用于治疗病理性肌肉损失和虚弱的NOPE的制作方法
提供了用neighborofpunce11(nope)，诸如nope细胞外结构域(ecd)多肽和nopeecd融合分子治疗肌肉萎缩和其他紊乱的方法。
背景
骨骼肌损失和身体虚弱是许多废用性状况的常见特征，所述许多废用性状况诸如卧床休息和衰老，神经肌肉损伤诸如als和脊髓损伤，以及慢性疾病包括癌症、糖尿病和心力衰竭。肌肉损失降低生理功能，而且还不利地影响患者预后并且增加死亡率(cohen等人naturerevdrugdisc2015.14,58-74)。因此，对用于治疗或预防与肌肉质量、肌肉强度、和肌肉功能中的任何一种或组合的减少相关的疾病的有效疗法的存在需求。
转化生长因子-β(tgf-β)超家族含有共有共同的序列元件和结构基序的多种分泌的生长因子。肌生成抑制蛋白，也称为生长和分化因子(gdf-8)，是tgf-β超家族的成员，并且在哺乳动物中是高度保守的。肌生成抑制蛋白已被表征为骨骼肌质量的负调节物(mcpherronac,lawleram,leesj.1997.nature387(6628):83–90)，且肌生成抑制蛋白的遗传失活或中和与发育期和成年期期间增加的肌肉质量相关(schuelke等人,nengljmed2004,350:2682-8和leesjannurevcelldevbiol.2004；20:61-86)。另外，在许多肌肉萎缩状况中，肌生成抑制蛋白的循环水平被增加(hanhq,mitchwe.curropinsupportpalliatcare2011dec；5(4):334-41和elkina等人jcachexiasarcopeniamuscle2011；2:143–151)。作为肌肉萎缩和虚弱的紊乱的治疗策略，抑制肌生成抑制蛋白的方法已表现出具有药物阻滞的潜力，在多种疾病(包括癌症恶病质和肾衰竭)动物模型中显示出预防或逆转肌肉损失并延长寿命(如curropindrugdiscovdevel.2008jul；11(4):487-94.和intjbiochemcellbiol.2013oct；45(10):2333-47.中所综述)。然而，目前未批准任何疗法，并且因此仍存在需求。
nope是一种直接结合并中和肌生成抑制蛋白以及密切相关的家族成员gdf11的蛋白，并提供了一种增加骨骼肌质量的新方法。这可以提供用于治疗或预防与肌肉萎缩相关的疾病的有效疗法。
概述
在一些实施方案中，提供了减少或延迟患有肌肉萎缩或处于肌肉萎缩风险的受试者中的肌肉萎缩的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的nope细胞外结构域(ecd)多肽。在一些实施方案中，受试者患有选自以下的至少一种状况：慢性阻塞性肺病(copd)、慢性肾病、终末期肾病、慢性心力衰竭、癌症、危重疾患肌病、危重疾患多发性神经病、中风、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩、多发性硬化、进行性多灶性脑白质病、脑脊髓炎、脑桥中央髓鞘溶解(centralpontinemyelolysis)、肾上腺脑白质营养不良、沃勒变性(walleriandegeneration)、亨廷顿舞蹈病(huntington’sdisease)、帕金森病(parkinson’sdisease)、创伤性脑损伤、亚历山大病(alexander’sdisease)、佩梅病(pelizaeusmerzbacherdisease)、球形细胞脑白质营养不良、和肌肉减少症。
在一些实施方案中，提供了治疗肌肉损伤的方法，所述方法包括向患有肌肉损伤的受试者施用有效量的nope细胞外结构域(ecd)多肽。在一些实施方案中，肌肉损伤选自手术相关的肌肉损伤、创伤性肌肉损伤、工作相关的骨骼肌损伤、和过度训练相关的肌肉损伤。
在一些实施方案中，提供了治疗肌肉退行性紊乱的方法，所述方法包括向患有肌肉退行性紊乱的受试者施用有效量的nope细胞外结构域(ecd)多肽。在一些实施方案中，肌肉退行性紊乱选自肌营养不良、肌强直性营养不良、多肌炎、和皮肌炎。在一些实施方案中，肌肉退行性紊乱是肌营养不良。在一些实施方案中，肌营养不良选自杜氏肌营养不良(duchennemusculardystrophy)、贝克肌营养不良(beckermusculardystrophy)、先天性肌营养不良(福山型(fukuyama))、埃-德肌营养不良(emerydreifussmusculardystrophy)、肢带肌营养不良和面肩肱型肌营养不良。在一些实施方案中，肌肉退行性紊乱是肌强直性营养不良。在一些实施方案中，肌强直性营养不良选自i型肌强直性营养不良、ii型肌强直性营养不良、和先天性肌强直。
在多种实施方案中，治疗包括以下中的至少一种：延迟肌肉萎缩的进展、改善受试者的6分钟步行距离(6mwd)、减少体力下降、延迟改变生活的事件的发生、改善独立性、减少住院治疗、以及延迟对辅助生活安排的需要。在一些实施方案中，受试者的6mwd在治疗12个月后被增加了至少10米、或至少20米、或至少30米。在一些实施方案中，该方法包括延迟对轮椅的需要和/或延迟呼吸机的放置。
在一些实施方案中，提供了治疗肌萎缩侧索硬化(als)的方法，所述方法包括向患有als的受试者施用有效量的nope细胞外结构域(ecd)多肽。在一些实施方案中，治疗als包括以下中的至少一种：延迟als的进展、减少体力下降、改善用力肺活量、减缓用力肺活量下降、减缓受试者在als功能评定量表(alsfrs)上的评分下降、改善受试者在alsfrs上的评分、延迟改变生活的事件的发生、和提高受试者的存活时间。在一些实施方案中，该方法包括延迟气管造口术和/或延迟经皮内窥镜胃造口术(percutaneousendoscopicgastrostomy)(peg)的布置。
在多种实施方案中，施用nope细胞外结构域(ecd)多肽增加i型慢肌肉质量和/或降低脂肪质量。
在一些实施方案中，提供了增加i型慢肌肉质量的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的nope细胞外结构域(ecd)多肽。
在一些实施方案中，提供了降低脂肪质量的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的nope细胞外结构域(ecd)多肽。
在一些实施方案中，提供了nope细胞外结构域(ecd)多肽用于减少或延迟患有肌肉萎缩或处于肌肉萎缩风险的受试者中的肌肉萎缩的用途。在一些实施方案中，受试者患有选自以下的至少一种状况：慢性阻塞性肺病(copd)、慢性肾病、终末期肾病、慢性心力衰竭、癌症、危重疾患肌病、危重疾患多发性神经病、中风、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩、多发性硬化、进行性多灶性脑白质病、脑脊髓炎、脑桥中央髓鞘溶解、肾上腺脑白质营养不良、沃勒变性、亨廷顿舞蹈病、帕金森病、创伤性脑损伤、亚历山大病、佩梅病、球形细胞脑白质营养不良、和肌肉减少症。
