酵母多糖在制备防护急性放射性骨髓损伤药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体地说，是酵母多糖或其衍生物在制备防护急性放射性骨髓损伤药物中的应用，以及含有酵母多糖或其衍生物的药物组合物。

背景技术：

目前，核工业、核能与核辐射技术已经广泛用于国民经济、军事领域和医疗领域，核与辐射的广泛应用，使得放射工作人员和公众受到核辐射损伤的几率大大增加，核辐射损伤及防护也受到学界及公众越来越多的关注。在受到大剂量电离辐射之后，暴露人员可发生急性放射病，其中急性放射性骨髓损伤(又称骨髓型急性放射病)因其发生率高、难预防而日益受到关注。

急性放射性骨髓损伤的发生机制主要为：高能射线的电离作用通过直接作用和间接作用作用于细胞内生物大分子如dna、蛋白质等，导致骨髓造血系统出血，血窦破坏，骨髓细胞死亡，进而导致白细胞数减少、感染、出血等临床表现。

目前对于急性放射性骨髓损伤的防护药物主要为氧自由基清除剂(如w2721)，抗炎药物(如糖皮质激素)，细胞因子类(如g-csf)。但这些药物由于副毒作用较大、缺乏特异性，限制了其在临床中的广泛应用。因此，找到一种新型有效、毒副作用小、特异性强的核辐射防护药物，是目前放射生物学和放射医学研究的重点和难点。

酵母多糖(zymosan-a，cas号：58856-93-2)提取自酵母真菌细胞壁，研究证明其为tlr2(toll-likereceptor2)配体(参见文献：lijt,wangwq,wangl,liunn,zhaoyl,zhuxs,liuqq,gaocf,yangag,jialt:subanestheticisofluranerelieveszymosan-inducedneutrophilinflammatoryresponsebytargetingnmdaglutamatereceptorandtoll-likereceptor2signaling.oncotarget2016；7:31772-31789.)。对于酵母多糖的研究主要集中在其可以激活机体免疫系统，增强机体免疫力。既往研究发现，tlr2信号通路的激活可以促进nf-κb核转位，上调多种细胞因子，发挥其对急性放射性骨髓损伤的防护(参见文献：gaof,zhangc,zhouc,sunw,liux,zhangp,hanj,xianl,baid,liuh,chengy,lib,cuij,caij,liuc:acriticalroleoftoll-likereceptor2(tlr2)andits'invivoligandsinradio-resistance.scirep2015；5:13004.)

目前尚未有文献报道酵母多糖通过激活tlr2信号通路发挥急性放射性骨髓损伤防护的作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种酵母多糖或其衍生物的新的医药用途，以及含有酵母多糖或其衍生物的药物组合物。

本发明的第一方面，提供酵母多糖或其衍生物在制备防护急性放射性骨髓损伤药物中的应用。

进一步，所述的防护急性放射性骨髓损伤药物为减轻电离辐射引起的骨髓造血系统破坏程度，减少照后细胞凋亡率，提高照后细胞增殖活力的药物。更进一步，所述的减轻电离辐射引起的骨髓造血系统破坏程度的药物为减少骨髓造血系统出血、骨髓结构破坏的药物。

进一步，所述的防护急性放射性骨髓损伤药物为靶向激活tlr2的药物。由前所述可知，tlr2信号通路的激活可以促进nf-κb核转位，上调多种细胞因子发挥辐射防护作用。

本发明中的酵母多糖及其衍生物指的是能够发挥药理作用的酵母多糖化合物，为由β-1，3糖苷键连接而成的葡聚糖聚合物。

为了验证酵母多糖对于急性放射性骨髓损伤的防护效果，及其是否通过tlr2信号通路发挥辐射防护作用，本发明通过对小鼠体内实验和细胞学的体外实验两个方面验证了酵母多糖对小鼠骨髓造血系统和人淋巴b细胞ahh-1、人小肠上皮细胞hiec的辐射防护作用。

对于小鼠体内实验选择c57/bl6，8周龄的雄性野生型小鼠进行实验，照射前24小时和照射前2小时予以小鼠腹腔注射酵母多糖(25mg/kg/次)。防护小鼠的照射方式为单次全身照射，照射剂量为7.0gy，剂量率为1gy/min，照射源采用⁶⁰coγ射线；对tlr2敲除型小鼠照射前24小时和照射前2小时予以小鼠腹腔注射酵母多糖(25mg/kg/次)。防护小鼠的照射方式为单次全身照射，照射剂量为6.0gy，剂量率为1gy/min，照射源采用⁶⁰coγ射线；对于细胞学的体外实验，照射前12小时和照前2小时，40ug/ml的酵母多糖处理hiec和ahh-1细胞，防护的hiec和ahh-1细胞所接受的照射剂量梯度为4.0gy、8.0gy，剂量率1gy/min，照射源采用⁶⁰coγ射线。

