小分子核苷酸在制备脑损伤的脑保护和脑修复药物中的用途的制作方法

本发明涉及基础医学技术领域，涉及小分子核苷酸在制备治疗脑损伤药物中的用途，尤其是在制备治疗脑损伤中的脑保护和脑修复双重作用的药物用途。本发明所述的脑损伤包括出血性或缺血性脑卒中、急性脑创伤及和慢性神经退行性损伤。

背景技术：

现有技术公开了脑中风是人类第一大致残性疾病，第三大致死性疾病。脑卒中又称脑中风，主要分为出血性脑中风(脑出血或蛛网膜下腔出血)和缺血性脑中风(急性脑血栓或慢性缺血性脑梗塞)两大类，缺血性脑中风是临床上的主要类型，占脑卒中发病的80％以上。据2016年我国脑卒中的流行病学统计数据显示，我国现有脑卒中患者多达7000万人，发病率为2.6-7.2人/千人，每年新增患者约200万人，死于脑卒中的人数165万人/年，即每12秒即有一个国人发生脑卒中。由于缺乏有效的治疗手段，脑卒中患者的幸存者中约75％有程度不等的神经功能缺损后遗症，40％重度残疾，失去生活自理能力。脑卒中发病、致残和死亡人数仍呈增多趋势，对个人、家庭和整个社会均带来沉重的负担。

研究显示，缺血性脑中风主要的病理表现为损伤脑区大量的神经细胞由于缺血而损伤，若得不到及时治疗，缺血损伤脑区神经细胞进一步死亡形成梗死，而梗死中心区周围形成半暗带。病理发展过程中，脑内的损伤和抗损伤的机制均被激活导致半暗带的神经细胞一部分进行性损伤死亡，加重患者神经功能的缺失；同时，另一部分损伤的细胞被修复，神经元新生并形成新的功能性的神经网络，从而促进神经功能的重建或修复。可以设想，患者若能得到及时和有效的治疗，这对于减轻或者预防卒中幸存者后遗症的产生是十分重要的。

目前，临床唯一相对有效的治疗药物是重组组织型纤溶酶原激活剂(rtpa)，主要用于恢复早期缺血性脑卒中患者的脑血流，但是，其缺点是治疗时间窗较窄，同时很难控制再灌注损伤和继发性脑出血等缺憾限制了治疗的有效性。另外，rtpa治疗的幸存者，脑内神经元通常伴有再灌注损伤和死亡，导致神经功能的进一步缺失。现有的神经保护药物仅仅针对急性损伤病理过程的某单一机制而设计的，如抗兴奋性神经毒，抗氧化或自由基清除剂等单一作用。这些新药在临床i期或ii期试用研究中均以失败而告终。因此，临床需要一类能具有抗神经细胞急性损伤和促进修复作用的多重作用的药物。

基于现有技术有关脑卒中的治疗主要包括急性期的脑保护作用和慢性期的脑修复作用的现状，本申请的发明人拟提供小分子核苷酸在制备治疗脑损伤药物中新的药用用途，尤其是在制备治疗脑损伤中的脑保护和脑修复的双重作用的药物中的用途，进一步为临床治疗脑中风提供一药两用的双重治疗方式及思路。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供小分子核苷酸在制备治疗脑损伤药物中新的药用用途，尤其是在制备治疗脑损伤中的脑保护和脑修复双重作用的药物中的用途，本发明基于脑缺血后使用一种小分子核苷酸同时起到脑保护和脑修复的作用，为治疗缺血性脑中风提供一药两用的治疗思路。

本发明中通过化学合成的方法合成小分子核苷酸a,b,c和d，并进行了缺血性脑卒中的动物实验和离体培养神经细胞的实验。本发明采用小分子核苷酸靶向性地增加神经细胞内促神经分化因子pax6的合成，促进神经元新生而促进脑修复，在脑缺血模型上给予小分核苷酸干预，显示小分子核苷酸b显著缩小缺血性脑梗塞灶的体积，减少缺血损伤脑内神经细胞的凋亡，改善缺血性脑损伤大鼠神经功能，促进了活化的星形胶质细胞转分化为新生神经元的作用。