在一些实施方案中，提供了nope细胞外结构域(ecd)多肽用于治疗受试者中的肌肉损伤的用途。在一些实施方案中，肌肉损伤选自手术相关的肌肉损伤、创伤性肌肉损伤、工作相关的骨骼肌损伤、和过度训练相关的肌肉损伤。
在一些实施方案中，提供了nope细胞外结构域(ecd)多肽用于治疗受试者中的肌肉退行性紊乱的用途。在一些实施方案中，肌肉退行性紊乱选自肌营养不良、肌强直性营养不良、多肌炎、和皮肌炎。在一些实施方案中，治疗包括以下中的至少一种：延迟肌营养不良的进展、改善受试者的6分钟步行距离(6mwd)、减少体力下降、延迟改变生活事件的发生、改善独立性、减少住院治疗、以及延迟对辅助生活安排的需要。
在一些实施方案中，提供了nope细胞外结构域(ecd)多肽用于治疗受试者中的肌萎缩侧索硬化(als)的用途。在一些实施方案中，治疗als包括以下中的至少一种：延迟als的进展、减少体力下降、改善用力肺活量、减缓用力肺活量下降、减缓受试者在als功能评定量表(alsfrs)上的评分下降、改善受试者在alsfrs上的评分、延迟改变生活的事件的发生、和提高受试者的存活时间。在一些实施方案中，施用nope细胞外结构域(ecd)多肽增加i型慢肌肉质量和/或降低脂肪质量。
在一些实施方案中，提供了nope细胞外结构域(ecd)多肽用于增加受试者中的i型慢肌肉质量的用途。在一些实施方案中，提供了nope细胞外结构域(ecd)多肽用于降低受试者中的脂肪质量的用途。在一些实施方案中，提供了nope细胞外结构域(ecd)多肽用于治疗受试者中的贫血和/或地中海贫血的用途。
在多种实施方案中，nope细胞外结构域(ecd)多肽是nopeecd融合分子。在一些实施方案中，nopeecd多肽或nopeecd融合分子能够以小于100nm的kd结合肌生成抑制蛋白。在一些实施方案中，nopeecd多肽或nopeecd融合分子抑制肌生成抑制蛋白介导的smad2/3活化。在一些实施方案中，nopeecd多肽或nopeecd融合分子包含seqidno:1的氨基酸25至620。在一些实施方案中，nope细胞外结构域(ecd)多肽是nopeecd融合分子。在一些实施方案中，nopeecd融合分子包含nopeecd多肽和融合配偶体。在一些实施方案中，融合配偶体是fc。在一些实施方案中，nopeecd融合分子包含seqidno:19的序列。
本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的本发明的任何和所有方法。
附图简述
图1示出了具有信号序列的人类和小鼠nope细胞外结构域的比对。
图2示出了本文所述实验中使用的nope细胞外结构域(ecd)-fc构建体的结构。
图3a-d示出了通过流体动力学尾静脉转染施用nopeecd-fc的小鼠中的瘦质量(leanmass)的变化(a、b)，施用纯化的nopeecd-fc蛋白的小鼠中的瘦质量的变化(c、d)，如实施例2中所述。ta＝胫骨前肌；edl＝趾长伸肌；gastroc＝腓肠肌。
图4a-e示出了小鼠nopeecd-fc与肌生成抑制蛋白结合(a)但不与肌生成抑制蛋白前体(pro-myostatin)结合(b)；人类nopeecd-fc与肌生成抑制蛋白结合(c)；和actr2b-fc，一种肌生成抑制蛋白抑制剂与肌生成抑制蛋白结合(d)。如实施例3中所述，每种蛋白对肌生成抑制蛋白的结合常数、解离常数和亲和力示于(e)中。
图5示出了nopeecd-fc构建体对肌生成抑制蛋白的抑制，如实施例4中所述。
图6示出了通过流体动力学尾静脉转染施用某些nopeecd-fc构建体的小鼠中的瘦质量的变化，如实施例4中所述。
详述
本发明人已发现nope与肌生成抑制蛋白和其他配体相互作用，并且当通过流体动力学尾静脉转染或作为纯化的蛋白施用时，nope细胞外结构域(ecd)-fc构建体增加小鼠中的瘦质量。因此，施用nope，诸如nopeecd或其变型(variations)，可以是用于涉及肌肉损伤和/或肌肉萎缩的状况的有效治疗。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，且不应被解释为限制所描述的主题。
定义
除非另外定义，否则与本发明关联使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
与重组dna、寡核苷酸合成、组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质体转染)、酶促反应、和纯化技术关联使用的示例性技术是本领域已知的。许多这样的技术和程序描述于例如sambrook等人molecularcloning:alaboratorymanual(第3版，coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2001))，以及其他地方中。另外，用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送、以及患者治疗的示例性技术也是本领域已知的。
在本申请中，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。在多于一项(multiple)从属权利要求的上下文中，“或”的使用仅重新提及可选方案中的多于一项前述独立或从属权利要求。除非另外指示，否则术语“包括(include)”具有与“包括但不限于(include,butarenotlimitedto)”相同的含义，术语“包括(includes)”具有与“包括但不限于(includes,butisnotlimitedto)”相同的含义，并且术语“包括(including)”具有与“包括但不限于(including,butnotlimitedto)”相同的含义。类似地，术语“诸如”具有与术语“诸如但不限于”相同的含义。此外，除非另外特别说明，否则诸如“元件”或“组件”的术语涵盖包含一个单元的元件和组件以及包含多于一个子单元的元件和组件。
如根据本公开内容使用的，除非另外指示，否则以下术语应被理解为具有以下含义：
术语“核酸分子”和“多核苷酸”可以可互换地使用，并且指核苷酸的聚合物。这样的核苷酸的聚合物可以含有天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于dna、rna、和pna。“核酸序列”指构成核酸分子或多核苷酸的核苷酸的线性序列。
术语“多肽”和“蛋白”可互换地使用，指氨基酸残基的聚合物，并不限于最小长度。这样的氨基酸残基的聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于肽、寡肽、氨基酸残基的二聚体、三聚体和多聚体。全长蛋白和变体蛋白两者都被定义涵盖。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本发明的目的，“多肽”指包括对天然序列的修饰，诸如缺失、添加和取代(通常本质上是保守的)的蛋白，只要蛋白保持期望活性即可。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或者可以是偶然的，诸如通过产生蛋白的宿主突变或由于pcr扩增引起的错误。
