本申请要求2016年4月7日提交的美国临时专利申请号62/319,684、2016年5月4日提交的美国临时专利申请号62/331,951和2016年5月17日提交的美国临时专利申请号62/337,701的优先权，每个所述临时专利申请整体通过参考并入本文。关于联邦资助的研究的陈述本发明在由国立卫生研究院/国家牙科和颅面研究所(nationalinstitutesofhealth/nationalinstituteofdentalandcraniofacialresearch)(nih/nidcr)授予的资助号为de018549和de018529s1以及由国立卫生研究院/国家关节炎及肌肉骨骼和皮肤病研究所(nationalinstitutesofhealth/nationalinstituteofarthritisandmusculoskeletalandskindiseases)(nih/niams)授予的资助号为ar059402、ar31737和ar050452的政府支持下做出。美国政府在本发明中具有一定权利。本公开涉及用于对表面进行消毒、对对象进行麻醉和治疗炎症、疼痛、痒感、癌症、自体免疫疾病、纤维化疾病、皮肤色素沉着和/或其他皮肤障碍的方法和组合物。
背景技术：
：：皮肤是许多脊椎动物(包括人类)中的最大器官。它针对潜在有害的外部环境提供屏障保护。皮肤也代表了周围环境与生物体的有免疫能力且有感知能力的结构发生首次相互作用的位点。对暖、冷、机械诱因、疼痛和痒感具有感觉转导能力的细胞是背根和三叉神经节中的感觉神经元，它们的外周轴突与皮肤直接相接。然而，成功地靶向皮肤以治疗炎症、疼痛、痒感、癌症、自体免疫疾病、纤维化疾病、皮肤色素沉着和其他皮肤障碍，仍然遥不可及。皮肤中的生物化学途径包括与离子通道的瞬时受体电位(trp)超家族相关的途径。这个家族中的一种离子通道是trpv4。trpv4是可透过钙(即ca++)的多模式激活的非选择性阳离子通道。trpv4离子通道稳健地表达在哺乳动物皮肤的表皮角化细胞中。然而，trpv4也表达在使皮肤受神经支配的感觉神经元中。在trpv4-/-小鼠中，已显示出表皮与真皮之间的屏障功能受损的表皮表型。对于疼痛信号转导来说，已发现trpv4对于对有害的渗透压和机械诱因但不是热诱因的生理后撤反应来说是关键的，并且还发现它与炎症或神经损伤引起的伤害感受的敏化相关。尽管已了解trpv4在表皮角化细胞和使皮肤受神经支配的感觉神经元中表达，但trpv4在由uvb暴露诱发的病理性疼痛中的体内作用尚未被证实。此外，trpv4在痒感传播中的直接作用同样尚未被证实。trpa1是位于质膜上的另一种trp离子通道。trpa1充当环境刺激物、疼痛、冷和拉伸的传感器。尽管trpv4和trpa1在皮肤中发挥作用，但尚不知道靶向trpv4和/或trpa1是否将在炎症、疼痛、痒感、癌症、自体免疫疾病、纤维化疾病、皮肤色素沉着和其他皮肤障碍的治疗中有用。此外，目前尚不知道trpv4和trpa1的特异性抑制剂。需要用于皮肤障碍的新的且成功的治疗，以及用于消毒和麻醉的方法。技术实现要素：一方面，本公开涉及一种包含抑制剂和碘的组合物，其中所述抑制剂抑制trpv4、trpa1或其组合。一方面，本公开涉及一种包含抑制剂和麻醉剂的组合物，其中所述抑制剂抑制trpv4、trpa1或其组合。一方面，本公开涉及一种抑制trpv4、trpa1或其组合的抑制剂。在某些实施方式中，所述抑制剂不抑制trpv1、trpv2或trpv3。在某些实施方式中，所述抑制剂包含式i的化合物：其中a、b和c独立地选自芳香族基团、杂芳族基团、环烯基和杂环烯基；d是c1-c3亚烷基；e是键或c1-c2亚烷基；并且r选自氢、羟基、氨基、烷基、烯基、杂烷基、芳香环或杂芳环。在某些实施方式中，所述抑制剂包含选自下述的化合物：另一方面，本公开涉及对对象进行消毒的方法。在某些实施方式中，所述方法包括将所述对象与本文中详述的组合物相接触。在某些实施方式中，将所述对象与所述组合物接触一段足以使所述对象上的微生物群体减少的时间。在某些实施方式中，所述组合物被给药到所述对象的表面，其中所述表面选自皮肤区域、伤口和溃疡。在某些实施方式中，所述组合物将所述对象消毒。在某些实施方式中，所述组合物对所述对象进行灭菌。在某些实施方式中，所述组合物具有抗细菌活性。另一方面，本公开涉及对对象进行麻醉的方法。在某些实施方式中，所述方法包括向所述对象给药本文中详述的组合物。在某些实施方式中，所述方法包括将麻醉剂和抑制剂共同给药到所述对象，其中所述抑制剂抑制trpv4、trpa1或其组合。在某些实施方式中，所述组合物消毒并减轻疼痛。另一方面，本公开涉及在需要的对象中治疗和/或预防皮肤障碍的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的trpv4和/或trpa1抑制剂。在某些实施方式中，所述皮肤障碍选自胰腺炎、癫痫、关节炎、骨关节炎、多发性硬化症、中风、cns自体免疫病症、创伤性脑损伤、脊髓损伤、脑水肿、cns感染、神经-精神障碍、骨骼退行性-炎性障碍、三叉神经痛、结肠炎和硬化症。在某些实施方式中，所述三叉神经痛包含头痛。在某些实施方式中，所述trpv4和/或trpv4抑制剂包含式i的化合物：其中a、b和c独立地选自芳香族基团、杂芳族基团、环烯基和杂环烯基；d是c1-c3亚烷基；e是键或c1-c2亚烷基；并且r选自氢、羟基、氨基、烷基、烯基、杂烷基、芳香环或杂芳环。在某些实施方式中，所述trpv4和/或trpa1抑制剂包含选自下述的化合物：在某些实施方式中，所述化合物抑制trpv4和trpa1。在某些实施方式中，所述化合物不抑制trpv1、trpv2或trpv3。本公开提供了其他方面和实施方式，它们将根据下面的详细描述和附图变得显而易见。附图说明图1a-1g：角化细胞特异性且可诱导的trpv4缺失小鼠及其uvb反应。(图1a)作为角化细胞特异性且可诱导的trpv4敲除小鼠的产生的基础的trpv4的基因靶向和遗传操作。示出了小鼠trpv4靶向的顺序步骤，始于在trvp4外显子13两侧添加loxp元件并将两侧带有frt位点的选择盒插入到小鼠胚胎干细胞中。在产生嵌合小鼠并且所述工程化的突变稳定遗传后，通过繁育到flpe小鼠将所述选择盒去除。将得到的小鼠纯合子化并与k14-cre-ertam小鼠杂交，其然后允许角化细胞特异性且可诱导的trpv4敲除/敲落。(图1b)dna基因分型。示出了wt、杂合子和纯合的trpv4lox/lox小鼠的pcr产物。注意，所述pcr产物需要用paci消化，并且所有小鼠已通过另一个基因分型pcr预先筛查为cre+。(图1c)小鼠皮肤的角蛋白-1和角蛋白-14的共同标记指示了介质诱导的对照小鼠的已确立的模式(上图)和角化细胞中特异性trpv4敲落的类似模式(下图)。然而，在这些动物中注意到了棘层中k14的略微提高的表达，反映出弱化的trpv4表达和因此减少的ca++内流。k14通常在基底层向基底上层转变时被下调，与ca++信号转导的升高和末端分化的诱导相伴。(图1d)l5drg神经元中trpv4蛋白的表达在不同基因型之间没有差异。l5(＝使脚垫受神经支配的)drg神经元中trpv4免疫组织化学的光密度测定法(上图显微照片)，条形图说明对于基线和uv暴露后48小时两者来说，油处理与tam处理的小鼠相比trpv4蛋白的丰度缺少差异，证实了当使用k14作为cre驱动者时皮肤中trpv4敲落的特异性。注意，装饰的细胞的特征性形态将它们鉴定为drg感觉神经元。还应注意这些神经元中trpv4表达的不同水平，正如以前注意到的；n＝3只小鼠/组，≥50个神经元/小鼠。(图1e)在脚垫表皮中的梅克尔细胞中缺少trpv4表达。示出了一组共聚焦三荧光显微照片，描绘了来自于iko对照和他莫昔芬诱导的小鼠的免疫标记的爪垫的代表性图像的比较。注意到在这个实例中trpv4的完全敲落(红色通道)。对于梅克尔细胞(绿色通道)来说，使用抗细胞角蛋白8抗体。注意到在梅克尔细胞中缺少trpv4共标记。蓝色通道＝dapi。(图1f)在k14-cre-ertam小鼠中施用他莫昔芬对uvb行为性敏化缺少影响。注意到在(k14-cre-ertamxtrpv4lox/+)小鼠(＝当用他莫昔芬诱导时角化细胞中的trpv4杂合子)中对有害机械(上图)和热(下图)刺激的后撤阈值非常相近；n＝7只小鼠/组。还注意到在48小时时间点处具有峰值敏感度的时间过程。(图1g)在暴露于uvb的油处理的iko小鼠中，表达perk的l5drg神经元的尺寸分布。条形图说明在uvb暴露后48小时表达perk的感觉神经元以小尺寸和中尺寸为主，注意到不存在较大的神经元(>1200μm2)，n＝22个神经元。图2a-2g：uvb刺激装置和uvb角化细胞对照实验。(图2a)由led发射的uv光谱，其与几乎完全可透过uvb的石英的光谱(红色迹线)和具有非常低的uvb透过率的玻璃的光谱(蓝色迹线)交叠。(图2b)球透镜的聚焦性质。(图2c)uv-led与球透镜的组合的聚焦几何学。(图2d)uv-led不存在热效应；在焦点处随时间测量温度。(图2e)trpv3活化实验。通过莰酮诱导ca++瞬变，其可以被10μmipp有效地阻断，表明trpv3介导的信号转导。(图2f)与trpv4选择性激活剂gsk101相关的发现。在1°mk中对5nmgsk101做出响应的ca++瞬变，其可以被20μmgsk205完全阻断，表明它由trpv4特异性介导。gsk101反应也可以通过不存在外部ca++来消除，与trpv4信号转导相一致。(图2g)trpv4对于uvb-ca++反应来说是足够的——hek293t细胞异源转染。trpv4在hek293t细胞中的定向表达导致对uvb辐照做出响应的ca++瞬变，这在对照转染的细胞中被极大降低。预先暴露于20μmgsk205事实上在trpv4转染的细胞中消除了ca++信号，并消除了对照转染的细胞的中等信号。图3a-3e：trpv4的角化细胞特异性消融引起对uvb做出响应的疼痛反应行为的改变。(图3a)在tam诱导的iko小鼠中表皮trpv4的表达及其在trpv4的角化细胞特异性消融后的丧失。(i)trpv4免疫荧光。注意到介质(油)处理的对照而不是tam诱导的iko小鼠的表皮中的trpv4。标尺条＝10μm。(ii)来自于爪垫皮肤的表皮裂解物的western印迹。注意到在诱导的trpv4消融后trpv4的敲落和更完全的丧失(将β-肌动蛋白用于归一化)。(iii)示出了来自于爪垫皮肤的trpv4mrna的qrt-pcr，指示了与载体(油)相比对tam处理做出响应的显著的trpv4敲落。p<0.0001，t-检验。(iv)表皮谱系标志物的免疫荧光。在wt皮肤中，在开始终端分化后，基底表皮标志物角蛋白-14被下调，并且基底上层标志物角蛋白-1被诱导。在trpv4敲落后，这种平衡似乎被扰乱，其中一些棘层细胞显示出共同标记。标尺条＝10μm。(图3b)对uvb暴露做出响应的疼痛反应行为。由有害的机械刺激诱发的疼痛反应行为(自动vonfrey毛发测定法，左)或热诱发的疼痛反应行为(hargreaves测定法，右)的时间过程(单位为小时)。注意到相对于油处理的(介质)iko和wt小鼠，在trpv4-/-和tam处理的iko小鼠中敏化显著降低。n≥10只动物/组；**p<0.01anova。(图3c)疼痛反应行为与trpv4敲落水平之间的相关性。示出了n＝12只动物，对于它们来说两个参数可用并且trpv4mrna水平<0.45。注意4只介质诱导的动物(绿色符号)与它们的他莫昔芬诱导的对应体(红色符号)的比较。(图3d)表皮trpv4的丧失显示出对福尔马林注射引起的疼痛反应行为没有显著影响。条描绘了在注射后的前10分钟(阶段i)和10-45分钟(阶段ii)内的平均累积疼痛反应行为。n＝4/组。(图3e)l5drg神经元中磷酸化的erk。示出了对于油和tam处理的iko动物±暴露于uvb来说，l5drg切片的perk免疫荧光。注意到只有uvb暴露过的对照小鼠在使爪垫受神经支配的l5drg中显示出perk表达。定量示出在右侧。n＝3只动物/组，每只动物每个drg6个切片，**p<0.01anova。图4a-4e：结构和超微结构分析显示出uvb介导的皮肤组织损伤依赖于角化细胞trpv4，并且免疫组织化学分析证实了uvb介导的角化细胞的活化以及巨噬细胞和嗜中性粒细胞的召集依赖于角化细胞trpv4。(图4a)1μm甲苯胺蓝半薄切片。显微照片示出了皮肤对uvb做出响应的代表性发现，在uvb暴露后48小时取样。注意到在uvb刺激后，油处理(trpv+)但不是tam处理(trpv-)的iko小鼠表现出在表皮-真皮边界处的分离和组织损伤的稳健信号；注意粒细胞(gr，嗜中性粒细胞)。还注意到刚好在角质层(sc)下方，上部表皮显示出广泛的结构损伤，这也可以在trpv4敲落不完全的tam处理的iko小鼠的皮肤中看到，但不能在trpv4敲落更加完全的动物中看到(参见图2a)。标尺条＝20μm。der＝真皮；epi＝表皮。(图4b)通过em获得的超微结构发现。通过透射电子显微术检查从爪皮肤的1μm半薄切片选择的区域。(a-a’)和(c-c’)示出了在不存在uvb刺激的情况下，油和tam处理的两种iko小鼠的正常表皮(epi)结构。(a)和(c)示出了完整表皮。基底(bl)和棘(sp)层被放大，a’和c’展示了正常的组织化，没有表皮损伤的迹象。(b、b’、b”)、(d-d’)和(e-e’)示出了皮肤对uvb做出响应的代表性发现，在uvb暴露后48h取样。(b)在油处理的iko小鼠中被破坏的表皮。等同于所述加框区域的区域放大在(b’)中，其中表皮的粒细胞浸润是显著的(gr)，并起疱且伴有表皮从真皮的分离(双箭头)。(b”)表皮的与角质层(sc)相接触的上方部分，显示出广泛的空泡化和纤维蛋白在空泡内的沉积(星号)。(d)他莫昔芬处理的具有不完全的trvp4敲落的iko小鼠显示出与油处理的iko小鼠相似的皮肤表型，具有基底和棘层组织损伤、纤维蛋白沉积(星号)和细胞间空间(d’中的箭头)的强烈迹象。(e)具有trvp4的完全敲落的iko中的完整表皮，在(e’)中具有正常的基底和棘层。der，真皮。虚线指示真皮-表皮边界。标尺条＝20μm(对于a、b、c和d来说)；10μm(对于b’和e’来说)；2μm(对于其他显微照片来说)。(图4c)角化细胞中作为表皮激活的标志物的il-6上调。il-6免疫荧光揭示出trpv4缺陷小鼠对uvb暴露做出响应提高角化细胞il-6表达的能力降低。紧邻显微照片示出了蛋白质定量。密度测量是针对n≥3只小鼠/组，显示出油处理的iko小鼠的显著上调，而tam处理的小鼠缺乏这种上调。右侧条形图示出了il-6mrna的定量和时间过程。il-6mrna在从爪垫表皮分离总rna后，通过qpcr来确定。注意到在wt对照表皮中，在2小时时间点的早期和稳健的增加，尽管具有变动，而与此相反，在trpv4-/-表皮中非常温和的增加。还注意到在24小时时持续的稳健上调，而在trpv4-/-表皮中同样温和地上调。定量是针对n＝8-12只小鼠/组。*表示统计上显著的(p＝0.011，t-检验)；标尺条＝20μm。(图4d)在uvb暴露的皮肤中巨噬细胞的召集。注意到当表皮中的trpv4被消融时，在对照小鼠中由uvb暴露诱导的真皮cd68+巨噬细胞的数目显著降低。在右侧示出了定量(n＝3只小鼠/组；*p<0.05t-检验)；标尺条＝20μm。(图4e)表达弹性蛋白酶的嗜中性粒细胞向uvb暴露的皮肤的召集。示出了代表性的免疫荧光显微照片和相应的定量。注意到在对照小鼠中表达弹性蛋白酶的嗜中性粒细胞丰度的强烈提高，而在tam处理的iko小鼠中缺少这种提高。(n＝4只小鼠/组，*p<0.05t-检验)；标尺条＝40μm。图5a-5e：在trpv4-/-和对照小鼠中对uvb做出响应的组织病理学。(图5a)图4a-4e中示出的样品的trpv4敲落水平。该条形图显示了与wt相比，图4中示出的uvb暴露的皮肤样品的trpv4敲落的相对水平。相邻的后爪皮肤样品在暴露后48h进行rna提取并进行trpv4qrt-pcr；将来自于10只小鼠的合并的wtmrna值设为100％。(图5b)来自于trpv4-/-和wt对照小鼠的1μm半薄切片发现的光学显微镜分析。在上方行中示出了处于未刺激状态下的两种基因型的正常皮肤，当将皮肤暴露到uvb时在wt对照中存在表皮和真皮炎症，而在trpv4-/-中不存在，取样在48小时时进行。注意到炎性变化类似于如图4中所示油处理的iko小鼠的炎性变化。(图5c)trpv4-/-和wt对照小鼠的超微结构分析。(a-a’)和(b-b’)wt和trpv4-/-小鼠在不存在uvb刺激的情况下显示出正常的皮肤形态，具有完整的表皮(epi)。a’和b’示出了基底层(bl)细胞的更高放大倍数。(c-c’)具有空泡化(c中的插图)和粒细胞(嗜中性粒细胞)(粒细胞-gr)浸润(c’)的受损的表皮。(d-d’)暴露于uvb的trpv4-/-小鼠中的正常表皮和真皮的超微结构。der-真皮；nt，神经末梢。虚线表示真皮-表皮边界。标尺条＝10μm(对于a、b、c、c’和d来说)，2μm(对于其他显微照片来说)。(图5d)对uvb做出响应的表皮角化细胞中il-6上调依赖于trpv4；来自于trpv4-/-和wt对照小鼠的发现。示出了来自于未暴露和暴露到uvb的trpv4-/-和wt对照皮肤的荧光显微照片。注意到在暴露到uvb的wt中的强烈il-6信号，以及对于未暴露和uvb暴露两种状态来说，trpv4-/-中的低的信号。还注意到真皮中表达il-6的神经支配性外周神经末梢。(图5e)在iko小鼠中，在uvb-光照性皮炎中肥大细胞的丰度没有差别。左侧显微照片示出了在用他莫昔芬诱导的iko小鼠中，表皮下炎性组织内用甲苯胺蓝染色的肥大细胞，右侧显微照片是它在油处理的iko小鼠中的对应物。肥大细胞用白色箭头指示。标尺条＝20μm。右侧条形图指示了每个63x视野的肥大细胞计数的定量(每只小鼠5个视野，每组3只小鼠)。图6a-6h：对uvb做出响应的ca++向角化细胞中内流依赖于trpv4。(图6a)客户定制的uvb细胞照射装置。也参见图2。(图6b)1°mk中的fluo-4ca++成像。在装载ca++敏感性染料fluo-4之后，在uvb暴露之前(上图)和结束时(下图)1°mk的荧光显微照片。标尺条＝10μm。c-huvb诱发的ca++信号转导的曲线。使用fluo-4成像来检测uvb暴露后1°mk中的ca++瞬变。y轴指示荧光的增加δf，其被归一化到刺激前的信号f0(δf/f0)。示出的信号是来自于≥50个细胞的平均。(图6c)ca++信号转导依赖于uvb，并且在将石英盖玻片用阻止uvb透过的玻璃盖玻片代替时显著降低(参见图2a)。注意，正如有时观察到的，wt1°mk中的该特定ca++信号在uvb后保持。(图6d)uvb诱发的ca++信号转导依赖于外部[ca++]。(图6e)uvb诱发的ca++信号转导在trpv4-/-1°mk中没有观察到，揭示出trpv4离子通道的重要性。(图6f)uvb诱发的ca++信号转导在trpv4选择性抑制剂gsk205(20μm)存在下被强烈下调。(图6g)uvb诱发的ca++信号不被trpv3选择性抑制剂ipp抑制。对于ipp活性的验证，参见图2e。(图6h)uvb诱发的ca++信号可以被特异性plc抑制剂u73122强烈降低。图7a-7d：角化细胞trpv4在uvb诱发的ca++信号转导和疼痛反应行为中的中心作用——et1的影响。(图7a)et1对1°mk中uvb诱发的ca++信号转导的影响。图(i)示出了在1°mk中对uvb做出响应的平均ca++瞬变，它们被共同暴露于et1肽而增强，以及它们被抑制trpv4的gsk205或阻断et1蛋白水解加工的et转化酶抑制剂cgs35066而显著减弱。图(ii)示出了与(i)中相同的et增强的uvb诱导的ca++瞬变，但在这种情况下，它们被et(r)-a(bq123)和et(r)-b(bq788)的选择性拮抗作用减弱。图(iii)示出了当两种et(r)亚型被阻断时，et1增强的ca++瞬变的完全消除。(图7b)1°mk中4α-pdd诱发的ca++信号转导——与et1相关的发现。左侧图示出了对选择性trpv4激活剂4α-pdd做出响应的ca++瞬变(按照fura-2比率测量成像)。通过共同施用et1，可以观察到响应的显著提高，并且这部分依赖于et(r)-a且完全依赖于et(r)-b。(图7c)对uvb做出响应的小鼠爪中et1上调。免疫组织化学揭示出在油介质处理(trpv4+)而不是tam处理的iko小鼠的uvb暴露的皮肤中显著更强的et1信号。定量是针对n＝3只小鼠/组。***表示统计上显著的(p<0.001，t-检验)。(图7d)对et1脚垫注射做出响应的疼痛反应行为依赖于表皮trpv4。条形图概述了trpv4-/-与wt以及油处理与tam处理的iko小鼠的行为发现的比较。注意到在wt和油处理的iko小鼠中，et1的脚垫注射产生显著水平的机械触摸痛。trpv4-/-和tam处理的iko小鼠没有响应；n≥7只小鼠/组，**p<0.01，anova。图8a-8d：kctrpv4在uvb诱发的ca++信号转导和疼痛反应行为中的中心作用——与et1相关的补充发现。(图8a)gsk101诱发的ca++信号转导被et1增强。示出了对5nmgsk101做出响应的平均ca++测量值(fura-2)。注意到对共同暴露于et1做出响应的信号提高。(图8b)未受刺激的1°mk的et1分泌依赖于trpv4和plc。示出了在未受刺激的1°mk的上清液中的相对et1浓度(通过elisa确定，pg/ml；介质处理和wt对照被归一化至100)。注意到对trpv4的明显依赖性，正如在trpv4-/-1°mk中降低50％所指示的。此外，存在由trpv4的特异性抑制引起的显著下调，其是剂量依赖性的(两种gsk205剂量)并且可以通过两种不同化合物介导(gsk205、rn1734)。