通过实验发现，小鼠照前给药能明显减轻照射引起的野生型小鼠骨髓出血、血窦破坏，并保护骨髓有核细胞数，减少骨髓有核细胞的凋亡，并加快骨髓损伤修复；通过tlr2敲除型小鼠实验证实酵母多糖通过靶向激活tlr2发挥辐射防护作用；对hiec和ahh-1进行实验，照射能诱导细胞发生凋亡、抑制细胞增殖，而照前给药能减少细胞照后凋亡率，改善增殖抑制情况。说明照前运用酵母多糖能减轻小鼠急性放射性骨髓损伤，保护骨髓内有核细胞，加快照后骨髓造血系统的恢复。

进一步，所述的防护急性放射性骨髓损伤药物是酵母多糖或其衍生物作为唯一活性成份或者是包含酵母多糖或其衍生物的药物组合物。

所述的药物或药物组合物可以和药学上常用的辅料制成任何剂型，例如其可以是汤剂、散剂、丸剂、酒剂、锭剂、胶剂、膏药、茶剂、曲剂、糕剂、露剂、棒剂、线剂、条剂、钉剂，灸熨剂，膏剂、丹剂、微型胶囊、静脉乳剂、脂质体制剂、气雾剂、前体药制剂、注射剂、合剂、口服安瓿剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、乳剂、软膏剂、橡胶硬膏、膜剂、海绵剂、离子透入剂，或透皮吸收剂。

本发明的第二方面，提供一种防护急性放射性骨髓损伤的药物组合物，由酵母多糖或其衍生物以及药学上可接受的辅料组成。

本发明的酵母多糖或其衍生物用于预防急性放射性骨髓损伤，特别适用于核战争、核事故、放射工作人员、肿瘤放疗治疗患者等伴有的急性放射性骨髓损伤。本发明的酵母多糖或其衍生物尤其可用于预防急性放射性骨髓损伤，即提前给药于可能遭遇放射性骨髓损伤的人群，给药方式不限于口服、注射等。

本发明有益效果在于：

本发明通过小鼠体内实验，酵母多糖能够明显减轻电离辐射引起的骨髓造血系统的破坏程度，促进造血系统的恢复，抑制电离辐射引起的外周血白细胞下降；通过体外细胞学实验，酵母多糖能够减少照后细胞凋亡率，提高照后细胞增殖活力；通过tlr2敲除型小鼠证实酵母多糖通过靶向激活tlr2发挥辐射防护作用；通过体外细胞学实验，酵母多糖能够减少细胞照后凋亡率，改善增殖抑制情况，说明照前运用酵母多糖能够通过靶向激活tlr2减轻小鼠急性放射性骨髓损伤，保护骨髓有核细胞，保护外周血白细胞，降低小鼠骨髓造血系统对放射的敏感性。因此，本发明为酵母多糖或其衍生物防护急性放射性骨髓损伤提供了新的依据。

目前研究已证实酵母多糖具有吸附病原菌、抗肿瘤以及增强免疫功能等作用，而本发明提供了酵母多糖的新适应症，为防护核辐射带来的损伤提供了新的药物。

附图说明

图1为酵母多糖对小鼠照射后骨髓损伤的影响结果图。其中，a为酵母多糖减轻小鼠照射后骨髓损伤的结果图，b为小鼠骨髓有核细胞的结果图，用于衡量骨髓损伤的情况。

图2为酵母多糖对照射引起的小鼠外周血白细胞的影响结果图。

图3为酵母多糖对小鼠脾系数(脾重/体重)的影响结果图。

图4为酵母多糖对体外细胞ahh-1凋亡的影响结果图。其中，a为annexinv/pi试剂盒通过流式细胞仪检测的结果；b为酵母多糖对细胞凋亡率影响的定量统计结果图。

图5为酵母多糖减轻hiec增殖抑制作用的结果图。

图6为酵母多糖对tlr2野生型和tlr2敲除型小鼠的生存期影响结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：酵母多糖能够减轻小鼠照射后骨髓损伤

一、实验方法

选取c57/bl6、8周龄的雄性小鼠进行实验，将小鼠分为酵母多糖组以及对照组两组。照射前24小时和照射前2小时予以小鼠腹腔注射酵母多糖(25mg/kg/次)，因酵母多糖用无菌生理盐水溶解，因此对照组小鼠予以腹腔注射相同剂量的无菌生理盐水。

