一种可再生毛囊的皮肤再生材料及其制备方法与流程

本发明涉及基因活性组织工程支架的制备方法，尤其涉及一种可再生毛囊的皮肤再生材料及其制备方法，具体涉及利用肝细胞生长因子质粒dna(简写为hgf-pdna或pdna-hgf)和骨髓间充质干细胞(bmscs)制备负载干细胞的基因活性组织工程支架的方法。

背景技术：

皮肤缺损特别是大面积皮肤缺损，对人类的健康有极大的威胁。作为传统治疗手段“皮肤移植”的替代者，组织工程与再生医学产品发展势头强劲。尽管已经商业化的组织工程与再生医学产品能够修复损伤的表皮和真皮组织，但再生皮肤组织的功能化还没有得到完全解决，特别是皮肤附属器官的缺失对皮肤组织功能的恢复有极大影响。如何在再生表皮和真皮组织的同时再生出附属器官结构是皮肤组织工程与再生医学的重点。基因活性支架材料是将外源性基因与支架结合起来构建的复合体系。外源性基因取代生长因子使基因活性支架能够维持生长因子更长时间、更稳定的释放。同时基因载体的存在使基因能够在局部释放，使生长因子的作用更加有针对性。基因活性支架的核心是构建合适的支架体系，支架作为基因的暂时存储空间，在合适的时间和地点释放基因。一般需要选择特定的基因载体或者对基因载体改性使其能够与支架体系融合。

胶原和壳聚糖是天然高分子材料，作为支架材料，他们被广发的应用于组织工程领域。本课题组前期开发了一种胶原壳聚糖复合支架材料，该复合支架具有良好的生物相容性，可作为再生材料用于皮肤缺损的修复。体外试验证明该复合支架材料可以促进成纤维细胞的粘附。体内试验表明该支架材料能有效诱导真皮的再生，控制挛缩，提高创面愈合速度，增加创面愈合后皮肤的弹性、柔软性及机械耐磨性，降低疤痕组织的形成。胶原壳聚糖复合支架是一种有效的、具有重要潜在应用价值的皮肤再生材料。

一些研究已经证实肝细胞生长因子(hgf)能够诱导干细胞向毛囊方向分化，因此选取hgf作为诱导毛囊分化的因子。为了充分发挥hgf的作用，将基因工程引入支架体系，基因转染细胞之后能够持续有效表达hgf，从而避免了裸hgf在体内不可控释放及被生理环境中的酶降解。利用商业化的脂质体与编码hgf的质粒dna结合形成复合纳米粒子，以保护质粒dna的活性，提高转染效率。将纳米粒子与胶原壳聚糖支架复合制备基因活性支架。

作为组织工程的三要素之一，种子细胞是组织工程与再生医学的关键。前期研究者的很多探索表明毛囊部位提取细胞如毛乳头细胞，毛囊外根鞘细胞等细胞的混合细胞具有再生毛囊结构的能力，但这些细胞来源有限、提取困难、需细胞混合等，在组织工程与再生医学中不具有可行性。而近年来快速发展的干细胞技术为解决这一问题提供了方案。干细胞特别是骨髓间充质干细胞来源广泛，提取容易，具有多分化潜能，在毛囊这种结构复杂的组织再生中具有独特优势。干细胞的分化需要一个合适的诱导环境，而伤口组织的毛囊结构缺失，生理环境遭到破坏，已不足以诱导植入的干细胞分化为毛囊再生所需的各种组织特异性细胞。固本发明导入外源性的骨髓间充质干细胞，利用肝细胞生长因子(hgf)质粒dna表达hgf，进而诱导干细胞向毛囊方向分化。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种可再生毛囊的皮肤再生材料及其制备方法，该材料是负载骨髓间充质干细胞的基因活性支架材料，是利用胶原壳聚糖支架材料结合肝细胞生长因子质粒dna(hgf-pdna)以及骨髓间充质干细胞，简便易行地制备具有良好生物相容性，诱导毛囊再生的基因活性组织工程支架材料。

