增效的泰拉霉素的制作方法

本发明还涉及一种用于使泰拉霉素增效的方法，其中将一种式(i)化合物(或几种式(i)化合物)与泰拉霉素共施用。在该方法中，以一定剂量使用式(i)的化合物，其单独地在此剂量是无活性的。

发明的目的

背景

本发明旨在提供与抗生素在商业和医药使用期间其活性降低或丧失有关的问题的解决方案。

在1940年代随着抗微生物剂的出现，很快就发现微生物(细菌和真菌)可以适应所使用的抗微生物剂。后者的功效随着时间和使用的程度而降低。有两种策略用于控制耐受：第一，发现新的抗微生物分子；第二，将现有的抗微生物剂与用于选择性地阻断耐受机制的分子组合。

在过去的二十年中，进入市场的新抗微生物分子的数量有所减少，这导致耐受性微生物全球流行率大幅增加。结果是患者的微生物感染越来越难以治愈的复杂情况。

在申请pct/ep2015/071093中，申请人已经证明式(i)化合物能够使抗生素增效。在该申请中，表明良好的体外结果在体内得到证实。申请pct/ep2015/071093并未提及泰拉霉素。

泰拉霉素是一种大环内酯类抗生素。其化学名称(iupac命名法)为(2r,3s,4r,5r,8r,10r,11r,12s,13s,14r)-13-[[2,6-二脱氧-3-c-甲基-3-o-甲基-4-c-[(丙基氨基)甲基]-α-l-己吡喃核糖基]氧]-2-乙基-3,4,10-三羟基-3,5,8,10,12,14-六甲基-11-[[3,4,6-三脱氧-3-(二甲基氨基)-β-d-己吡喃木糖基]-氧]-1-氧杂-6-氮杂环十五烷-15-酮。它由zoetis以商标名销售，用于治疗牛和猪或其他家养动物。

在牛中，泰拉霉素尤其适用于治疗、防治(metaphylaxie)和预防与泰拉霉素敏感的溶血曼海姆菌(mannheimiahaemolytica)、多杀巴斯德菌(pasteurellamultocida)、睡眠嗜组织菌(histophilussomni)和牛支原体(mycoplasmabovis)相关的牛呼吸道疾病。其还适用于治疗和防治与泰拉霉素敏感的牛莫拉氏菌(moraxellabovis)相关的感染性牛角膜结膜炎。

在猪中，泰拉霉素尤其适用于治疗、防治和预防与泰拉霉素敏感的胸膜肺炎放线杆菌(actinobacilluspleuropneumoniae)、多杀巴斯德菌、猪肺炎支原体(mycoplasmahyopneumoniae)和副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis)相关的猪呼吸道疾病。

描述

本发明描述了式(i)化合物使泰拉霉素增效的用途。出乎意料地，这些化合物已经证明，其能够在低剂量(0.01至100mg/l)使泰拉霉素的作用增效，所述剂量远低于它们单独可以具有抗微生物性质的那些剂量。因此，由于增效，与式(i)化合物共施用的泰拉霉素具有比通常观察到的更高的活性。

重要的是想到，从绝对上来讲任何分子都具有抗微生物性质。因此，必须与抑制细菌的最小浓度作比较来评估分子的抗微生物性质。

本发明基于令人惊讶的发现，即，在非常高的剂量(与用于该目的医药用途不相容的水平)具有抗微生物性质，且具有高于5000mg/l，有利地高于10000mg/l的最小抑制浓度(cmi)的化合物，在低剂量(0.01至100mg/l)具有增效作用。在这些剂量时，有可能在动物中使用化合物(i)。

仍然令人惊讶地，已经观察到，化合物(i)在低剂量时增效作用更好，并且当远离化合物(i)单独地具有抗微生物性质的剂量时，作用(对于在非常高的剂量时具有抗微生物性质的化合物)增加。

例如，已经出人意料地显示，在大约g/l的浓度(25000mg/l至50000mg/l的cmi，即2.5至5％，取决于菌株)时具有抗微生物性质的桉树脑(cinéole)，在接近于cmi的这些浓度(1至3倍稀释)时具有抗生素增效作用。

当其浓度降低至低于cmi时，桉树脑不再使抗生素增效(参见申请pct/ep2015/071093的实施例2和6)。然后，非常令人惊讶地，已显示，通过进一步显著地降低桉树脑的浓度(比cmi低10到50倍)，桉树脑再次在很多种的菌株中对很多种的抗生素具有增效作用，此时是在与医药或兽医用途相容的剂量。

非常有利的是，以远低于其功效阈值的这些剂量使用的化合物(i)通常可以用于动物中而不受毒性约束，因为不存在毒性或处于可接受的毒性水平。如果以具有抗微生物性质的高剂量使用它们，或者甚至以接近于其cmi的剂量(在此剂量，它们可以使抗微生物剂增效)使用它们，则将不是这种情况。

