牛樟芝化合物及其萃取物用于制备治疗及预防神经退行性疾病的药物的用途的制作方法

本发明涉及一种分离自牛樟芝的化合物、萃取物及其用途，特别是关于将该化合物及萃取物应用于制备治疗及预防神经退行性疾病的药物的用途。

背景技术：

牛樟芝(antrodiacamphorata)，又称樟芝、牛樟菇或红樟芝等，属于非褶菌目(aphyllophorales)、多孔菌科(polyporaceae)的多年生蕈菌类，为台湾特有种真菌，仅生长于台湾保育类树种-牛樟树(cinnamoumkanehiraihay)的中空腐朽心材内壁上。由于牛樟树分布数量极为稀少，加上人为的盗伐，使得寄生在其中方能生长的野生牛樟芝数量更形稀少，且由于其子实体生长相当缓慢，生长期亦仅在六月至十月之间，因此价格非常昂贵。

牛樟芝众多成分中以三萜类化合物被研究的最多，三萜类化合物是由三十个碳元素结合成六角形或五角形天然化合物的总称，牛樟芝所具有的苦味即主要来自三萜类此成分。1995年时，cherng等人发现牛樟芝子实体萃取物中含有三种新的以麦角甾烷(ergostane)为骨架的三萜类化合物：antcina、antcinb与antcinc(cherng,i.h.,andchiang,h.c.1995.threenewtriterpenoidsfromantrodiacinnamomea.j.nat.prod.58:365-371)。chen等人以乙醇萃取樟芝子实体后发现zhankuicacida、zhankuicacidb及zhankuicacidc等三种三萜类化合物(chen,c.h.,andyang,s.w.1995.newsteroidacidsfromantrodiacinnamomea,－afungusparasiticoncinnamomummicranthum.j.nat.prod.58:1655-1661)。此外，chiang等人于1995年也由子实体萃取物中发现另外三种分别为倍半萜内酯(sesquiterpenelactone)与两种双酚类衍生物的新三萜类化合物，此即antrocin,4,7-二甲氧基-5-甲基-1,3-苯并二氧环(4,7-dimethoxy-5-methy-1,3-benzodioxole)与2,2',5,5'-四甲氧基-3,4,3',4'-双-亚甲二氧基-6,6'-二甲基联苯(2,2',5,5'-teramethoxy-3,4,3',4'-bi-methylenedioxy-6,6'-dimethylbiphenyl)(chiang,h.c.,wu,d.p.,cherng,i.w.,andueng,c.h.1995.asesquiterpenelactone,phenylandbiphenylcompoundsfromantrodiacinnamomea.phytochemistry.39:613-616)。到了1996年，cherng等人以同样分析方法再度发现四种新的三萜类化合物：antcine、antcinf、methylantcinateg、methylantcinateh(cherng,i.h.,wu,d.p.,andchiang,h.c.1996.triteroenoidsfromantrodiacinnamomea.phytochemistry.41:263-267)；而yang等人则发现了二种以麦角甾烷为骨架的新化合物zhankuicacidd、zhankuicacide，和三种以羊毛甾烷(lanostane)为骨架的新化合物：15α–乙酰-去氢硫色多孔菌酸(15α-acetyl-dehydrosulphurenicacid)、去氢齿孔酸(dehydroeburicoicacid)与去水硫色多孔菌酸(dehydrasulphurenicacid)(yang,s.w.,shen,y.c.,andchen,c.h.1996.steroidsandtriterpenoidsofantrodiacinnamomea－afungusparasiticoncinnamomummicranthum.phytochemistry.41:1389-1392)。

阿尔茨海默病(alzheimer'sdisease，ad)为一种神经退化性疾病，会导致脑部萎缩，记忆丧失等症状。阿尔茨海默病占了痴呆症(失智症)中六到七成的成因，是一种发病进程缓慢、随着时间不断恶化的持续性神经功能障碍。在2010年，全球有将近2100万到3500万名阿尔茨海默病患者，而归因于阿尔茨海默病相关的死亡案例，大约有48.6万例。在已开发国家中，阿尔茨海默病是相当耗费社会财政补助的疾病之一。

目前已知脑部类淀粉蛋白β(amyloid-β，aβ)的堆积，是引起该疾病的主因。aβ会于脑部中沉积造成氧化压力与发炎反应使神经元受损，最终造成记忆学习能力的障碍。因此抗氧化能力与预防ad具有极高的相关性。pc-12细胞常被用于模拟阿尔茨海默病中aβ伤害神经细胞的一种模式，pc-12神经纤维母细胞在神经生长因子(ngf)的刺激下，能够分化出类似神经突出的结构，表现类似的生理反应，被广泛应用于神经方面的研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于利用合成的aβ，与类神经细胞pc-12共同培养，模拟阿尔茨海默病中aβ伤害神经细胞，来探讨牛樟芝萃取物(anca，anca-d)及化合物(antrocamollt1，lt2，lt3)对ad细胞模型的影响。