也存在et1分泌被plc的特异性抑制剂(u73122)和用作对照化合物的et转化酶抑制剂cgs35066下调。此外，在wt和trpv4-/-1°mk中plc抑制剂稳健地影响et1分泌。(图8c)uvb暴露的1°mk的et1表达依赖于trpv4和plc——免疫细胞化学。示出了在暴露于uvb的1°mk中的特异性et1免疫标记，使用了与用于ca++成像相同的uvb-led。uvb-led装置的使用阻止了et1elisa的使用，只可检查辐照过的细胞。注意到et1的免疫反应性被trpv4的特异性抑制(两种不同化合物gsk205、rn1734)、plc抑制(u73122)以及et转化酶的抑制(cgs35066)显著下调。(图8d)uvb暴露的1°mk的et1表达依赖于trpv4和plc——免疫细胞化学的定量。示出了每种条件n≥25个细胞的密度测量法测量值，背景被减除，示出了对uvb做出响应的et1显著上调(*p<0.05anova)，以及对使用选择性trpv4拮抗剂(gsk205、rn1734)、plc抑制剂u73122和et转化酶抑制剂cgs35066的处理来说，与对照处理和uvb暴露的细胞相比的显著下调；·p<0.05，t-检验；#p<0.05anova。图9a-9h：角化细胞中uvb诱发的炎性体活化依赖于trpv4。(图9a)对uvb做出响应的脚垫皮肤中的半胱天冬酶-1免疫标记。代表性图像来自于刺激前(对照)或uvb暴露后48小时的皮肤的切片。标尺条＝20μm。(图9b)半胱天冬酶-1免疫标记的定量。条形图显示光密度测定，n≥3只动物/组。比较：uvb暴露的wt相比于trpv4-/-，和iko+油相比于iko+tam。**p<0.01anova。(图9c)来自于1°mk±uvb暴露的半胱天冬酶-1的western印迹分析。注意到在uvb暴露的wt细胞中半胱天冬酶-1、特别是切开的半胱天冬酶-1的水平(下方条带)升高，但在来自于trpv4-/-小鼠的1°mk中，半胱天冬酶-1原和切开的半胱天冬酶-1两者完全不存在。(图9d)il-1β在uvb暴露后被诱导并依赖于trpv4。抗il-1β抗体免疫荧光，其余的与图a中相同。(图9e)il-1β免疫标记的定量，n≥3只动物/组。比较：uvb暴露的wt相比于trpv4-/-，和iko+油相比于iko+tam，**p<0.01anova。(图9f)uvb暴露的脚垫的组织间隙液中的il-1β浓度。示出了组织间隙灌洗液中的il-1β水平(elisa)。注意到在wt和油处理的iko小鼠中，在uvb后的强烈上调，与此相反，在trpv4-/-和tam处理的iko小鼠中显著减弱。n≥5只小鼠/组，**p<0.01anova。(图9g)cxcl5在uvb暴露后被诱导并依赖于trpv4。抗cxcl5抗体免疫标记，其余的与图a中相同。(图9h)cxcl5免疫标记的定量，n≥3只动物/组。比较：uvb暴露的wt相比于trpv4-/-，和iko+油相比于iko+tam，**p<0.01anova。图10a-10b：与健康人类皮肤相比，在光照性皮炎中表皮trpv4、et1和il-1β升高。(图10a)在急性光照性皮炎的表皮中trpv4、et1和il-1β分布的代表性显微照片，与健康人类皮肤进行比较。与健康皮肤相比，在急性光照性皮炎中对每种抗原的免疫染色提高。标尺条＝50μm(左)、100μm(中)、50μm(右)。(图10b)免疫反应性trpv4、et1和il-1β的形态计量分析。发现揭示出与健康人类皮肤相比，在急性光照性皮炎中所有三种蛋白质的免疫标记显著增加(n＝正常健康皮肤的3个对象和急性uv光照性皮炎的3个患者)。图11：人类慢性光照性皮炎的样例。上图示出了与图10a中显示的相同的正常健康人类皮肤，用于比较。下图示出了慢性光照性皮炎的实例，其具有棘层和基底层中的trpv4、et1(整个皮肤)和il-1β(整个皮肤)的提高的表达。与急性光照性皮炎相比，注意到表皮内组织间隙水肿的减少。标尺条＝50μm。图12a-12d：选择性trpv4抑制剂的外部表面施用减弱uvb诱发的疼痛反应行为和炎症。(图12a)uvb诱导的疼痛反应行为。疼痛行为被gsk205的表面施用减弱。左侧图示出了uvb暴露后对有害热诱因(hargreaves试验)做出响应的后撤阈值，以及它们被两种剂量的表面施用的gsk205(1mm和5mm；在暴露前60’和10’施用)调节。较高的剂量在uvb后48小时时引起热触摸痛的显著减弱；n＝6只小鼠/组；**p<0.01anova。右侧图示出了在trpv4-/-小鼠中温和的热触摸痛的发生，以及介质处理与5mmgsk205处理的小鼠相比相似的敏化，表明所述化合物在5mm下不存在脱靶效应；n＝5只小鼠/组。(图12b)在uvb暴露的脚垫中gsk205处理减弱角化细胞的il-1β表达——代表性显微照片。标尺条＝20μm。(图12c)在uvb暴露的脚垫定量中，gsk205处理减弱角化细胞的il-1β表达。条形图示出了来自于n＝3只小鼠/组的光密度测定法结果，**p<0.01anova。(图12d)gsk205处理减弱uvb暴露的1°mk的il-1β分泌。示出了对uvb做出响应的上清液中的il-1β浓度(elisa)。将细胞在+/-5μmgsk205的条件下培养。注意到在用gsk205处理后，对uvb做出响应的il-1β分泌的增加被阻止。**p<0.01anova。图13a-13b：选择性trpv4抑制剂的表面施用通过抑制鼠类角化细胞中促疼痛/致疼痛介导物的上调来减弱uvb诱发的疼痛反应行为——对cxcl5和il6的发现。(图13a)在uvb暴露的脚垫中gsk205处理减弱角化细胞的cxcl5表达——显微照片和定量。与图12b中相同，对uvb做出响应的脚垫角化细胞中cxcl5的特异性免疫标记被选择性上调，注意到使用gsk205处理时减弱。条形图示出了cxcl5免疫标记的光密度测定，n＝3只动物/组，每只动物分析≥3个切片。注意到对于介质处理的小鼠来说，在uvb暴露与未暴露之间存在显著差异，而对于用5mmgsk205表面处理的小鼠来说没有这种差异。介质与gsk205处理之间uvb暴露的比较，**p<0.01anova。标尺条＝20μm。(图13b)在uvb暴露的脚垫中gsk205处理减弱角化细胞的il-6表达——显微照片和定量。与图12b和图13a中相同，对il-6的特异性免疫标记证实了il-6与cxcl5和il-1β相似的调控。介质与gsk205处理之间uvb暴露的比较，**p<0.01anova。标尺条＝20μm。图14a-14d：选择性trpv4抑制剂的外部表面施用减弱uvb诱发的疼痛反应行为和炎症。(图14a)在用gsk205处理的小鼠中uvb-光照性皮炎被减弱。示出了爪垫皮肤的代表性h&e显微照片，标尺条＝20μm。与介质处理的小鼠相比，用gsk205处理uvb暴露的皮肤在24小时后改善了小鼠中的皮肤结构体系。(i)和(iii)在gsk205处理后uvb诱导的光照性皮炎的代表性皮肤切片显示出明显减少的炎性浸润、更少的海绵层水肿、以及真皮-表皮起疱并伴有剩余的表皮增厚。(ii)和(iv)在uvb诱导的光照性皮炎后，介质处理的小鼠的特征在于严重急性光照性皮炎的症状，例如海绵层水肿、表皮角化过度、真皮-表皮边界破坏(起疱)、以及明显的炎性浸润并伴有血管扩张和真皮水肿(箭头)。还注意到血管中的红细胞积累，指示了皮炎。(图14b)用trpv4特异性抑制剂表面处理减弱了致疼痛et1/edn1的上调。edn1mrna在从爪垫表皮提取总rna后通过qpcr确定。在介质处理的皮肤中注意到edn1表达的提高，其中在2小时时间点早期上调，并持续升高直至24小时时间点。这个时间过程类似于当与trpv4-/-相比时在wt对照小鼠中看到的(图15)。重要的是，使用5mmgsk205的表面处理导致这种调控的完全丧失；n＝4只小鼠/组，*p<0.05anova。(图14c)gsk205不起到防晒霜作用。示意示出了实验设置。(图14d)gsk205不起到防晒霜作用。条形图示出了来自于n＝7-8只小鼠/组的结果，注意到使用与(b)相同的表面施用的5mmgsk205时与介质对照相比不存在uvb透过率的变化，而使用防晒霜spf100时显著降低。图15：对uvb做出响应的小鼠爪中et1/end1上调。edn1mrna在从爪垫表皮分离总rna后通过qpcr确定。注意到在wt对照表皮中在2小时时间点时的早期增加及其在trpv4-/-中的完全不存在，和在24小时时的持续上调，与2小时时间点相比略微降低，而在trpv4-/-中同样缺少上调。对n＝4只小鼠/组进行定量。**表示统计上显著的(p<0.01，t-检验)。图16a-16b：皮肤uvb透过率试验。(图16a)用于测试皮肤对uvb的透过率的实验设置。(图16b)来自于图16a的结果。注意到在距uv光束中心500μm半径之内强度为70％。图17：trpv4在小鼠体内痒感传递中的作用。将组胺(10％)皮内注射到c57b/6对照(wt)或trpv4敲除小鼠(trpv4全敲除，n＝6/组)的颊中。在30分钟内，trpv4缺失小鼠与wt小鼠相比显示出痒感行为的显著减少((p<0.01)t-检验))。图18：trpv4在痒感中的作用。示出了在诱导trpv4敲除后，在角化细胞中具有trpv4缺失的小鼠中，与没有诱导的小鼠相比在给药致痒原后的抓挠行为的图。在没有诱导时，所述小鼠与野生型对照小鼠功能相同(moore等，proc.natl.acad.sci.u.s.a.2013,110,e3225-e3234)。与对照小鼠相比，对于在皮肤角化细胞中trpv4通道已被选择性缺失的小鼠来说，抓挠行为显著减少。图19：化合物16-19。化合物16-8/18h被设计成化合物16-8和16-18的混合体。化合物16-19在本文中也可以被称为16-8/18hy。图20：抑制通过trpv4的钙离子通量。本发明的化合物显示出针对trpv4的抑制活性，并且是比gsk205更强的拮抗剂。图21：疼痛的治疗。本文中公开的化合物在小鼠中减弱疼痛反应行为。图22：uvb暴露后疼痛的治疗。本文中公开的化合物在晒伤小鼠模型中减弱疼痛反应行为。图23：对trpa1的影响。本文中公开的化合物抑制trpa1，如通过测量钙瞬变所指示的。图24：对trpv1、trpv2和trpv3的影响。本文中公开的化合物不抑制trpv1、trpv2或trpv3，如通过测量钙瞬变所指示的。图25：工具化合物gsk205的修饰以提高trpv4的靶向。合成的化合物在分子的突显部分中不同，改变的残基用箭头指示。合成了化合物16-19以并入来自于在抗trpv4抗体筛选测定法中发现最强效的两种化合物16-8和16-18的两种修饰(参见图26)。图26a-26b：在具有trpv4定向表达的n2a细胞中评估化合物。(图26a)具有trpv4(大鼠)定向表达的n2a细胞中所有化合物的ca++成像筛选。在存在5μm相应抑制剂的情况下将所述细胞用trpv4选择性激活剂化合物gsk101(5nm)刺激。每个条上的数字对应于在≈100个细胞中的平均峰值δca++浓度。插图：在使用5nmgsk101激活之前和之后假着色的细胞的显微照片，此外注意到平均的ca++信号(fura-2ca++成像)的相应时间过程。除了化合物16–43c之外，与介质对照的差异达到统计上显著的水平p<0.01(单向anova)。(图26b)在表达trpv4的n2a细胞中，最强效的“获胜”化合物的剂量响应。ic50为：0.45±0.05μm(16-8)，0.59±0.12μm(16–18)，0.81±0.1μm(16–19)，4.19±0.71μm(gsk205)。从每个数据点≥75个细胞的平均峰值δca++浓度产生的图。图27a-27b：化合物16-8和16-19对trpv4通道的抑制——膜片钳电生理学分析。(图27a)在用5nmgsk101激活后trpv4介导的电流的电流-电压关系。记录在trpv4-gfp+n2a细胞中进行。所述代表性迹线表示≈12次扫描的平均值。在我们的实验中，将细胞与相应化合物(5μm)预温育5分钟。(图27b)在-100mv/+100mv下的平均电流密度被抑制剂显著降低(*p<0.05；单向anova；n≥5个细胞/组)。图28a-28b：在i°细胞中化合物16-8比gsk205更强效地抑制trpv4。(图28a)1°(原代)关节软骨细胞(猪)；对5nmgsk101的刺激做出响应，最强效的化合物16-8与gsk205之间的剂量响应的比较。插图：软骨细胞对使用gsk101的激活做出响应，fura-2ca++成像；右侧图像在施用gsk101后5秒获取。16-8比gsk205显著更强效(平均值±sem，n＝6个独立实验，n≥25个细胞/实验；*p<0.05，t-检验)。纵坐标示出了平均峰值δca++浓度。(图28b)1°(原代)星形细胞(大鼠)；对5nmgsk101做出响应，16-8与gsk205之间的剂量响应的比较。插图：星形细胞对使用gsk101的激活做出响应；右侧图像在施用gsk101后5秒获取(平均值±sem，n＝5个独立实验，n≥200个细胞/实验；*p<0.05，t-检验)。纵坐标示出了平均峰值δca++浓度。图29a-29b：化合物16-8和16–19也强效地抑制trpa1而不抑制trpv1-3。(图29a)相对于trpv1-3的特异性。16-8和16–19(各5μm)两种化合物都不抑制trpv1、-2或-3通道(都是小鼠的同工型)，在n2a细胞中定向过表达和随后的ca++成像。示出了平均值±sem，每种条件≥100个细胞。(图29b)trpa1(小鼠，在n2a细胞中定向表达)被gsk205、16-8和16–19剂量依赖性抑制，用100μm芥子油活化，得到的ic50为5.56±0.4μm(gsk205)、0.41±0.37μm(16–19)、0.43±0.3μm(16-8)。图从每个数据点≥75个细胞的平均峰值δca++浓度产生。图30a-30b：化合物16-8和16–19的细胞毒性研究。使n2a细胞经历浓度逐渐提高的化合物16-8和16–19，在接下来的48h分析得到的细胞存活率。(图30a)在各种不同浓度的16-8存在下细胞存活率的时间过程。注意到在40和80μm下的明显降低。(图30b)与(图30a)中相同，针对化合物16–19，具有相似的结果。2个独立实验的代表性结果。图31a-31d：16-8和16-19有效地减弱福尔马林诱发的三叉神经刺激痛。(图31a)在4％福尔马林的须垫注射后，wt小鼠中的疼痛反应行为的时间过程。所述小鼠用gsk205、16-8或16–19预先注射(i.p.，10mg/kg；在福尔马林之前15分钟)。注意到在较晚的“神经”阶段，疼痛反应行为被化合物16-8、16–19，但不被gsk205有效减少。(图31b)累积响应被分为3个阶段：急性阶段(0–5分钟)，中间阶段(5–15分钟)和晚期“神经”阶段(15–45分钟)。注意到在晚期阶段疼痛反应行为被16-8、16–19，但不被gsk205显著减少(*p<0.01，相比于介质和gsk205，单向anova)。(图31c)与在(图31a)中相同，但还包括trpv4-/-小鼠。在福尔马林激惹之前15分钟，除了已确立的trpa1阻断剂a967079(25mg/kg)之外，化合物以10mg/kgi.p.施用。以前在trpv4-/-小鼠中确立的在早期和晚期阶段中疼痛反应行为的减弱被重演，其被trpa1阻断剂a967079进一步降低。(图31d)与在(图31b)中相同，加上包含trpv4-/-小鼠。trpa1阻断剂a967079的稳健效果，在早期阶段被16-8和16–19、在晚期阶段被16-8、在晚期阶段部分被16–19等效能地模拟。(图31a、图31c)示出了每个时间点的平均行为测量值，(图31b、图31d)中的条表示平均值±sem；对于(d)来说：*p<0.05；#p<0.005，单向anova；对于所有图来说，n＝5–8只小鼠/组。图32a-32f：化合物16-8减弱急性胰腺炎并改善疼痛行为。(图32a)蛙皮素诱发的急性胰腺炎引起胰腺水肿，其被化合物16-8(10mg/kg，在首次暴露于蛙皮素之前30分钟施用)消除。(图32b)蛙皮素诱发的急性胰腺炎强烈升高血清中的细胞毒性标志物淀粉酶。在16-8处理的动物中，淀粉酶减少，但不显著。(图32c)蛙皮素诱发的急性胰腺炎引起血清中髓过氧化物酶(mpo)活性升高，这是炎性细胞浸润到胰腺中的标志物。在16-8处理的小鼠中mpo活性显著降低。(图32d)蛙皮素诱发的急性胰腺炎可以在组织学上容易地证实，在示出的显微照片图中示例。注意到在中图中与介质对照激惹的小鼠中未发炎的胰腺相比，胰腺炎症增加，并且它被使用化合物16-8的处理减弱。(图32e)条形图显示了如(图32d)中所示的炎性组织参数的定量。注意到在蛙皮素急性胰腺炎小鼠中炎症指数显著提高，以及它在使用化合物16-8处理后的显著降低。(图32f)蛙皮素诱发的急性胰腺炎引起疼痛行为，被化合物16-8显著降低。注意到在蛙皮素诱导的急性胰腺炎中，在6h试验时期内活性的极大降低。对化合物16-8的全身性施用做出响应，这种疼痛反应行为被极大改善。结果被表示为平均值±sem；n＝6只小鼠/组；*p<0.05(单向anova)。图33a-33e：化合物16-8、16-19和gsk205在体内的药代动力学/药物毒性。(图33a)在几种鼠类组织/器官中，化合物16-8、16-19和gsk205(10mg/kg)在i.p.注射后1h的浓度。(图33b)化合物16-19在几种器官中在6h和24h时的时间过程。选择16-19是因为它在1h时间点时水平升高，并且是基于16-19比16-8和gsk205更加亲脂的估计。注意到在6h时的测量值始终比24h时的高。所有值都显著高于1h时。(图33c)1小时后在脂肪和胰腺中16-8、16-19和gsk205的浓度。注意到16-8与16-19和gsk205相比较低的浓度，但仍高于它的ic50。(图33d)在1h和24h时间点处胰腺中16-8的浓度。(图33e)在4h/37℃后的稳定浓度表明了化合物16-19在血浆中的结构稳定性。结果被表示为平均值±sem，对于所有实验来说n＝6只小鼠/实验组。图34a-34c：化合物16-8、16-19没有心、肾和肝毒性。(图34a)在化合物的i.p.注射(10mg/kg)后的心率时间过程。在介质与化合物之间心率不存在显著差异。(图34b)与介质对照相比，在用16-19和16-8处理的动物中血清肌酸酐未显著升高。(图34c)与介质对照相比，在用16-19和16-8处理的动物中血清丙氨酸氨基转移酶(alt)水平未显著升高。对于所有实验来说n＝6只小鼠/组。图35：化合物16-08至16-19的通用合成方案。试剂和条件：(i)k2co3，ch3cn。(ii)zn，meoh，12mhcl。(iii)1,1′-硫羰基二咪唑。(iv)meoh中的7mnh3。(v)etoh，回流。详细描述本公开涉及处理对象的皮肤或伤口以便对它们进行消毒并去除任何污染的和可能有害的细菌或其他微生物。本公开还涉及减少可能由碘或局部麻醉剂引起的疼痛、炎症和/或刺激。本文中描述了用于对对象进行消毒、对对象进行麻醉以及治疗和/或预防皮肤障碍的组合物和方法。皮肤起到外部环境与脊椎动物生物体之间的必不可少的屏障的作用。皮肤中的角化细胞吸收uv光，在过度暴露后引起皮肤炎症、疼痛和痒感，其随后引起皮肤色素沉着。本发明人鉴定到皮肤、特别是它的表皮上皮细胞实质上参与感觉转导。本文中描述了一种晒伤的小鼠模型，并将其用于诱导由对光的uv光谱做出响应的有限、自我消解的炎症所诱发的低感觉阈值的状态。uv诱发的感觉阈值的降低具有病理性疼痛的主要标志，这是这种模型的有价值的特点。1.定义除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。在有冲突的情况下，以本文件、包括定义为准。下文描述了优选的方法和材料，尽管与本文中描述的相似或等同的方法和材料也可用于本发明的实践或试验。本文中提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献整体通过参考并入本文。本文中公开的材料、方法和实施例仅仅是说明性的，而不打算是限制性的。当在本文中使用时，术语“包含”、“包括”、“具有”、“可以”、“含有”及其变化形式，打算作为开放式过渡性短语、术语或词语，其不排除其他行动或结构的可能性。没有具体数目的指称包括复数指称物，除非上下文明确指示不是如此。本公开还设想了包含本文中提出的实施方式或要素、由它们构成和基本上由它们构成的其他实施方式，不论是否明确阐述。对于本文中数值范围的叙述来说，明确设想了在其之间的具有相同精确度的每个居间数字。例如，对于6-9的范围来说，除了6和9之外还设想了数字7和8，对于6.0-7.0的范围来说，明确设想了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。在本文中更详细地描述了特定官能团和化学术语的定义。化学元素按照cas版本的元素周期表来鉴定(periodictableoftheelements，cas版本，《化学和物理学手册》(handbookofchemistryandphysics)第75版，内封面)，特定官能团通常如本文中所述来定义。另外，有机化学的普通原理以及特定功能组成部分和反应性被描述在下述文献中：《有机化学》(organicchemistry)，thomassorrell，universitysciencebooks，sausalito，1999；smith和march的《march高等有机化学》(march'sadvancedorganicchemistry)，第5版，johnwiley&sons,inc.，newyork，2001；larock，《综合有机转化》(comprehensiveorganictransformations)，vchpublishers,inc.