同样令人惊讶地，用根据本发明的化合物观察到的增效作用不是特异性地针对特定的耐受机制，而是在多种菌株中观察到，不管它们是否已产生一种或多种不同的耐受机制。

现有技术

现有技术在许多出版物中描述了一些化合物(i)的抗微生物性质。这些出版物没有预期化合物(i)在远低于其功效阈值的剂量时的增效作用。

对于化合物(i)的现有技术是大量的，因为它们属于已经在许多领域中被深入地研究的化学物质类别。本发明范围内的化合物(i)具有以下特征，所述特征能够将它们与现有技术相分离，并且所述特征能够考虑到它们作为施用至人和动物的抗微生物剂的增效剂的用途：

a/它们以低剂量(0.01至100mg/l)使用，所述剂量远低于它们的抗微生物性质阈值；它们的增效作用不是特异性地针对特定作用或耐受的机制。

b/它们已经通过适合于它们的物理化学特征的筛选方法来验证。

c/在它们增效的剂量时，它们具有允许在人或动物中安全使用的作用/毒性比例。

d/它们组成一个或多个分离的化学实体，其特征在于可以持续不断地再生产，因为用于获得它们的方法(合成、半合成、提取)允许这点。

e/它们没有特别的毒性，所述毒性即使在低剂量时也将阻止它们的使用(基因毒性、心脏毒性…)。

a/关于现有技术中测量的活性水平

在现有技术中，用于观察抗微生物活性的浓度与在人或动物中(特别在全身应用期间)的预期用途是不相容的。在大多数科学出版物中，考虑了医药用途，而测量的有效浓度(大约若干mg/ml)与这种用途是不相容的。测量的抗微生物作用经常为精油或其活性化合物的水平，大约若干mg/ml。但是，这样的浓度不适合在人或动物中(特别是全身地)的预期用途。一毫克每毫升对应于1g/l或1g/kg或0.1％。如果cmi为1mg/ml，取决于药代动力学参数，应当施用至少1g/kg/j体重。例如，对于牛，有效剂量应当为至少500g/j，而对于人，有效剂量应当为至少60g/j(这对应于最小剂量，因为这里假设产品被完全吸收并分布在身体中)。这些剂量因为过高而不能被考虑用于安全的治疗使用。

示例包括两篇出版物，其提及萜类的抗细菌作用和其使抗微生物剂增效的可能性：

-biointerfacae第2卷,第1期,2012,271-276:marinas等人：rosmarinusofficinalisessentialoilasantibioticpotentiatoragainststaphylococcusaureus。

如果该出版物似乎接近于本发明，那么重要的是注意到25μl/ml(或25ml/l，或25g/l)的考虑的(envisagée)桉树脑剂量(p274)远非可以施用至人或动物的剂量。考虑的协同测试是用50g/l的储存溶液(50％桉树脑)进行的，比在出版物中的桉树脑的cmi高，该剂量与医药用途不相容。

-journalofantimicrobialchemotherapy(2009)64,1219-1225:hendry等人:antimicrobialefficacyofeucalyptusoiland1,8-cineolealoneandincombinationwithchlorhexidindigluconateagainstmicroorganismsgrowninplanktonicandbiofilmcultures。

再一次，考虑了与具有抗微生物性质的产品的协同。考虑的桉树脑的浓度为4g/l，该剂量非常接近于在出版物中的桉树脑的cmi

(8-64g/l)，但是太高以至于不能考虑用于在人或动物中施用。

显然，本发明与这两个出版物不同，因为在后者中，考虑的剂量非常高，而考虑的浓度接近于cmi。

b/关于现有技术中描述的方法的不适当性

经由不同的方法(单独的活性成分、天然产物...)工作的作者对包含化合物(i)的化学物质家族通常使用标准的抗细菌作用测量方法，而没有使所述方法适应于萜类和苯丙素类的疏水性和挥发性。

例如，wo99/66796(wisconsinalumniresearchfoundation)描述了一种用于使微生物细胞对抗细菌化合物敏感的方法，其包括使抗细菌化合物与倍半萜烯接触的步骤，以改善抗细菌化合物的作用。

在本申请中，使用琼脂扩散法确定了cmi，所述方法对于化合物(i)和相关家族的挥发性和疏水性是不合适的。该方法由将用已知量的待测试化合物浸透的纸盘放置在接种有待研究的细菌的琼脂上组成。化合物的浓度梯度建立在每个盘周围的琼脂上；18小时后，测量抑制晕的直径。然而，对于干扰在琼脂中浓度梯度的形成的疏水化合物(由于在亲水表面上的非常不同的表面张力和接触角)，该方法是不可靠的。在一些区域，待测化合物的浓度远高于理论浓度。因此，测试不能是定量的，但是它们可以是定性的。进一步地，将待测疏水性化合物在乙醇中稀释，但不校正结果，即便乙醇是一种抗细菌的且挥发性的化合物。