“天然序列”多肽包含具有与在自然界中发现的多肽相同的氨基酸序列的多肽。因此，天然序列多肽可以具有来自任何哺乳动物的天然存在的多肽的氨基酸序列。这样的天然序列多肽可以从自然界分离，或者可以通过重组或合成方法产生。术语“天然序列”多肽特别涵盖天然存在的截短或分泌形式的多肽(例如，细胞外结构域序列)、天然存在的变体形式(例如，可变剪接形式)的多肽和多肽的天然存在的等位基因变体。
多肽“变体”意指在比对序列并引入空位(如有必要)以实现最大序列同一性百分比并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分后，与seqidno:17的天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物活性多肽。这样的变体包括，例如，其中在多肽的n末端或c末端添加或缺失一个或更多个氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，变体将具有至少约80％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体将具有至少约90％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体与天然序列多肽将具有至少约95％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体与天然序列多肽将具有至少约97％的氨基酸序列同一性。
如本文使用的，关于肽、多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”被定义为在比对序列并引入空位(如有必要)以实现最大序列同一性百分比并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分后，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公众可得的计算机软件，诸如blast、blast-2、align或megaligntm(dnastar)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括实现跨越所比较的序列的全长的最大比对所需的任何算法。
除非另外指示，否则术语“neighborofpunce11”和“nope”包括来自任何脊椎动物来源的任何天然nope，所述任何脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括全长、未加工的nope以及通过在细胞中加工而得来的任何形式的nope或其保留以小于≤1μm、≤100nm、或≤10nm的亲和力(kd)特异性结合肌生成抑制蛋白的能力的任何变体。该术语还涵盖nope的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。在一些实施方案中，nope是具有seqidno:1(前体，具有信号肽)或seqidno:2(成熟，不具有信号肽)的氨基酸序列的人类nope。非限制性示例性非人类nope是具有seqidno:3(前体，具有信号肽)或seqidno:4(成熟，不具有信号肽)的氨基酸序列的小鼠nope。
术语“nope细胞外结构域”(“nopeecd”)包括全长nopeecd和nopeecd变体，并且指缺乏细胞内和跨膜结构域、具有或不具有信号肽的nope多肽。在一些实施方案中，nopeecd抑制肌生成抑制蛋白介导的信号传导。如本文使用的，术语“全长nopeecd”指延伸至细胞外结构域的最后一个氨基酸的nopeecd，并且可以包含或可以不包含n末端信号肽，并且包括细胞外结构域中的天然剪接变体。在一些实施方案中，全长人类nopeecd具有seqidno:5(具有信号肽)或seqidno:6(不具有信号肽)的氨基酸序列。在一些实施方案中，全长小鼠nopeecd具有seqidno:11(具有信号肽)或seqidno:12(不具有信号肽)的氨基酸序列。如本文使用的，术语“nopeecd变体”指含有氨基酸添加、缺失、和取代并且仍然能够与肌生成抑制蛋白结合的nopeecd。这样的变体可以与亲本nopeecd至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％相同。两种多肽的同一性％可以通过相似性评分来测量，所述相似性评分通过使用bestfit程序与用于确定相似性的缺省设置比较两种多肽的氨基酸序列来确定。bestfit使用smith和waterman,advancesinappliedmathematics2:482-489(1981)的局部同源性算法来找到两个序列之间的最佳相似性区段。
术语“nopeecd融合分子”指包含nopeecd、和一个或更多个“融合配偶体”的分子。在一些实施方案中，nopeecd和融合配偶体被共价连接(“融合”)。如果融合配偶体也是多肽(“融合配偶体多肽”)，则nopeecd和融合配偶体多肽可以是连续氨基酸序列的一部分，并且融合配偶体多肽可以被连接到nopeecd的n末端或c末端。在这样的情况下，nopeecd和融合配偶体多肽可以由编码nopeecd和融合配偶体多肽两者的编码序列翻译为单个多肽(“nopeecd融合蛋白”)。在一些实施方案中，nopeecd和融合配偶体通过其他方法，诸如，例如，除肽键之外的化学连接共价连接。可以使用许多将多肽与其他分子(例如，融合配偶体)共价连接的已知方法。在其他实施方案中，nopeecd和融合配偶体可以通过“接头”融合，所述“接头”包含至少一个氨基酸或化学部分。
在一些实施方案中，nopeecd多肽和融合配偶体被非共价连接。在一些这样的实施方案中，它们可以使用例如结合对来连接。示例性结合对包括但不限于生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白、抗体及其抗原等。
示例性融合配偶体包括但不限于免疫球蛋白fc结构域、白蛋白、和聚乙二醇。非限制性示例性fc结构域的氨基酸序列示于seqidno:26至28中。
在一些实施方案中，nopeecd氨基酸序列来源于非人类哺乳动物。在这样的实施方案中，nopeecd氨基酸序列可以来源于哺乳动物包括但不限于，啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠)、兔、猴(simians)、猫科动物(felines)、犬科动物(canines)、马科动物(equines)、牛科动物(bovines)、猪科动物(porcines)、绵羊类动物(ovines)、山羊类动物(caprines)、哺乳动物实验室动物、哺乳动物农场动物、哺乳动物运动动物和哺乳动物宠物。掺入非人类nopeecd的nopeecd融合分子被称为“非人nopeecd融合分子”。与人类nopeecd融合分子类似，非人类融合分子可以包含融合配偶体、任选的接头、和nopeecd。这样的非人类融合分子也可以包含信号肽。“非人类nopeecd变体”指含有氨基酸添加、缺失、和取代并且仍然能够与来自该序列来源于的动物的肌生成抑制蛋白结合的nopeecd。