，newyork，1989；carruthers，《有机合成的一些现代方法》(somemodernmethodsoforganicsynthesis)，第3版，cambridgeuniversitypress，cambridge，1987；每个所述文献的全部内容通过参考并入本文。术语“酰基”或“羰基”是指-c(o)r基团，其中r选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环基、杂芳基、芳烷基、环烷基烷基、杂芳烷基和杂环基烷基，其任一者可以任选地被取代，例如被一个或多个取代基取代。例如，当r是烷基时，这个基团可以被称为烷基羰基。术语“酰基”或“羰基”包括例如烷基羰基、环烷基羰基、杂环基羰基、芳基羰基或杂芳基羰基取代基，其任一者可以进一步被取代(例如被一个或多个取代基取代)。术语“烷基”是指含有所指示的碳原子数的直链或支链烃链。例如，c1-c12烷基指示所述烷基可以具有1至12个(含)碳原子，并且c1-c4烷基指示所述烷基可以具有1至4个(含)碳原子。烷基可以任选地被取代。c1-c4烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基。术语“亚烷基”是指具有1至6个碳原子的二价烃基，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基和亚丁基。亚烷基包括c1-c2亚烷基或c1-c3亚烷基或c1-c4亚烷基。术语“烯基”是指具有一个或多个双键的直链或支链烃链。烯基的实例包括但不限于烯丙基、丙烯基、2-丁烯基、3-己烯基和3-辛烯基。双键碳之一可以任选地作为烯基取代基的附连点。烯基可以任选地被取代。术语“炔基”是指具有一个或多个叁键的直链或支链烃链。炔基的实例包括但不限于乙炔基、炔丙基和3-己炔基。叁键碳之一可以任选地作为炔基取代基的附连点。炔基可以任选地被取代。术语“芳基”或“芳香族”是指芳香族单环、二环或三环烃环系统，其中能够取代的任何环原子可以被取代(例如被一个或多个取代基取代)。芳基组成部分的实例包括但不限于苯基、萘基和蒽基。芳香胺是被一个或多个氨基取代的芳基。芳香醇是被一个或多个羟基取代的芳基。芳香胺和芳香醇两者都可以被其他取代基进一步取代。术语“芳烷基”是指其中烷基的氢原子被芳基代替的烷基组成部分。芳烷基包括其中超过一个氢原子已被芳基代替的基团。芳烷基的实例包括苯甲基、2-苯基乙基、3-苯基丙基、9-芴基、二苯甲基和三苯甲基。术语“羧基”是指–c(＝o)or基团，其中r选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环基、杂芳基、芳烷基、环烷基烷基、杂芳烷基和杂环基烷基，其任一者可以任选地被例如一个或多个取代基取代。术语“羰基氨基”或“酰胺基”是指基团–c(o)nr'r”，其中r'和r”独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环基、杂芳基、芳烷基、环烷基烷基、杂芳烷基和杂环基烷基，或者r'和r”与它们所附连的氮一起可以形成环。r'和r”基团可以任选地被例如一个或多个取代基取代，或者当r'和r”与它们所附连的氮一起形成环时，所述环可以任选地被例如一个或多个取代基取代。当在本文中使用时，术语“环烷基”是指具有3至12个碳(例如3、4、5、6或7个碳原子)的非芳香族饱和或部分不饱和的环状、二环、三环或多环烃基。任何环原子可以被取代(例如被一个或多个取代基取代)。环烷基可以含有稠合的环。稠合环是共有一个或多个共同碳原子的环。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环己二烯基、甲基环己基、金刚烷基、降莰基和降莰烯基。术语“环烯基”是指具有单个环和至少一个内部不饱和点的4至8个碳原子的环状烯基。任何环原子可以被取代(例如被一个或多个取代基取代)。当在本文中使用时，术语“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘的任何自由基。当在本文中使用时，术语“卤代烷基”是指其中一个或多个氢原子被卤素代替的烷基，并包括其中所有氢都被卤素代替的烷基组成部分(例如全氟代烷基例如cf3)。当在本文中使用时，术语“杂芳基”或“杂芳族”是指芳香族5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环环系统，其如果是单环的话具有1-3个杂原子，如果是双环的话具有1-6个杂原子，或者如果是三环的话具有1-9个杂原子，所述杂原子独立地选自o、n、s、p和si(例如碳原子和如果是单环、双环或三环的话，分别1-3、1-6或1-9个独立地选自o、n、s、p和si的杂原子)。任何环原子可以被取代(例如被一个或多个取代基取代)。杂芳基可以含有稠合环，其是共有一个或多个共同原子的环。杂芳基的实例包括但不限于吡啶、嘧啶、吡嗪、哒嗪、吡咯、咪唑、吡唑、唑、异唑、呋喃、噻唑、异噻唑、噻吩、喹啉、异喹啉、喹啉、喹唑啉、噌啉、吲哚、异吲哚、中氮茚、吲唑、苯并咪唑、酞嗪、蝶啶、咔唑、卡啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、吩嗪、萘啶和嘌呤的自由基。当在本文中使用时，术语“杂环基”是指非芳香族饱和或部分不饱和的3-10元单环、8-12元双环或11-14元三环环系统，其如果是单环的话具有1-3个杂原子，如果是双环的话具有1-6个杂原子，或者如果是三环的话具有1-9个杂原子，所述杂原子选自o、n、s、si和p(例如碳原子和如果是单环、双环或三环的话，分别1-3、1-6或1-9个选自o、n、s、si和p的杂原子)。任何环原子可以被取代(例如被一个或多个取代基取代)。杂环基可以含有稠合环，其是共有一个或多个共同原子的环。杂环基可以包括杂环烯基。杂环基的实例包括但不限于四氢呋喃、四氢噻吩、四氢吡喃、哌啶、哌嗪、吗啉、吡咯啉、嘧啶、吡咯烷、二氢吲哚、四氢吡啶、二氢吡喃、噻蒽、吡喃、苯并吡喃、呫吨、吩嗪、吩噻嗪、呋咱、内酯类、内酰胺类例如氮杂环丁酮和吡咯烷酮、磺内酰胺类、磺内酯类等的自由基。术语杂烷基是指其中一个或多个(优选为1、2或3个)碳原子被一个或多个杂原子代替的烷基、烯基或炔基，所述杂原子选自o、n、s、si和p。杂烷基包括例如烷氧基例如甲氧基或乙氧基，或甲氧基甲基-、腈-、甲基羧基烷基酯-或2,3-二氧乙基-。此外，术语杂烷基是指羧酸或源自于羧酸的基团例如酰基、酰氧基、羧基烷基、羧基烷基酯例如甲基羧基烷基酯、羧基烷基酰胺、烷氧基羰基或烷氧基羰基氧基。术语“羟基”是指–oh自由基。术语“烷氧基”是指–o-r基团，其中r是烷基、烯基、炔基、环烷基或杂环基，其任一者可以任选地被例如一个或多个取代基取代。术语“芳氧基”是指–o-芳基自由基。术语“卤代烷氧基”是指–o-卤代烷基自由基。术语“取代基”是指在烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、芳烷基或杂芳基上，在该基团的任何原子处“取代的”基团。适合的取代基包括但不限于酰基、酰基酰胺基、酰基氧基、烷氧基、烷基、烯基、炔基、酰胺基、氨基、羧基、氰基、酯、卤素、羟基、亚氨基、硝基、氧代(例如c＝o)、膦酸酯、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、磺氨基、磺酰胺基、硫代酰胺基、硫醇、硫代(例如c＝s)和脲基。在实施方式中，基团上的取代基独立地是任一单个上述取代基或上述取代基的任何组合。在实施方式中，取代基自身可以被任一上述取代基取代。上述取代基在本文中可以被简写，例如缩略语me、e和ph分别代表甲基、乙基和苯基。有机化学家使用的缩略语的更详尽的名单出现在有机化学杂志(journaloforganicchemistry)每一卷的第一期中；该名单通常呈现在题为“缩略语标准名单”(standardlistofabbreviations)的表格中。所述名单中包含的缩略语以及被本领域普通有机化学家使用的所有缩略语，通过参考并入本文。对于化合物来说，其基团和取代基可以按照所述原子和取代基容许的化合价来选择，使得所述选择和取代产生稳定的化合物，例如不通过例如重排、环化、消除等自发地经历转化的化合物。在通过从左向右书写的常规化学式指定取代基的情况下，它们任选地涵盖由从右向左书写所述结构而得到的取代基，例如-ch2o-任选地也叙述为-och2-。根据本领域中使用的惯例，基团：在本文的结构式中用于描绘作为组成部分或取代基附连到核心或骨架结构的点的键。当应用于一个或多个目标值时，本文中使用的术语“约”是指与所陈述的参比值相近的值。在某些情况下，术语“约”是指在任一方向上(大于或小于)落于所陈述的参比值的20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小值之内的值的范围，除非另有陈述或以其他方式从上下文明显看出(除了在这些数字超过可能值的100％之外)。“给药”是指通过任何适合的途径递送化合物或组合物以实现所需效果。给药可以包括任何方便的给药途径，不论是全身性/外周性还是在所需作用位点处，包括但不限于口服(例如通过摄食)，表面(包括例如透皮、鼻内、眼部、颊和舌下)，肺，呼吸(例如通过吸入或吹入疗法，使用例如气溶胶，通过例如口或鼻)，直肠，阴道，肠胃外例如通过注射包括皮下、真皮内、肌肉内、静脉内、动脉内、心脏内、鞘内、脊柱内、囊内、囊下、眶内、腹膜内、气管内、角质层下、关节内、蛛网膜下和胸骨内，通过储集物(depot)的例如皮下或肌肉内植入。在某些实施方式中，给药可以是表面的。“共同给药”是指同时或顺序给药。化合物或组合物可以在另一种化合物或组合物的给药之前、同时或之后给药。本领域技术人员可以根据患者、待治疗的具体疾病、障碍或病症、治疗的持续时间、同时进行的疗法等来选择适合的剂量和给药途径。在某些实施方式中，考虑到所述疾病、障碍或病症(例如皮肤炎症、疼痛或痒感)的严重性，选择使有效性和潜在副作用平衡的剂量。术语“对照”、“参比水平”和“参比”在本文中可互换使用。所述参比水平可以是预定的值或范围，其被用作评估测量结果的基准。当在本文中使用时，“对照组”是指一组对照对象或细胞。所述预定的水平可以是来自于对照组的截止值。所述预定的水平可以是对照组的平均值。截止值(或预定的截止值)可以通过自适应指数模型(aim)方法来确定。截止值(或预定的截止值)可以从患者组的生物样品，通过受试者操作曲线(roc)分析来确定。生物学
技术领域：
：中公知的roc分析是一种试验将一种病症与另一种病症区分开的能力的确定，以例如确定每种标志物在鉴定具有crc的患者中的性能。roc分析的描述提供在p.j.heagerty等(biometrics2000,56,337-44)中，其公开内容整体通过参考并入本文。或者，截止值可以通过患者组的生物样品的四分位数分析来确定。例如，截止值可以通过选择对应于25th-75th百分位数范围内的任何值的值，优选地对应于25th百分位数、50th百分位数或75th百分位数、更优选地75th百分位数的值来确定。这些统计分析可以使用本领域中已知的任何方法来进行，并且可以通过大量可商购的软件包中的任一种(例如来自于下述公司的软件包：analyse-itsoftwareltd.,leeds,uk；statacorplp,collegestation,tx；sasinstituteinc.,cary,nc.)来进行。靶或蛋白质活性的健康或正常水平或范围可以根据标准做法来定义。对照可以是疾病状态已知的对象或来自于所述对象的样品。对照可以包括细胞，其被称为“对照细胞”。所述对象或来自于所述对象的样品可以是健康的、患病的、在治疗之前的患病的、在治疗期间的患病的或在治疗之后的患病的或其组合。“有效量”是指化合物或组合物有效地引发与合理的利益/风险比相称的所需效果的剂量。当在本文中使用时，该术语也指在动物、优选为人类中有效产生所需体内效果，例如皮肤炎症减轻、疼痛减轻或痒感减轻的量。当在本文中使用时，“多核苷酸”可以是单链或双链的，或者可以含有双链和单链序列两者的部分。多核苷酸可以是天然或合成的核酸、dna、基因组dna、cdna、rna或杂合体，其中所述多核苷酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合以及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤)的组合。多核苷酸可以通过化学合成方法或通过重组方法来获得。“肽”或“多肽”是通过肽键相连的两个或更多个氨基酸的连接的序列。所述多肽可以是天然的、合成的、或者天然与合成的修饰或组合。肽和多肽包括蛋白质例如结合蛋白、受体和抗体。术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”在本文中可互换使用。“一级结构”是指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”是指多肽内局部有序的三维结构。二级结构可以包括β-片层和α-螺旋。这些结构通常被称为结构域，例如酶结构域、细胞外结构域、跨膜结构域、孔结构域和胞质尾部结构域。结构域是多肽的形成所述多肽的紧凑单元的部分，并且通常为15至350个氨基酸长。示例性的结构域包括具有酶活性或配体结合活性的结构域。典型的结构域由组织化较低的区段例如β-片层和α-螺旋的延伸段构成。“三级结构”是指多肽单体的完整三维结构。“四级结构”是指由独立的三级单元的非共价结合形成的三维结构。“基序”是多肽序列的一部分并包括至少两个氨基酸。基序的长度可以是2至20、2至15或2至10个氨基酸。在某些实施方式中，基序包括3、4、5、6、或7个连续的氨基酸。当在本文中使用时，“对象”可以意味着想要或需要本文中描述的方法或组合物的哺乳动物。对象可以是人类或非人类动物。对象可以是哺乳动物。所述哺乳动物可以是灵长动物或非灵长动物。所述哺乳动物可以是灵长动物例如人类，非灵长动物例如狗、猫、马、牛、猪、小鼠、大鼠、骆驼、美洲驼、山羊、兔、绵羊、仓鼠和豚鼠，或非人类灵长动物例如猴、黑猩猩、大猩猩、猩猩和长臂猿。所述对象可以是任何年龄或发育阶段，例如成年、青少年或婴儿。当在本文中使用时，“需要治疗的对象”是指需要本文中详述的组合物和方法的对象。所述对象可能具有需要消毒的表面。所述对象可能需要麻醉。所述对象可能已被诊断为具有与皮肤炎症、疼痛、痒感或其组合相关的皮肤疾病或障碍。在实施方式中，对象可以包括人类和非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(例如鸡、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物例如非人类灵长动物、家畜和/或农业上有用的动物(例如绵羊、狗、猫、牛、猪等)和啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等)。因此，本文中描述的方法的实施方式涉及细胞或组织、来自于对象的细胞或组织、或者对象的治疗，所述对象可以是真核生物、动物、脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如小鼠)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如马)、灵长动物、猿猴(例如猴或猿)、猴(例如狨猴、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人类。“可药用的”意味着适合用于人类或其他哺乳动物中。术语“可药用载体”和“可药用赋形剂”在本文中可互换使用，并且是指可用于制备可药用组合物的物质。在某些实施方式中，可药用载体通常与所述组合物的其他成分相容，对接受者无害，和/或不在生物学或其他方面上不可取。短语“可药用的”或“药理上可接受的”是指当给药到动物或人类时不产生不利的、过敏性或其他不良反应的分子实体和组合物。当在本文中使用时，“可药用载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。在某些实施方式中，载体包括处于中性ph下的溶液。在某些实施方式中，载体包括盐。在某些实施方式中，载体包括缓冲溶液。当在本文中使用时，“样品”或“试验样品”可以意味着其中靶的存在和/或水平待检测或确定的任何样品，或来自于对象的一部分或本文中详述的组合物的一部分。样品可以包括液体、溶液、乳液或悬液。样品可以包括医学样品。样品可以包括任何生物流体或组织，例如血液、全血、血液级分例如血浆和血清、肌肉、组织间隙液、汗液、唾液、尿液、泪液、滑液、骨髓、脑脊液、鼻分泌物、痰液、羊水、支气管肺泡灌洗液、胃灌洗液、呕吐物、粪便物、肺组织、外周血单核细胞、全白血细胞、淋巴结细胞、脾细胞、扁桃体细胞、癌细胞、肿瘤细胞、胆汁、消化液、皮肤或其组合。在某些实施方式中，所述样品包含细胞。在某些实施方式中，所述样品包含等分试样。在其他实施方式中，样品包含生物流体。样品可以通过本领域中已知的任何手段来获得。所述样品可以如从患者获得时的原样直接使用，或者可以例如通过过滤、蒸馏、萃取、浓缩、离心、干扰性组分的失活、添加试剂等进行预处理，以本文中所讨论的某些方式或本领域中已知的其他方式改变所述样品的特性。当指称对象中的疾病时，“治疗”意味着抑制、阻遏、减轻、改善或完全消除所述疾病。抑制所述疾病包括在引起所述疾病之后但在其临床表现出现之前向对象给药组合物。阻遏或减轻或改善所述疾病包括在所述疾病的临床表现出现之后向对象给药组合物。“预防”所述疾病包括在所述疾病发作之前向对象给药组合物。2.trpv4和/或trpa1的抑制本文中提供了用于抑制trpv4和/或trpa1的组合物和方法。本文中详细描述了trpv4和/或trpa1的抑制剂以及包含所述抑制剂的组合物。所述抑制剂可用于各种不同的方法中，包括对对象的表面进行消毒、对对象进行麻醉和治疗各种不同的障碍和疾病。a.trp通道本文中公开的组合物和方法与下述发现相关，即表皮角化细胞显著地起到协调控制uvb介导的皮肤中外周神经末梢的炎症和敏化的作用。就此而言，表皮角化细胞具有与辅助感觉细胞相似的作用。角化细胞丰富地表达trpv4。正如本文中所描述的，在表皮角化细胞中表达的trpv4在uv诱导的炎症和疼痛中发挥作用。trpv4通道通过ca++内流到角化细胞中发挥其作为uvb诱发的皮肤炎症和伤害感受的主要调控物的作用。这种uvb诱发的trpv4介导的ca++内流将所述角化细胞重编程成通过内皮素-1(et-1)的trpv4依赖性分泌，以促炎性和促疼痛的方式发挥作用，这可能引起发痒感觉和皮肤色素沉着。与uvb暴露同时，trpv4被激活，这通过以前被证实在人类疼痛中具有相关性的分泌因子引起促疼痛途径的激活。正如在本文中进一步详细描述的，对具有靶向角化细胞的可诱导的trpv4缺失的小鼠进行诱导以获得trpv4缺失，随后进行uvb暴露，并发现其与对照小鼠相比对有害的热和机械刺激的敏感性较低。在这些研究的基础上，将表皮trpv4鉴定为是参与uvb介导的皮肤炎症的协调控制的蛋白质。在小鼠皮肤中，uvb诱发的炎性体激活和促疼痛/致疼痛介导物例如il1-β、cxcl5、et-1和il-6的表达增加，是trpv4依赖性的。在人类中已显示et-1在注射到皮肤中时不仅引发疼痛感觉，而且引发痒感。此外，et-1也已被鉴定为是黑素原，也就是说通过向黑素细胞转导信号而增加皮肤色素沉着。在鼠类原代角化细胞中，uvb引起直接的、trpv4依赖性的ca++反应。此外，在小鼠中，trpv4选择性抑制剂的表面施用减少uvb诱发的表皮炎症和疼痛行为。此外，已发现在人类急性uv光照性皮炎中，trpv4、et1和il1β的表皮表达提高。术语光照性皮炎在本申请中用于指称对uv辐照/光做出响应的皮肤炎症。这种组织响应可以包括疼痛、刺激、痒感、炎性和增强疼痛的细胞的内流和组织损伤。本文中详述的化合物可以抑制trpv4。本文中详述的化合物可以抑制trpa1。本文中详述的化合物可以抑制trpv4和trpa1。本文中公开的化合物可能不抑制trpv1、trpv2或trpv3。所述抑制剂可能对trpv4和trpa1是特异性的。b.trpa1和/或trpv4抑制剂由于trpv4是ca2+通透性的非选择性阳离子通道，因此某些实施方式提供了可以抑制trpa1和/或trpv4的生物功能(例如抑制阳离子通道活性，抑制ca++运输和/或可利用性)的trpa1和/或trpv4抑制剂。其他实施方式提供了可以抑制编码trpa1或trpv4的mrna的表达的trpa1和/或trpv4抑制剂。某些实施方式提供了可以抑制编码trpa1或trpv4的mrna翻译成蛋白质的trpa1和/或trpv4抑制剂。因此，trpa1和/或trpv4抑制剂可以在细胞中间接或直接地结合并抑制trpa1和/或trpv4的活性(例如结合活性或酶活性)，减少trpa1和/或trpv4的表达，阻止trpa1和/或trpv4的表达，或抑制trpa1和/或trpv4的产生。抑制是指量或活性例如本文中所公开的trpa1和/或trpv4的量或活性的任何可测量到的减少或减弱。蛋白质或表达的“量”和“水平”在本文中可互换使用。本文中详述的抑制剂可以抑制trpa1。本文中详述的抑制剂可以抑制trpv4。本文中详述的抑制剂可以抑制trpv4和trpa1。本文中公开的抑制剂可能不抑制trpv1、trpv2或trpv3。所述抑制剂可能对trpv4和trpa1是特异性的。在某些实施方式中，trpa1和/或trpv4抑制剂可以提高能够降低trpa1和/或trpv4的活性的蛋白质的量或生物活性。能够提高这种蛋白质的水平的抑制剂可以包括能够提高所述抑制trpv4和/或trpa1的蛋白质的蛋白质或mrna水平或提高所述蛋白质的表达的任何抑制剂。