应当注意，本申请教导了用除倍半萜烯类以外的萜烯类不会获得任何作用。

c/关于现有技术的化合物的毒性

关于天然化合物和组合物，天然来源与不存在毒性之间存在混乱。精油(及其衍生物)通常被描述为具有低毒性，这在食品应用或香料中通常是正确的，但在治疗施用中是错误的。

对于分离的化合物，也存在混乱，并且是基于化合物的天然来源(提取)。

例如，wo2006/120567(advancedscientificdevelopments)描述了药物组合物，其包含至少一种被描述为无毒性的活性治疗物质，所述物质选自香苇醇、百里香酚、丁香酚、莰醇、香芹酚、α-紫罗酮、β-紫罗酮、和其异构体、衍生物和混合物，并且包含作为第二活性治疗物质的抗生素。单独使用的香苇醇、百里香酚、丁香酚、莰醇、香芹酚、α-紫罗酮和β-紫罗酮具有抗细菌活性，然而它们中的一些也引起毒性问题，这在该申请中被忽略。

例如，香芹酚的毒性数据如下：dl50(小鼠，经静脉)为80mg/kg，而在两种哺乳动物物种(猫和大鼠)中的口服最低致死剂量为100mg/kg。应当将这些数据与在文献中考虑的0.3mg/ml(或300mg/kg)剂量作比较。

d/关于现有技术中描述的化合物的化学可变性

在质量和可再生产性方面，精油在工业规模上的使用是有问题的，因为精油的组成因批次而异。

例如，de19631037(boehringer)描述了茶树精油使抗生素对金黄色葡萄球菌菌株的作用增效的用途。茶树精油的主要组分为萜品烯-1-醇。

对于在人或动物中的应用，这种可变性具有三个后果，其限制了工业开发：

‐难以确保治疗作用的一致性

‐难以确保产品的低毒性

‐供应材料和管理其质量和可再生产性是昂贵的。

下表总结了这些现有技术的教导：

表1

与在低剂量(远低于它们具有抗微生物活性的剂量)时的化合物(i)相关的工作是新的，并且据我们所知，现有技术并未考虑到这种用途。

定义

“微生物(micro-organisme)”是指因为其小尺寸而肉眼不可见的任何活的生物体。

“生物体”是指能够出生、生长和正常繁殖的任何动物或植物生物实体(生物)。

在本专利中，微生物(microbe)的定义采用微生物定义，限于本发明所涉及的医药领域。因此，“微生物”是潜在致病的活的微生物(细菌、真菌、酵母和分枝杆菌)。因此，该术语不包括惰性病原体如病毒和朊病毒。

“抗微生物剂”是指旨在施用至人或动物的、能够杀死或抑制微生物生长的任何化合物。这些抗微生物剂的药学上可接受的盐也包括在该定义内。其包括例如普鲁卡因、二苄胺、乙二胺、乙醇胺、甲基葡糖胺牛磺酸等的钠盐、钾盐、钙盐等和氨基盐(selsaminés)，以及酸加成盐如盐酸盐和碱性氨基酸。因此，该术语包括旨在全身或局部使用的抗生素(其与耐受机制抑制剂的组合)、抗真菌剂。

“抗微生物性质”是指能够破坏或抑制微生物生长的任何物质的性质。具有抗微生物性质的产品尤其包括抗微生物剂和杀生物剂。

与包含旨在用于施用的抗细菌剂和抗真菌剂的术语“抗微生物剂”相比，术语“杀生物剂”包含旨在用于应用至惰性系统(病毒和朊病毒)的、具有抗微生物性质的产品。

“抗细菌性质”和“抗真菌性质”不仅是指杀细菌性质和杀真菌性质(其特征在于破坏细菌和真菌(和酵母、分枝杆菌))，还指抑制细菌性质和抑制真菌性质(其特征在于抑制所述细菌和真菌(和酵母、分枝杆菌)的生长)。具有抗细菌性质或抗真菌性质的产品尤其包括抗微生物剂。

对于本发明的目的，抗生素“耐受细菌”是指耐受至少一种、尤其至少两种、特别地至少三种、或甚至至少四种常规使用的抗生素或抗生素家族的细菌。

对于本发明的目的，“多重耐受细菌”是指耐受几种抗生素(特别地，菌株对其应当是敏感的或先验敏感的)的细菌，更特别地是指具有至少两种非天然耐受的细菌。

“天然耐受”和“获得性耐受”是有区别的。一些抗生素在无毒剂量对某些细菌菌株或物种从未有效过。这是天然耐受。当通常有效的抗生素被证明对一种细菌几乎无效或无效时，则这种细菌已经发展出获得性耐受。

对于本发明的目的，“微生物感染”是指由一种或多种微生物菌株引起的感染，并且包括从宿主定殖到病理期的阶段。因此，表述“微生物感染”包括微生物定殖导致的出现在人或动物中的任何不利作用、临床体征、症状或任何疾病。