术语“肌生成抑制蛋白(myostatin)”和“mstn”指成熟肌生成抑制蛋白，其在人类肌生成抑制蛋白的一些实施方案中具有seqidno:20的序列。非限制性示例性小鼠肌生成抑制蛋白序列示于seqidno:23中。术语“肌生成抑制蛋白前体(pro-myostatin)”指具有或不具有信号序列的肌生成抑制蛋白前肽，其在人类肌生成抑制蛋白前体的一些实施方案中，具有seqidno:21(具有信号序列)或seqidno:22(不具有信号序列)的序列。非限制性示例性小鼠肌生成抑制蛋白前体具有seqidno:24(具有信号序列)或seqidno:25(不具有信号序列)的序列。
如本文使用的，肌生成抑制蛋白的术语“肌生成抑制蛋白活性”或“生物学活性”包括肌生成抑制蛋白的任何生物学作用。在一些实施方案中，肌生成抑制蛋白活性包括肌生成抑制蛋白活化smad2/3的能力。用于确定肌生成抑制蛋白活化smad2/3的非限制性示例性测定描述于实施例4中。
在示例性实施方案中，nope细胞外结构域(ecd)将nope与肌生成抑制蛋白的可检测结合的量减少至少50％。在一些实施方案中，nope细胞外结构域(ecd)多肽将nope与肌生成抑制蛋白的可检测结合的量减少至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
术语“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibit)”指任何表型特征的减少或停止或该特征的发生率、程度或可能性的减少或停止。在一些实施方案中，“减少”或“抑制”意指引起20％或更大的降低的能力。在另一个实施方案中，“减少”或“抑制”意指引起50％或更大的降低的能力。在又另一个实施方案中，“减少”或“抑制”意指引起75％、85％、90％、95％或更大的总体降低的能力。
在一些实施方案中，当nope细胞外结构域(ecd)多肽使用例如本文实施例4中所述的测定以小于10nm的ic50减少smad2/3活化时，其被认为“抑制肌生成抑制蛋白介导的信号传导”。在一些实施方案中，nope细胞外结构域(ecd)多肽使用例如本文实施例4中所述的测定以小于5nm、或小于3nm、或小于2nm、或小于1nm的ic50减少smad2/3活化。
术语“信号肽”指位于多肽n末端促进多肽从哺乳动物细胞中分泌的氨基酸残基的序列。信号肽可以在多肽从哺乳动物细胞输出后被裂解，形成成熟蛋白。信号肽可以是天然的或合成的，并且它们可以与它们所附接的蛋白是异源的或同源的。示例性信号肽包括但不限于nope和肌生成抑制蛋白的信号肽。示例性信号肽还包括来自异源蛋白的信号肽。“信号序列”指编码信号肽的多核苷酸序列。在一些实施方案中，nopeecd多肽或nopeecd融合分子缺乏信号肽。在一些实施方案中，nopeecd多肽或nopeecd融合分子包含至少一种信号肽，其可以是天然nope信号肽或异源信号肽。
术语“载体”用于描述可以被工程化以含有可以在宿主细胞中繁殖的一个或更多个克隆的多核苷酸(aclonedpolynucleotideorpolynucleotides)的多核苷酸。载体可以包含以下元件中的一种或更多种：复制起点、调节感兴趣的多肽的表达的一种或更多种调节序列(诸如，例如，启动子和/或增强子)、和/或一种或更多种可选择标志物基因(诸如，例如，抗生素抗性基因和可以在比色测定中使用的基因，例如β-半乳糖苷酶)。术语“表达载体”指用于在宿主细胞中表达感兴趣多肽的载体。
“宿主细胞”指可以是或已经是载体或分离的多核苷酸的受体的细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，诸如灵长类动物或非灵长类动物的动物细胞；真菌细胞，诸如酵母；植物细胞；和昆虫细胞。非限制性示例性哺乳动物细胞包括但不限于nso细胞、per.
如本文使用的，术语“分离的”指已经与通常在自然界中它被发现的至少一些组分分开的分子，或者已经与通常产生它的至少一些组分分开的分子。例如，当多肽与产生它的细胞的至少一些组分分开时，多肽被称为“分离的”。在多肽在表达后由细胞分泌的情况下，将含有多肽的上清液与产生它的细胞物理分离，被认为是“分离”多肽。类似地，当多核苷酸不是通常在自然界中该多核苷酸被发现的较大多核苷酸的一部分(诸如，例如，在dna多核苷酸的情况下，基因组dna或线粒体dna)，或者例如在rna多核苷酸的情况下，将其与产生它的细胞的至少一些组分分开时，多核苷酸被称为“分离的”。因此，被包含在宿主细胞内的载体中的dna多核苷酸可以被称为“分离的”，只要在自然界中该多核苷酸在该载体中未被发现。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换地使用以指人类。在一些实施方案中，还提供了治疗其他哺乳动物的方法，所述其他哺乳动物包括但不限于啮齿动物、猴、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊类动物、山羊类动物、哺乳动物实验室动物、哺乳动物农场动物、哺乳动物运动动物和哺乳动物宠物。在一些情况下，“受试者”或“患者”指需要治疗疾病或紊乱的受试者或患者。
如本文使用的，术语“样品”或“患者样品”指从感兴趣的受试者获得或来源于感兴趣的受试者的材料，其含有例如基于物理、生物化学、化学和/或生理特征待表征和/或鉴定的细胞和/或其他分子实体。例如，短语“疾病样品”及其变型指从感兴趣的受试者获得的任何样品，其将被预期或已知含有待表征的细胞和/或分子实体。“组织或细胞样品”意指从受试者或患者的组织获得的类似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以来自实体组织如来自新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样品或活组织检查或抽吸物(包括例如支气管肺泡灌洗液和诱导痰)；血液或任何血液成分；体液，诸如痰、脑脊髓液、羊水、腹膜液或间质液；来自受试者的妊娠或发育的任何时间的细胞。组织样品也可以是原代细胞或培养细胞或细胞系。任选地，组织或细胞样品从疾病组织/器官获得。组织样品可以含有在自然界中天然地不与该组织混合的化合物，诸如防腐剂、抗凝血剂、缓冲液、固定剂、营养物、抗生素等。
如本文使用的，“参考样品”、“参考细胞”或“参考组织”指从已知或认为不会罹患正使用本发明的方法或组合物鉴定的疾病或状况的来源获得的样品、细胞或组织。在一个实施方案中，参考样品、参考细胞或参考组织从使用本发明的组合物或方法正鉴定疾病或状况的同一受试者或患者的身体的健康部分获得。在一个实施方案中，参考样品、参考细胞或参考组织从使用本发明的组合物或方法正鉴定疾病或状况的受试者或患者中的至少一个个体的身体的健康部分获得不是。在一些实施方案中，参考样品、参考细胞或参考组织在发展疾病或状况之前或在疾病或状况的早期阶段先前从患者获得。