据此，本发明提供一种牛樟芝化合物用于制备治疗及预防神经退行性疾病的药物的用途，该牛樟芝化合物如式(i)所示：

其中r1为氢或乙酰基，r2为

较佳地，其中该化合物的r1为氢、r2为以式(ii)表示：

较佳地，其中该化合物的r1为乙酰基、r2为以式(iii)表示：

较佳地，其中该化合物的r1为氢、r2为以式(iv)表示：

本发明更提供一种牛樟芝萃取物用于制备治疗及预防神经退行性疾病的药物的用途，其中该萃取物以下列步骤进行萃取而得：取牛樟芝菌丝体、子实体或二者的混合物以10倍量的酒精抽取2次后合并浓缩得到一粗抽物，其中该粗抽物为该牛樟芝萃取物。

较佳地，其中该粗抽物更进一步以二氯甲烷/水(1:1)进行分配萃取法3次，以分为一个二氯甲烷层及一个水层，其中该二氯甲烷层为该牛樟芝萃取物。

附图说明

图1a～1e示出了牛樟芝萃取物(anca，anca-d)及化合物(antrocamollt1，lt2，lt3)对pc-12细胞生长的影响；

图2a～2e示出了牛樟芝萃取物(anca，anca-d)及化合物(antrocamollt1，lt2，lt3)在体外对ad细胞模型的治疗效果；

图3a～3e示出了牛樟芝萃取物(anca，anca-d)及化合物(antrocamollt1，lt2，lt3)在体外对ad细胞模型的预防效果。

具体实施方式

1.材料及方法

1.1实验药物

牛樟芝萃取物(anca，anca-d)及化合物(antrocamollt1，lt2，lt3)，由兰亭生物科技有限公司提供，-20℃保存。

牛樟芝成分的萃取

取牛樟芝(antrodiacamphorata)菌丝体、子实体或二者的混合物(1.0kg)以10倍量的酒精抽取2次后，合并浓缩可得粗抽物约230g(anca)，粗抽物以二氯甲烷/水(1:1)进行分配萃取法3次，分为二氯甲烷层约102.6g(anca-d)及水层约127.4g(anca-w)，取二氯甲烷层6.0g以硅胶柱层析法经过正己烷/二氯甲烷(1:4)、二氯甲烷、甲醇/二氯甲烷(5:95)的溶媒分离，分为anca-e-d-1、anca-e-d-2、anca-e-d-3、anca-e-d-4等四层。上述四层的取得分别为：合并正己烷/二氯甲烷(1:4)及二氯甲烷为anca-e-d-1，甲醇/二氯甲烷(5:95)冲提液前半部分为anca-e-d-2，甲醇/二氯甲烷(5:95)冲提液后半部分为anca-e-d-3，最后以甲醇冲提为anca-e-d-4。相关材料及方法可参阅相关期刊文献：fitoterapiavolume102,april2015,pages115–119。

牛樟芝化合物antrocamollt1、antrocamollt2、antrocamollt3

牛樟芝化合物antrocamollt1、antrocamollt2、antrocamollt3为本案发明人自牛樟芝萃取物中所纯化而得的三个新颖化合物，其纯化方法及结构鉴定已于先前申请案中公开，在此不再重复赘述，仅简要说明其结构式及其简单信息，如下：

antrocamollt1为无色的液体产物，经分析该化合物的分子式为c24h38o5，分子量为406，完整中文英名称为4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5-(9-羟基-3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮、4-hydroxy-5-[9-hydroxy-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,10-trienyl]-2,3-dimethoxy-6-methyl-cyclohex-2-enone，其结构式如式ii所示：

antrocamollt2:为无色的液体产物，经分析该化合物的分子式为c26h40o6；分子量为448，完整中文英名称为4-乙酰氧基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5-(9-羟基-3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮、4-acetoxy-5-[9-hydroxy-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,10-trienyl]-2,3-dimethoxy-6-methyl-cyclohex-2-enone。其结构式如式iii所示：

antrocamollt3:为无色的液体产物，经分析该化合物的分子式为c24h38o5；分子量为406；，完整中、英名称分别为(4r,5r,6r)-4-羟基5-[(2e,6e,9e)-11-羟基-3,7,11-三甲基-十二-2,6,9-三烯基]-2,3-二甲氧基-6-甲基-环己-2-烯酮、(4r,5r,6r)-4-hydroxy-5-[(2e,6e,9e)-11-hydroxy-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,9-trienyl]-2,3-dimethoxy-6-methylcyclohex-2-enone。其结构式如式iv所示：