在一个实施方式中，trpa1和/或trpv4抑制剂可以包含所述蛋白质本身。例如，trpa1和/或trpv4抑制剂可以包括外源表达并分离的能够被递送到细胞的蛋白质。所述蛋白质可以通过各种不同方法递送到细胞，包括融合到tat或vp16或通过递送介质例如脂质体，所有这些方法都允许跨过细胞膜递送基于蛋白质的抑制剂。本领域技术人员将会认识到，其他用于蛋白质的递送机制也可以使用。或者，通过与trpa1和/或trpv4抑制剂的接触，可以相对于对照细胞增强mrna表达。例如，能够提高本源表达的抑制trpv4和/或trpa1的蛋白质的水平的抑制剂，可以包括基因表达激活剂或去阻遏物。作为另一个实例，能够降低本源表达的trpv4和/或trpa1蛋白质的水平的trpa1和/或trpv4抑制剂，可以包括基因表达阻遏物。能够提高抑制trpv4和/或trpa1的蛋白质的水平的抑制剂，也可以包括直接或间接地结合到所述蛋白质并例如通过增强所述蛋白质的结合或其他活性来提高其有效水平的抑制剂。能够降低trpv4和/或trpa1蛋白质的水平的抑制剂，也可以包括直接或间接地结合到trpv4和/或trpa1蛋白质，并例如通过抑制或降低所述trpv4和/或trpa1蛋白质的结合或其他活性来降低所述蛋白质的有效水平的化合物或组合物。细胞中生物分子(例如mrna或蛋白质)的表达量或水平可以通过本领域中已知的各种不同技术中的任一种来评估。例如，蛋白质(例如trpv4和/或trpa1)的表达水平的抑制，可以使用包括但不限于western印迹、elisa、northern印迹、实时pcr、免疫荧光或facs分析的技术，在蛋白质或mrna水平上评估。例如，蛋白质的表达水平可以通过将用荧光标记的蛋白质特异性抗体染色的细胞可视化的免疫荧光、蛋白质表达的western印迹分析和蛋白质转录本的rt-pcr来评估。可以将trpa1和/或trpv4的表达水平与对照进行比较。可以与对照细胞例如非患病细胞或其他正常细胞中的表达水平进行比较。或者，所述对照可以包括来自于正常细胞群体的表达水平的平均范围。或者，可以使用通过分析对疗法或药剂具有已知响应的细胞群体的结果而开发出的标准值。本领域技术人员将会认识到，可以使用各种不同对照中的任一种。trpa1和/或trpv4抑制剂可以包括一种或多种化合物和组合物。在某些实施方式中，trpa1和/或trpv4抑制剂包含化合物。在某些实施方式中，trpa1和/或trpv4抑制剂是化合物。在某些实施方式中，trpa1和/或trpv4抑制剂包含小分子。在某些实施方式中，trpa1和/或trpv4抑制剂是小分子。trpa1和/或trpv4抑制剂可以包含生物分子，包括核酸分子例如具有针对trpa1和/或trpv4或其底物的rnai活性的多核苷酸。在某些实施方式中，所述核酸分子包括rna、dsrna、mirna、sirna、核酸适体、反义核酸分子和酶核酸分子，其包含足以允许结合到编码核酸序列并抑制其活性(即与这些编码核酸序列互补)的序列。适合情况下，rnai分子包含与靶序列的至少一部分互补的序列，使得所述rnai可以在生理或人工限定的(例如反应)条件下杂交到所述靶序列。在某些实施方式中，rnai分子包含互补的序列，使得所述分子可以在公知的并且可以由本领域技术人员确定的中或高严紧条件下杂交到靶序列。在某些实施方式中，rnai分子在其整个长度上与靶序列具有完全(100％)互补性。各种不同的rnai分子在本领域中是已知的，并且可以包括化学修饰，例如本领域中已知的对糖-磷酸酯骨架或核碱基的修饰。所述修饰可以由本领域技术人员选择，以改变活性、结合、免疫应答或其他性质。在某些实施方式中，所述rnai可以包含sirna，其具有约18至约24个核苷酸、约5至约50个核苷酸、约5至约30个核苷酸或约10至约20个核苷酸的长度。在某些实施方式中，所述抑制性核酸分子可以在严紧的结合条件下结合到靶核酸序列。术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”包括多核苷酸将以与其他序列相比可检测到的更高程度(例如与背景相比至少2倍)杂交到它的靶序列的条件。严紧条件的实例包括在37℃下在50％甲酰胺、1mnacl、1％sds中杂交，并在60至65℃下在0.1xssc中进行洗涤的那些条件。氨基酸和多核苷酸的同一性、同源性和/或相似性，可以使用clustalw算法megaligntm(lasergene,wi)来确定。给定例如trpa1和/或trpv4或其生物学底物的靶多核苷酸序列，可以使用基序设计抑制性核酸分子，并将其靶向预期抑制活性将是有效的区域，例如本领域中已知的。在其他实施方式中，trpa1和/或trpv4抑制剂包含可以特异性结合到蛋白质例如trpa1和/或trpv4或其片段的抗体。实施方式还提供了通过特异性结合到trpa1和/或trpv4底物分子来抑制trpa1和/或trpv4的抗体。所述抗体可以通过本领域中已知的任何方法来生产，例如通过用全长蛋白例如trpa1和/或trpv4或其片段免疫接种。所述抗体可以是多克隆或单克隆的，和/或可以是重组抗体。在实施方式中，作为人类抗体的抗体可以例如通过能够生产人类抗体的转基因动物的免疫接种来制备(参见例如国际专利申请公布号wo93/12227)。单克隆抗体(mab)可以通过各种不同的技术来生产，包括常规的单克隆抗体方法例如kohler和milstein的标准的体细胞杂交技术，以及其他技术例如b-淋巴细胞的病毒或致癌性转化。用于制备杂交瘤的动物系统包括小鼠。小鼠中的杂交瘤生产是非常完善的，并且免疫接种方案和用于分离免疫接种过的脾细胞以备融合的技术在本领域中是公知的。融合配偶体(例如鼠类骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。可以使用任何适合的方法来评估候选活性化合物或组合物对trpa1和/或trpv4的抑制活性。这些方法可以包括例如体外测定法、体外基于细胞的测定法、离体测定法和体内方法。所述方法可以评估结合活性或目标酶的下游的活性。离体测定法可以包括用本发明的抑制剂处理细胞，然后通过收集细胞rna、转变成cdna并通过定量实时聚合酶链反应(rt-qpcr)进行定量来检测某些基因例如trpa1和/或trpv4的转录水平的变化。此外，可以在用抑制剂处理后确定细胞存活性或炎性。i.式i的化合物在某些实施方式中，所述trpa1和/或trpv4抑制剂是式i的化合物：其中a、b和c独立地选自芳香族基团、杂芳族基团、环烯基和杂环烯基；d是c1-c3亚烷基；e是键或c1-c2亚烷基；并且r选自氢、羟基、氨基、烷基、烯基、杂烷基、芳香环或杂芳环。在某些实施方式中，b和c独立地是苯基。在某些实施方式中，a是苯基或杂芳基。在某些实施方式中，a是吡啶基。在某些实施方式中，r是c1-c4烷基。在某些实施方式中，a是杂芳基，b和c是苯基，d是亚乙基，e是亚甲基，并且r是甲基。在某些实施方式中，r是乙基。在某些实施方式中，所述trpa1和/或trpv4抑制剂是下述化合物：在某些实施方式中，所述trpa1和/或trpv4抑制剂排除下述化合物：在某些实施方式中，所述trpa1和/或trpv4抑制剂是下述化合物：在某些实施方式中，所述trpa1和/或trpv4抑制剂是下述化合物：在某些实施方式中，所述trpa1和/或trpv4抑制剂是下述化合物：在某些实施方式中，所述trpa1和/或trpv4抑制剂是下述化合物：在某些实施方式中，所述trpa1和/或trpv4抑制剂是下述化合物：在某些实施方式中，所述trpa1和/或trpv4抑制剂是下述化合物：在某些实施方式中，所述trpa1和/或trpv4抑制剂是下述化合物：在某些实施方式中，所述trpa1和/或trpv4抑制剂是下述化合物：在某些实施方式中，所述trpa1和/或trpv4抑制剂包含下述化合物：ii.化合物的合成式i的化合物可以通过本领域中已知的各种不同手段来合成。示例性的合成详细描述在实施例和图35中。用于4-硝基苯乙基溴的sn2置换的通用程序：可以将烤箱干燥的粉状k2co3(1.5当量)和胺(1.5当量)顺序添加到溴化物(0.33m)在无水ch3cn中的室温溶液。可以将所述反应混合物加热到80℃(油浴温度)，直至通过lcms进行的反应混合物的分析表明溴化物被完全消耗(～6-18h)。可以将所述混合物冷却至室温并用盐水(2体积当量)稀释。可以将得到的乳液用etoac(2x1体积当量)萃取。可以将合并的萃取物添加到硅胶(硅胶的质量＝2x起始溴化物的质量)，并且可以将所述混合物在减压下浓缩至干。快速柱层析(rediseprfsio2，100％ch2cl2→ch2cl2中的5％meoh)可以确认作为棕色至琥珀色油状物的所述产物。用于硝基向苯胺的还原的通用程序：可以将所述硝基化合物的溶液(0.5m，在meoh中)在冰-nacl浴中冷却。可以将锌粉(4.5当量)一次性添加，然后在2-3分钟内逐滴添加12mhcl(4.5当量)。1h后，可以撤除所述冷却浴，并且可以允许所述反应混合物在室温下搅拌过夜。第二天早晨，可以将所述混合物在冰-nacl浴中再次冷却，并且可以逐滴添加30％naoh水溶液，直至达到ph14(通用ph试纸)。可以将所述混合物用ch2cl2(5体积当量)稀释并搅拌5分钟。在此时间后，可以在真空下去除不溶物，并且可以将滤饼用ch2cl2(2x25ml)洗涤。可以分离滤液的有机相，用盐水(100ml)洗涤并干燥(mgso4)。可以通过过滤去除所述干燥剂。可以添加硅胶(～5g)，并且可以将所述滤液在减压下浓缩至干。快速柱层析(rediseprfsio2，100％ch2cl2→ch2cl2中的5％meoh)可以确认作为透明琥珀色油状物的所述产物。用于硫脲形成的通用程序：可以将苯胺在无水ch2cl2中的溶液(0.22m)在2-5分钟内逐滴添加到冰-nacl浴冷却的1,1’-硫羰基二咪唑(2当量,0.15m)在无水ch2cl2中的溶液。15分钟后，可以将所述冷却浴撤除，并且可以将所述反应混合物在室温下搅拌，直至通过tlc(5％meoh在ch2cl2中)进行的分析表明起始的苯胺被完全消耗。可以将所述混合物在冰浴中再次冷却，并且可以在2-5分钟内逐滴添加meoh中的7mnh3(10.5当量)。可以将所述浴撤除，并且可以将所述混合物在室温下搅拌过夜。可以添加硅胶(硅胶的质量＝2x起始苯胺的质量)，并将所述混合物在减压下浓缩至干。快速柱层析(rediseprfsio2，100％ch2cl2→ch2cl2中的10％meoh)可以确认纯的硫脲。用于噻唑形成的通用程序：可以将etoh中的所述硫脲(0.1m)与α-溴乙酰苯衍生物(1.1当量)的混合物加热到75℃(油浴温度)，直至通过tlc(5％meoh在ch2cl2中)进行的分析表明所述硫脲被完全消耗。可以添加硅胶(硅胶的质量＝2x起始硫脲的质量)，并可以将所述混合物在减压下浓缩至干。快速柱层析(rediseprfsio2，100％ch2cl2→ch2cl2中的10％meoh)可以确认纯的噻唑氢溴酸盐。c.组合物在其他方面，本公开提供了包含一种或多种trpa1和/或trpv4抑制剂的组合物。所述组合物可用于处理对象的皮肤或伤口，以便对它们进行消毒或去除或减少污染的和可能有害的细菌或其他微生物。此时，所述组合物也可以减少可能由局部麻醉剂造成或引起的疼痛、炎症、刺激或其组合。在某些实施方式中，所述组合物包含抑制剂和碘。碘可以作为元素碘或作为碘盐或其组合存在于所述组合物中。碘盐可以包括例如碘化钾和碘化钠。在某些实施方式中，所述组合物包含抑制剂和麻醉剂。在某些实施方式中，所述麻醉剂是局部麻醉剂。在某些实施方式中，所述麻醉剂不是全身麻醉剂。在某些实施方式中，所述麻醉剂使所述对象的皮肤失去感觉。所述包含抑制剂和麻醉剂的组合物可用于高效清洁对象的皮肤。所述包含抑制剂和麻醉剂的组合物可以在医学程序、手术或切口之前施用到所述对象。所述包含抑制剂和麻醉剂的组合物可以施用到所述对象的伤口以促进愈合。局部麻醉剂通过阻断疼痛纤维中的传导而减轻或消除触觉和疼痛感觉，并允许医学专业人员操作被麻醉的组织而不怕造成对象疼痛。与全身麻醉不同，局部麻醉允许对象在所述程序期间清醒，从而在医学程序期间促进对象的自信和幸福感。此外，局部麻醉避免了一些与全身麻醉相关的风险，例如恶心、呕吐和恶性高热。可获得许多化合物用作局部麻醉剂。局部麻醉剂根据其化学结构可以分成两大类。含有酰胺的麻醉剂包括例如阿替卡因、布比卡因、辛可卡因、依替卡因、左布比卡因、利多卡因、甲哌卡因、丙胺卡因、罗哌卡因和三甲卡因。另一类局部麻醉剂含有酯化学残基，并包括例如苯唑卡因、氯普鲁卡因、可卡因、环美卡因、二甲卡因、哌罗卡因、丙氧卡因、普鲁卡因(奴佛卡因)、丙美卡因和丁卡因。所述组合物可以包含与载体、介质或稀释剂相组合的所述trpa1和/或trpv4抑制剂。实施方式提供了可药用载体，包括但不限于对表面、鞘内、眼部、肠胃外、静脉内、腹膜内、肌肉内、舌下、鼻和口服给药有用的物质。给药可以是全身性的。“可药用载体”还包括用于制备水性分散系和注射或分散用无菌粉剂的试剂。可药用载体和赋形剂的实例在例如《remington制药学》(remingtonpharmaceuticalscience)第16版中讨论。用于制造剂型的某些示例性技术和组合物描述在下述参考文献中：《现代制药学》(modernpharmaceutics)，第9和10章，banker&rhodes主编(1979)；lieberman等，《药物剂型：片剂》(pharmaceuticaldosageforms:tablets)(1981)；和ansel，《药物剂型简介》(introductiontopharmaceuticaldosageforms)，第2版(1976)。所述载体、介质或稀释剂可能适合于表面施用。在某些实施方式中，所述载体包含水。在某些实施方式中，所述载体包含醇例如甲醇或乙醇。在某些实施方式中，组合物被配制成用于注射。在某些实施方式中，组合物被配制成用于表面给药。对于适合于表面给药的组合物来说，可以将所述组合物与一种或多种载体组合，并以美容制剂的形式使用。制剂可以包括泡沫、霜剂、凝胶、洗剂、软膏或溶液。例如，trpa1和/或trpv4抑制剂可以被适合地溶解在皮肤消毒凝胶的醇中或洗剂、霜剂或其他制剂中。在某些实施方式中，trpa1和/或trpv4抑制剂可以被包含在或添加到美容制剂中。在某些实施方式中，trpa1和/或trpv4抑制剂可以被包含在或添加到防晒表面制剂中。对于口服治疗性给药来说，可以将所述组合物与一种或多种载体组合，并以可摄食片剂、颊片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、干胶片、口香糖、食品等的形式使用。所述组合物和制剂的百分率当然可以改变，并且可以方便地在给定单元剂型的重量的约0.1至约100％之间。所述片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可含有下述物质：粘合剂，例如黄芪树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；以及甜味剂例如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜，或调味剂例如胡椒薄荷、冬青油或樱桃调味剂。上述名单仅仅是代表性的，并且本领域技术人员可以设想其他粘合剂、赋形剂、甜味剂等。当所述单元剂型是胶囊时，除了上述类型的材料之外，它还可以含有液体载体例如植物油或聚乙二醇。各种不同的其他材料可以作为包衣存在或以其他方式修改固体单元剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用明胶、蜡、虫胶或糖等进行包衣。在这些治疗上有用的组合物中trpa1和/或trpv4抑制剂的量，使得将会获得有效的剂量水平。所选的剂量水平取决于各种不同因素，包括所使用的特定化合物的活性、给药途径、给药时间、所使用的特定化合物的排泄或代谢速率、治疗的持续时间、与所使用的特定化合物相组合使用的其他药物、化合物和/或材料、待治疗患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和以前的医疗史，以及医学领域中公知的其他因素。一般来说，每日药剂含有约0.1mg至约2000mg所述活性成分或约0.5至约60mg所述活性成分。这种剂量形式允许将整个每日剂量在1或2个口服药剂中给药。本文中也设想了超过每日一次或每日两次给药，例如每日3、4、5或6次给药。在某些实施方式中，如上所提到的，给药是指提供在动物例如人类中有效产生所需体内效果例如trpa1和/或trpv4的抑制的量。d.小鼠模型在其他方面，本公开提供了一种转基因小鼠，其基因组在表皮的角化细胞中包含trpv4基因的缺失。所述转基因小鼠可以在位点特异性重组酶的角化细胞特异性激活和表达后敲除表皮角化细胞中的trpv4基因。所述trpv4基因的敲除可以通过本领域中已知的任何适合的手段来进行。例如，所述转基因小鼠可以通过位点特异性重组酶的角蛋白-14启动子表达来产生。位点特异性重组酶可以包括cre重组酶。所述位点特异性重组酶可以被融合到突变的雌激素受体。抗雌激素剂相对于野生型雌激素可能对所述突变的雌激素受体具有提高的亲和性。所述抗雌激素剂可以包含他莫昔芬。在某些实施方式中，向所述转基因小鼠添加所述抗雌激素剂驱动所述位点特异性重组酶朝向细胞核并引起trpv4基因表达的敲落。因此，所述trpv4基因的角化细胞特异性缺失可以通过施用抗雌激素剂来诱导。在某些实施方式中，所述trpv4基因的缺失可以在表皮的角化细胞中特异性且条件性地诱导。在某些实施方式中，所述trpv4基因的缺失可以通过表皮角化细胞中组成性活性或可诱导的重组酶的表达来实现。在某些实施方式中，对uvb暴露做出响应，所述转基因小鼠相对于对照可能表现出il6、et1、半胱天冬酶1、il1β和cxcl5中的至少一者或其组合的表达降低。e.方法i.对对象进行消毒的方法本文中提供了对对象或所述对象的表面或一部分进行消毒的方法。所述方法可以包括将所述对象与包含抑制剂和碘的组合物相接触，其中所述抑制剂抑制trpv4、trpa1或其组合。在某些实施方式中，所述抑制剂不抑制trpv1、trpv2或trpv3。在某些实施方式中，所述抑制剂包含本文中详述的式i的化合物。在某些实施方式中，将所述对象与所述组合物接触一段足以使所述表面上的微生物群体减少的时间。所述对象的与所述组合物相接触的表面或其一部分可以选自皮肤区域、伤口、痛处和溃疡。在某些实施方式中，所述组合物被施用到医用敷料或绷带，然后将它们施用到所述对象。在某些实施方式中，所述组合物被给药到所述对象以处理所述对象的皮肤或伤口，以便将它们消毒并减少或去除任何污染的和可能有害的细菌或其他微生物。在某些实施方式中，所述组合物将所述对象或其表面消毒。在某些实施方式中，所述组合物对所述对象或其表面进行灭菌。在某些实施方式中，所述组合物具有抗细菌活性。在某些实施方式中，所述组合物促进所述皮肤、伤口、痛处或溃疡的愈合。在某些实施方式中，所述组合物还减少可能由碘造成或引起的疼痛、炎症、刺激或其组合。在某些实施方式中，所述抑制剂减轻或减弱由碘引起的疼痛。在某些实施方式中，所述组合物提供疼痛的局部抑制。在某些实施方式中，所述组合物在医学程序例如手术或切口之前施用到所述对象。在这些实施方式中，所述组合物可以将对象的区域消毒，防止微生物感染，减少微生物感染，治疗微生物感染或其组合。所述组合物可以在手术或其他医学程序之前、期间或之后给药。ii.对对象进行麻醉的方法本文中提供了对对象进行麻醉的方法。所述方法可以包括向所述对象给药包含抑制剂和麻醉剂的组合物，其中所述抑制剂抑制trpv4、trpa1或其组合。所述方法可以包括向所述对象共同给药麻醉剂和抑制剂，其中所述抑制剂抑制trpv4、trpa1或其组合。在某些实施方式中，所述抑制剂不抑制trpv1、trpv2或trpv3。在某些实施方式中，所述抑制剂包含本文中详细描述的式i的化合物。在某些实施方式中，所述麻醉剂是局部麻醉剂。在某些实施方式中，所述组合物减轻可能由所述局部麻醉剂造成或引起的疼痛、炎症、刺激或其组合。在某些实施方式中，所述组合物提供疼痛的局部抑制。在某些实施方式中，所述抑制剂减轻或减弱由所述麻醉剂引起的疼痛和/或烧灼。在某些实施方式中，所述对象具有急性牙髓炎或发炎的“火牙”。在某些实施方式中，所述对象具有皮肤或软组织的化脓性感染。在某些实施方式中，所述组合物被给药到所述对象的急性牙髓炎、发炎的“火牙”、或者皮肤或软组织的化脓性感染。在某些实施方式中，所述组合物在医学程序例如手术或切口之前施用到所述对象。所述组合物可以在手术、口腔手术或其他牙科或医学程序之前、期间或之后给药。iii.治疗疾病或障碍的方法所述组合物和方法可用于治疗各种不同的疾病和障碍，包括皮肤障碍。本文中提供了治疗疾病或障碍的方法。所述方法可以包括向所述对象给药有效量的本文中详细描述的trpv4和/或trpa1抑制剂。在某些实施方式中，可以通过本文中公开的组合物和方法治疗的疾病或障碍可以包括胰腺炎(例如，根据由蛙皮素诱导的胰腺炎的模型)、癫痫、关节炎、骨关节炎、多发性硬化症、中风、cns自体免疫病症、创伤性脑/脊髓损伤、脑水肿、cns感染、神经-精神障碍、骨骼退行性-炎性障碍、三叉神经痛例如头痛、结肠炎和硬化症。在其他方面，本公开提供了预防皮肤疾病或障碍例如刺激、疼痛、痒感、瘙痒、自体免疫疾病、皮肤癌(包括黑素瘤，例如使用基于trpa1和/或trpv4抑制剂的uv防护的表面治疗)、自体免疫疾病、纤维化障碍、色素沉着障碍和如上所述的其他疾病或障碍的方法。在某些实施方式中，本公开提供了预防着色性干皮病、柯凯因综合征、布卢姆综合征、rothmund-thomson综合征和哈特纳普综合征的发生和/或恶化的方法。所述皮肤障碍可能与trpa1或trpv4途径相关。