当状况的特征已经在患有该状况的患者的至少一个子集中或在该状况的一个或更多个动物模型中显示出时，该状况“先前已经被表征为具有这样的[特征]”。在一些实施方案中，不必在待用nope细胞外结构域(ecd)多肽治疗的患者中确定该状况的这样的特征。在待使用本发明方法和/或组合物治疗的特定患者中不需要确定该特征的存在，以便使患者被认为具有先前已经被表征为具有该特征的状况。
“紊乱”或“疾病”是将受益于用本发明的nope细胞外结构域(ecd)多肽治疗的任何状况。这包括慢性和急性紊乱或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论的紊乱的那些病理状况。本文中待治疗的紊乱的非限制性实例包括癌症、自身免疫性疾病和神经退行性疾病。
如本文使用的，“肌肉萎缩(musclewasting)”是指肌肉质量的降低，在一些实施方案中，指肌肉质量的降低伴随直接引起肌肉萎缩和/或导致受限运动的状况，该状况可导致肌肉萎缩。可与肌肉萎缩相关的非限制性示例性状况包括慢性阻塞性肺病(copd)、慢性肾病、终末期肾病、慢性心力衰竭、癌症、危重疾患肌病、危重疾患多发性神经病、中风、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩、多发性硬化、进行性多灶性脑白质病、脑脊髓炎、脑桥中央髓鞘溶解、肾上腺脑白质营养不良、沃勒变性、亨廷顿舞蹈病、帕金森病、创伤性脑损伤、亚历山大病、佩梅病、球形细胞脑白质营养不良、和肌肉减少症。
如本文使用的,“肌肉退行性紊乱”指直接(例如，影响肌肉的病理学)或间接(例如，影响神经或神经肌肉接头(neuromuscularjunctions)的病理学)损害肌肉功能的紊乱。非限制性示例性肌肉退行性紊乱包括肌营养不良、肌萎缩侧索硬化、肌强直性营养不良、多肌炎、和皮肌炎。
如本文使用的，“治疗”涵盖对哺乳动物(包括人类)中的疾病(在本文中也称为“紊乱”或“状况”)的治疗剂的任何施用或应用，并且包括抑制疾病或疾病进展、抑制或减缓疾病或其进展、阻止其发展、部分或完全缓解疾病、部分或完全缓解疾病的一种或更多种症状、或恢复或修复丢失、缺失或有缺陷的功能；或刺激低效的过程。
术语“有效量”或“治疗有效量”指有效治疗受试者中的疾病或紊乱的药物的量。在一些实施方案中，有效量指以必要的剂量和在必要的时间段内有效实现期望治疗或预防结果的量。本发明的nope细胞外结构域(ecd)多肽的治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素以及细胞外结构域(ecd)多肽在个体中引发期望应答的能力而变化。治疗有效量涵盖其中nope细胞外结构域(ecd)多肽的治疗有益作用超过任何毒性或有害作用的量。
“预防有效量”指以必要的剂量和在必要的时间段内有效实现期望预防结果的量。通常但非必要地，由于在疾病之前或疾病的早期阶段在受试者中使用预防剂量，所以预防有效量将小于治疗有效量。
“药学上可接受的载剂”指本领域常规与治疗剂一起使用一起包含用于向受试者施用的“药物组合物”的无毒固体、半固体、或液体填充剂、稀释剂、包封材料、制剂辅助剂或运载体(carrier)。药学上可接受的运载体在所用剂量和浓度对接受者无毒并且与制剂的其他成分相容。药学上可接受的运载体适用于所用的制剂。例如，如果治疗剂被待口服施用，则运载体可以是凝胶胶囊。如果治疗剂被待皮下施用，则运载体理想地不会刺激皮肤并且不会引起注射部位反应。
“制品(articleofmanufacture)”是包含至少一种试剂例如用于治疗疾病或紊乱的药物、或者用于特异性检测本文所述生物标志物的探针的任何制造物(manufacture)(例如包装或容器)或试剂盒。在一些实施方案中，制造物或试剂盒作为用于执行本文所述方法的单元被推广、分发或出售。
治疗性组合物和方法
治疗疾病的方法
提供了nope细胞外结构域(ecd)多肽(包括nopeecd融合分子)，用于在治疗人类和其他哺乳动物的方法中使用。提供了治疗疾病的方法，所述方法包括向人类和其他哺乳动物施用nope细胞外结构域(ecd)多肽。
治疗肌肉萎缩的方法
本发明人已经发现nopeecd多肽和nopeecd融合分子增加肌肉质量并且在体内神经挤压损伤后增强恢复。此外，本发明人已经证明nope在体外结合肌生成抑制蛋白，表明nopeecd多肽和nopeecd融合分子可以充当肌生成抑制蛋白配体陷阱(ligandtrap)并在体内抑制肌生成抑制蛋白介导的信号传导。
在一些实施方案中，提供了治疗肌肉萎缩的方法，所述方法包括向患有肌肉萎缩或处于肌肉萎缩风险的受试者施用有效量的nope细胞外结构域(ecd)多肽。在一些实施方案中，提供了治疗肌肉萎缩的方法，所述方法包括向患有肌肉萎缩或处于肌肉萎缩风险的受试者施用有效量的nopeecd多肽或nopeecd融合分子。在一些实施方案中，受试者患有引起肌肉萎缩的状况。在一些实施方案中，受试者患有导致无法活动的状况，从而导致肌肉萎缩。与肌肉萎缩相关的非限制性示例性状况包括但不限于慢性阻塞性肺病(copd)、慢性肾病、终末期肾病、慢性心力衰竭、癌症、危重疾患肌病、危重疾患多发性神经病、中风、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩、多发性硬化、进行性多灶性脑白质病、脑脊髓炎、脑桥中央髓鞘溶解、肾上腺脑白质营养不良、沃勒变性、亨廷顿舞蹈病、帕金森病、创伤性脑损伤、亚历山大病、佩梅病、球形细胞脑白质营养不良、和肌肉减少症。
在一些实施方案中，提供了治疗肌肉损伤的方法，所述方法包括向患有肌肉损伤的受试者施用有效量的nope细胞外结构域(ecd)多肽。在一些实施方案中，提供了治疗肌肉损伤的方法，所述方法包括向患有肌肉损伤的受试者施用有效量的nopeecd多肽或nopeecd融合分子。许多情况和事件可能导致肌肉损伤，包括但不限于手术相关的肌肉损伤、创伤性肌肉损伤、工作相关的骨骼肌损伤、和过度训练相关的肌肉损伤。
手术相关的肌肉损伤的非限制性实例包括由于膝关节置换、前十字韧带(acl)修复、整形手术、髋关节置换手术、关节置换手术、肌腱修复手术、肩袖疾病和损伤的手术修复以及截肢引起的肌肉损伤。
创伤性肌肉损伤的非限制性实例包括战场肌肉损伤、车祸相关的肌肉损伤和运动相关的肌肉损伤。对肌肉的创伤性损伤可包括撕裂伤、钝性挫伤(bluntforcecontusions)、弹片伤(shrapnelwounds)、肌肉拉伤或撕裂、烧伤、急性劳损(acutestrains)、慢性劳损、体重或力应激损伤、重复性应激损伤、撕脱性肌肉损伤和骨筋膜室综合征(compartmentsyndrome)。
在一些实施方案中，肌肉损伤是创伤性肌肉损伤，并且治疗方法提供在创伤性损伤后(例如，在损伤的一天内)立即施用至少一次高剂量的本发明的化合物，随后在恢复期间定期施用低剂量的本发明的化合物。
工作相关的肌肉损伤的非限制性实例包括由高度重复的运动、强力运动、不良姿势(awkwardpostures)、身体和物体之间的长时间和有力的机械耦合以及振动引起的损伤。过度训练相关的肌肉损伤包括缺乏恢复或缺乏体力劳动能力增加同时发生的未修复或修复中的肌肉损伤。在另外的实施方案中，肌肉损伤是锻炼或运动诱发的肌肉损伤，导致包括锻炼诱发的延迟性肌肉酸痛(doms)。