本发明的可再生毛囊的皮肤再生材料，是由胶原-壳聚糖多孔支架、骨髓间充质干细胞(bmsc)以及基因载体/表达肝细胞生长因子的质粒dna(pdna-hgf)纳米粒子组成；所述的基因载体/pdna-hgf纳米粒子、bmsc通过多点注射的方法先后注入胶原-壳聚糖多孔支架中。

所述的骨髓间充质干细胞采用二代bmscs。所述的基因载体是脂质体、高分子基因载体或病毒基因载体。

本发明的可再生毛囊的皮肤再生材料的制备方法，包括以下步骤：

1)将500μg/ml的pdna-hgf质粒溶液，按照dna(μg)：基因载体(μl)＝1:2的比例混合，制备基因载体/pdna-hgf纳米粒子悬液；

2)将胶原和壳聚糖分别溶于3％(w/v)的乙酸水溶液中，分别得到终浓度为0.5％(w/v)的胶原和壳聚糖溶液；将胶原和壳聚糖溶液以9:1的体积比混合，搅拌均匀得到胶原-壳聚糖溶液；向其中加入戊二醛溶液，使戊二醛的终浓度为0.01％-0.04％(w/v)，置于37℃反应4h；反应结束后冷却至室温，真空脱泡后，注入24孔板，置于-20℃2h，冷冻干燥后得胶原-壳聚糖多孔支架；

3)采用多点注射的方法，以20-60μg/支架的量将纳米粒子悬液与胶原-壳聚糖支架复合，置于37℃孵育4h，获得基因活性支架；

4)采用多点注射的方法，将浓度为1×10⁶-5×10⁶/ml的bmsc细胞悬液与基因活性支架复合，置于37℃孵育4-12h，更换含10％fbs的培养基，获得负载干细胞的基因活性支架，即可再生毛囊的皮肤再生材料。

将负载干细胞的基因活性支架置于10％fbs的α-mem培养基中37℃培养，每三天更换一次培养基，用于评价基因活性支架诱导bmscs分化性能。将粘附有硅胶膜的负载干细胞的基因活性支架植入雌性sd大鼠皮肤创伤部位，评价体内诱导毛囊再生的效果。

本发明的优点：以天然生物材料胶原和壳聚糖为支架材料，结合肝细胞生长因子质粒dna(hgf-pdna)以及骨髓间充质干细胞制备负载干细胞的基因活性支架，用于缺损皮肤的毛囊再生。该基因活性支架的制备方法简单易行、重复性好。体外试验表明该基因活性支架具有良好的生物相容性，可以显著促进hgf的表达。体内结果证明基因活性支架可以原位诱导毛囊再生，35d后可观察到新生毛发。该基因活性支架具有广阔的临床应用前景。

附图说明

图1是hgf-pdna/脂质体复合纳米粒子的投射电镜图。

图2是胶原壳聚糖支架的扫描电镜图。

图3是hgf-pdna/脂质体复合纳米粒子在胶原壳聚糖支架中的分布，a、b、c分别为同一区域在不同放大倍数下的扫描电镜图。

图4是不同时间bmscs在基因活形支架中的分布。

图5是不同时间基因活性支架中bmsc目的蛋白的表达。其中bsm代表只负载骨髓间充质干细胞的支架，gasm代表负载骨髓间充质干细胞和hgf-pdna/脂质体复合纳米粒子的基因活性支架。

图6是基因活性支架中毛囊特征因子基因水平的表达。其中blankscaffold代表没有负载骨髓间充质干细胞和hgf-pdna/脂质体复合纳米粒子的空白支架。versican：多功能蛋白聚糖，colⅳ：ⅳ型胶原，alp：碱性磷酸酶，α-sma：α平滑肌蛋白。