根据本发明，“萜类”是指包含接近于萜烯的骨架的任何化合物。“萜烯”是指以生物方式通过c5单元的缩合(得到例如单萜、倍半萜烯)获得的异戊二烯衍生物。“接近于”是指骨架类似于萜烯，或者其不同在于，通常存在的至少一个烷基取代基可以不存在，或连接至另一个原子。骨架还可以被不同的基团取代，如饱和的或不饱和的、直链或环状的脂族基团(烷基、烯基、亚烷基)、氧基、醛、酯、醇、醚，和其含硫或含氮等价物。萜类可以有利地为天然来源的。

根据本发明，“苯丙素”是指包含接近于苯丙烷的骨架的任何化合物。“苯丙烷”是指由苯丙烷通过生物合成获得的衍生物，并且得到c6(芳香烃)-c3(脂肪烃)或c6(芳香烃)-c1(脂肪烃)衍生物和相应的内酯。“接近于”是指骨架类似于苯丙烷，特别是存在苯基单元，或者其不同在于，通常存在的至少一个烷基取代基可以不存在，或连接至另一个原子。骨架还可以被不同的基团取代，如饱和的或不饱和的、直链或环状的脂族基团(烷基、烯基、亚烷基)、氧基、醛、酯、醇、醚，和其含硫或含氮等价物。苯丙素可以有利地为天然来源的。

在本申请中使用的术语“预防(prophylaxie)”或“感染的预防(prévenir)”是指感染的临床体征或症状发作的任何程度的延迟，以及感染的临床体征或症状的严重性的任何程度的抑制，包括但不限于所述感染的全面预防。这要求将抗微生物剂和根据本发明的化合物共施用至人或动物作为预防措施，所述人或动物可能被微生物菌株定殖，例如在手术程序、医疗装置的植入或侵入性医疗程序之后。为了预防、改善和/或降低任何随后的感染的严重性的目的，可以在可能导致感染(尤其是医院感染)的程序之前、期间或之后进行这种预防性施用。

对于本发明的目的，术语“治疗”意味着在定殖时，或在被可能引起感染(如医院感染)的微生物菌株污染或疑似污染后，将抗微生物剂和根据本发明的化合物共施用至受试者(人或动物)。因此，术语“治疗”或“治疗感染”包括：

‐借助于抗微生物剂+根据本发明的化合物的共施用获得的任何治疗作用(抑制微生物的生长或破坏微生物)，以及观察到的临床体征或症状的改善，和受试者状况的改善；

‐减缓、中断以阻止感染的进展。抗微生物剂-根据本发明的化合物的共施用还可以减缓微生物的进展和/或完全或部分地防止微生物感染延伸到周围组织和其他组织；

‐抑制、减弱或预防感染的有害后果，如由在感染的或相邻的组织上的某些微生物产生的毒素引起的细胞损伤或生理损伤。

如本申请所使用的术语“防治(metaphylaxie)”是指对被认为是健康的但有风险的动物的任何预防性和系统性治疗。

术语“共施用”是指将泰拉霉素和根据本发明的化合物(或根据本发明的化合物的混合物)以组合的或并列的形式施用至受试者。组合包括任何药物组合、任何药物组合物、任何药物试剂盒和任何药物，其包含(i)至少泰拉霉素，和(ii)至少一种根据本发明的化合物。化合物(i)和(ii)可以以混合物的形式，或以分开的制剂或组合物的形式存在于所述组合中。组合还可以包含几种根据本发明的化合物，特别是两种或三种或更多种根据本发明的化合物。组合还可以包含一种或多种其他抗生素。由于常见的指征(其为抗微生物治疗的实施)，这些组分形成功能单元。这种组合治疗更具体地旨在预防和/或治疗微生物来源的感染和疾病，特别是医院感染。

共施用可以为同时的或随时间延续。

术语“同时的”是指将泰拉霉素和根据本发明的化合物(或根据本发明的化合物的混合物)同时一齐施用至受试者。可以以混合物的形式施用这些化合物，或者同时但分别以分开的组合物的形式施用这些化合物。

表述“顺序施用”是指将泰拉霉素和根据本发明的化合物(或根据本发明的化合物的混合物)非同时地施用，而是随时间一个接一个地分别施用。

术语使泰拉霉素“增效”是指根据本发明的化合物的使用产生比单独使用泰拉霉素所获得的预防、防治或治疗作用更高的预防、防治或治疗作用。这可以以不同的替代方案或累积方式表达：增强泰拉霉素的作用、在泰拉霉素的作用不变的情况下降低泰拉霉素的剂量、降低cmi。此外，增效能够最小化或甚至消除耐受的产生。

表述“增强泰拉霉素的作用”是指，在泰拉霉素的剂量不变的情况下，扩大泰拉霉素活性的微生物谱、增加泰拉霉素的作用速率、改善泰拉霉素的临床成功(治愈率)或临床成功速度(治愈的时间)。