在一些实施方案中，提供了治疗肌肉退行性紊乱的方法，所述方法包括向患有肌肉退行性紊乱的受试者施用有效量的nope细胞外结构域(ecd)多肽。在一些实施方案中，提供了治疗肌肉退行性紊乱的方法，所述方法包括向患有肌肉退行性紊乱的受试者施用有效量的nopeecd多肽或nopeecd融合分子。在一些实施方案中，患有肌肉退行性紊乱的受试者已经经历了肌肉萎缩。在一些实施方案中，患有肌肉退行性紊乱的受试者已被诊断为患有该紊乱，但尚未经历显著或可检测的肌肉萎缩。非限制性示例性肌肉退行性紊乱包括但不限于肌营养不良、肌强直性营养不良、多肌炎、和皮肌炎。非限制性示例性肌营养不良包括但不限于杜氏肌营养不良、贝克肌营养不良、先天性肌营养不良(福山型)、埃-德肌营养不良、肢带肌营养不良和面肩肱型肌营养不良。非限制性示例性肌强直性营养不良包括但不限于i型肌强直性营养不良、ii型肌强直性营养不良、和先天性肌强直。
在一些实施方案中，治疗肌肉萎缩、肌肉损伤或肌肉退行性紊乱包括以下中的至少一种：延迟肌肉萎缩的进展、改善受试者的6分钟步行距离(6mwd)、减少体力下降、延迟改变生活事件的发生、改善独立性、减少住院治疗、以及延迟对协助生活安排的需要。在一些实施方案中，改善受试者的6分钟步行距离(6mwd)意指受试者的6mwd在治疗12个月后增加了至少10米、或至少20米、或至少30米。在另一个实施方案中，受试者的6mwd的保持将指示在一些紊乱(例如杜氏肌营养不良)中的良好效力。非限制性示例性改变生活事件包括被放置在呼吸机上和/或需要轮椅。
在一些实施方案中，提供了治疗肌萎缩侧索硬化(als)的方法，所述方法包括向患有als的受试者施用有效量的nope细胞外结构域(ecd)多肽。在一些实施方案中，提供了治疗肌肉退行性紊乱的方法，所述方法包括向患有als的受试者施用有效量的nopeecd多肽或nopeecd融合分子。在一些实施方案中，当方法引起以下中的至少一种时，该方法被认为治疗als：延迟als的进展、减少体力下降、改善用力肺活量、减缓用力肺活量下降、减缓受试者在als功能评定量表(alsfrs)上的评分下降、改善受试者在alsfrs上的评分、延迟改变生活事件的发生、和提高受试者的存活时间。在一些实施方案中，当方法引起延迟气管造口术和/或延迟经皮内窥镜胃造口术(peg)的放置时，该方法被认为治疗als。
施用的途径和运载体
在多种实施方案中，nope激动剂可以皮下或静脉内施用。在一些实施方案中，nope细胞外结构域(ecd)多肽可以通过多种途径体内施用，所述多种途径包括但不限于口服、动脉内、肠胃外、鼻内、肌内、心脏内、心室内、气管内、含服、直肠、腹膜内、通过吸入、皮内、局部、经皮、和鞘内，或以其他方式，例如通过植入。主题组合物可以被配制为呈固体、半固体、液体或气体形式的制品(preparation)；包括但不限于片剂、胶囊、粉末、颗粒剂(granules)、软膏、溶液、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂、和气雾剂(aerosols)。在一些实施方案中，nope细胞外结构域(ecd)多肽使用基因疗法递送。作为非限制性实例，编码nope细胞外结构域(ecd)多肽的核酸分子可以被涂覆在金微粒上并通过粒子轰击装置或“基因枪”皮内递送，例如，如文献中所述(参见例如，tang等人,nature356:152-154(1992))。
在多种实施方案中，以具有多种药学上可接受的运载体的制剂提供包含nope细胞外结构域(ecd)多肽(诸如nopeecd融合分子)的组合物(参见例如gennaro,remington:thescienceandpracticeofpharmacywithfactsandcomparisons:drugfactsplus,第20版(2003)；ansel等人,pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems,第7版,lippencottwilliams和wilkins(2004)；kibbe等人,handbookofpharmaceuticalexcipients,第3版,pharmaceuticalpress(2000))。多种药学上可接受的运载体是适用的，所述药学上可接受的运载体包括媒介物、佐剂、和稀释剂。此外，多种药学上可接受的辅助物质，诸如ph调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂等也是可用的。非限制性示例性运载体包括盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇，及其组合。
在多种实施方案中，包含nope细胞外结构域(ecd)多肽的组合物可以通过将它们溶解、悬浮或乳化在水性或非水性溶剂，诸如植物油或其他油、合成脂肪族酸甘油酯、高级脂肪族酸的酯或丙二醇中被配制用于注射，包括皮下施用；并且如果需要，具有常规添加剂诸如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。在多种实施方案中，组合物可以被配制用于吸入，例如使用加压的可接受的推进剂诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。在多种实施方案中，组合物还可以诸如用生物可降解或生物不可降解的聚合物配制为持续释放微胶囊。非限制性示例性生物可降解制剂包括聚乳酸-乙醇酸聚合物。非限制性示例性生物不可降解制剂包括聚甘油脂肪酸酯。制备这样的制剂的某些方法描述于例如ep1125584a1中。
还提供了包含一个或更多个容器的药物剂量包，每个容器含有一个或更多个剂量的nope细胞外结构域(ecd)多肽。在一些实施方案中，提供了一种单位剂量，其中该单位剂量含有预定量的包含nope细胞外结构域(ecd)多肽的组合物，具有或不具有一种或更多种另外的剂。在一些实施方案中，这样的单位剂量以一次性预填充注射器供应用于注射。在多种实施方案中，以单位剂量中所含的组合物可以包含盐水、蔗糖等；缓冲液，诸如磷酸盐等；和/或被配制在稳定且有效的ph范围内。可选地，在一些实施方案中，组合物可以作为冻干粉末提供，该冻干粉末可以在添加适当的液体(例如无菌水)后被重构。在一些实施方案中，组合物包含一种或更多种抑制蛋白聚集的物质，所述物质包括但不限于蔗糖和精氨酸。在一些实施方案中，本发明的组合物包含肝素和/或蛋白多糖。
药物组合物以有效治疗或预防特定适应症(indication)的量施用。治疗有效量通常取决于所治疗的受试者的体重、他或她的身体或健康状况、待治疗的状况的广泛性、或所治疗的受试者的年龄。在一些实施方案中，nope细胞外结构域(ecd)多肽可以以每剂量在约50μg/kg体重至约50mg/kg体重的范围内的量施用。在一些实施方案中，nope细胞外结构域(ecd)多肽可以以每剂量在约100μg/kg体重至约50mg/kg体重的范围内的量施用。在一些实施方案中，nope细胞外结构域(ecd)多肽可以以每剂量在约100μg/kg体重至约20mg/kg体重的范围内的量施用。在一些实施方案中，nope细胞外结构域(ecd)多肽可以以每剂量在约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重的范围内的量施用。