以上antrocamollt1、antrocamollt2及antrocamollt3具有相似的主结构，其通式可表示如式i所示：

其中，r1为氢或乙酰基，r2为

关于上述三种牛樟芝化合物的萃取及纯化等详细信息，可参阅本案发明人的先前相关申请案(例如：台湾发明专利申请号103140521)。由于该等化合物在先前申请案中已陆续揭示了具有多种医疗功效性，在此对以上述萃取物及三种化合物进行相关实验，检测其对于神经退行性疾病的影响，研究是否对于阿尔茨海默病等相关神经退行性疾病亦具有医疗潜力。

1.2细胞培养(cellculture)

pc-12神经纤维母细胞，来源于大鼠肾上腺髓质的嗜铬细胞瘤的细胞系。细胞株(cellline)购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心(200031，shanghai，china)。

1.3主要试剂

rpmi1640medium，wisent；fetalbovineserum(fbs)，wisent；heat-inactivatedhorseserum，gibco；penicillin-streptomycin(100x)，beyotime；dimethylsulfoxide(dmso)，sunshinebio；trypsin1:250，sunshinebio；edta2na，sunshinebio；phosphatebufferedsaline(pbs)，beyotime；ngf2.5snativemouseprotein，invitrogen；amyloidβproteinfragment1-40，sigma-aldrich；trifluoroaceticacid99％，tci；cck-8cellviabilityassaykit，beyotime。

1.4主要仪器

forma^tmseries3waterjacketedco2incubator，thermo；msc-advantage^tmclassiibiologicalsafetycabinets，thermo；entris64-1sanalyticalbalance，sartorius；hh-4digitalwaterbath，荣华仪器制造有限公司；sb25-12dtultrasoniccleaning，新艺超声设备有限公司；mls-3780autoclave，sanyo；dhg-9423aelectricoventhermostatblast，三发科学仪器有限公司；bio-medicalhycd-282ultra-lowtemperaturefreezers，haier；allegrax-15rbenchtopcentrifuge，beckman；eclipsets100invertedroutinemicroscope，nikon；infinitem1000promicroplatereaders，tecan。

2.实验方法

2.1pc-12神经纤维母细胞株的培养

pc-12神经纤维母细胞以rpmi1640medium(含5％fetalbovineserum、10％heat-inactivatedhorseserum、2mmglutamine、50u/mlpenicillin、50mg/mlstreptomycin)，培养于37℃、5％co2的环境下，每周继代培养两次。

在本研究中进行的所有实验之前，pc-12细胞需先在含有小鼠颌下腺神经生长因子(ngf2.5s，100ng/ml)的medium上预培养72hr以诱导分化成神经元样细胞。

2.2牛樟芝萃取物及化合物在pc-12细胞中ic50滴定实验

cck-8assay允许采用灵敏的比色测定法在细胞增殖和细胞毒性试验中进行cellviability的测定。cck-8的检测灵敏度高于其它四唑盐，如mtt、xtt、mts或wst-1。高水溶性四唑盐wst-8被细胞中的脱氢酶还原，从而得到在培养基中可溶的黄色产物(甲臜)，通过细胞中的脱氢酶活性产生的甲臜染料的量与活细胞数成正比。

为了针对ngf诱导的pc-12神经模型优化牛樟芝萃取物(anca，anca-d)及化合物(antrocamollt1，lt2，lt3)的浓度，进行了滴定实验以测定其在pc-12细胞中的ic50。将5×104个已用ngf处理过的pc-12细胞置于96-well中培养24hr，之后medium更换为含1％fetalbovineserum、2％heat-inactivatedhorseserum、2mmglutamine、50u/mlpenicillin、50mg/mlstreptomycin之rpmi1640medium，并加入以梯度稀释的不同浓度药物：anca、anca-d(0.064，0.32，1.6，8，40，200μg/ml)，antrocamollt1、lt2、lt3(0.032，0.16，0.8，4，20，100μg/ml)，每个well的dmso浓度不超过0.5％，孵育24hr。处理结束后将cck-8solution加至plate的每个well中，置于incubator孵育4hr，在microplatereadersod450nm处检测各well甲臜产物的浓度，并且将cellviability表示为相对于相应对照的百分比。