表述“降低所使用的泰拉霉素的量”是指根据本发明的化合物的使用允许使用更低的泰拉霉素的量，所述量低于当单独施用泰拉霉素时，获得指定的治疗、防治或预防作用所通常必需的泰拉霉素的量。所使用的泰拉霉素的量的降低可以或多或少地显著；相比于获得指定的治疗或预防作用所通常必需的量，优选降低至少10％，并且更优选降低至少20％，甚至更优选降低至少40％，或甚至降低50％或更多。

“cmi”是指“最小抑制浓度(concentrationminimaleinhibitrice)”，其为物质的最低浓度，在此浓度下，在有利于微生物生长的条件下，在18至24小时的接触后不再观察到微生物的生长。

根据现行的国际标准(clsi标准m7-a9jan12)：将待测试化合物分散在马-欣二氏(muellerhinton)琼脂中，在固体琼脂介质中进行最小抑制浓度测量测试。然而，与化合物和组合物的疏水性有关的适应性对将它们分散在介质中是必需的：将化合物在溶剂中稀释。可以首先在一种或多种溶剂(用水稀释的80、用丙烯稀释的80、用水稀释的dmso)中，将掺入琼脂中的化合物和组合物稀释。介质可以是经阳离子调节的。用转向装置将菌株沉积在琼脂表面上。在实施例中，平行地测试用于溶解产品的不同方法，以规避涉及分子(抗微生物剂和增效剂)的水/溶剂分配系数的问题，因为细菌只在水相中生长。技术限制将不会影响体内测试。可以在液体介质(微孔板和管)中使用相同的稀释方法。对真菌使用相同的方法学。

cmi50和cmi90分别代表抑制50％和90％的相同属的菌株数量的浓度。

具有遗传毒性作用的产品是对遗传物质显示有害作用的产品。

可以通过艾姆斯氏试验测量遗传毒性，特别是根据国际协调会议(ich)的指导方针。

对于本发明的目的，“卤素原子”是指氟、氯、溴和碘原子。

对于本发明的目的，“杂原子”是指n、o或s，有利地指o。

对于本发明的目的，“(c1-c6)烷基”基团是指直链或支链饱和单价烃链，其含有1个至6个，优选1个至4个碳原子。示例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基或己基。

对于本发明的目的，“(c2-c6)烯基”基团是指直链或支链单价烃链，其含有至少一个双键，并且含有2个至6个碳原子。示例包括乙烯基或烯丙基。

对于本发明的目的，“(c1-c6)卤代烷基”是指如上面所定义的(c1-c6)烷基，其中一个或多个氢原子已被如上面所定义的卤素原子替代。特别地，其可以为cf3基团。

对于本发明的目的，“(c1-c6)烷氧基”基团是指如上面所定义的(c1-c6)烷基，其经由氧原子与分子的其余部分连接。示例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基和叔丁氧基。

对于本发明的目的，“(c2-c6)烯氧基”基团是指如上面所定义的(c2-c6)烯基，其经由氧原子与分子的其余部分连接。示例为-och2ch＝ch2基团。

对于本发明的目的，“(c1-c6)亚烷基(alkylène)”或“(c1-c6)烷二基(alcanediyle)”基团是指含有1个至6个碳原子的直链或支链二价烃链，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基或亚己基。

对于本发明的目的，“(c2-c6)亚烯基(alcénylène)”或“(c2-c6)烯二基(alcènediyle)”基团是指直链或支链二价烃链，其含有2个至6个碳原子和至少一个双键，例如亚乙烯基(vinylène)(亚乙烯基(éthénylène))或亚丙烯基。

发明的描述

本发明涉及被式i的化合物增效的泰拉霉素，其用于治疗、防治和预防微生物感染的用途。因此，其涉及一种泰拉霉素和具有下式i的化合物的组合：

其中r1、r2、r3彼此独立地代表h、oh、(c1-c6)烷基、(c2-c6)烯基、(c1-c6)卤代烷基、(c1-c6)烷氧基、(c2-c6)烯氧基、(c1-c6)卤代烷氧基、-o-co-(c1-c6)烷基；

a代表杂原子或r-(het)-r’或-(het)-r基团，其中r、r’彼此独立地代表任选被c1-c4烷基取代的(c1-c4)烷二基，并且het代表杂原子，a有利地代表-(het)-r基团；

式(i)化合物:泰拉霉素的质量比为8:1至1:10。

式(i)化合物:泰拉霉素的质量比更有利地为4:1至1:10，更有利地为1:1至1:10，甚至更有利地为1:1至1:5。

这意味着式(i)化合物的施用剂量与泰拉霉素的施用剂量处于相同数量级。

质量比为施用至人或动物的化合物和泰拉霉素的剂量(以mg/kg计)的比例。

令人惊讶地，已显示当根据本发明的化合物(或根据本发明的化合物的混合物)的剂量增加时，增效作用降低。这种增效作用可以在单独的化合物的cmi处重新出现，但是这不是本发明的目的。