在一些实施方案中，nope细胞外结构域(ecd)多肽可以以每剂量在约10mg至约1,000mg的范围内的量施用。在一些实施方案中，nope细胞外结构域(ecd)多肽可以以每剂量在约20mg至约500mg的范围内的量施用。在一些实施方案中，nope细胞外结构域(ecd)多肽可以以每剂量在约20mg至约300mg的范围内的量施用。在一些实施方案中，nope细胞外结构域(ecd)多肽可以以每剂量在约20mg至约200mg的范围内的量施用。
可以根据需要向受试者施用nope细胞外结构域(ecd)多肽组合物。在一些实施方案中，一次或更多次向受试者施用有效剂量的nope细胞外结构域(ecd)多肽。在多种实施方案中，一月一次、少于一月一次(诸如例如每两个月一次、每三个月一次、或每六个月一次)向受试者施用有效剂量的nope细胞外结构域(ecd)多肽。在其他实施方案中，多于一月一次，诸如例如每两周一次、每周一次、每周两次、每周三次、每天一次或每天多于一次施用有效剂量的nope细胞外结构域(ecd)多肽。至少一次向受试者施用有效剂量的nope细胞外结构域(ecd)多肽。在一些实施方案中，可以多于一次施用有效剂量的nope细胞外结构域(ecd)多肽，包括持续至少一个月、至少六个月、或至少一年的时间段。在一些实施方案中，根据需要向受试者施用nope细胞外结构域(ecd)多肽以便减轻状况的一种或更多种症状。
组合疗法
根据本发明的nope细胞外结构域(ecd)多肽(包括其任何功能变体)可以与其他生物活性物质或用于治疗疾病的其他治疗程序组合施用至有相应需要的受试者。例如，nope细胞外结构域(ecd)多肽可以单独地施用或与其他治疗模式一起施用。nope细胞外结构域(ecd)多肽可以在其他治疗模式之前、基本上同时或之后被提供。
在一些实施方案中，在另一种治疗模式(诸如锻炼和/或物理疗法或手术)之前、期间或之后向受试者施用nope细胞外结构域(ecd)多肽。
对于治疗某些肌营养不良，诸如杜氏肌营养不良，用nope细胞外结构域(ecd)多肽治疗的方法可以还包括施用皮质类固醇。对于治疗某些肌强直性营养不良，用nope细胞外结构域(ecd)多肽治疗的方法可以还包括施用选自苯妥英(phenytoin)、普鲁卡因酰胺(procainamide)和奎宁(quinine)的治疗剂。对于治疗肌萎缩侧索硬化(als)，用nope细胞外结构域(ecd)多肽治疗的方法可以还可以包括施用利鲁唑(riluzole)。
nope细胞外结构域(ecd)
非限制性示例性nopeecd包括全长nopeecd、和nopeecd变体。nopeecd与肌生成抑制蛋白结合。在一些实施方案中，nopeecd抑制肌生成抑制蛋白介导的smad2/3活化。nopeecd可以包含或缺乏信号肽。示例性nopeecd包括但不限于具有选自seqidno:5(具有信号肽)和6(不具有信号肽)以及seqidno:8的氨基酸序列的人类nopeecd。
nopeecd变体包括包含一个或更多个氨基酸添加、缺失和/或取代并且仍然能够结合肌生成抑制蛋白的变体。在一些实施方案中，nopeecd变体序列与亲本nopeecd的对应序列至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％相同。
融合配偶体和缀合物
在一些实施方案中，本发明的nopeecd可以与融合配偶体多肽组合，产生融合蛋白。这些融合配偶体多肽可以促进纯化，并且可以显示体内半衰期增加。由于igg部分而具有二硫键连接的二聚体结构的融合配偶体多肽在结合和中和其他分子方面也可以比单体nopeecd融合蛋白或单独的nopeecd更有效。用于nopeecd的其他合适的融合配偶体包括，例如，聚合物，诸如水溶性聚合物，免疫球蛋白的恒定结构域；全部或部分人类血清白蛋白(hsa)；胎球蛋白a；胎球蛋白b；亮氨酸拉链结构域；四联凝集素(tetranectin)三聚化结构域；甘露糖结合蛋白(也称为甘露糖结合凝集素)，例如，甘露糖结合蛋白1；和fc区，如本文所述并在美国专利第6,686,179号中进一步描述。
融合分子可以通过将聚氨基酸或分支点氨基酸附接至nopeecd来制备。例如，聚氨基酸可以是用于增加nopeecd的循环半衰期的运载体蛋白(除了经由融合分子实现的优势之外)。出于本发明的治疗目的，这样的聚氨基酸应该理想地是不产生中和抗原应答或其他不良应答的那些聚氨基酸。这样的聚氨基酸可以选自血清白蛋白(诸如hsa)、胎球蛋白a、胎球蛋白b、亮氨酸拉链核因子红细胞衍生物-2(nfe2)、神经视网膜亮氨酸拉链、四联凝集素或其他聚氨基酸，例如赖氨酸。如本文所述，聚氨基酸的附接位置可以在n末端或c末端，或其间的其他位置，并且还可以通过化学接头部分与选择的分子连接。
聚合物
聚合物，例如水溶性聚合物，可以用于本发明中以减少在水性环境中附接聚合物的nopeecd的沉淀，诸如通常在生理环境中所发现的。在本发明中采用的聚合物对于制备治疗性产品或组合物将是在药学上可接受的。
合适的临床上可接受的水溶性聚合物包括但不限于聚乙二醇(peg)、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇的共聚物、单甲氧基-聚乙二醇、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇(pva)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二噁戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(均聚物或无规共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物(ppg)和其他聚环氧烷、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(pog)(例如甘油)和其他聚氧乙烯化多元醇、聚氧乙烯化山梨糖醇或聚氧乙烯化葡萄糖、结肠酸(colonicacids)或其他碳水化合物聚合物、ficoll或右旋糖酐及其混合物。
本文使用的聚合物，例如水溶性聚合物，可以具有任何分子量，并且可以是支化的或未支化的。在一些实施方案中，聚合物具有在2kda和100kda之间、在5kda和50kda之间、或在12kda和25kda之间的平均分子量。通常，分子量越高或分支越多，聚合物:蛋白比率越高。根据期望的治疗谱(therapeuticprofile)；例如，持续释放的持续时间；对生物活性的影响(如果有的话)；处理方便；抗原性的程度或缺乏；和其他已知的聚合物对本发明的nopeecd的影响，也可以使用其他尺寸。