本发明中，所述的小分子核苷酸序列如下所示：

小分子核苷酸(a)5’-uaaugccccuaaaaauccuuau-3’

5’-aaggauuuuuaggggcauuauu-3’

小分子核苷酸(b)5’-auaaggauuuuuaggggcauua-3’

小分子核苷酸(c)5’-uucuccgaacgugucacgutt-3’

5’-acgugacacguucggagaatt-3’

小分子核苷酸(d)5’-caguacuuuuguguaguacaa-3’

本发明的实施例中，采用在大鼠大脑中动脉栓塞手术(mcao)后进行脑室注射小分子核苷酸，然后检测脑保护作用相关的梗塞灶体积以及脑修复作用相关的神经元新生等情况，实验结果表明，小分子核苷酸会同时涉及到缺血损伤后急性期脑保护和恢复期脑修复两方面的作用，小分子核苷酸通过作用于细胞凋亡相关蛋白以及驱神经元化转录因子pax6，同时参与脑缺血后的神经保护与神经修复两个进程；缺血性脑损伤后，小分子核苷酸a加剧脑损伤，使脑梗塞灶体积扩大，小分子核苷酸b后则显著减轻脑损伤，脑梗塞灶体积缩小；此外，小分子核苷酸b促进缺血周边区活化的星形胶质细胞表达pax6，促进星形胶质细胞转分化为新生神经元，实验结果证实，小分子核苷酸b通过抑制缺血损伤脑内急性期细胞凋亡起到脑保护的作用，同时，促进恢复期神经元新生起到脑修复的作用。

本发明提供了小分子核苷酸拮抗剂在制备治疗脑损伤药物中新的药用用途，尤其是在制备治疗脑损伤中的脑保护和脑修复双重作用的药物中的用途，本发明的实验结果表明，小分子核苷酸会同时涉及到缺血损伤后急性期神经保护和恢复期神经修复两方面，小分子核苷酸能通过作用于细胞凋亡相关蛋白以及驱神经元化转录因子pax6同时参与缺血损伤后的脑保护与脑修复两个进程，本发明为治疗缺血性脑中风提供一种一药两用的治疗思路。

本发明针对脑卒中的有效治疗包括急性期的脑保护和慢性期的脑修复作用提供了小分子核苷酸在脑中风之后的脑保护及脑修复的双重药物作用，本发明的小分子核苷酸适用于与脑内神经细胞凋亡、干细胞分化或胶质细胞转分化的神经元新生能力减弱所致的神经系统疾病的治疗干预，所述神经系统疾病包括脑卒中、急性脑创伤，神经退行性病等急慢性脑损伤性疾病。

附图说明

图1是小分子核苷酸对缺血性脑细胞凋亡影响的实验结果，

其中，显示了小分子核苷酸b具有显著减少损伤脑内神经细胞的凋亡作用。

图2是小分子核苷酸对缺血性脑梗塞灶影响的实验结果，

其中，显示小分子核苷酸b显著减小缺血后脑梗塞体积，小分子核苷酸a增加梗塞体积，小分子核苷酸c和d不明显改变梗塞体积。

图3是小分子核苷酸对缺血性脑损伤大鼠神经功能缺失影响的实验结果，

其中显示，小分子核苷酸b减轻缺血性脑损伤大鼠神经行为功能的缺失，小分子核苷酸a显著加重缺血性脑损伤大鼠神经行为功能的缺失，小分子核苷酸c和d对神经功能缺失没有明显影响。

图4是小分子核苷酸的靶向调节pax6表达的实验结果，

其中显示，与小分子核苷酸c和d组相比，小分子核苷酸a降低细胞中pax6mrna及其蛋白的表达量，小分子核苷酸b显著增加pax6mrna及其蛋白的表达量；

图5是小分子核苷酸b促进缺血损伤脑内pax6表达作用的实验结果。、，

其中显示，与小分子核苷酸c和d组相比，小分子核苷酸b具有促进损伤脑内pax6蛋白表达，小分子核苷酸a显著抑制pax6蛋白表达。

图6是小分子核苷酸调节缺血损伤脑内pax6免疫阳性标记细胞数的实验结果：其中显示，与小分子核苷酸c和d组相比，小分子核苷酸b显著增加pax6免疫阳性标记的细胞数，小分子核苷酸a显著减少pax6免疫阳性标记的细胞数。