图7是基因活性支架中毛囊特征因子蛋白水平的表达。

图8是雌性sd大鼠动物实验模型。

图9是创面修复过程大体观察。gas代表未负载骨髓间充质刚细胞的基因活形支架。

图10是35d后修复观察效果。

图11是再生毛囊细胞来源鉴定图。

图12是再生毛囊结构鉴定。

图13是基因活性支架的结构表征。

图14是组织切片中皮脂腺的鉴定。

图15是再生组织分子生物学分析。

图16是毛囊特征因子基因水平的表达。

图17是毛囊特征因子蛋白水平的表达。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作详细说明。

实例1：

利用肝细胞生长因子质粒dna(hgf-pdna)和胶原壳聚糖支架制备诱导毛囊再生的基因活性胶原壳聚糖支架方法，包括以下步骤：

(1)采用超纯质粒抽提试剂盒提取的质粒溶液，将质粒溶液用稀释剂mem稀释到500μg/ml，按照dna(μg)：脂质体(μl)＝1:2的比例，将质粒溶液加入到脂质体中，轻轻吹打，静置20min得到质粒脂质体纳米复合粒子悬液。将胶原壳聚糖分别溶于3％的乙酸水溶液中，分别得到终浓度为0.5％的胶原和壳聚糖溶液。将胶原和壳聚糖溶液以9:1的体积比混合，搅拌均匀得到胶原壳聚糖溶液。加入一定量的戊二醛溶液，使戊二醛的终浓度为0.04％，置于37℃反应4h。反应结束后冷却至室温，真空脱泡后，注入24孔板，置于-20℃2h，冷冻干燥后得胶原壳聚糖多孔支架。采用多点注射的方法，以质粒40μg/支架的量注入复合粒子悬液。置于37℃孵育4h，即得基因活性支架。用无fbs的培养基将bmscs配制成一定浓度的细胞悬液，采用多点注射的方法，将一定量的细胞悬液注入基因活性支架。置于37℃孵育4h，更换含10％fbs的培养基，即得负载干细胞的基因活性支架。

(2)负载干细胞的基因活性支架置于10％fbs的α-mem培养基中37℃培养，每三天更换一次培养基，用于评价基因活性支架诱导bmscs分化性能。

(3)以重量为300g左右的雌性sd大鼠为动物实验模型，对负载干细胞的基因活性支架诱导毛囊再生进行体内评价。用戊巴比妥pbs溶液将大鼠麻醉，聚维酮碘(pvp-i)消毒后，在背部脊柱线两侧1cm的位置用手术刀制备直径15mm的全层皮肤创伤。将粘附有硅胶膜的支架放入皮肤创伤部位，胶原壳聚糖紧贴伤口内侧，硅胶膜朝上。在spf级的环境中饲养大鼠。在10d、21d和35d观察伤口修复状况并进行组织学和分子生物学测试。

上述的用于体外评价的胶原壳聚糖支架尺寸为直径15mm，高3mm，以40μgdna/支架的量加入hgf-pdna/脂质体复合粒子悬液，每个支架中加入40×10⁴个二代的bmscs；用于动物实验模型的胶原壳聚糖支架尺寸为直径15mm，高2mm，以40μgdna/支架的量加入hgf-pdna/脂质体复合粒子悬液，每个支架中加入400×10⁴个二代的bmscs。

利用投射电镜表征肝细胞生长因子质粒dna(hgf-pdna)/脂质体复合纳米粒子。图1显示制备的复合粒子分散均匀，粒子呈实心的球状结构，结构致密，这是负电荷的质粒与正电荷的脂质体之间强烈的电荷作用使复合粒子压实。粒子的大小均一，直径约为190nm。

扫描电镜表征了胶原壳聚糖支架的微观结构以及纳米粒子在支架中的分布。图2表明胶原壳聚糖支架具有很好的孔隙率，且孔连通性较好，孔径均匀，约为100μm。图3表明负载复合粒子支架支架的断面形貌基本保持不变。只是负载粒子之后孔略微缩小，孔之间多了些纤维物质，同时表面比空白支架粗糙一些，这主要是由于加入复合粒子悬液之后，水使部分胶原溶胀所致，但这些不足以影响支架的性能。hgf-pdna/脂质体复合粒子在孔壁表面均匀分散，且粒子能够在孔壁上良好粘附，这使粒子能够在支架中保持一定时间，减少粒子的损失。