皮肤障碍包括但不限于光诱导的炎症、疾病中的疼痛包括皮肤疼痛、痒感、癌症、自体免疫疾病、纤维化疾病、其他痤疮样或炎性皮肤病和色素沉着障碍。例如，皮肤障碍可以包括但不限于晒伤、光过敏反应、光毒性反应、植物光照性皮炎(伯洛克皮炎)、急性和慢性光化性皮炎、特应性皮炎恶化、红斑痤疮的所有亚型包括与三叉神经痛相关的红斑痤疮、所有红斑狼疮亚型(全身性、圆盘状、亚急性)、特应性皮炎、光化性痒疹、结节性痒疹、亚急性痒疹、色素性痒疹、单纯性苔癣(也被称为神经性皮炎)、糖尿病瘙痒、尿毒症瘙痒、由代谢(肝)病引起的瘙痒、由恶性肿瘤如淋巴瘤引起的瘙痒、由真性红细胞增多引起的瘙痒、由疥疮引起的瘙痒、由大疱性类天疱疮引起的瘙痒、由荨麻疹(特别是但不排他性地光化性荨麻疹)引起的瘙痒、由昆虫/蛛形纲虫媒叮咬引起的瘙痒、由寄生虫病引起的瘙痒、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(bcc、scc)、光化性角化病和其他前恶性皮肤癌、蕈样真菌病、sézary综合征、着色性干皮病、柯凯因综合征、所有红斑狼疮亚型(全身性、圆盘状、亚急性)、皮肌炎、多形性红斑、扁平苔癣、由uv暴露引起的纤维化疾病(肥大性酒渣鼻、慢性光化性皮炎、光化性类网状细胞增多、光老化、皮肤黏膜透明蛋白变性)、多形性日光疹、夏令痤疮、与光诱导的皮肤变化有牵连的所有卟啉症亚型(生血性卟啉症、生血性原卟啉症、多样性卟啉症)、光诱导的单纯性疱疹感染(唇疱疹)、darier病、播散性浅表光化性汗孔角化症、毛发红糠疹、布卢姆综合征、rothmund-thomson综合征、哈特纳普综合征、光老化、皱纹、光诱导的炎症、色素沉着和色素沉着障碍。在某些实施方式中，本公开提供了治疗对象的方法，其中所述方法包括给药在可药用组合物中的trpa1和/或trpv4的抑制剂。iv.减轻皮肤炎症的方法一方面，本公开提供了在需要的对象中减轻皮肤炎症的方法。所述方法可以包括向所述对象给药有效量的trpa1和/或trpv4抑制剂。所述皮肤炎症可能与uvb暴露有关。皮肤炎症可能与病症相关，所述病症包括但不限于晒伤(急性光照性皮炎)、光过敏反应、光毒性反应、植物光照性皮炎(伯洛克皮炎)、急性和慢性光化性皮炎、特应性皮炎恶化和红斑痤疮。v.疼痛管理在其他方面，本公开提供了疼痛管理的方法。所述方法可以包括向需要的对象的至少一部分皮肤给药有效量的trpa1和/或trpv4抑制剂。所述疼痛可能与uvb暴露有关。疼痛可能是慢性或急性的。疼痛可能与病症有关或由病症引起，所述病症包括但不限于红斑痤疮的所有亚型包括与三叉神经痛相关的红斑痤疮、反射交感性营养不良(rsd)和所有红斑狼疮亚型(全身性、圆盘状、亚急性)。vi.减轻痒感的方法在其他方面，本公开提供了在需要的对象中减轻痒感的方法。已显示et-1引发痒感，并且如实施例中所示，et-1表达的提高是trpv4依赖性的。所述方法可以包括向所述对象给药有效量的trpa1和/或trpv4抑制剂。痒感可能是慢性或急性的。痒感可能与病症有关或由病症引起，所述病症包括但不限于红斑痤疮、特应性皮炎、光化性痒疹、结节性痒疹、亚急性痒疹、色素性痒疹、单纯性苔癣(也被称为神经性皮炎)、糖尿病瘙痒和尿毒症瘙痒。痒感或瘙痒可能与病症有关或由病症引起，所述病症包括代谢(肝)疾病、恶性肿瘤例如淋巴瘤、真性红细胞增多、疥疮、大疱性类天疱疮、荨麻疹(特别是但不排他性地光化性荨麻疹)、昆虫/蛛形纲虫媒叮咬和寄生虫病。vii.治疗癌症的方法在其他方面，本公开提供了在需要的对象中治疗癌症的方法。所述方法可以包括向所述对象给药有效量的trpa1和/或trpv4抑制剂。所述癌症和相关病症可以包括但不限于黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(bcc、scc)、光化性角化病和其他前恶性皮肤癌、蕈样真菌病、sézary综合征和着色性干皮病。viii.治疗自体免疫疾病的方法在其他方面，本公开提供了在需要的对象中治疗自体免疫疾病的方法。所述方法可以包括向所述对象给药有效量的trpa1和/或trpv4抑制剂。自体免疫疾病可以包括但不限于所有红斑狼疮亚型(全身性、圆盘状、亚急性)、皮肌炎、多形性红斑和扁平苔癣。ix.治疗纤维化疾病的方法在其他方面，本公开提供了在需要的对象中治疗纤维化疾病的方法。所述方法可以包括向所述对象给药有效量的trpa1和/或trpv4抑制剂。纤维化疾病可以包括由uv暴露引起的病症，例如肥大性酒渣鼻、慢性光化性皮炎、光化性类网状细胞增多、光老化和皮肤黏膜透明蛋白变性。x.治疗其他痤疮样或炎性皮肤疾病的方法在其他方面，本公开提供了在需要的对象中治疗其他痤疮样或炎性皮肤疾病的方法。所述方法可以包括向所述对象给药有效量的trpa1和/或trpv4抑制剂。痤疮样或炎性皮肤疾病可以包括但不限于多形性日光疹、夏令痤疮、光诱导的单纯性疱疹感染(唇疱疹)、darier病、播散性浅表光化性汗孔角化症、毛发红糠疹和与光诱导的皮肤变化有牵连的所有卟啉症亚型例如生血性卟啉症、生血性原卟啉症和多样性卟啉症。xi.减轻皮肤色素沉着的方法在其他方面，本公开提供了在需要的对象中减轻皮肤色素沉着的方法。已显示et-1向皮肤黑素细胞发出信号并起到主要黑素原(＝增强皮肤色素沉着)的作用，并且如实施例中所示，et-1表达的提高是trpv4依赖性的。所述方法可以包括向所述对象给药有效量的trpa1和/或trpv4抑制剂。皮肤炎症、疼痛、痒感和/或色素沉着也可能与障碍相关，所述障碍包括但不限于柯凯因综合征、低于3度的非uv皮肤烧伤、伤口愈合紊乱、对毒葛的暴露和病理性反应、以及与皮肤直接相邻的骨骼的骨折例如胫骨、指骨或颅骨的骨折的疼痛。例如，这些障碍中的一者或多者可能是反射交感性营养不良(rsd)的症状。xii.治疗或预防美容病症的方法在其他方面，本公开提供了治疗或预防美容病症的方法。例如，本公开提供了治疗或预防光老化、皱纹、光诱导的炎症、色素沉着和色素沉着障碍的方法。所述方法可以包括向所述对象给药有效量的trpa1和/或trpv4抑制剂。xiii.用于鉴定trpa1和/或trpv4的选择性抑制剂的方法在另一方面，本公开提供了用于鉴定trpa1和/或trpv4的选择性抑制剂的方法。所述方法可以包括(a)将小鼠与试验化合物相接触；(b)在与所述试验化合物相接触后确定trpa1和/或trpv4的生物活性；并且(c)在不存在所述试验化合物的情况下确定trpa1和/或trpv4的生物活性的对照水平；(d)将来自于步骤(b)的trpa1和/或trpv4的生物活性与来自于trpv4缺失模型的trpa1和/或trpv4的生物活性进行比较，其中所述trpv4缺失模型包括本文中公开的转基因小鼠或全缺失trpv4-/-小鼠；并且(e)当出现下述情况中的至少一者时将所述试验化合物鉴定为trpa1和/或trpv4的选择性抑制剂：(i)在存在所述试验化合物的情况下trpa1和/或trpv4的生物活性低于在不存在所述试验化合物的情况下trpa1和/或trpv4生物活性；(ii)在存在所述试验化合物的情况下trpa1和/或trpv4的生物活性近似等于或低于trpv4缺失模型中的trpa1和/或trpv4生物活性；或(iii)(i)和(ii)的任何组合。3.实施例实施例1：材料和方法动物。对trpv4的基因组基因座进行工程化改造，使得loxp位点围绕编码tm5-6的外显子13。该突变在与k14-cre-ertam小鼠杂交的小鼠中传播，使得((trpv4lox/lox)x(k14-cre-ertam))小鼠可以通过在2-4月龄时经口饲管用在0.3ml玉米油中的他莫昔芬以6mg/天的剂量连续5天给药加上在最后一次施用后2周时的一次加强来诱导。雄性和雌性小鼠被同等地诱导。敲落的效率通过使用正义引物5’-cctgctggtcacctacatca(seqidno:1)和反义引物5’-ctcaggaacacagggaagga(seqidno:2)对trpv4进行qrt-pcr来核实，其中前一种引物位于外显子13中。这里描述的所有动物实验在完全遵照nih和杜克大学的内部指导方针的情况下并在合法的iacuc方案下进行。使用用于产生trpv4-/-全缺失小鼠的相同基因组克隆，将trpv4靶向构建物电转化到小鼠es细胞(c57bl6背景)中，并通过pcr和southern印迹确认正位整合。通过嵌合小鼠与c57bl6wt小鼠的交配，将所述工程化的突变引入到种系中。在flpe缺失器小鼠中通过flpe介导的frt-pgk-neo-frt盒的切除，使所述选择标志物缺失。基因分型通过pcr和随后的paci消化来完成(图1b)。在整个所述实验中使用8–12周龄的小鼠。trpv4-/-小鼠3已与wt(c57bl/6j)背景进行异型杂交，并通过pcr进行基因分型3,15。动物饲养在气候受控室中，使用12/12h的光/暗周期，并随意取用水和标准化啮齿动物饲料。所有实验遵照并根据nih和杜克大学动物护理和使用委员会(institutionalanimals’careandusecommittee)(iacuc)的指导方案，并在杜克大学iacuc的合法iacuc方案下进行。在本出版物中描述的所有动物方法都得到杜克大学iacuc批准。后撤阈值的行为评估。进行行为试验以评估对施加到后爪的机械vonfrey毛发或热刺激做出响应的后撤阈值的减少。进行了所述试验。在uv暴露之前和之后确定了这些后撤阈值。小鼠在最后一次施用他莫昔芬/油之后3-5天，使用bioradgeldoc2000uv透照器(302nm)以600mj/cm2的暴露量暴露5分钟。爪组织间隙液分析。在uv暴露后48小时，每只动物在安乐死后直接接受10μlpbs的足底内注射。立即收集组织间隙液并通过elisa(biorad)分析il-1β的存在。体内表面干预。et1注射：在确定基线后撤阈值后，每只动物接受10μl100nmet-1的足底内注射加上对侧的介质注射。在注射后1小时再次评估阈值。gsk205表面处理：通过用20μl进行摩擦，将68％etoh/5％甘油加上1mm或5mmgsk205(对于对照来说无)的粘稠溶液施加到后爪，施加时间点为uv暴露前1小时和10分钟共两次。福尔马林诱导的疼痛反应行为：将4％福尔马林注射到右后爪中。然后对小鼠录影50分钟，并由不知情的观察者对行为进行分析。用于1μm半薄切片和em的小鼠组织处理。对样品进行处理并进行em。用于免疫组织化学的小鼠和人类组织处理。遵照常规程序，并且人类组织在学术审查委员会批准(ucsf)下进行处理。小鼠原代角化细胞培养。小鼠原代角化细胞源自于新生小鼠的背部皮肤。在uv暴露后由培养的角化细胞分泌的il-1β的分析。在uv辐照之前，将培养基用pbs替换。然后将所述细胞用uvb以50mj/cm2的剂量辐照。24小时后，使用il-1βelisa(r&dsystems,minneapolis,mn)测定上清液。培养的角化细胞的ca++成像。1°mk的ca++成像按照常规程序来进行。对于uvb刺激来说，建立定制装置。所述系统包含用于电连接的印刷电路板和机械支撑物以及发射紫外光的二极管(uvled)。细胞端的定制供应品包括安装于olympusbx61直立显微镜的作为细胞培养皿底面的石英盖玻片加上热平衡台(hw-101dagancorporation)。所述uvled是基于氮化物的iii型(uvtop-295bl；sensorelectronictechnology)。操作波长是295nm(图2a)，半峰全宽为12nm。光学功率为500mw。焦点对准石英盖玻片的上表面的平面，其被用于使沿着朝向细胞的光径的uv吸收最小化(图2a-c)。在焦点处的光强度据估计为150mw/mm2。角化细胞的使用295nmled的uv辐照和免疫细胞化学。使用uv光学系统(295nmled)将1°mk暴露于uvb。24小时后，将所述细胞固定并对et1进行荧光免疫标记。捕获数字图像并进行形态计量分析。统计分析。数据被表示为平均值±sem。对相应组的数字信号或值进行平均，并使用固定效应单向anova和事后scheffe检验或student’st-检验或双尾t-检验或单向anova和随后的tukey事后检验，以p<0.05的显著性水平对组之间的统计平均值+/-所述平均值的标准误差进行比较。化学品/生物制品。使用了下述生物制品和化合物：内皮素1；bq123和bq788(用于et(r)-a和et(r)-b的et(r)阻断剂；sigma,st.louis,mo)，u73122(plc抑制剂；tocris,ellisville,mo)，4α-佛波醇12,13-二癸酸酯(4α-pdd；trpv4激活剂；tocris)，gsk205(trpv4抑制剂(li等，2011；phan等，2009；vincent和duncton，2011))，rn-1734(trpv4抑制剂；tocris)，cgs35066(内皮素转化酶抑制剂，tocris)，异戊烯焦磷酸，ipp(trpv3抑制剂；sigma)；和莰酮(trpv3激活剂；wholefoods)。后撤阈值和疼痛反应行为的行为评估。进行行为试验以评估对施加到后爪的机械或热刺激做出响应的后撤阈值的减少。在uvb暴露之前和之后确定了这些后撤阈值。小鼠被25x26cmbioradgeldoc2000uv透照器(302nm)顶上的有机玻璃围护结构禁闭，并在其他方面允许公开地探索这个环境。uv暴露以600mj/cm2的暴露量持续5分钟。在此方法开始后的仔细观察证实了后爪在此整个期间暴露于uv。自动vonfrey毛发试验。通过自动vonfrey毛发方法，使用直径0.5mm的不锈钢细丝、自动足底触碰刺激器的部件(ugobasile,modena,italy)，来确定后爪机械后撤阈值。相关的细节包括试验前在静室中适应环境30分钟，在一天的同一时间进行试验，并且观察者不知情。将刺激递送到后爪，一旦后撤后自动中断，并自动记录它的强度。每只动物进行6-8次试验，两只后爪具有相等的暴露量，产生平均后撤阈值。结果被报告为δ阈值，其通过从处理前的测量值中减去处理后的测量值来计算，表示为％或相对于1.0来表示。hargreaves试验。通过确立已久的hargreaves方法，使用从后爪下方递送刺激与一旦后撤后自动关闭相组合的红外热刺激装置(ugobasile)，来确定后爪热后撤阈值。刺激和测量如对vonfrey毛发试验所述来进行。设定20秒的截止值以防止组织损伤。福尔马林诱导的疼痛反应行为。由不知情的观察者读取视频，以获得每只小鼠缩回或舔注射的后爪所花费的时间的总量。用于1μm半薄切片和电子显微术的小鼠组织处理。将样品在含有2％戊二醛、4％pfa和2mmcacl2的0.05mph7.2的二甲胂酸钠缓冲液中，在室温下固定>1h，脱水，在1％四氧化锇中后固定，并进行环氧树脂包埋处理。半薄切片(1μm)用甲苯胺蓝染色并用axioplan2显微镜(zeiss)照相。对于em分析来说，将超薄切片(60–70nm)用乙酸双氧铀和柠檬酸铅复染。使用装备有数字相机(xr60型；advancedmicroscopytechniques,corp.)的透射电子显微镜(tecnaig2-12；fei)获取em图像。用于免疫组织化学的小鼠组织处理。遵照以前描述的常规程序(chen等，2009)。将小鼠用30mlpbs、然后用30ml4％多聚甲醛进行心脏灌注。将组织、包括l5drg(双侧)和脚垫制备物解剖下来并在4％多聚甲醛中后固定。将组织块在含有30％蔗糖的pbs中进一步冷冻防护24–48小时。对于小鼠trpv4、角蛋白特异性抗体、磷酸化erk、il-6、il-1β、cxcl5和半胱天冬酶-1来说，将组织制备为冷冻块，随后在低温恒温器上切片。对于cd68、cd15(嗜中性粒细胞弹性蛋白酶)和cd3来说，通过2％pfa灌注来制备小鼠皮肤。将脚垫和drg切片(均为6-10μm)融化，固定，用5％正常山羊血清(ngs；jackson)阻断，然后在4℃下与下述第一抗体温育过夜：兔抗trpv4抗体(1:300；abcam)，小鼠抗角蛋白14抗体(1:300；abcam，针对第850位残基之后的c-端肽)，兔抗角蛋白14抗体(1:1000；fuchs-lab)，兔抗磷酸化erk1/2抗体(1:500；cellsignalingtechnologies)，山羊抗il-1β抗体(1:800；abcam)，山羊抗il-6抗体(1:200；santacruzbiotechnologyinc)，兔抗半胱天冬酶-1抗体(1:200；biovisionresearchproducts,ca)，山羊抗小鼠lix/cxcl5抗体(1:200；r&dsystemsinc)，抗cd68抗体，抗cd25抗体和抗cd3抗体(abdserotec)。使用适合的荧光标记的第二抗体(alexafluor595、alexafluor488偶联的抗体，1:600；invitrogen；对于cd15来说，使用来自于驴的生物素化的第二抗体，1:400，然后使用罗丹明-链亲和素，1:250)或连接有过氧化物酶的检测试剂(对cd68来说)在室温下温育2小时来实现免疫检测。将切片漂洗、固定并用fluoromount(sigma)封片。使用bx61olympus直立显微镜，并且也使用zeisslsm510共聚焦显微镜来获得数字显微照片，两者都装备有高分辨率ccd相机；并使用恒定的曝光设置，使用isee或zeisszen软件来获取所述照片。使用imagej免费软件(v1.45)，使用不包括核区室的裁剪过的目标区来进行形态计量分析。imagej也用于drg表面积的确定。人类组织样本免疫标记。将人类组织用二甲苯和乙醇系列溶液进行脱石蜡，然后在pbs中洗涤，并在抗原修复缓冲液(biogenex)中在80℃温育20分钟。随后，将样本在pbs中洗涤。将内源过氧化物酶用含有0.3％h2o2+0.01％叠氮化钠的pbs在室温下阻断10分钟，然后进行在pbs中的洗涤步骤。在含有5％正常马血清+0.3％triton-x-100的pbs中，在室温下进行1小时阻断。将第一抗体(抗trpv4抗体，abcam，与用于小鼠的相同，1:8,000；抗et1抗体；抗il-1b抗体，与用于小鼠组织的相同)在ventana抗体稀释缓冲液(fisher)中在4℃温育过夜。在pbs中洗涤后，将样本与生物素化的驴抗兔第二抗体(vector，ba-1000)在稀释的阻断缓冲液中温育30分钟。在用pbs洗涤后，在室温下进行30分钟的亲和素生物素阻断(vector,pk4000)，并使用dab(fisher，nc9567138)将阳性免疫反应性可视化。在水中洗涤后，使用苏木精将核复染。将组织洗涤，脱水，然后固定在permount(fisher)中。对于trpv4、il-1β和et1的形态计量定量来说，以x20的放大倍数检查来自于每位患者和健康志愿者(n＝3/组)的5个切片并照相。使用leica软件将整个切片数字化，并使用imagej进行分析。对于定量来说，使用colorthresholdplugin中的isodata阈值化方法，将每张图像的3个随机选择的表皮区域(3.5x1.25英寸)中的dab和he染色分离开。从背景校正过的测量值计算相对信号强度。值被表示为从每位患者的5个切片确定的平均值的均值。从急性光照性皮炎进行人类皮肤组织的trpv4、et1和il-1β的定量，并与健康皮肤进行了比较(n＝3/组)。慢性光照性皮炎的各种不同亚型与急性光照性皮炎和健康皮肤相比的定量，目前正在积极研究中。更多的最终结果等待每个人类慢性光照性皮炎亚组的至少3个病例的获得和正确染色。小鼠原代角化细胞培养。通过1小时的dispase(bdbiosciences)处理将表皮与真皮分离开。然后使用胰蛋白酶从表皮解离角化细胞。将角化细胞铺于胶原蛋白包被的培养皿或玻璃或石英盖玻片上，并在增补有牛垂体提取物和表皮生长因子(egf)(r&dsystems)、100pmol霍乱毒素(calbiochem,sandiego,ca,usa)和1x抗生素/抗真菌剂(gibco)的角化细胞无血清培养基(gibco)中，在培养箱中，在5％co2和37℃下生长。培养的角化细胞的uvb刺激；钙成像。在装载2μmfura2-am后，按照比率测量ca2+成像方案，使用用于双重激发的340/380nm蓝光，进行小鼠1°mk对trpv4的化学激活做出响应的ca++成像。以0.5hz的频率获取发光的比率。δr/r0被确定为给定比率相对于基线比率的增加除以基线比率的分数。对于使用uvb的细胞刺激来说，由于使用340/380nm的刺激与295nm接近，fura-2是不适合的，因此使用2μmfluo4-am来代替。ca++成像在488nm激发下进行，以0.5hz的频率获取发光，并表示为δf/f0。在客户定制的uv光学系统中，在uvled上戴上球透镜，这是半球形透镜形状的透明光学窗(图2b)。所述led输出光束聚焦于距透镜15～20mm处，光斑直径为约1.5～2.0mm(图2c)。用于所述uvled的电源是印刷电路板上的表面安装部件，其具有由外部开关控制的稳态20ma电流输出。设置热平衡台以获得生理温度。我们在专门实验中使用定制的295nmled装置确认了uvb刺激的非热本质(图2d)，从而确认了特定刺激模态为uvb。使用295nmled的角化细胞uv辐照和免疫细胞化学。将小鼠角化细胞在胶原蛋白包被的石英盖玻片上培养，然后使用以前提到的uv光学系统，使用295nmled从底部刺激。24小时后，将所述细胞在含有4％甲醛的pbs中固定20分钟，用含有0.1％tritonx-100的pbs通透化10分钟，洗涤，然后在含有10％正常山羊血清的pbs中阻断45分钟。将盖玻片与第一抗体小鼠抗et1抗体(1:200；abcam)温育过夜，在pbs中洗涤三次，并与第二抗体在25℃下温育2小时。将盖玻片在pbs中洗涤三次，用双蒸水洗涤一次。使用40x油浸物镜在bx61olympus直立显微镜上捕获数字图像。使用imagej免费软件，使用裁剪过的目标区进行形态计量分析。