在本发明的情况下，在体外，观察到增效作用的非活性化合物的浓度与观察到抗微生物性质时的抗微生物性质的阈值(cmi)相距甚远。相距甚远是指体外浓度比cmi低至少10倍，有利地至少20倍，更有利地至少50倍，甚至更有利地至少100倍。

特别地，对于引起考虑的微生物感染的病原菌株a，化合物(i)的浓度有利地满足以下方程式：

[c]<[cmi]/x

其中[c]为在菌株a中使用的根据本发明的化合物(i)的浓度，

[cmi]为在该菌株a中测量的单独的化合物(i)的cmi，

x大于或等于100，有利地大于或等于1000，更有利地x为2000至10000，或甚至大于50000。

在体外，化合物(i)的剂量小于100mg/l，有利地小于64mg/l，更有利地为0.01至25mg/l，甚至更有利地为1至16mg/l。

在施用的组合物中，式(i)化合物的浓度(每单位剂量每千克)有利地小于100mg，更有利地小于64mg。

可以以低浓度(体外浓度大约μg/ml)使用化合物(i)以使泰拉霉素增效，其与在动物中的预期用途完全相容(特别是如果期望全身施用)。

这使得能够考虑在动物中的剂量为小于64mg/kg，有利地为0.01至64mg/kg，更有利地为0.1至30mg/kg，甚至更有利地为0.5至10mg/kg。

有利地以一定的浓度施用根据本发明的增效化合物，在所述浓度在施用后其最大血清浓度小于250mg/l，有利地小于150mg/l，更有利地为10至150mg/l。

当然，可以将化合物以这些浓度施用至动物，包括全身施用，并且没有较大的副作用，特别是致癌性或遗传毒性。

通常，式(i)化合物没有遗传毒性作用。

值得注意的是，根据欧洲关于最大残留限量的法规(2010年12月22日的委员会法规37/2010)授权的物质清单中存在桉树脑。

有利地以小于64mg/kg，有利地0.01至64mg/kg，更有利地0.1至30mg/kg，甚至更有利地0.5至10mg/kg的剂量施用泰拉霉素。

对于泰拉霉素，在通常以2.5mg/kg的剂量施用的情况下，式(i)化合物的剂量可以为0.75mg/kg至2.5mg/kg，有利地0.75mg/kg至2mg/kg或甚至更小。

换言之，本发明涉及一种独立于耐受机制的用于使泰拉霉素的抗微生物活性增效的方法，其包括以下步骤：

a)选择式(i)化合物，其在考虑的剂量下单独无治疗活性(用作抗感染)，

b)制备组合物，其包含步骤a)中选择的化合物和泰拉霉素。

本发明还涉及一种用于在动物中治疗和/或预防微生物感染的方法，其包括将泰拉霉素和式(i)化合物共施用至患有或可能患有所述微生物感染的动物。

化合物和泰拉霉素适合于向动物同时、分别或错开施用。

令人惊讶地，已显示，以这种低浓度使用的式(i)化合物能够使泰拉霉素的活性增效。因此，这些增效剂的使用有利地允许泰拉霉素以较低浓度使用，和/或以通常的浓度使用，同时比在相同剂量单独的泰拉霉素具有更高的活性(增加作用的强度或作用的动力学)。

具体而言，本发明尤其能够：

a/剂量降低而作用不变：降低抑制/破坏通常敏感的微生物所需的泰拉霉素的量；

b/作用增强而剂量不变：增强泰拉霉素抑制/破坏敏感细菌的能力(改善作用的动力学、作用的强度，并将泰拉霉素的活性谱扩大到对泰拉霉素非一贯性敏感的细菌或耐受泰拉霉素的细菌)。

降低泰拉霉素的施用剂量(a/)不仅从治疗动物中的微生物感染的角度看(尤其是减少副作用)是有令人关注的，而且从环境的角度看(降低泰拉霉素的耐受的发生)也是不可忽视的。以较低的剂量使用泰拉霉素可以有助于控制新的耐受机制的发生。特别地，可以以较低的剂量使用泰拉霉素，其中泰拉霉素的施用剂量为泰拉霉素的必需剂量的1/50至3/4，所述必需剂量为没有共施用根据本发明的化合物时用于施用至动物以治疗微生物感染所需的剂量。泰拉霉素的剂量降低而作用不变限制了其毒性。当应用于家畜时，这能够降低屠宰前的延迟时间。

增强泰拉霉素的作用而剂量不变(b/)具有明确的临床意义，无论是从定量的角度改善抗微生物作用的动力学，还是从定性的角度使得能够用泰拉霉素治疗患有微生物感染的动物(在没有增效时菌株对泰拉霉素是敏感的或非一贯性敏感的)。泰拉霉素的作用速率的提高减少动物在“感染”状态下所消耗的时间，从而减少疾病的流行病学以及耐受的发生和扩散。