图7是小分子核苷酸b促进缺血损伤脑内神经胶质细胞表达pax6的实验结果，其中显示，与小分子核苷酸c和d组相比，小分子核苷酸b显著促进活化的星形胶质细胞表达pax6，小分子核苷酸a明显抑制活化的星形胶质细胞表达pax6。

图8是小分子核苷酸b促进缺血损伤脑内神经元新生的实验结果，

其中显示，相对于对照组，小分子核苷酸b显著增加gfp⁺-pax6⁺神经细胞数；小分子核苷酸b显著增加gfp⁺-neun⁺神经细胞数,小分子核苷酸a明显减少gfp⁺-neun⁺神经细胞数。

具体实施方式

实施例1小分子核苷酸的脑保护作用的实验

本实施例采用mcao模型观察脑室内注射小分子核苷酸a、b、c或d对脑损伤的影响，包括对损伤脑内神经细胞凋亡、脑梗塞体积和神经功能的影响；

(1)小分子核苷酸对缺血性脑细胞凋亡影响的实验：

大鼠接受mcao手术后，立即接受脑室注射小分子核苷酸a、b、c或d，待动物清醒后回到动物房常规饲养，手术后3天动物麻醉处死，取其脑组织，提取蛋白，用westernblotting检测凋亡蛋白p53和抗凋亡蛋白bcl-2和akt的表达量，结果显示注射小分子核苷酸b动物脑内akt和bcl-2表达量显著增加，而p53表达量明显减少；采用免疫组织化学的技术观察损伤脑内表达活化型caspase-3神经细胞数量明显减少，而注射小分子核苷酸c或d的动物脑内表达量没有明显的改变，结果显示，小分子核苷酸b具有显著减少损伤脑内神经细胞的凋亡作用。

(2)小分子核苷酸对缺血性脑梗塞灶影响的实验：

大鼠接受mcao手术后，立即接受脑室注射小分子核苷酸a、b、c或d，待动物清醒后回到动物房常规饲养，手术后3天动物麻醉处死，取脑进行组织切片，脑片厚度30μm，每隔9片的脑片进行焦油紫(cv)染色，采用hin提供imagej1.37软件分析梗塞灶体积，结果显示，小分子核苷酸b显著减小缺血后脑梗塞体积，而小分子核苷酸a则增加梗塞体积，而小分子核苷酸c和d则不明显改变梗塞体积。

(3)小分子核苷酸对缺血性脑损伤大鼠神经功能缺失影响的实验

大鼠接受mcao手术后，立即接受脑室注射小分子核苷酸a、b、c或d，待动物清醒后回到动物房常规饲养，手术后3天动物接受神经行为功能的评分分析，结果显示，与对照组相比，小分子核苷酸b减轻缺血性脑损伤大鼠神经行为功能的缺失，小分子核苷酸a则显著加重缺血性脑损伤大鼠神经行为功能的缺失，而小分子核苷酸c和d对神经功能缺失没有明显影响；

实验结果证实，小分子核苷酸b具有减少缺血损伤脑内神经细胞凋亡的作用，缩小缺血性脑梗塞体积，改善缺血性脑损伤大鼠的神经行为学功能，表明小分子核苷酸b具有脑保护效应，而小分子核苷酸a具有明显的相反的作用。

实施例2小分子核苷酸b促进缺血损伤脑的脑修复作用实验

(1)小分子核苷酸的靶向调节pax6表达的实验

已知小分子核苷酸的生物学功能通过靶向性抑制蛋白表达，从而发挥其生物学效应，为此，采用targetscan、mirbd、mirnda三种信息学软件进行综合分析，分析数据提示某些小分子核苷酸序列具有与促神经发生因子pax6mrna相互结合的可能，为此，我们提出小分子核苷酸序列是否过调节pax6的表达而实现其调节损伤脑的修复作用。