酵母多糖组和对照组小鼠照射采用单次全身照射，剂量为7.0gy，剂量率为1gy/min，照射源采用⁶⁰coγ射线。

照射后分别于第1，5，10，15，30天摘取小鼠骨髓进行病理检测。病理检测为he染色，显示骨髓组织结构及病变情况。除了病理检测，我们还测量了骨髓有核细胞计数、外周血白细胞计数和脾指数，脾指数即计算新取出的脾脏组织与体重比值，通过该比值来指示外周血液系统的损伤情况，从而间接推测骨髓造血系统的损伤程度。一般造血系统损伤越严重，脾指数越低。

二、实验结果

以上实验结果由图1-图3显示：

(1)骨髓切片he染色指示照射后第1天对照组与给药组的小鼠骨髓组织差异并不明显；在照射后第5天和第10天，对照组较给药组损伤明显加重，骨髓有核细胞数明显减少；照后第20天，造血系统开始恢复，给药组较对照组恢复加快(图1a)。通过流式检测小鼠骨髓有核细胞数也提示给药组较对照组损伤明显减轻(图1b)。因此，酵母多糖减轻了小鼠照射后骨髓损伤的情况。

(2)外周血白细胞计数显示，给药组明显提高了外周血白细胞数(图2)。

(3)脾系数结果显示，照射引起脾系数减低，而酵母多糖能够增加脾系数，说明酵母多糖对造血系统发挥了保护作用(图3)。

实施例2：酵母多糖减轻ahh-1照后的凋亡

一、实验方法：

为了验证酵母多糖对照射后细胞凋亡的影响，对照射后的ahh-1进行细胞凋亡检测。

细胞凋亡检测采用annexinv/pi双染(购自invitrogen公司)流式检测法，其原理是：细胞凋亡是一个程序性启动的过程，可分为早期凋亡，晚期凋亡两个过程。在早期凋亡时，磷脂酰丝氨酸(ps)可由原来在细胞磷脂膜内侧的状态变为外翻，此时annexinv可与外翻的ps结合，作为早期凋亡的一个检测标志。细胞在晚期凋亡阶段，细胞膜通透性增加，此时碘化丙啶(propidiumiodide,pi)作为一种核酸染料则可进入细胞内部与核酸结合，细胞核被染成红色。annexinv标记上荧光素，与pi联合运用就可以通过流式细胞仪的分析来鉴定出细胞凋亡水平(包括早期凋亡和晚期凋亡)。

具体操作步骤为：对ahh-1(购自atcc)细胞于照射前12小时和照射前2小时予以酵母多糖(40ug/ml)或者无菌生理盐水，然后对细胞进行照射，剂量为4.0gy和8.0gy，剂量率为1gy/min。照射后24小时后消化细胞并进行annexinv/pi染色，20min后进行流式细胞分析。

二、实验结果

如图4所示，照射+酵母多糖组较照射+ns组凋亡率明显降低，表现为右上和右下象限细胞比例减少(图4a)。细胞凋亡率为坐标图右上象限加右下象限细胞比例之和，统计定量显示，酵母多糖明显降低细胞照后凋亡率(图4b)。

实施例3：酵母多糖减轻照射对hiec的增殖抑制作用

一、实验方法：

细胞增殖能力的检测采用cck-8实验，其原理为：cck-8试剂中的wst–8可以被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

具体操作步骤为：照射前24小时，将hiec细胞铺板于96孔板(5000个/孔)，待细胞贴壁后，照前12小时和照前2小时进行加药处理，予以酵母多糖(40ug/ml)和ns。照射剂量分别为8.0gy，剂量率为1gy/min，照后更换培养基继续培养，照后24小时对细胞用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值。

二、实验结果

如图5所示，相比对照，给药组细胞吸光度明显增加，说明酵母多糖减轻照射对细胞的抑制作用，促进照后细胞的增殖活力。

实施例4：tlr2敲除逆转了酵母多糖对小鼠的辐射防护作用

一、试验方法

选取tlr2敲除型、8周龄的雄性小鼠进行实验，将小鼠分为酵母多糖组以及对照组两组。照射前24小时和照射前2小时予以小鼠腹腔注射酵母多糖(25mg/kg/次)，因酵母多糖用无菌生理盐水溶解，因此对照组小鼠予以腹腔注射相同剂量的无菌生理盐水。

酵母多糖组和对照组小鼠照射采用单次全身照射，剂量为6.0gy，剂量率为1gy/min，照射源采用⁶⁰coγ射线。

照射后观察小鼠平均存活时间和生存期。

二、实验结果

如图6所示，给药组较对照组，生存期并无明显差异，酵母多糖对tlr2敲除小鼠并无辐射防护作用，证明酵母多糖发挥辐射防护作用主要通过tlr2信号通路。

上述实施例以酵母多糖为例探索了酵母多糖对小鼠照射后急性骨髓损伤、对ahh-1照后凋亡以及对hiec的增殖抑制的减轻作用，但本发明不限于酵母多糖，能够起到同样药理作用的酵母多糖衍生物也属于本发明的保护范围。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。