由于根据本发明的化合物的存在，能够在不改变抗微生物剂的剂量下提高泰拉霉素的杀细菌作用的速率。因此，增效的泰拉霉素的作用速率可以提高。

由于根据本发明的化合物的存在，泰拉霉素的谱可以被扩大，尤其是在不改变泰拉霉素的剂量下。因此，可以在菌株中使用被根据本发明的化合物增效的泰拉霉素，在没有增效时所述菌株对泰拉霉素不再敏感(尤其是因为耐受的发生)。

在一个实施方案中，式(i)化合物足以使泰拉霉素增效，因此单个的式(i)化合物的使用足以使泰拉霉素增效。然而，在某些情况下，可以考虑无活性化合物的组合使用。

在式(i)中，r2和r3各自代表h，r1代表(c1-c6)烷基，并且a代表杂原子o或r-o-r’或-o-r’基团，其中r、r’彼此独立地代表任选被c1-c4烷基取代的(c1-c2)烷二基。

有利地，化合物为式(ia)化合物：

其中r1、r2、r3和r’如上面所定义，特别地r2和r3各自代表h，r1代表(c1-c6)烷基，r’代表(c1-c2)烷二基。

有利地，式(i)化合物为桉树脑。

在本发明的范围内，微生物感染有利地为由选自以下潜在病原属的病原体引起的感染：醋菌属(acetobacter)、醋酸杆菌属(acetobacterium)、不动杆菌属(acinetobacter)、柠檬酸杆菌属(citrobacter)、肠杆菌属(enterobacter)、肠球菌属(enterococcus)、埃希氏杆菌属(escherichia)、幽门螺杆菌属(helicobacter)、嗜组织菌属(histophilus)、嗜血杆菌属(haemophilus)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、支原体属(mycoplasma)、莫拉克斯氏菌属(moraxella)、变形杆菌属(proteus)、普罗维登斯菌属(providencia)、假单胞菌属(pseudomonas)、沙门氏菌属(salmonella)、沙雷氏菌属(serratia)、葡萄球菌属(staphylococcus)、链球菌属(streptococcus)、放线杆菌属(actinobacillus)、奈瑟氏菌属(neisseria)、曼海玛氏属(mannheimia)、巴氏杆菌属(pasteurella)、念珠菌属(candida)、曲霉属(aspergillus)、隐球菌属(cryptococcus)、毛孢子菌属(trichosporon)、马拉色氏霉菌属(malassezia)和分支杆菌属(mycobacterium)。特别地，选自以下潜在病原属的病原体：曼海玛氏属、巴氏杆菌属、嗜组织菌属、支原体属、莫拉克斯氏菌属、放线杆菌属、嗜血杆菌属。

细菌菌株或物种有利地选自：醋菌属、醋酸杆菌属、不动杆菌属、放线杆菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、肠球菌属、埃希氏杆菌属、幽门螺杆菌属、嗜组织菌属、嗜血杆菌属、克雷伯氏菌属、曼海玛氏属、支原体属、莫拉克斯氏菌属、巴氏杆菌属、变形杆菌属、普罗维登斯菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、葡萄球菌属和链球菌属。更特别地，细菌菌株或物种有利地选自柠檬酸杆菌(citrobacterfreundii)、产气肠杆菌(enterobacteraerogenes)、阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)、大肠杆菌(escherichiacoli)、产酸克雷伯氏菌(klebsiellaoxytoca)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)、奇异变形杆菌(proteusmirabilis)、斯氏普罗威登斯菌(providenciastuartii)、沙门氏菌属物种(salmonellasp.)、粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)、鲍曼不动杆菌(acinetobacterbaumannii)、洋葱伯克霍尔德氏菌(burkholderiacepacia)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、葡萄球菌科(staphylococcaceae)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、屎肠球菌(enterococcusfaecium)、肠球菌属物种(enterococcussp.)、溶血曼海姆菌(mannheimiahaemolytica)、多杀巴斯德菌(pasteurellamultocida)、睡眠嗜组织菌(histophilussomni)、牛支原体(mycoplasmabovis)、牛莫拉氏菌(moraxellabovis)、胸膜肺炎放线杆菌(actinobacilluspleuropneumoniae)、多杀巴斯德菌(pasteurellamultocida)、猪肺炎支原体(mycoplasmahyopneumoniae)、猪链球菌(streptococcussuis)和副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis)。因此，细菌可以为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。

细菌更有利地选自溶血曼海姆菌、多杀巴斯德菌、睡眠嗜组织菌、牛支原体、牛莫拉氏菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀巴斯德菌、猪肺炎支原体、猪链球菌和副猪嗜血杆菌。

根据本发明的化合物有利地被全身施用。因此，它们适合于全身施用。

可以在任何配制的药物组合物中使用根据本发明的化合物，从而有助于其施用。药物组合物可以包含通常使用的所有药学上可接受的赋形剂，如载体或稀释剂。

可以经由口服、肠内、肠外(静脉内、肌内或皮下、腹膜内)、经皮(transcutanée)(或透皮(tansdermique)或由皮(percutanée))、皮肤或粘膜(尤其是经粘膜-颊、鼻、眼、耳、阴道、直肠)途径，或经由胃内、心内、腹膜内、肺内或气管内途径施用药物组合物。

