的mir-93-5p可以抑制cia模型小鼠的发病，缓解疾病的严重程度，并且过表达mir-93-5p的g-exosomes对cia模型小鼠具有更强的保护作用。

本实施例中过表达mir-93-5p的g-exosomes相对于原有的g-exosomes相比对于cia小鼠的保护作用更强，相对于原有的g-exosomes，过表达mir-93-5p的g-exosomes处理小鼠的平均关节炎指数下降了接近一倍，足趾肿胀程度明显减轻，关节结构更加完整。

(5)分离各组小鼠腘窝淋巴结，制备单细胞悬液，如图19所示流式细胞术分析各组小鼠腘窝淋巴结细胞中th17细胞比例，mimics-exosomes处理组小鼠的腘窝淋巴结细胞中th17细胞比例相对于mimics-nc-exosomes处理组显著降低(p<0.01)，inhibitors-exosomes处理组相对于inhibitors-nc-exosomes处理组th17细胞比例显著升高(p<0.001)，另外pbs处理组与mimics-nc-exosomes处理组或者inhibitors-nc-exosomes处理组相比无明显差异(p>0.05)。如图20所示qrt-pcr检测各组小鼠引流淋巴结cd4⁺t细胞mir-93-5p的表达量，mimics-exosomes处理组小鼠引流淋巴结cd4⁺t细胞mir-93-5p的表达量相对于mimics-nc-exosomes处理组显著升高(p<0.01)，inhibitors-exosomes处理组相对于inhibitors-nc-exosomes处理组mir-93-5p的表达量明显降低(p<0.01)，另外pbs缓冲液组与mimics-nc-exosomes处理组或者inhibitors-nc-exosomes处理组相比无明显差异(p>0.05)。这些结果说明g-exosomes可以通过运输mir-93-5p到受体细胞，抑制cia模型小鼠引流淋巴结致病性th17细胞的比例，缓解疾病的严重程度，并且本发明制备的过表达mir-93-5p的g-exosomes具有更高的运输mir-93-5p的效率，对于cia模型小鼠的保护作用也更强。

本实施例中过表达mir-93-5p的g-exosomes相对于原有的g-exosomes相比对于cia小鼠的保护作用更强，相对于原有的g-exosomes，过表达mir-93-5p的g-exosomes处理小鼠腘窝淋巴结细胞中th17细胞的比例下降了一倍，致病性th17细胞比例的减少对于抑制cia小鼠的发病至关重要。

实施例10：g-exosomes装载的mir-93-5p可以降低靶标蛋白stat3的表达

(1)根据targetscan网站分析，如图21所示，mir-93-5p可以与靶标基因stat3的3’utr区域的248-254、495-501两个区域特异性结合。

(2)收集过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes处理后th17诱导体系中的细胞，westernblot检测各处理组细胞stat3的表达水平，如图22所示，过表达mir-93-5p的g-exosomes处理组相对于mimics-nc组stat3的表达水平降低了(p<0.05)，而阻断mir-93-5p的g-exosomes处理组相对于inhibitors-nc组stat3的表达水平增高了(p<0.05)。这些结果表明g-exosomes携带的mir-93-5p可以抑制受体细胞stat3的表达，从而抑制th17细胞的分化，本发明制备的过表达mir-93-5p的g-exosomes具有更强的抑制靶标蛋白stat3表达的作用，从而发挥更强的免疫抑制功能。本发明制备的过表达mir-93-5p的g-exosomes具有更强的抑制靶标蛋白stat3表达的作用，相对于原有g-exosomes相比，stat3表达水平下降了一倍，从而发挥更强的抑制th17细胞分化的功能。

(3)收集过表达或阻断mir-93-5p的g-exosomes处理后cia模型小鼠引流淋巴结cd4⁺t细胞，westernblot检测各处理组细胞stat3的表达水平，如图23所示，过表达mir-93-5p的g-exosomes处理组相对于mimics-nc组stat3的表达水平明显降低了(p<0.01)，而阻断mir-93-5p的g-exosomes处理组相对于inhibitorss-nc组stat3的表达水平增高了(p<0.05)。这些结果说明g-exosomes携带的mir-93-5p可以在cia模型小鼠体内外降低受体细胞靶标蛋白stat3的表达，并且本发明制备的过表达mir-93-5p的g-exosomes具有更强的抑制靶标蛋白stat3表达的能力，从而对cia模型小鼠发挥更强的保护作用。本发明制备的过表达mir-93-5p的g-exosomes具有更强的抑制靶标蛋白stat3表达的能力，相对于原有g-exosomes相比，stat3表达水平下降了近2倍，从而对cia模型小鼠发挥更强的保护作用。