为此，本申请首先采用原代星形胶质神经细胞的模型观察不同的小分子核苷酸对pax6mrna及其蛋白表达的影响。原代培养的星形神经胶质细胞，分别转染小分子核苷酸a、b、c或d，转染48小时后收集细胞，分别提取细胞中的mrna或蛋白，采用qpcr技术检测pax6mrna含量或westernblotting检测pax6蛋白表达量。实验结果显示，与小分子核苷酸c和d组相比，小分子核苷酸a降低细胞中pax6mrna及其蛋白的表达量，而小分子核苷酸b则显著增加pax6mrna及其蛋白的表达量；

上述实验分析证实，本发明合成的小分子核苷酸b具有有益的调节pax6表达的生物学效应，所述小分子核苷酸b能有效促进脑组织和神经胶质细胞表达pax6的表达。

(2)小分子核苷酸b促进缺血损伤脑内pax6表达作用的实验

基于离体培养细胞的实验结果，小分子核苷酸b具有增加损伤神经细胞的内源性pax6表达。已知，pax6的高表达具有促进神经干细胞转分化为神经元的作用。本实施例在mcao模型上进一步观察小分子核苷酸b促进缺血损伤脑内pax6蛋白表达的实验。

大鼠接受mcao手术后，立即接受脑室注射小分子核苷酸a、b、c或d，待动物清醒后回到动物房常规饲养。手术后3天动物处死，取脑组织，提取蛋白再行westernblotting检测pax6蛋白表达变化量，结果显示，与小分子核苷酸c和d组相比，小分子核苷酸b具有促进损伤脑内pax6蛋白表达，而小分子核苷酸a则显著抑制pax6蛋白表达。

(3)小分子核苷酸调节缺血损伤脑内pax6免疫阳性标记细胞数的实验：

大鼠接受mcao手术后，立即接受脑室注射小分子核苷酸a、b、c或d，待动物清醒后回到动物房常规饲养。手术后3天动物处死，取脑制备组织切片，脑片用于免疫组织化学染色观察pax6表达细胞，结果显示，与小分子核苷酸c和d组相比，小分子核苷酸b显著增加pax6免疫阳性标记的细胞数，而小分子核苷酸a则显著减少pax6免疫阳性标记的细胞数。

(4)小分子核苷酸b促进缺血损伤脑内神经胶质细胞表达pax6的实验：

为了证明小分子核苷酸b促进缺血损伤脑内表达pax6的细胞选择性，采用pax6抗体和gfap抗体的免疫组织化学双标记染色技术观察使用小分子核苷酸对损伤脑内神经胶质细胞表达pax6的影响；

脑组织切片来源同上，取脑切片进行pax6抗体和gfap抗体的免疫反应，进行组织化学双标记染色。实验结果显示，与小分子核苷酸c和d组相比，小分子核苷酸b显著促进活化的星形胶质细胞表达pax6，而小分子核苷酸a则明显抑制活化的星形胶质细胞表达pax6。

(5)小分子核苷酸b促进缺血损伤脑内神经元新生的实验

本实施例进行了小分子核苷酸对缺血后脑内活化的星形胶质细胞短时程重编程命运的影响实验，在mcao手术后立即进行脑实质注射pgfa2-egfp质粒标记活化的神经胶质细胞，同时脑室注射小分子核苷酸a、b、c或d，手术3天麻醉处死，取脑进行组织切片，脑片用于免疫组织化学双标记(gfp抗体和pax6抗体)染色，观察gfp⁺-pax6⁺双标记细胞，并进行细胞计数，实验结果显示，相对于对照组，小分子核苷酸b显著增加gfp⁺-pax6⁺神经细胞数；

为进一步进行小分子核苷酸对缺血后脑内活化的星形胶质细胞长时程分化命运的影响试验，大鼠行mcao手术前一周，脑实质内注射慢病毒包装的lenti-gfap-egfp质粒来标记神经胶质细胞，一周后大鼠接受mcao手术后立即进行脑室注射小分子核苷酸a、b、c或d，2周麻醉处死，取脑进行组织切片，脑片用于免疫组织化学双标记(gfp抗体和neun抗体)染色观察胶质细胞转分化为神经元的作用，实验结果显示，小分子核苷酸b显著增加gfp⁺-neun⁺神经细胞数,而小分子核苷酸a则明显减少gfp⁺-neun⁺神经细胞数；

实验结果表明，小分子核苷酸b具有增加损伤脑内活化神经胶质细胞转分化为神经元的潜能。

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