图4为不同时间点骨髓间充质干细胞在基因活性支架上分布的扫描电镜和激光共聚焦图。从图中可以看出种植细胞的基因活性支架的表面形貌逐渐变化，孔结构逐渐被纤维状的物质填充，这一方面是由于支架的降解，另一方面是细胞分泌的细胞外基质的影响。而支架表面已经完全被一层bmscs覆盖。clsm观察发现在24h时，仅有部分细胞粘附于支架，且仅有部分细胞完全铺展，铺展之后的细胞保持了bmscs的正常形貌。随着培养时间的增加，4d与7d时，细胞的数目明显增多，证明基因活性支架的生物安全性良好。

基因活性支架具有诱导功能的首要条件是基因活性支架能够表达目标蛋白hgf，我们通过westernblotting的方法半定量分析了基因活性支架能否诱导bmscs表达hgf。图5是以空白支架为对照组，比较负载干细胞的基因活性支架和空白支架在1w和3w时表达目的蛋白的表达。可以看出在1w和3w时，相对于空白支架，基因活性支架hgf条带的深度和宽度明显要高。这也证明了基因活性支架在促进bmscs表达目的蛋白方面的有效性，而且这种有效性能够维持足够长的时间。

通过rt-qpcr表征了基因活性支架诱导bmscs向毛囊方向分化相关特征因子在基因水平的表达。我们以空白支架为对照组，表征毛囊分化的四个关键因子versican、colⅳ、alp和α-sma的表达。图6显示1w时基因活性支架中alp和colⅳ基因水平的表达是空白支架的3倍多，而基因活性支架中versican和α-sma的表达是空白支架的15倍多，这说明基因活性支架能够有效诱导bmscs在基因水平上表现出向毛囊分化的趋势。对比3w时的表达量可以发现，基因活性支架中的四个指标仍然要高于空白支架。

通过westernblotting半定量的方法测试了空白支架与基因活性支架在诱导bmscs向毛囊分化各指标的蛋白水平的表达差异。从图7看出在1w和3w时，基因活性支架中

versican、colⅳ和alp蛋白表达的条带明显要比空白支架更宽，颜色更深，表明蛋白的表达量更多。基因活性支架与空白支架中三种蛋白的表达差异也与pcr结果中基因水平表达的差异一致。

体内动物实验采用的是雌性sd大鼠皮肤损伤模型。该模型被广泛用于皮肤修复实验模型。为了平衡各组别之间的差异，我们在背部皮肤靠近脊椎线的对称位置创造皮肤损伤，考虑到大鼠背部皮肤的面积，同时避免制备的伤口过小收缩影响伤口的取样等问题，在大鼠背部制造4个直径1.5cm，深度为2mm的全层皮肤切伤如图8所示。按照步骤制备空白支架、基因活性支架和负载干细胞的基因活性支架。支架的大小为直径15mm，高度2mm，每个支架中基因含量为40μg，细胞数目为400×10⁴。以负载相同数目bmscs的空白支架和负载phgf/脂质体复合粒子的基因活性支架为对照组，验证phgf/脂质体复合粒子及bmscs在体系中的必要性。图9显示随着修复时间的增加，实验组和对照组伤口均随着时间的增加而收缩，这是伤口愈合过程中的正常的生理过程，也是伤口愈合程度的一个标志。但相对于对照组，在同一个时间点，实验组的伤口收缩的程度更为明显。

图10是35d后修复效果。从图中够可以看出尽管对照组均能够修复表皮和真皮结构，但修复的组织表面光滑，无任何毛干再生的迹象，而实验组表皮和真皮组织修复的同时，发现再生的皮肤组织表面有毛干结构。这说明负载干细胞的基因活性支架能够在修复表皮与真皮的同时再生出毛干结构，而且bmscs和hgf-pdna/脂质体复合粒子对于体系的完整性是缺一不可的。