2.2牛樟芝萃取物及化合物对β淀粉样蛋白诱导pc-12细胞存活检测

将β-淀粉样蛋白1-40(aβ1-40)以10mg/ml溶解于0.1％(v/v)的三氟乙酸(tfa)水溶液中，储存于-20℃作为储备溶液。试验前将aβ1-40储备溶液用pbs稀释为0.5mg/ml，并于25℃下凝聚48hr。

为了研究anca，anca-d，antrocamollt1、lt2、lt3在体外对阿尔茨海默病(alzheimer'sdisease，ad)细胞模型的治疗效果，将5×104个已用ngf处理过的pc-12细胞置于96-well中培养24hr，之后medium更换为含1％fetalbovineserum、2％heat-inactivatedhorseserum、2mmglutamine、50u/mlpenicillin、50mg/mlstreptomycin的rpmi1640medium，并加入10μmaβ1-40稀释液处理24hr，分别加入anca(5，10，20μg/ml)，anca-d(10，20，40μg/ml)，antrocamollt1、lt2、lt3(25，50，100μg/ml)再培养24hr。以未经过处理的细胞其od值作为control，计算cellviability，既等于药物对aβ1-40神经细胞毒性的抑制率，以％表示。公式如下：

cellviability(％)＝(sample-blank)/(control-blank)×100％

为了研究anca，anca-d，antrocamollt1、lt2、lt3对ad细胞模型的预防效果，将5×104个已用ngf处理过的pc-12细胞置于96-well中培养24hr，之后medium更换为含1％fetalbovineserum、2％heat-inactivatedhorseserum、2mmglutamine、50u/mlpenicillin、50mg/mlstreptomycin之rpmi1640medium，并预先分别加入anca(5，10，20μg/ml)，anca-d(10，20，40μg/ml)，antrocamollt1、lt2、lt3(25，50，100μg/ml)培养24hr，再加入10μmaβ1-40稀释液处理24hr，之后进行cellviability测定。

3.实验结果

3.1牛樟芝萃取物及化合物对pc-12细胞生长的影响

通过进行细胞存活检测，测得anca、anca-d在pc-12细胞中的ic50分别为22.91、49μg/ml(图1a～1b)；antrocamollt1、lt2、lt3在pc-12细胞中的ic50分别为178.5、168.5、105.5μg/ml(图1c～1e)。

3.2牛樟芝萃取物及化合物对β淀粉样蛋白诱导pc-12生长的影响

anca、anca-d、antrocamollt1、antrocamollt2、antrocamollt3在体外对阿尔茨海默病(alzheimer'sdisease，ad)细胞模型的治疗效果，通过细胞存活检测的结果显示：anca、anca-d、antrocamollt1、antrocamollt2、antrocamollt3均能显著地抑制由aβ诱导的损伤并且改善其细胞存活率(图2a～2e)。其中以anca、anca-d的抑制损伤较果最好，其次antrocamollt1、antrocamollt2在100μg/ml、50μg/ml时仍有显著抑制效果、至25μg/ml时效果较不明显，而antrocamollt3在在100μg/ml、50μg/ml时仍具有抑制效果，而逐步下降至25μg/ml效果已不明显。

anca、anca-d、antrocamollt1、antrocamollt2、antrocamollt3在体外对阿尔茨海默病(alzheimer'sdisease，ad)细胞模型的预防效果，通过细胞存活检测的结果显示：anca、anca-d、antrocamollt1、antrocamollt2、antrocamollt3在防止细胞受到aβ诱导的神经元损伤(或降低其风险)方面显示出显著的影响(图3a～3e)。其中anca、anca-d的预防效果仍旧非常显著，而antrocamollt1在浓度为100、50、25μg/ml时甚至表现出比anca、anca-d更佳的预防效果，而antrocamollt2、antrocamollt3的效果则较差。各成分所显示出的效果差异，可能与所涉及的机制不同有关，未来可对于进行进一步研究。然而，至少在本次试验中已证实anca、anca-d、antrocamollt1、antrocamollt2、antrocamollt3确实对于阿尔茨海默病(alzheimer'sdisease，ad)细胞模型中因β淀粉样蛋白所致的伤害具有抑制及预防的明显功效，故anca、anca-d萃取物及antrocamollt1、antrocamollt2、antrocamollt3化合物实具有治疗及预防阿尔茨海默病或其它神经退行性疾病的潜力。

由以上实施例可知，本发明所提供的牛樟芝化合物及其萃取物用于制备治疗神经退行性疾病的药物的用途确具产业上的利用价值，以上的叙述仅为本发明的较佳实施例说明，任何熟悉本领域技术的技术人员均可依据上述的说明而作其它种种的改良，但这些改变仍属于本发明的精神及以下所界定的权利要求范围中。