确定皮肤的uvb透过性。首先，如图16a中所示，使用剃刀边缘光斑遮挡法估算来自于led(uvtop-295uv)的uv输入光束的光斑尺寸(结果示出在图16b中)。所述uvled用20ma电流供电，在直径1.5mm的圆形焦斑中产生500μw的光学功率，其中总通量的70％在0.5mm的光束半径内。通过hamamatsus127-66bruv检测器来检测透过样品的uv光学功率，并且使用keithley236源测量装置来测量所述光检测器的输出。接下来，通过将小鼠的脚垫表皮置于石英盖玻片上并暴露于uv光束，来测量它的uv透光率。与图12a中示出的实验相同，将gsk205在醇和甘油溶液中给药到所述脚垫皮肤。介质对照组只用醇和甘油溶液处理。另一个对照组由霜剂形式的可商购的spf100防晒制剂构成，其与介质对照相似来施用。将所述gsk205和防晒霜的数据归一化到该对照数据。western印迹。将样品通过sds-page分离，转移到pvdf膜(bio-rad)上。将膜用奶粉阻断，然后用第一抗体探测(兔抗trpv4抗体(免疫原＝与用于免疫标记相同的trpv4的最终c-端表位)，alomone；抗半胱天冬酶-1抗体，biovision；小鼠抗β-肌动蛋白抗体(克隆ac-5)，abcam；小鼠抗β-微管蛋白抗体，iowahybridomabank)，然后用辣根过氧化物酶偶联的第二抗体(jacksonimmunoresearch)探测。使用supersignalwestduraextendedduration底物(amersham)来检测第二抗体。急性胰腺炎小鼠模型。如以前所述61，通过每小时腹膜内注射超最大剂量的蛙皮素(50μg/kg)共6h，使8-10周龄的c57bl/6j雄性小鼠经历急性胰腺炎。对照动物每小时通过腹膜内注射接受25％dmso-盐水溶液，共6h。将化合物16-8溶解在该介质中(10mg/kg)，并在第一次蛙皮素注射之前30分钟i.p.注射。在最后一次注射后1h，将动物处死。收集血液并迅速分离胰腺组织，称重，用于确定胰腺湿重/体重的比率。将组织样品在10％缓冲至中性的甲醛中固定，石蜡包埋并h&e染色，或者将胰腺组织快速冷冻并评估髓过氧化物酶(mpo)活性。血清淀粉酶、mpo和组织学评估如以前所述来进行61。疼痛反应行为的评估8：在整个实验期间小鼠被饲养在各个笼子中并进行视频记录。一次观察两只小鼠。当小鼠通过笼子的中间平面时，线性移动被测量为一次事件。分析在第一次蛙皮素/介质注射后立即开始，并继续到实验结束。结果被表示为跨越第一次注射后6h的时间段的移动事件的总和。细胞培养。如以前所述13，将n2a细胞用于trp离子通道的定向表达。使用来自于大鼠的trpv4-egfp，以前已发现它以与本源的、非融合的trpv4相似的方式对使用gsk101和低渗透压的刺激做出响应。所有其他通道是来自于小鼠的本源通道，egfp被共转染。过表达的trpv4的刺激使用gsk101(5nm)来进行，trpv1的刺激使用辣椒素(10μm)来进行，trpv2的刺激使用低渗透压(270mosmol/l)来进行，trpv3的刺激使用莰酮(100μm)来进行，并且trpa1的刺激使用芥子油(100μm)来进行。egfp对照转染的n2a细胞对这些刺激没有响应。ca++成像如以前所述13,14,34来进行。为了将剂量响应关系可视化，使用igorpro软件程序进行hill作图，所述程序基于下述方程推演所述图：对来自于骨骼成熟的猪的股骨髁的猪原代软骨细胞进行培养，并如以前所述19,32,62,63进行ca++成像。星形细胞培养按照已确立的流程64–66进行。从spraguedawley大鼠胚胎(e18)制备星形细胞。简单来说，将分离的皮层切碎，然后与胰蛋白酶和dnase温育。将解离的细胞悬浮在增补有10％胎牛血清和青霉素/链霉素(分别为100u/ml和100μg/ml)的dulbeccco改良的eagle培养基(dmem)中。随后，将细胞悬液铺于用聚l-赖氨酸(10μg/ml)预包被的75cm2组织培养瓶中(10×106个细胞/瓶)。将所述细胞在37℃下维持在10％co2培养箱中。10–12天后，去除培养基并将贴壁细胞用胰蛋白酶处理(0.25％)并铺于盖玻片上，用于随后的ca++成像34,67。发现>95％的所述细胞表达星形细胞标志物胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)68。培养物中的细胞存活率。将n2a细胞在96孔板中培养24–48h。细胞存活率研究依赖于使用指示剂染料刃天青监测的代谢能力。随时间监测它向试卤灵的还原(由深蓝向粉色的颜色变化指示)。使用微孔板读板器(moleculardevices)记录在λ＝570nm处的吸光度变化。有代谢活性且存活的细胞具有将刃天青还原为试卤灵的能力，而死细胞没有。每个实验点研究8份培养物平行样。在用16-…化合物处理的小鼠中肝、肾和心脏功能的评估。将小鼠用化合物16-8和16–19(10mg/kg)i.p.处理。肝和肾的完整性通过丙氨酸氨基转移酶和肌酸酐测定法(sigma)来分析，所述两种测定法都依赖于在96孔微量滴定板中测量在λ＝570nm处的吸光度。每只动物进行8份技术平行样。对于用16-8和16–19处理的小鼠中的心率评估来说，给动物装上两个电极，一个通过夹子装到耳朵，一个使用强力胶装到肋骨。使用axoscope和clampfit9.2软件(moleculardevices)监测并分析心率。液相色谱–串联质谱术(lc-ms/ms)。将小鼠用10mg/kg的相应抑制剂i.p.处理。将安乐死后收获的组织在液氮中冷冻并储存在-80℃下，以备进一步分析。将冷冻的组织样品部分融化并切成1mm薄片，将5–15mg组织、2倍过量的水(质量/体积)、6倍过量的含有适量内标的乙腈(16-…化合物)或甲醇(gsk205)和2.5mm氧化锆/二氧化硅珠子(biospecproductsinc.)添加到500μl聚丙烯(pp)锥形管，在fast-prep装置(thermo-savant)中，在室温下以速度“4”匀浆20秒，并在室温下以13,600g离心5分钟。取决于所测量的化合物的预期浓度范围，将上清液1/4–1/20稀释(在流动相a中，参见下文)，并放置在用于lc-ms/ms分析的自动进样器中。用于16-…化合物和gsk205的lc-ms/ms测定法在与appliedbiosystemsapi5500qtrap这种混合三重四极杆线性阱ms/ms光谱仪相接的agilent1200系列lc系统上开发。将analyst(1.6.1版)软件用于质量参数调谐、数据获取和定量。lc柱：3×4mmrpc18(phenomenex，aj0-4287)在35℃下运行。流动相a：0.1％甲酸，2％乙腈，在lc/ms级的水中；流动相b：乙腈；流速：1ml/min，1:1ms/ms：废液分流。运行时间为4分钟。导流阀被用于仅将1.2至2.5分钟之间的液流送往ms/ms。洗脱梯度为：0–0.5分钟，1％b；0.5–1.2分钟，1–95％b；1.2–1.5分钟，95％b；1.5–1.6分钟，95–1％b。自动进样器在4℃下运行；进样体积保持在10–50μl。电喷雾电离(esi)源参数为：正电离模式，气帘气流速＝30，电离电势＝5500v，温度＝500℃，雾化气体1流速＝30，雾化气体2流速＝30，去簇电势＝20v。将16-…化合物和gsk205作为在50％a/50％b中的100nm溶液，以10μl/min的流速和被优化成为“亲代”和碰撞产生的(“子代”)ms/ms离子提供最大离子计数的参数单个地注入。所使用的亲代/子代定量物[定性物]离子：gsk205(401.1/280[370])，16-8(400.1/279.1[91.1])，16-16(387.1/280[105])，16–18(415.2/280[370])，16–19(414.1/279.2[91.1])。所使用的标准品(目标被分析物)/内标对：gsk205/16-16，16-8/16-16，16–18/gsk205，16–19/16-8。通过以特定给药方案所需的适合的范围向组织匀浆液(组织+2倍过量的水，质量/体积)添加被测量化合物的纯标准品，制备了校准样品(n＝6)。所研究的器官与研究样品一起进行分析。下面是所使用的典型范围(较低值也代表在80％准确度极限下的lloq，所有其他校准物水平在85％准确度极限下)：0.38–6nm(血浆)，6–100nm(皮肤)，6–48nm(心)，7.5–120nm(脑)，19–300或1500–24000nm(肝)，56–900或1500–12000nm(肾)，500–8000nm(脂肪)。峰积分、校准和定量在analyst软件内进行。标准品/内标的峰面积对标示浓度的响应是线性的，r＝0.999或更好。膜片钳记录。对异源转染的n2a细胞进行膜片钳电生理记录。简单来说，在转染后24h，将细胞用含有(单位为mm)1mgcl2、10葡萄糖、10hepes、145nacl和2cacl2的细胞外流体(ecf)(ph7.4，310mosm)预洗涤。然后将细胞在含有或不含trpv4抑制剂的ecf中温育5分钟，然后进行全细胞记录。将盖玻片转移到安装在装备有荧光过滤片的leica倒置显微镜的载样台上的记录室中。转染的细胞在贴片之前通过它们的绿色荧光来鉴定。将细胞用2.5–3.0mω玻璃电极贴片，所述电极使用吸管拉制仪(sutterinstruments)从硼硅酸盐玻璃毛细管拉制。细胞内溶液含有(mm)140cscl、10hepes、1egta、0.3na-gtp、2na2-atp和2mgcl2(ph7.4，295mosm)。使用pclamp9.2软件和axopatch200b放大器(moleculardevices)记录全细胞电流。将细胞首先在-65mv下夹住，然后从-110mv至+120mv施加1s的电压匀升。每2秒施加所述电压匀升，共15至20次扫描。在整个实验记录期间监测电容量。报告的数据在±3pf之内。实施例2：表皮特异性、他莫昔芬可诱导的trpv4缺失小鼠的产生为了克服在具有遍在缺失的基因靶向小鼠中可能产生的发育问题，我们开发了可诱导的条件性系统来评估trpv4在uvb介导的皮肤刺激、炎症和感觉敏化中的作用。使用小鼠es细胞，我们首先建立了trpv4lox/lox小鼠，使得编码跨膜结构域5、6和居间的孔环的大小可调节的外显子在两侧带有loxp元件。在与flpe小鼠杂交以去除在两侧带有frt元件的选择标志物之后，将这些动物与他莫昔芬(tam)可诱导的角蛋白-14(k14)-creer转基因小鼠交配。构建物和基因分型概述在图1a-b中。我们将我们的分析聚焦于成年(2月龄)腺小鼠的爪垫皮肤，因为它更接近类似于人类皮肤。他莫昔芬诱导引起皮肤表皮中trpv4表达的高效敲落，正如通过抗trpv4抗体免疫标记、qrt-pcr和western印迹所判断的(图3a)。然而，在tam处理的可诱导的trpv4敲除(iko)小鼠中，皮肤/表皮的总体和微观外观正常。考虑到已确立的皮肤更新对角化细胞ca++信号转导的依赖性，我们注意到有趣的是，trpv4敲落既不引起皮肤/表皮中的总体改变，也不引起终端分化特异性标志物角蛋白-1(k1)的诱导，后者已知由基底上层中ca++内流的增加来控制(图3a和图1c)。trpv4缺陷的皮肤的更密切的分析揭示出在基底上层中k14的表达得以维持。这种角蛋白在基底向基底上层转变时通常被下调，与ca++信号转导的升高和终端分化的诱导相伴。合在一起，尽管存在这些较温和的异常情况，但在8周龄时在角化细胞中诱导trpv4敲落不引起对表皮的细胞和层组织结构的总体干扰。实施例3：由uvb暴露诱发的疼痛反应行为依赖于表皮表达的trpv4强调了trpv4基因靶向的特异性，使脚垫受神经支配的外周感觉神经元仍显示出稳健的trpv4表达(图1d)。这使我们能够评估表皮trpv4缺陷是否关键性地影响uvb介导的疼痛反应行为。为此目的，我们分析了两种相关的子模式——热和机械刺激，并将我们的iko小鼠与全缺失trpv4-/-和它们的野生型(wt)对照进行比较(图3b)。在uv暴露后48小时，tam处理的iko和trpv4-/-小鼠两者与它们相应的对照相比，都表现出对有害辐射热(hargreaves试验)以及对有害机械刺激(使用自动vonfrey毛发试验)低得多的敏感性。我们得出结论，在降低uvb诱导的对辐射热和机械刺激的行为敏化方面，即在减弱热和机械触摸痛方面，表皮特异性trpv4缺陷与全面trpv4消融等效。进一步强调了表皮trpv4在调控疼痛反应行为中的重要性，在对热刺激的uv敏感性与trpv4基因敲落水平、特别是trpv4mrna的<0.45wt水平之间，存在良好的相关性(图3c)。这表明对于trpv4敲落来说，存在影响疼痛反应行为的阈值。尽管在我们的机械测定法中剂量响应性不太明显(未示出)，但我们将这归因于在所述测定法中涉及了被迫后肢(脚)移动，这将与所述刺激混淆。相反，hargreaves测定法使用变得有害的纯粹热诱因，而不涉及令人混淆的刺激。为了评估所述伤害性刺激的特异性，我们使用诱发明确的双阶段响应的福尔马林的脚垫注射来诱导刺激。在这种测定法中，trpv4的条件性表皮敲落对直接的外周化学刺激(阶段i)或早期适应不良性神经应答(阶段ii)没有影响(图3d)。合在一起，这些结果表明表皮trpv4敲落水平是由uvb辐照引起的疼痛反应行为的减弱程度的决定性因素。这是特异性的，因为化学刺激物诱导的疼痛反应行为不受表皮trpv4敲落影响。在另外的对照实验中，trpv4lox/+杂合小鼠事实上具有一致的对uvb做出响应的行为敏化(与wt相似)，不论是用他莫昔芬还是介质进行cre诱导(图1e)。这些发现排除了creer自身的功能性作用，并重申了我们的方法在靶向角化细胞的trpv4消融中的特异性。此外，trpv4-/-皮肤与它的wt对应物同等地可透过uvb。实施例4：使皮肤受神经支配的外周神经元的活化标志物支持行为发现在wt小鼠中，脚垫受l5drg的感觉神经元神经支配，我们通过免疫标记对其进行检查。随着脚垫暴露于uvb这种已知使神经支配性神经元敏化的刺激诱因，trpv4表达不改变(图1d)。有趣的是，尽管敏化可以在对照小鼠中被证实，但它似乎在tam处理的iko小鼠中不存在，正如由磷酸化erk(perk)的标记所证实的，所述perk是感觉神经元对炎症和刺激做出响应而活化的已知标志物(图3e)。此外，表达perk的l5drg神经元的尺寸测量揭示出它们具有小到中的尺寸，表明它们可能参与有害刺激的中继(图1f)。这些结果与在我们的小鼠中看到的疼痛反应行为缺陷良好相符，并进一步强调了表皮表达的trpv4在控制使皮肤受神经支配的drg感觉神经元的uvb诱导的激活中的作用。实施例5：uvb诱导的皮肤炎症依赖于trpv4的表皮表达为了理解trpv4的丧失如何影响uvb诱导的皮肤，我们进行了光学显微术和超微结构分析(图4a和图5a-c)。对uvb做出响应，在对照皮肤内出现稳健的炎症迹象，正如粒细胞的表皮内浸润所证实的。对于所述表皮来说，发生局灶起疱并伴有大量空泡化。在tam处理的具有不完全靶向的iko小鼠的皮肤中，仍然观察到炎症变化，并且严重性可能适度降低。然而，形成鲜明对比的是，在trpv4的条件性表皮消融完全的皮肤区域中，没有看到炎症的迹象或起疱。这些数据令人信服地证实了表皮trpv4对于皮肤对uvb暴露产生促炎性响应来说是必需的。此外，由于所述炎症涉及免疫细胞并且所述条件性敲除特异性针对表皮，因此所述数据进一步强调了在所述响应中表皮-炎性细胞串扰的重要性。具体来说，这些数据暗示在正常皮肤中，表皮角化细胞触发炎性细胞召集作为uvb响应的一部分，并且当表皮trpv4被敲落时，该环路被中断。接下来，我们力图鉴定在暴露于uvb的wt小鼠中出现的特异性的trpv4依赖性表皮信号，以及做出响应的免疫细胞群体。il-6是所述表皮信号的适合的候选物，因为它是uv皮炎期间皮肤表皮激活的已确立的标志物，并且此外il-6稳健地致疼痛。事实上，不仅在对照小鼠的uv暴露的表皮中观察到il-6免疫反应性，而且在条件性靶向以及全缺失trpv4敲除皮肤中几乎消除这种稳健的il-6上调(图4b和图5d)。已知巨噬细胞和嗜中性粒细胞两者通过它们的多种促疼痛/致疼痛介导物例如tnfα、il-6、il-8、蛋白酶和趋化因子的表达而对疼痛阈值的降低有贡献。正如通过对cd68(巨噬细胞)和细胞类型特异性弹性蛋白酶(指示活化的嗜中性粒细胞，已知也增强伤害感受)的免疫染色所判断的，在trvp4条件敲除小鼠的皮肤中uvb诱导的这两种细胞群体的浸润被显著减少(图4c-d)。相反，肥大细胞浸润不受影响(图5e)，强调了巨噬细胞和活化的嗜中性粒细胞发现的特异性；在不同基因型之间t-细胞计数也不变。合在一起，这些发现显示角化细胞的trpv4表达对于它们对uvb辐射做出响应产生il-6并吸引巨噬细胞和活化的嗜中性粒细胞的能力来说是关键的。实施例6：在暴露于uvb的小鼠原代角化细胞中uvb诱导的ca++响应关键依赖于细胞外ca++通过trpv4的内流为了进一步剖析所涉及的基础机制，我们建造了定制装置用于体外培养的小鼠原代表皮角化细胞(1°mk)的特异性和窄带uvb刺激(图6a-b和图2a-d)。这允许使用ca++敏感性染料fluo-4并评估uvb暴露后1°mk的ca++动力学(图6b)。所述引发的ca++信号被折射uv的玻璃盖玻片消除，强调了钙响应对uvb的严格依赖性(图6c和图2a)。接下来，我们提出疑问，即uvb介导的ca++响应是否依赖于细胞外ca++，并通过首先向uvb、然后向ca++的顺序暴露记录了肯定性发现(图6d)。这一发现促使我们直接质询trpv4在uvb介导的ca++响应中的作用。事实上，来自于trpv4-/-小鼠的1°mk相对于它们的wt对应物表现出极大减少的响应(图6e)。此外，当使用选择性小分子化合物gsk205(vincent和duncton，currenttopicsinmedicinalchemistry2011,11,2216-2226)来阻断trpv4通道功能时，wt1°mk显示出与trpv4-/-1°mk非常相似的响应(图6f)。有鉴于已知trpv3在角化细胞中稳健地表达(moqrich等，2005；peier等，2002)，我们还致力于发现trpv3在uvb介导的ca++增加中的作用，但使用trpv3选择性抑制剂ipp时观察到没有影响(图6g)。同样剂量的ipp有效地抑制莰酮诱发的ca++瞬变(图2e)，验证了阴性结果。合在一起，我们的实验表明表皮的uvb暴露引发细胞外ca++通过trpv4但不是trpv3通道的内流。由于两个通道都存在，因此所述数据进一步表明trpv4通道被uvb光选择性激活。我们通过用可以直接刺激wt1°mk中的trpv4的gsk101化学激活trpv4，获得了确证性发现。gsk101介导的响应依赖于外部ca++，并被trpv4抑制剂gsk205消除(图2f)。这些发现显示trpv4的直接化学通道激活具有uvb诱发的ca++动力学的关键性质。为了评估trpv4对于uvb诱发的ca++内流是否足够，我们将高水平的trpv4引入hek293上皮细胞。trpv4表达使这些细胞具有对uvb做出响应产生稳健的ca++信号转导的能力(图2g)。此外，如果将它们预先暴露于gsk205，所述响应被阻断。因此，异源trpv4表达足以使uvb辐射引起细胞的ca++瞬变。实施例7：升高的内皮素-1是uvb-trpv4-ca++响应的关键表皮效应物uvb-trpv4-ca++响应依赖于磷脂酶c(plc)，因为它事实上被特异性plc抑制剂u73122消除(图6h)。trpv4活化对plc信号转导的依赖表明plc的相应的脂类产物例如ip3可能参与。它还暗示了g蛋白偶联受体信号转导的可能参与。使用候选物方法，我们聚焦于已知在皮肤角化细胞中表达的内皮素受体[et(r)]。et(r)是特别良好的候选物，因为它们起到促疼痛/致疼痛作用，并且它们的同源肽配体内皮素-1(et1)在角化细胞暴露于uvb时升高。当将我们的1°mk暴露于et1时，它们表现出uvb诱导的ca++信号转导的显著提高(图7a(i))。这种响应依赖于trpv4，因为它被gsk205极大地降低。与这一结果相符，et1增强gsk101诱发的ca++信号转导(图8a)。接下来，我们通过施用内皮素原转化酶抑制剂cgs35066来阻断et1分泌。这种抑制剂在1°mk中显著减少uvb诱导的ca++信号转导(图7a(i))。由于et1对ca++信号转导的增强效果依赖于trpv4，并且在体外uvb-ca++响应通过et1分泌被显著维持，因此我们推断涉及et1的自分泌/旁分泌信号转导可能起到激活它的同源受体et-r(a)和et-r(b)的作用。与这个见解良好地相符，et-r抑制剂显著减弱对uvb和et1共同暴露做出响应的ca++信号。有趣的是，et-r(a)的拮抗作用消除了ca++响应的晚期阶段，而留下开始的升高不受影响；相反，et-r(b)的拮抗作用将uvb-ca++响应转变成更加延长的响应(图7a(ii))。两种抑制剂的共同施用完全消除了1°mk的uvb诱导的ca++响应(图7a(iii))。合在一起，这些发现表明uvb介导的et1分泌是uvb-trpv4-ca++响应的重要贡献因素。所述数据进一步表明，不依赖于uvb的其他效应，et1-et(r)共同信号转导可以放大trpv4依赖性的ca++响应。支持这一见解的是，通过省略uvb暴露并代之以用et1和选择性trpv4激活剂4α-pdd共同处理1°mk，可以重现uvb-ca++响应。此外，这种响应被et(r)-a抑制显著减弱，并被et(r)-b抑制极大降低(图7b)。对于两种化合物来说，et(r)的选择性拮抗作用都引起减弱，但对于使用uvb时观察到的模式显示出轻微差异，即对于uvb来说两种et(r)是共同依赖的，并且对于4α-pdd来说et(r)-b的召集超过et(r)-a。