采用y染色体杂交的方法对其分析。由于y染色体存在于雄性sd大鼠体内，而在雌性sd大鼠体内不存在。将雄性sd大鼠提取的bmscs，并用异硫氰酸荧光素(fitc)标记的荧光染料标记y染色体。图11可以看出，在10d时，可以看到有部分y染色体阳性的细胞存在于团状的类毛囊结构。表明毛囊的构建是植入的干细胞与自体细胞共同作用的结果。而在21d时，y染色体阳性的细胞比例明显降低，这说明植入的细胞逐渐被自体细胞所取代。这一实验说明植入的干细胞与自体细胞共同参与了毛囊结构的重建。

采用免疫荧光的方法对负载bmscs的基因活性支架再生的类毛囊组织毛囊特异性因子的表达进行鉴定。如图12所示，versican和alp在各个时间点都呈明显的阳性表达。α-sma尽管在10d时阳性并没有那么明显，但在21d和35d时其阳性已经很明显。这种情况与体外实验的westernblotting的结果相一致。

为了进一步鉴定毛囊结构，对修复的组织分别在10d、21d、35d取样，h&e染色，分析其组织结构。图13表明随着时间的延长，表皮和真皮结构逐渐完善，组织的成熟度逐渐提高，胶原的规整度逐渐提高，逐渐接近正常组织。5w时，对比与对照组发现，实验组中组织成熟度较高，而且可以看到在实验组中出现了一些类毛囊的松散的细胞团簇状结构。而实验组随着时间的延长，表皮和真皮结构逐渐接近正常组织，类毛囊结构逐渐成熟，并且在毛囊结构的周围发现了一些类皮脂腺的结构。

在he切片中我们发现了毛囊结构周围存在类皮脂腺的囊状结构，为了验证其是否是皮脂腺结构，对组织的冰冻切片进行油红o染色。由图14可知，对照组中看不到任何油红o阳性的组织，而实验组中，10d时即可看到一些阳性的组织存在，而在21d时这种阳性组织分布更广泛，在35d时阳性的组织则与毛囊组织融合在一起。这证明组织中的组织确实是皮脂腺，负载bmscs的基因活性支架在修复皮肤组织，诱导毛囊再生的同时也诱导了皮脂腺。

通过pcr和westernblotting的方法分析了对照组与实验组体内目标因子hgf在基因水平和蛋白水平的表达情况。分别取10d、21d、35d的样品进行pcr分析，取35d的样品进行westernblotting的分析。图15可以看到，10d时目标因子hgf在基因水平的表达要明显高于空白支架。而在21d和35d时实验组目标因子在基因水平的表达与对照组差别不大，这主要是由于支架中细胞增殖，同时自体迁移过来的细胞稀释了转染质粒的细胞的比例。从westernblotting的结果来看，35d时，实验组目的蛋白的表达要明显高于对照组，这证明负载干细胞的基因活性支架体系在表达目标蛋白方面长期有效。

为了分析组织修复过程，采用pcr分析了组织修复过程中，毛囊相关的特征因子versican、alp、α-sma表达在基因和蛋白水平的变化。由图16可知，在10d时，三种因子在基因水平的表达较高，21d时和35d时基因水平的表达明显降低，这与诱导因子发挥作用的时间有关。在10d时，负载bmscs的基因活性支架组三种因子的基因水平的表达都高于基因活性支架组和负载干细胞的空白支架。这主要是由于，负载干细胞的空白支架没有质粒转染来分泌诱导因子hgf，所以组织表达的毛囊特征因子的量是最少的，而负载干细胞的基因活性支架因为有质粒dna转染bmscs，因此可以分泌诱导因子hgf。

我们进一步通过westernblotting的方法检测了实验组和对照组中三种特征因子蛋白表达水平的差异。因为蛋白表达的滞后性，我们取长时间点35d的样品检测。由图17可知实验组中三种因子的条带明显比对照组颜色更深，条带更宽，证明实验组能够有效表达毛囊特征因子。