药物组合物可以为干燥形式(所述干燥形式在使用时被重新配制(粉末、冻干物等))，固体形式(特别是扁囊剂、粉末、胶囊、丸剂、颗粒、栓剂、片剂，更准确地说是快速释放片剂、耐胃酸片剂或缓释片剂)，糊状形式(特别是凝胶、软膏、霜剂或胚珠)，液体形式(特别是糖浆，可注射的、不熔化的或口服的溶液，或滴眼剂)，气雾剂形式(喷雾、蒸汽或气体)，贴剂形式，可注射形式(为水性、非水性或等渗溶液)。

此外，药物组合物可以被包装，用于以单次剂量(单剂量)或多次剂量(多剂量)的形式的施用。

可以在同一个药物组合物中或分开的药物组合物中，同时、依次或随时间延续施用泰拉霉素和根据本发明的化合物。在分别施用的情况下，药物组合物的形式可以是相似的或不同的；施用途径可以是相同的或不同的。

将由医生根据具体情况调整施用计划。施用途径和剂量随各种的参数而变化，例如随患者状况、感染类型和待治疗的感染的严重程度而变化。

动物优选为哺乳动物，特别是人、宠物、家畜动物(牛、绵羊、山羊)。

具体实施方式

下面的实施例阐明了本发明。

cmi测量：根据上面定义的方案，根据现行的国际标准(clsi标准)，在固体琼脂介质中进行最小抑制浓度测量测试。可以首先在一种或多种溶剂(乙醇或用水稀释的dmso)中，将掺入琼脂中的化合物和组合物稀释。

抗生素为泰拉霉素。

除非另有说明，表中的比例为质量比。

实施例1：最小抑制浓度的测量

单独的泰拉霉素或与桉树脑组合的泰拉霉素的cmi显示在下表1至3中。

在这些表中，使用以下缩写：

atb＝泰拉霉素

c＝1,8-桉树脑

1/1：atb/c质量比

xmg＝固定量的xmg桉树脑，泰拉霉素的量随cmi的变化而变化

etoh＝乙醇

表1

表2

表3

显示桉树脑能够在多种菌株中使泰拉霉素增效。

实施例2：生长测试/杀细菌作用测试

生长测试在液体介质中进行，预先将抗生素增强剂分散在合适的溶剂(此处为dmso)中。

在泰拉霉素(浓度为其cmi的4或16倍)，泰拉霉素(浓度为其cmi的4或16倍)和1,8-桉树脑(质量比为1:1)，和泰拉霉素(浓度为其cmi的4或16倍)和1mg的1,8-桉树脑的存在下测量细菌生长动力学。

泰拉霉素的cmi＝2mg/l(菌株13120)和0.5mg/l(菌株13043)，

1在菌株13120(大肠杆菌属)中的生长测试

结果如图1所示，其图例为：

菱形：对照(在dmso中的单独的细菌)

方形：在dmso中稀释的泰拉霉素，浓度为其cmi的4倍

三角形：泰拉霉素和桉树脑，在dmso中稀释，泰拉霉素的浓度为其cmi的4倍，泰拉霉素/桉树脑质量比为1:1

叉形(×)：泰拉霉素和桉树脑，在dmso中稀释，泰拉霉素的浓度为其cmi的4倍，桉树脑的浓度为1mg/l

以非常低的剂量存在的桉树脑显示出增强了泰拉霉素的杀细菌作用。

2在菌株13043(胸膜肺炎放线杆菌)中的生长测试

结果如图2所示，其图例为：

菱形：对照(在dmso中的单独的细菌)

方形：在dmso中稀释的泰拉霉素，浓度为其cmi的16倍

三角形：泰拉霉素和桉树脑，在dmso中稀释，泰拉霉素的浓度为其cmi的16倍，桉树脑的浓度为1mg/l

交叉(×)：桉树脑对照，1mg/l

以非常低的剂量存在的桉树脑显示出显著减少细菌的数量，而泰拉霉素在单独使用时是该菌株的抑菌抗生素。

实施例3：耐受

将100微升待研究菌株的马-欣二氏肉汤培养物(重接种体>10¹⁰ufc/ml)铺在马-欣二氏平板上，所述平板含有等于泰拉霉素的cmi的0.5、1、2、4倍的油浓度。孵育48小时后，观察到可能为耐受突变的菌落的存在或不存在。

桉树脑的使用也显示出减少耐受细菌的发生。

结果如下表所示：

表4-菌株8147/葡萄球菌属-乙醇溶剂

尽管在金黄色葡萄球菌中单独使用泰拉霉素导致无数突变的发生，但是向泰拉霉素中加入桉树脑(5mg/l)不再导致突变的发生。

表5-菌株8146/葡萄球菌属-乙醇溶剂

在这里再次，桉树脑减少了突变的发生。