考虑到uvb的多效性，这些微小差异并不令人吃惊，并且总的来说，所述结果为在所述响应中trpv4和et(r)信号转导的相互依赖提供了强力支持。有趣的是，未受刺激的1°mk产生可观的et1水平，其分泌行为依赖于trpv4和plc(图8b)。我们测试了uvb是否以trpv4依赖性方式引起et1上调。考虑到1°mk中et1的表达具有精确的波长依赖性，我们求助于与用于ca++成像相同的uvb-led装置(图6a和图2a-d)。uvb暴露的1°mk显示出et1免疫标记的提高，其在将细胞与trpv4抑制剂gsk205和rn1734预温育时降低(图8c-d)。与它对uvb诱发的ca++瞬变的影响相符，plc抑制剂u73122也减弱et1表达。合在一起，这些发现表明了一种有限前馈的机制，其包括对uvb做出响应的et1表达的trpv4依赖性的提高和通过et(r)的自分泌/旁分泌信号转导。这引起trpv4依赖性的ca++信号转导，其进而以旁分泌/自分泌方式放大et1信号转导。为了评估我们的发现在体内的生理意义，我们将爪垫暴露于uvb。在wt小鼠的爪垫皮肤中可以明显看出edn1mrna表达的有趣的时间过程，其中它在120分钟后达到峰值并在24小时时减弱，当仍保持显著提高。相反，在trpv4-/-小鼠的爪垫皮肤中不存在受调控的edn1表达。这些发现表明对uvb做出响应edn1的基因表达被trpv4更直接地调控。et1在对照表皮中被容易地检测到，但在trpv4缺陷的表皮中减少(图7c)。trpv4对于et1对疼痛反应行为的促进作用来说也是关键的，正如通过下述发现所判断的，即，对表皮下et1注射做出响应，在对照中对vonfrey毛发刺激做出响应的后撤阈值显著降低，但在全缺失和条件缺失两种trpv4-/-小鼠中没有显著降低(图7d)。这个结果表明et1的促疼痛/致疼痛效应完全依赖于角化细胞中的trpv4。尽管以前的研究已显示et1足以引发疼痛反应行为，但考虑到et(r)和trpv4两者都由在我们的tam处理的iko小鼠中不受影响的感觉传入神经表达，在我们的trpv4-条件缺失小鼠中et1的促疼痛/致疼痛效应的消除是出人意料的。实施例8：角化细胞的uvb诱导的炎性体活化依赖于trpv4在角化细胞中将uvb暴露联系到炎症和伤害感受的另一个信号转导机制是炎性体，其是一种大的多蛋白复合体，对感染和其他细胞损伤做出响应而组装并触发炎性级联反应，所述级联反应以半胱天冬酶的活化和细胞因子il-1和il-18的产生为终结。以前已显示它的形成依赖于ca++信号转导，这促使我们质询炎性体活化对trpv4的依赖性。事实上，尽管在uvb处理的对照皮肤中半胱天冬酶-1被上调，但这在trpv4-/-中被大大消除，并在tam处理的iko皮肤中被极大减弱(图9a-b)。此外，尽管通过来自于暴露到uvb的wt1°mk的裂解物的western印迹分析容易地检测到半胱天冬酶-1切割(活化)，但在trpv4-缺陷的对应物中缺少半胱天冬酶-1表达，即使不使用uvb(图9c)。同样地，促疼痛炎性体产物il-1β的上调在对对照皮肤表皮的uvb处理的响应中容易地检测到，但不能在trpv4缺陷的表皮中检测到。这不仅通过免疫标记，而且通过测量爪垫水肿组织间隙液中的il-1β水平来证实(图9d-f)。合在一起，这些结果确立了trpv4在角化细胞介导的炎性体活化中的基础重要性，所述炎性体活化增强pro-il-1β的半胱天冬酶-1介导的蛋白水解切割，以形成有活性的il-1β。与皮肤对uvb做出响应分泌il-1β相关，我们质询了cxcl5对trpv4的依赖性。最近已报道，在啮齿动物和人类中，表达依赖于il1β/il1r1信号转导的cxcl5对uvb做出响应，以促疼痛/致疼痛的方式在角化细胞中起作用。与炎性体功能和il-1β表达对trpv4的依赖相一致，我们发现同样地，uvb诱导的促疼痛/致疼痛的cxcl5上调也依赖于角化细胞来源的trpv4(图9g-h)。实施例9：表皮来源的trpv4在传递对uvb暴露的伤害感受响应中的临床意义有趣的是，在患有uv光照性皮炎的人类患者的表皮中trpv4显著增加(图10a和图11)。与健康皮肤对照相比，在急性光照性皮炎中也看到et1和il-1β免疫染色的稳健增加(图10a-b)。这些发现表明trpv4也可能参与uvb诱导的光照性皮炎，这是人类皮肤对伤害性uv辐照的各种不同响应之一。有鉴于在对uvb的响应中观察到的表皮特异性trpv4缺陷对小鼠伤害感受的影响，并且由于选择性trpv4阻断剂在体外对1°mk的明确效果，我们测试了我们的发现的可能的临床意义。为此目的，我们向wt小鼠皮肤表面施用trpv4抑制剂gsk205，随后将动物暴露到uvb(图12a)。尽管溶剂处理的对照小鼠表现出正常的热超敏反应，但用1mmgsk205处理的小鼠显示出敏感性的～24小时的延迟，并且将剂量提高到5mmgsk205导致热诱发的疼痛反应行为的持续减弱。值得注意的是，这种处理也引起小鼠对vonfrey毛发机械刺激的敏感性显著降低。为了评估外部表面处理的特异性，我们向trpv4-/-小鼠施用了5mmgsk205，并与介质对照进行比较(图12a)。疼痛反应行为没有显示出任何组间差异，当与刺激前阈值存在显著差异。在这些结果的基础上，在体内用5mmgsk205表面处理不引发可能可测量地影响后撤行为的对其他通道或信号转导途径的脱靶效应。尽管不能排除gsk205介导的巨噬细胞和神经trpv4的拮抗作用，但表皮是表面施用的药物的初始靶点，并且我们使用5mmgsk205测量到的效果与我们在trpv4tam诱导的iko皮肤中观察到的效果一致。gsk205表面处理的皮肤的组织病理学在介质处理的爪中显示出uvb-光照性皮炎的标志，明显与gsk205处理的动物(5mm)相反，后者的爪显示出炎症的实质性消除(图14a)。有鉴于皮肤中et/edn1表达的trpv4依赖性，我们测量了gsk205与介质处理的爪垫皮肤中的edn1mrna丰度。在介质处理的小鼠中，我们在2小时时间点处检测到早期上调，其在24小时时仍显著高于暴露前的动物，类似于未处理的wt小鼠中的edn1调控和时间过程(图14b，与图15比较)。形成鲜明对比并且与组织病理学相符的是，发现在gsk205表面处理的皮肤中edn1mrna的表达不变。为了验证这些发现，我们测试了gsk205处理的爪垫皮肤中的uvb吸收，以及gsk205是否因此起到防晒霜的作用。结果是阴性的，正如由gsk205和介质处理的爪垫皮肤相比具有同等的uvb透过性所证实的，结果也是有效的，正如由使用spf100防晒霜时uvb透过率显著降低所证实的(图14cd和图16ab)。这些结果证实了表面施用的gsk205的效果由trpv4拮抗作用引起，可能通过影响表皮角化细胞中的trpv4引起。我们还测试了下游uvb效应物机制对体内gsk205处理的响应。在小鼠皮肤中，使用介质处理时il-1β对uvb做出响应被上调，但使用5mmgsk205时未被上调(图12b-c)。这个体内发现在1°mk中被重现，其中在5μmgsk205存在下，所述1°mk的uvb诱导的il-1β分泌增加被完全消除(图12d)。观察到了对cxcl5和il-6上调的同等显著的阻断(图13a-b)。因此，在通过表面施用特异性小分子抑制剂来拮抗trpv4以及在我们的角化细胞特异性且可诱导的trpv4条件缺失小鼠中对trpv4进行遗传靶向两种情况下，表皮中uvb诱发的信号转导降低。这表明trpv4的离子通道功能对于两种实验方法来说是共同的关键因素。合在一起，这些发现使选择性trpv4阻断剂例如gsk205成为用于在人类中减少由uvb暴露引起的损害性炎性响应的治疗方法的出色候选物。实施例10：trpv4对痒感响应的重要性行为研究显示，与wt小鼠相比，在trpv4缺失小鼠中抓挠行为减少。将组胺(10％)皮内注射到c57b/6对照(wt)或trpv4缺失小鼠(n＝6/组)的颊中。30分钟内，与wt小鼠相比，trpv4缺失小鼠显示出显著减少((p<0.01)t-检验)(图17)。所述结果证实，与trpv1和trpa1相似，trpv4参与痒感，并且trpv4活化的阻断剂可能对治疗痒感有益。实施例11：trpv4在痒感中的作用的证据使用具有选择性trpv4缺失的小鼠和化合物48/80，进一步研究了trpv4是否在痒感中起作用。化合物48/80(可以从sigma-aldrich,st.louis,mo获得)是已确立的致痒原，并通过肥大细胞脱颗粒引发组胺依赖性痒感。使用如实施例2中详细描述的小鼠，在所述小鼠中皮肤角化细胞中的trpv4通道已通过基因靶向被选择性缺失，并通过提供他莫昔芬来诱导被靶向的等位基因。野生型小鼠被用作对照。将化合物48/80(100微克，在50μl中)耳后注射到小鼠中，并监测小鼠对其做出响应的抓挠行为。结果示出在图18中。对于在皮肤角化细胞中trpv4通道已被选择性缺失的小鼠来说，与对照小鼠相比，30分钟内的抓挠行为显著减少。所述结果为trpv4在痒感中的作用，特别是痒感对皮肤的角化细胞中表达的trpv4离子通道的依赖性，提供了另外的证据。所述结果清楚地表明，皮肤上皮细胞(角化细胞)而不是感觉神经元或免疫相关细胞或过敏相关细胞中的trpv4，是trpv4表达的关键位点并在组胺依赖性痒感中发挥作用。这些发现还表明trpv4通道的表面靶向可能在对抗痒感中是成功的。实施例12：化合物的总体制备用于制备化合物16-8、16-12c、16-13、16-14、16-16、16-18和16-19的通用流程如下所述，每个步骤使用下述试剂和条件：(i)k2co3，ch3cn；(ii)zn，meoh，12mhcl；(iii)1,1′-硫羰基二咪唑；(iv)meoh中的7mnh3；(v)etoh，回流：步骤(i)用于4-硝基苯乙基溴的sn2置换的通用程序。将烤箱干燥的粉状k2co3(1.5当量)和胺(1.5当量)顺序添加到溴化物(0.33m)在无水ch3cn中的室温溶液。将所述反应混合物加热到80℃(油浴温度)，直至通过lcms进行的反应混合物的分析表明溴化物被完全消耗(～6-18小时)。将所述混合物冷却至室温并用盐水(2体积当量)稀释。将得到的乳液用etoac(2x1体积当量)萃取。将合并的萃取物添加到硅胶(硅胶的质量＝2x起始溴化物的质量)，并将所述混合物在减压下浓缩至干。快速柱层析(rediseprfsio2，100％ch2cl2→ch2cl2中的5％meoh)给出作为棕色至琥珀色油状物的产物。中间体13a-d(在步骤(i)中形成的叔胺)的得率呈现在表1中。表1.在步骤(i)中形成的叔胺13a-d的得率中间体编号rn得率13ame017％13bme149％13cme242％13det115％步骤(ii)用于硝基向苯胺的还原的通用程序：将所述硝基化合物的溶液(0.5m，在meoh中)在冰-nacl浴中冷却。将锌粉(4.5当量)一次性添加，然后在2-3分钟内逐滴添加12mhcl(4.5当量)。1小时后，撤除所述冷却浴，并允许所述反应混合物在室温下搅拌过夜。第二天早晨，将所述混合物在冰-nacl浴中再次冷却，并逐滴添加30％naoh水溶液，直至达到ph14(通用ph试纸)。将所述混合物用ch2cl2(5体积当量)稀释并搅拌5分钟。在此时间后，在真空下去除不溶物，并将滤饼用ch2cl2(2x25ml)洗涤。分离滤液的有机相，用盐水(100ml)洗涤并干燥(mgso4)。通过过滤去除所述干燥剂。添加硅胶(～5g)，并将所述滤液在减压下浓缩至干。快速柱层析(rediseprfsio2，100％ch2cl2→ch2cl2中的5％meoh)给出作为透明琥珀色油状物的产物。中间体14a-d(在步骤(ii)中形成的苯胺)的得率呈现在表2中。表2.在步骤(ii)中形成的苯胺14a-d的得率中间体编号rn得率14ame075％14bme184％14cme297％14det185％步骤(iii)和(iv)用于硫脲形成的通用程序。将苯胺在无水ch2cl2中的溶液(0.22m)在2-5分钟内逐滴添加到冰-nacl浴冷却的1,1’-硫羰基二咪唑(2当量,0.15m)在无水ch2cl2中的溶液。15分钟后，将所述冷却浴撤除，并将所述反应混合物在室温下搅拌，直至通过tlc(5％meoh在ch2cl2中)进行的分析表明起始的苯胺被完全消耗。将所述混合物在冰浴中再次冷却，并在2-5分钟内逐滴添加meoh中的7mnh3(10.5当量)。将所述浴撤除，并将所述混合物在室温下搅拌过夜。添加硅胶(硅胶的质量＝2x起始苯胺的质量)，并将所述混合物在减压下浓缩至干。快速柱层析(rediseprfsio2，100％ch2cl2→ch2cl2中的10％meoh)给出纯的硫脲。中间体15a-d(步骤(iii)-(iv)中形成的硫脲)的得率呈现在表3中。表3.步骤(iii)-(iv)中形成的硫脲15a-d的得率中间体编号rn得率15ame099％15bme196％15cme288％15det167％步骤(v)用于噻唑形成的通用程序。将etoh中的所述硫脲(0.1m)与α-溴乙酰苯衍生物(1.1当量)的混合物加热到75℃(油浴温度)，直至通过tlc(5％meoh在ch2cl2中)进行的分析表明所述硫脲被完全消耗。添加硅胶(硅胶的质量＝2x起始硫脲的质量)，并将所述混合物在减压下浓缩至干。快速柱层析(rediseprfsio2，100％ch2cl2→ch2cl2中的10％meoh)给出纯的噻唑氢溴酸盐。终产物16-8至16-19(在步骤(v)中形成的噻唑氢溴酸盐)的得率呈现在表4中。表4.在步骤(v)中形成的噻唑氢溴酸盐16-8至16-19的得率实施例13：化合物16-8和16-19的制备化合物16-8。化合物16-8如实施例11中详述来制备。简单来说，将所述溴化物(5.01g，21.8mmol)、n-苯甲基甲基胺(4.2ml，33mmol，1.5当量)和k2co3(4.6g，33mmol，1.5当量)在无水ch3cn(65ml)中的悬液加热至80℃(油浴温度)18小时，在此时间后起始原料接近完全反应。将所述混合物冷却至室温并用盐水(120ml)稀释。将得到的乳液用etoac(2x60ml)萃取。将合并的萃取物添加到硅胶(～10g)，并将所述混合物在减压下浓缩至干。快速柱层析(rediseprfsio2(120g)，100％ch2cl2→ch2cl2中的5％meoh)给出作为透明深橙色油状物的产物(2.91g，49％)。1hnmr(cdcl3,400mhz)：8.13(d,j＝8.4hz,2h),7.32(d,j＝8.4hz,2h),7.30-7.22(m,5h),3.55(s,2h),2.91(t,j＝6.8hz,2h),2.68(t,j＝6.8hz,2h),2.29(s,3h)。esims：m/z271[(m+h)+]。将所述硝基化合物(2.8g，10.4mmol)在meoh(20ml)中的溶液在冰-nacl浴中冷却。添加锌粉(325目，3g，4.5当量)，然后在2-3分钟内逐滴添加12mhcl(3.8ml，4.5当量)。1小时后，撤除所述冷却浴，并允许反应混合物在室温下搅拌过夜。第二天早上，将所述混合物在冰-nacl浴中再次冷却，并逐滴添加30％naoh水溶液，直至达到ph14(通用ph试纸)。将所述混合物用ch2cl2(100ml)稀释并搅拌5分钟。在此时间后，在真空下去除不溶物，并将滤饼用ch2cl2(2x25ml)洗涤。分离滤液的有机相，用盐水(100ml)洗涤并干燥(mgso4)。通过过滤去除所述干燥剂。添加硅胶(～5g)，并将所述滤液在减压下浓缩至干。快速柱层析(rediseprfsio2(120g)，100％ch2cl2→ch2cl2中的5％meoh)给出作为透明琥珀色油状物的产物(2.1g，84％)。esims：m/z241[(m+h)+]。该材料不需进一步分析或纯化直接用于下一步骤中。将所述胺(2.1g，8.7mmol)在无水ch2cl2(40ml)中的溶液在2-5分钟内逐滴添加到冰-nacl浴冷却的1,1’-硫羰基二咪唑(95％，3.1g，17.4mmol，2当量)在无水ch2cl2(120ml)中的溶液。15分钟后，将所述冷却浴撤除，并将所述反应混合物在室温下搅拌1.5小时，在此时间后通过tlc(5％meoh在ch2cl2中)进行的分析表明起始的苯胺被完全消耗。将所述混合物在冰浴中再次冷却，并在2-5分钟内逐滴添加meoh中的7mnh3(13ml，91mmol，10.5当量)。将所述浴撤除，并将所述混合物在室温下搅拌过夜。添加硅胶(～5g)，并将所述混合物在减压下浓缩至干。快速柱层析(rediseprfsio2(120g)，100％ch2cl2→ch2cl2中的10％meoh)给出作为琥珀色油状物的硫脲，其在静置后固化成粘性残留物(2.5g，96％)。将所述硫脲(2.5g，8.3mmol)与2-溴乙酰苯(1.8g，9.1mmol，1.1当量)在etoh(80ml)中的混合物加热到75℃(油浴温度)20分钟，在此时间后通过tlc(5％meoh在ch2cl2中)进行的分析表明所述硫脲被完全消耗。添加硅胶(～5g)，并将所述混合物在减压下浓缩至干。快速柱层析(rediseprfsio2(120g)，100％ch2cl2→ch2cl2中的10％meoh)给出作为稻草色玻璃状物质的噻唑氢溴酸盐(3.73g，93％)。化合物16-19。在检查了gsk205相对于化合物16-8和16-18的活性后，似乎从吡啶基去除氮提高trpv4拮抗剂的效能，并且向氮碳侧链添加额外的碳提高trpv4拮抗剂的效能。在16-8和16-18的结构的基础上形成了化合物16-19。参见图19。化合物16-19如实施例11中详述来制备。简单来说，将所述溴化物(5.01g，21.8mmol)、n-苯甲基甲基胺(4.9ml，33mmol，1.5当量)和k2co3(4.6g，33mmol，1.5当量)在无水ch3cn(65ml)中的悬液加热至80℃(油浴温度)18小时，在此时间后起始原料接近完全反应。将所述混合物冷却至室温并用盐水(120ml)稀释。将得到的乳液用etoac(2x60ml)萃取。将合并的萃取物添加到硅胶(～10g)，并将所述混合物在减压下浓缩至干。快速柱层析(rediseprfsio2(120g)，100％ch2cl2→ch2cl2中的5％meoh)给出作为橙色油状物的产物，其在室温下静置后固化(3.3g，53％)。1hnmr(cdcl3,400mhz)：8.13(d,j＝8.4hz,2h),7.32(d,j＝8.4hz,2h),7.30-7.22(m,5h),3.55(s,2h),2.91(t,j＝6.8hz,2h),2.68(t,j＝6.8hz,2h),2.87(q,j＝6.8hz,2h),1.20(t,j＝6.8hz,3h)。esims：m/z285[(m+h)+]。将所述硝基化合物(3.0g，10.4mmol)在meoh(20ml)中的溶液在冰-nacl浴中冷却。添加锌粉(325目，3g，4.5当量)，然后在2-3分钟内逐滴添加12mhcl(3.8ml，4.5当量)。1小时后，撤除所述冷却浴，并允许反应混合物在室温下搅拌过夜。第二天早上，将所述混合物在冰-nacl浴中再次冷却，并逐滴添加30％naoh水溶液，直至达到ph14(通用ph试纸)。将所述混合物用ch2cl2(100ml)稀释并搅拌5分钟。在此时间后，在真空下去除不溶物，并将滤饼用ch2cl2(2x25ml)洗涤。分离滤液的有机相，用盐水(100ml)洗涤并干燥(mgso4)。通过过滤去除所述干燥剂。添加硅胶(～5g)，并将所述滤液在减压下浓缩至干。快速柱层析(rediseprfsio2(120g)，100％ch2cl2→ch2cl2中的5％meoh)给出作为透明琥珀色油状物的产物(2.3g，87％)。esims：m/z255[(m+h)+]。该材料不需进一步分析或纯化直接用于下一步骤中。将所述胺(0.110g，0.43mmol)在无水ch2cl2(2ml)中的溶液在2-5分钟内逐滴添加到冰-盐浴冷却的1,1’-硫羰基二咪唑(95％,0.162g，0.87mmol，2当量)在无水ch2cl2(6ml)中的溶液。15分钟后，将所述冷却浴撤除，并将所述反应混合物在室温下搅拌1.5小时，在此时间后通过tlc(10％meoh在ch2cl2中)进行的分析表明起始的苯胺被完全消耗。将所述混合物在冰浴中再次冷却，并在2-5分钟内逐滴添加meoh中的7mnh3(620μl,4.3mmol，10当量)。将所述浴撤除，并将所述混合物在室温下搅拌过夜。添加硅胶(～1g)，并将所述混合物在减压下浓缩至干。快速柱层析(rediseprfsio2(40g)，100％ch2cl2→ch2cl2中的10％meoh)给出作为琥珀色油状物的硫脲，其在静置后固化(0.130g，97％)。将所述硫脲(159mg,0.51mmol)与2-溴乙酰苯(0.113g，0.56mmol，1.1当量)在etoh(5ml)中的混合物加热到75℃(油浴温度)1小时，在此时间后通过tlc(10％meoh在ch2cl2中)进行的分析表明所述硫脲被完全消耗。添加硅胶(～1g)，并将所述混合物在减压下浓缩至干。快速柱层析(rediseprfsio2(40g)，100％ch2cl2→ch2cl2中的10％meoh)给出作为稻草色玻璃状物质的噻唑氢溴酸盐(0.165g，78％)。实施例14：对trpv4介导的钙运输的影响在具有人类trpv4的靶向表达的n2a培养的细胞中，测试了化合物(gsk205、16-12、16-13、16-14、16-18、16-8和16-19)对trpv4介导的钙内流的影响。ca2+成像按照li等(environ.healthperspect.2011,119,784-93)和moore等(proc.natl.acad.sci.u.s.a.2013,110,e3225-e3234)进行。简单来说，在装载2μmfura2-am后，按照比率测量ca2+成像方案，使用用于双重激发的340/380nm蓝光，进行小鼠原代表皮角化细胞(1°mk)对trpv4的化学激活做出响应的ca2+成像。以0.5hz的频率获取发光的比率。δr/r0被确定为给定比率与基线比率相比的增加除以基线比率的分数。对于使用uvb的细胞刺激来说，由于使用340/380nm的刺激与295nm接近，fura-2是不适合的，因此使用2μmfluo4-am来代替。ca2+成像在488nm激发下进行，以0.5hz的频率获取发光，表示为δf/f0。trpv4被10nm的特异性活化剂gsk101激活，所述活化剂对rfp转染的细胞没有影响。添加所述6种化合物中的每一种至2.5μm的浓度，并观察其效果。结果示出在图20中。左侧的条形图示出了2.5μm的相应抑制剂的效果(预温育10分钟)。纵坐标是细胞中的峰值钙浓度(平均n>75个细胞)，单位为nm。所有6种化合物有效地抑制trpv4介导的钙内流，其中16-18和16-8是最强效的。16-19与16-8相比不显示出更强的抑制(数据未示出)。应该指出，gsk205在该浓度下在靶向过表达的培养细胞中具有非常低的效能。实施例15：在小鼠中的体内疼痛模型使用小鼠中的体内疼痛模型来测试化合物在减轻疼痛中的效果。对于小鼠的福尔马林诱发的刺激行为测量来说，将小鼠良好喂养，休息良好，并在每天的相同时间，在它们的昼夜节律的相同时间点进行测试。在测试前允许它们适应有机玻璃室的环境至少30分钟，并通过30号针头在右须垫中接受10μl4％福尔马林(用生理盐水(ns)从商品化的37％甲醛水溶液稀释)的皮下注射，正如在luccarini等(j.pain,2006,7,908-914)中进一步详述的。使用生理盐水作为对照注射。在注射后，将小鼠立即放回到所述室中，并通过私人消费者类型的摄像机在45分钟的观察期内记录摩擦行为。所述记录时间被分成9个5分钟的区段，并通过测量动物主要用同侧前爪并偶尔用后爪摩擦被注射区域所花费的时间来确定每个区段的伤害感受分值。这种使用前爪的摩擦行为由疼痛诱发，其不同于痒感行为。行为分析由对处理不知情的观察者进行。为了调查特定化合物gsk205、16-8和16-19对福尔马林诱导的伤害感受行为的影响，小鼠在福尔马林注射前15分钟在须垫中接受所述化合物的单次皮下注射(10μl，溶解在4％dmso中)。对照动物接受相同体积的ns、4％dmso。结果示出在图21中。图21a示出了对向bl6小鼠的须垫注射福尔马林做出响应的疼痛反应行为的时间过程。注意到所述双阶段响应和“干净的”对照。图21b示出了图21a的定量，使用n＝10只动物/组。注意到对福尔马林注射做出响应的显著增加。图21c示出了当化合物以0.5mm/10μl预先表面注射时的相似定量。这种浓度在trpv4-/-小鼠中对残留疼痛反应行为没有影响。注意到gsk205在这个浓度下缺乏效果，但对16-8和16-19做出响应疼痛反应行为显著减弱，特别是中枢引起的第二阶段。图21d示出了三种化合物的时间过程。gsk205在这种浓度下与对照没有差别，而16-19和16-8显著减弱疼痛反应行为。注意到使用亲脂性较低的16-8时在45分钟时间点处低于对照水平，并且使用亲脂性更高的16-19时在该时间点处逆转到对照水平。还注意到，所有化合物都不影响第一阶段，其由福尔马林对外周须垫神经末梢造成的直接刺激引起。实施例16：uvb暴露诱发疼痛反应行为测试了化合物对uvb过度暴露后的疼痛反应行为(对疼痛的响应)的影响。进行了行为试验以评估对施加到后爪的机械vonfrey毛发或热刺激做出响应的后撤阈值的减小。von-frey装置(ugobasile)使用柔性钢丝从后爪下方施加机械刺激。确定引起后撤的力。对于热刺激试验来说，利用通过红外光束(hargreave试验装置；ugobasile)从下方施加的热来刺激爪，并记录后撤延时。在uv暴露之前和之后确定后撤阈值。小鼠在最后一次施用tam/油后3-5天，使用bio-radgeldoc2000uv透照器(302nm)以600mj/cm2的暴露量暴露于uvb5分钟。这代表了最低红斑诱导剂量的5–10倍，与诱导晒伤和研究晒伤诱发的疼痛的基本原理相一致。结果示出在图22中，证实了化合物16-8有效地表面治疗uvb过度暴露诱发的疼痛反应行为。表面施用16-8在降低对uvb暴露后的疼痛的响应中特别有效，而gsk205在该浓度(0.5mm，在40μl中)下与介质效果相同(n＝4/组)。实施例17：对trpa1的影响测试了化合物对trpa1的影响。使用pcdna3.1表达质粒，将n2a永久细胞用人类trpa1cdna转染。将它们用表达egfp的质粒共转染，或者对于对照来说，只用egfp质粒转染。介质处理的表达trpa1的细胞对60μmaitc并且也对1mm芥子油做出响应显示出稳健的ca2+瞬变，这两者都是已知的亲电性trpa1激活剂。然而，表达egfp的对照转染的细胞(无trpa1)对trpa1激活剂aitc无响应。然后将细胞预先暴露于5μm化合物16-8和16-1910分钟。结果示出在图23中。显示了来自于>75个细胞的平均ca2+信号。在以5μm给药化合物16-8或16-19后，得到的由60μmaitc诱发的ca2+瞬变降低>80％，表明两种化合物具有可观的trpa1抑制效果。因此，化合物16-8和16/8-18hy显示出针对人类trpa1的抑制活性。对于低于或等于25μm的剂量来说，gsk205不抑制trpa1活性。实施例18：对trpv1、trpv2和trpv3的影响测试了化合物对trpv1、trpv2和trpv3的影响。方法与实施例15中描述的相似。简单来说，将n2a细胞用人类trpv1、trpv2或trpv3转染。使用egfp转染作为对照。为了特异性刺激trpv1，使用5μm辣椒素。为了刺激trpv2，在trpv2具有渗透压响应性的以前报道的基础上使用低渗透压(260mosmol/l)。n2a细胞对低渗透压没有响应性，对照转染的细胞也没有。对于表达trpv3的细胞来说，使用莰酮(20％的可商购的储用溶液)。莰酮本身不刺激表达egfp的对照n2a细胞或本源n2a细胞。使用的刺激和对照流程与上面在实施例15中详述的用于表达trpa1的n2a细胞的相同。结果示出在图24中，其示出了trpv1、trpv2和trpv3的特异性刺激的ca2+信号。对照转染的n2a细胞对辣椒素(trpv1激活)或莰酮(trpv3激活)没有响应。对于trpv1、trpv2和trpv3来说，ca2+瞬变不受16-8或16-19给药的影响。因此，化合物16-8和16-19不影响trpv1、trpv2和trpv3。实施例19：gsk205衍生物的化学合成和在基于细胞的测定法中评估它们的trpv4抑制效能。通过产生如图25中所示的7个主要修饰，我们修饰了化合物gsk205。还合成了另一种化合物(16–19)，其具有在初次筛选中确定的两种最强效化合物的相应修饰的组合。我们在具有哺乳动物(大鼠)trpv4的定向表达的神经元2a(n2a)永久性组织培养细胞中，在ca++成像测定法中评估了这些合成的化合物的trpv4抑制效能。用以5nm浓度使用的选择性激活剂化合物gsk1016790a(gsk101)刺激trpv4通道。对于第一轮评估来说，所有trpv4抑制性化合物都以5μm的浓度使用(图26a)。化合物16–43c不抑制ca++内流，并且它的效果与介质对照相似。所有其他化合物都抑制trpv4介导的ca++内流，其中化合物16-8和16–18作为最强效的两种化合物而出现。并入了16-8和16-18两者的修饰的化合物16–19，也有效地抑制trpv4介导的电流。然而，我们在事实上都消除ca++内流的化合物16-19与16-8之间没有发现显著差异。然后，我们对化合物16-8、16–18和16–19进行了更详尽的剂量响应评估，所述化合物分别显示出0.45、0.81和0.59μm的ic50，与此相比母体化合物gsk205的ic50为4.19μm。这些发现代表gsk205衍生化合物的效能提高，对16-8来说提高大约10倍，对16–19来说8倍，对16–18来说5倍。令人吃惊的是，化合物16–19的效能不显著强于16-8，而16-8比16–18更强。在这些结果的基础上，我们在膜片钳研究中测试了16-8和16–19并与gsk205(作为对照)比较(图27)。我们的结果表明，与母体分子gsk205相比，化合物16-8和16–19(都以5μm施用)在减弱trpv4介导的电流中效能显著提高。接下来，我们决定在已知表达trpv4并且其中已在相关生物学背景中证实了trpv4功能的两种类型的原代细胞中，评估最强效的化合物16-8的效能并与母体化合物gks205比较。我们检查了具有显著trpv4表达的关节软骨细胞，其中trpv4充当生理机械负载的机械传感器，以在软骨中调控细胞的合成代谢响应以及因此组织内平衡19。此外，我们研究了脑星形细胞，其中trpv4的表达以及在调控星形细胞水肿、神经元活性与脑血液流动的偶联和介导cns创伤性损伤中的相关功能，以前已被证实35–37。实现了我们的主要目的，我们在两种细胞类型中观察到化合物16-8与母体分子gsk205相比效能显著提高(图28)。在这些表达有功能且生物学上重要的trpv4而没有所述通道的定向过表达的原代细胞中gsk205衍生物的抑制效能的评估(图28)，直接确证了使用异源过表达trpv4的永生化细胞系进行的更基础的研究的发现(图26)，强烈支持了我们关于所述新衍生的化合物效能提高的结论。合在一起，我们将化合物16-8鉴定为trpv4抑制性化合物，其在异源系统中具有亚微摩尔效能，与其母体分子gsk205相比效能提高大约10倍。此外，证明了16-8在表达trpv4的骨骼和cns来源的原代细胞中更加有效。然而，对化合物16–19进行的旨在进一步增强效能的合理修饰，没有产生预期效果。在相关的体内动物模型中测试这些化合物之前，我们接下来测试了这些化合物的细胞毒性以及针对其他所选trp离子通道的特异性。实施例20：新的trpv4抑制剂是选择性的，具有良性的毒性曲线，并且还展现出trpa1的强力抑制。在异源转染的永久性n2a细胞中，我们没有观察到化合物16-8或16–19对trpv1、trpv2和trpv3的抑制效能(图29a)。然而，我们做出了出人意料的发现，即化合物16-8和16–19对trpa1的亚微摩尔抑制效能，gsk205的微摩尔效能，并且引人注目的是，化合物16–18没有显著活性(图29b)。对于化合物16-8、16–19、gsk205和16–18来说，我们记录到的ic50分别为0.41、0.43、5.56μm和>25μm。对于细胞毒性来说，我们使用灵敏的细胞存活率测定法在2天时间过程内，在20μm下发现了毒性的第一个证据，并且在40μm下存在更显著的效应(图30)。合在一起，我们的结果表明化合物16-8和16–19也以亚微摩尔效能抑制trpa1，并且它们的细胞毒性相比于它们对trpv4/trpa1的抑制效能在50-100倍的范围内。评估16-8、16–18和16–19对更广范围的受体和离子通道的特异性，将是将来针对这些化合物向临床转化的专门研究的主题。接下来，我们针对已知依赖于trpv4和trpa1两者的刺激性疼痛的体内模型，评估了这些化合物。实施例21：trpv4/trpa1双重抑制剂有效地克制三叉神经刺激痛。以前我们已将trpv4描述为福尔马林的细胞受体13，并证实了它参与福尔马林刺激诱发的疼痛行为，焦点在于三叉神经介导的刺激痛行为。在这项最近的研究中，我们也证实了trpv4与trpa1一起在福尔马林诱发的三叉神经痛中的共同贡献。我们还显示了使用gsk205以剂量依赖性方式有效减弱福尔马林诱发的三叉神经痛行为。此外，我们发现了在三叉神经区中对trpv4的选择性激活做出响应的刺激痛行为，其被gsk205阻断，并发现在trpv4-/-全缺失小鼠中不存在这种效应。以这种相关背景为基本原理，我们以10mg/kg的剂量全身性施用trpv4/trpa1双重抑制化合物16-8和16–19，使用gsk205作为对照。我们优先测试所述双重抑制剂而不是测试化合物16–18(仅为trpv4抑制剂)是因为(i)所述福尔马林三叉神经痛模型依赖于trpv4和trpa1两者，(ii)我们首先打算将trpv4/trpa1双重抑制分子推向转化使用。在代表了急性化学品组织损伤疼痛的福尔马林须垫注射后的早期阶段中，所述化合物都不能有效地显著减少疼痛行为。在被理解为是指示早期适应不良性神经塑性的神经介导的疼痛的延迟阶段中，对化合物16-8和16–19做出响应存在福尔马林诱发的疼痛行为的显著减弱，其中化合物16-8以引人注目的>50％减少疼痛行为13，并且化合物16–19也显示出稳健的效果((图31a、b)。值得注意的是，以10mg/kg的剂量全身性施用，gsk205没有显著效果，其以前在通过真皮内注射施用时以剂量依赖性的方式有效13。因此，化合物16-8和16–19在全身性施用后有效地减弱福尔马林三叉神经痛的晚期、神经介导的阶段，并且这些化合物在体内比它们的母体化合物gsk205更强效。根据这些体内发现，与来自于异源细胞表达系统的指示了化合物16-8和16–19的额外trpa1抑制效果的结果合在一起，我们决定评估这些化合物在遗传编码的trpv4缺失的背景(trpv4-/-小鼠)中的有效性，以便更好地确定它们在体内的trpa1抑制效能。我们在trpv4-/-小鼠中，在福尔马林模型的所有阶段中观察到了显著的残留刺激痛行为，与我们以前的报道相一致13(图31c、d)。使用化合物16-8和16–19事实上消除了即时阶段的疼痛行为，这两种化合物都再次以10mg/kg体重的剂量施用。晚期阶段的疼痛行为在施用化合物16-8时显著减少，在施用化合物16–19时相对于介质处理的trpv4-/-也显著减少，尽管不如16-8强效。基于以前的报道38，将参比trpa1抑制性化合物a967079以25mg/kg体重的剂量用作抑制trpa1的阳性对照。在trpv4-/-小鼠中疼痛行为的减少是显著的，在晚期神经阶段中超过50％。我们注意到10mg/kg体重的化合物16-8与25mg/kg体重的参比trpa1抑制性化合物a967079的效能相等，二者以相近的稳健程度减少福尔马林诱发的三叉神经痛行为(图31c、d)。我们得出结论，在特别设计用于评估trpa1对三叉神经刺激痛的贡献的体内刺激痛模型中，化合物16-8也起到强效trpa1抑制剂的作用，并且至少与已确立的参比trpa1拮抗性化合物同样强效。实施例22：在急性胰腺炎中强效trpv4/trpa1双重抑制剂16-8有效地控制炎症和疼痛。这些发现在基于细胞和活体动物的结果的基础上确定了化合物16-8是强效trpv4/trpa1双重抑制分子。因此，我们决定在依赖于trpv4和trpa1两者的更特异性的临床前疼痛模型中对它进行测试，以便确立双重抑制剂可以在胰腺炎中有效地治疗疼痛和炎症的原理论证。我们使用胰腺炎模型是因为由于在这种病症中对新的有效治疗的未满足的临床需求，它提供了高的转化潜力，并且还因为trpv4和trpa1两者在胰腺炎疼痛和炎症中的已知作用8,25,40。用蛙皮素诱导胰腺炎，这是急性胰腺炎的研究得很透彻的模型41。在诱导炎症之前30分钟，用10mg/kgbw16-8通过腹膜内注射处理动物。我们发现炎症参数即水肿显著减弱，其在16-8处理的动物中事实上被消除。此外，血清淀粉酶这种胰腺的炎症损伤的标志物，被16-8处理显著降低，作为胰腺炎性细胞浸润的标志物的胰腺髓过氧化物酶含量也是如此。胰腺炎症的组织病理学评分也显著降低(图32a–e)。值得注意的是，与16-8对胰腺水肿的效果相似，在用化合物16-8处理后疼痛行为事实上被消除。因此，发现了化合物16-8在减弱急性化学物质诱发的胰腺炎的疼痛和炎症中高度有效。实施例23：新的tprv4/trpa1抑制剂的良性的初步毒性和药代动力学。强效16-…化合物的有前途的性质促使我们尝试根据体内毒性和药代动力学来确定它们的起始初步特点，随后将在将来的研究中进行更广泛深入的调查。为此，我们选择作为总体上最强效的双重trpv4/trpa1抑制剂的化合物16-8，以及具有潜在提高的亲脂性的化合物16–19(表5)。我们测量了几种器官和血浆中的化合物浓度，并在肝和肾中检测到微摩尔/亚微摩尔浓度，在心、脑、脑干、三叉神经节和皮肤中检测到低于100nm的浓度。值得注意的是，在血浆中化合物事实上不可检测(图33a)。我们在非神经组织、特别是肝和肾中检测到较高浓度的16–19，这种模式可能与化合物16–19的提高的亲脂性相关。在这一发现的基础上，我们接下来检查了6和24h时间点，并检测到与1h时间点相比，在6h时间点16–19的浓度提高10-20倍，表明化合物固定到实体器官中(图33b–d)。在24h时间点的值低于6h但高于1h时间点的值，表明正在进行中的延长的化合物清除。接下来，我们确认了血浆中低的/不可检测的浓度不是由化合物在血浆中的变性/降解引起的，如图33e中所指示的，使用化合物16-19在血浆中在37℃下进行4h温育后，没有显示出可检测的化合物的损失。表5.gsk205、16-8和16-19的性质化合物mwpsac-logp(oct/h2o)gsk20540037.535.3516-8399.624.46.3316-19413.624.26.58mw＝分子量。psa＝极性表面积。c-logp(oct/h2o)指示了计算的logp(辛醇溶解度/h2o溶解度)。我们接下来对化合物16-8和16–19进行基础初步体内毒性研究，两种化合物的浓度都为10mg/kgbw，这是在两种体内疼痛模型中有效的浓度。当将化合物16-8和16-19与介质相比时，我们没有检测到心、肝和肾毒性的第一个证据(图34)。对于心脏评估来说，我们没有检测到1h内心率的差异和变化，所述评估在6h时间点通过ekg进行。在用化合物16-8或16–19处理的动物中，作为肾功能的标志物的血清肌酸酐和作为肝细胞完整性的标志物的丙氨酸氨基转移酶(alt)没有显著升高。因此，强效16-…化合物的初始证据强调了它们可接受的初步药代动力学性质以及缺少总体全身毒性。为了更详细地评估这些化合物的药代动力学和毒性，进一步的研究是必需的。***上述具体方面的描述如此充分地揭示出本发明的总体本质，以致其他人可以利用本
技术领域：
：内的知识，不需过多实验，容易地修改和/或改编这些具体方面来适应于各种不同应用，而不背离本公开的总体构思。因此，基于本文中提出的教导和指导，这些改编和修改打算在所公开的方面的等同性含义和范围之内。应该理解，本文中的短语或术语是出于描述而不是限制的目的，使得本说明书的术语或短语应该由专业技术人员根据所述教导和指导来解释。本公开的广度和范围不应受到任何上述示例性方面的限制，而是应该只根据下面的权利要求书及其等同物来确定。在本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文件为所有目的整体通过参考并入本文，其程度等同于每个单个出版物、专利、专利申请和/或其他文件被各个指明为所有目的通过参考并入本文。出于完整性原因，本发明的各种不同方面被阐述在下述编号的条款中：条款1.一种组合物，其包含抑制剂和碘，其中所述抑制剂抑制trpv4、trpa1或其组合。条款2.一种组合物，其包含抑制剂和麻醉剂，其中所述抑制剂抑制trpv4、trpa1或其组合。条款3.条款1或2的组合物，其中所述抑制剂不抑制trpv1、trpv2或trpv3。条款4.上述条款任一项的组合物，其中所述抑制剂包含式i的化合物：其中a、b和c独立地选自芳香族基团、杂芳族基团、环烯基和杂环烯基；d是c1-c3亚烷基；e是键或c1-c2亚烷基；并且r选自氢、羟基、氨基、烷基、烯基、杂烷基、芳香环或杂芳环。条款5.条款4的组合物，其中所述抑制剂包含选自下述的化合物：条款6.一种对对象进行消毒的方法，所述方法包括将所述对象与条款1和3-5任一项的组合物相接触。条款7.条款6的方法，其中将所述对象与所述组合物接触一段足以使所述对象上的微生物群体减少的时间。条款8.条款6或7的方法，其中所述组合物被给药到所述对象的表面，其中所述表面选自皮肤区域、伤口和溃疡。条款9.条款6-8任一项的方法，其中所述组合物将所述对象消毒。条款10.条款6-8任一项的方法，其中所述组合物对所述对象进行灭菌。条款11.条款6-8任一项的方法，其中所述组合物具有抗细菌活性。条款12.一种对对象进行麻醉的方法，所述方法包括向所述对象给药条款2-5任一项的组合物。条款13.一种对对象进行麻醉的方法，所述方法包括向所述对象共同给药麻醉剂和抑制剂，其中所述抑制剂抑制trpv4、trpa1或其组合。条款14.条款13的方法，其中所述组合物消毒并减轻疼痛。条款15.一种在需要的对象中治疗和/或预防皮肤障碍的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的trpv4和/或trpa1抑制剂。条款16.条款15的方法，其中所述皮肤障碍选自胰腺炎、癫痫、关节炎、骨关节炎、多发性硬化症、中风、cns自体免疫病症、创伤性脑损伤、脊髓损伤、脑水肿、cns感染、神经-精神障碍、骨骼退行性-炎性障碍、三叉神经痛、结肠炎和硬化症。条款17.条款16的方法，其中所述三叉神经痛包含头痛。条款18.条款15-17任一项的方法，其中所述trpv4和/或trpv4抑制剂包含式i的化合物：其中a、b和c独立地选自芳香族基团、杂芳族基团、环烯基和杂环烯基；d是c1-c3亚烷基；e是键或c1-c2亚烷基；并且r选自氢、羟基、氨基、烷基、烯基、杂烷基、芳香环或杂芳环。条款19.条款18的方法，其中所述trpv4和/或trpa1抑制剂包含选自下述的化合物：条款20.条款18或19的方法，其中所述化合物抑制trpv4和trpa1。条款21.条款18或19的方法，其中所述化合物不抑制trpv1、trpv2或trpv3。序列(seqidno:1)5’-cctgctggtcacctacatca(seqidno:2)5’-ctcaggaacacagggaagga当前第1页12当前第1页12