在一些实施方案中，本发明预期了化学衍生化的nopeecd，包括单-peg部分或聚-(例如2-4个)peg部分。聚乙二醇化可以通过任何可用的聚乙二醇化反应进行。存在许多本领域技术人员可用的peg附接方法。参见，例如，ep0401384；malik等人,exp.hematol.,20:1028-1035(1992)；francis,focusongrowthfactors,3(2):4-10(1992)；ep0154316；ep0401384；wo92/16221；wo95/34326；chamow,bioconjugatechem.,5:133-140(1994)；美国专利第5,252,714号；以及本文引用的与聚乙二醇化相关的其他出版物。
标志物
本发明的nopeecd可以与标志物序列诸如促进融合多肽纯化的肽融合。标志物氨基酸序列可以是六组氨酸肽，诸如pqe载体(qiagen,mississauga,ontario,canada)中提供的标签，以及其他，其中许多商购可得。如例如gentz等人,proc.natl.acad.sci.86:821-824(1989)中所述，六组氨酸提供了融合蛋白的方便纯化。可用于纯化的另一种肽标签，即血凝素(ha)标签，对应于源自流感ha蛋白的表位。(wilson等人,cell37:767(1984))。可以使用本发明的nopeecd来构建任何这些上述融合物。
寡聚化结构域融合配偶体
在多种实施方案中，寡聚化为融合蛋白提供一些功能优势，包括但不限于多价、增加的结合强度、和不同结构域的组合功能。因此，在一些实施方案中，融合配偶体包含寡聚化结构域，例如二聚化结构域。示例性寡聚化结构域包括但不限于，卷曲螺旋结构域，包括α-螺旋卷曲螺旋结构域；胶原蛋白结构域；胶原蛋白样结构域；和某些免疫球蛋白结构域。示例性卷曲螺旋多肽融合配偶体包括但不限于，四联凝集素卷曲螺旋结构域；软骨寡聚基质蛋白的卷曲螺旋结构域；血管生成素卷曲螺旋结构域；和亮氨酸拉链结构域。示例性胶原蛋白或胶原蛋白样寡聚化结构域包括但不限于见于胶原蛋白、甘露糖结合凝集素、肺表面活性蛋白a和d、脂联素、纤维胶凝蛋白、共凝素(conglutinin)、巨噬细胞清道夫受体和emilin中的那些。
抗体fc免疫球蛋白结构域融合配偶体
可以用作融合配偶体的许多fc结构域是本领域已知的。在一些实施方案中，融合配偶体是fc免疫球蛋白结构域。fc融合配偶体可以是见于天然存在的抗体或其变体中的野生型fc。非限制性示例性fc融合配偶体包括包含铰链和人类igg(例如人类igg1、人类igg2、人类igg3或人类igg4)的ch2和ch3恒定结构域的fc。在一些实施方案中，fc融合配偶体包含例如在igg1恒定区中的c237s突变。参见例如，seqidno:17。在一些实施方案中，fc融合配偶体是人类igg4恒定区。在一些这样的实施方案中，人类igg4恒定区包含s241p突变。参见例如angal等人mol.immunol.30(1):105-108(1993)。在一些实施方案中，fc融合配偶体包含铰链、具有p331s突变的人类igg2的ch2和ch3结构域，如美国专利第6,900,292号中所述。另外的示例性fc融合配偶体还包括但不限于人类iga和igm。某些示例性fc结构域融合配偶体示于seqidno:26至seqidno:28中。
在一些实施方案中，效应物功能是不期望的。例如，在一些实施方案中，在治疗炎性状况和/或自身免疫性紊乱中可能不期望效应物功能。在一些这样的实施方案中，选择或工程化人类igg4或igg2重链恒定区。在一些实施方案中，igg4恒定区包含s241p突变。
白蛋白融合配偶体和白蛋白结合分子融合配偶体
在一些实施方案中，融合配偶体是白蛋白。示例性白蛋白包括但不限于人类血清白蛋白(hsa)和能够增加与它们融合的多肽的血清半衰期或生物可利用度的hsa片段。在一些实施方案中，融合配偶体是白蛋白结合分子，诸如例如结合白蛋白的肽或与结合白蛋白的脂质或其他分子缀合的分子。在一些实施方案中，包含hsa的融合分子如例如美国专利第6,686,179号中描述来制备。
融合配偶体的示例性附接
融合配偶体可以与nopeecd的n末端或c末端共价或非共价附接。附接也可以通过例如氨基酸侧链(诸如例如，半胱氨酸、赖氨酸、丝氨酸、或苏氨酸的侧链)发生在nopeecd内除了n末端或c末端之外的位置。
在共价或非共价附接实施方案中，接头可以被包含在融合配偶体和nopeecd之间。这样的接头可以包括至少一个氨基酸或化学部分。将融合配偶体与nopeecd共价附接的示例性方法包括但不限于将融合配偶体和nopeecd翻译为单个氨基酸序列和融合配偶体与nopeecd的化学附接。当融合配偶体和nopeecd被翻译为单个氨基酸序列时，另外的氨基酸可以被包含在融合配偶体和nopeecd之间作为接头。在一些实施方案中，基于编码接头的多核苷酸序列选择接头，以便于将融合配偶体和/或nopeecd克隆到单个表达构建体中(例如，含有特定限制性位点的多核苷酸可以被放置于编码融合配偶体的多核苷酸和编码nopeecd的多核苷酸之间，其中含有限制性位点的多核苷酸编码短氨基酸接头序列)。当融合配偶体和nopeecd通过化学方法共价偶联时，通常可以在偶联反应期间包含多种尺寸的接头。
将融合配偶体与nopeecd非共价附接的示例性方法包括但不限于通过结合对附接。示例性结合对包括但不限于生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白、抗体及其抗原等。
nopeecd和nopeecd融合分子的示例性性质
在一些实施方案中，nopeecd或nopeecd融合分子与肌生成抑制蛋白结合，并抑制肌生成抑制蛋白介导的smad2/3活化。在一些实施方案中，nopeecd融合分子以小于50nm、小于20nm、小于10nm、小于1nm、或小于0.1nm的结合亲和力(kd)与肌生成抑制蛋白结合。在一些实施方案中，nopeecd融合分子阻断肌生成抑制蛋白与天然nope的结合。
信号肽
为了使一些分泌的蛋白大量表达和分泌，来自异源蛋白的信号肽可以是期望的。采用异源信号肽可以是有利的，因为在分泌过程期间在er中去除信号肽，得到的成熟多肽可以保持不变。可能需要添加异源信号肽来表达和分泌一些蛋白质。
非限制性示例性信号肽序列描述于例如由新加坡国立大学生物化学系(thedepartmentofbiochemistry,nationaluniversityofsingapore)维护的在线信号肽数据库中。参见choo等人,bmcbioinformatics,6:249(2005)；和pct公布第wo2006/081430号。
共翻译和翻译后修饰
在一些实施方案中，诸如nopeecd的多肽在翻译期间或之后被差别修饰，例如通过糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解或与抗体分子或其他细胞配体连接。可以通过已知技术进行许多化学修饰中的任何一种，所述已知技术包括但不限于通过溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶，v8蛋白酶的特异性化学裂解；nabh4；乙酰化；甲酰化；氧化；还原；和/或在衣霉素(tunicamycin)存在下的代谢合成。
本发明涵盖的另外的翻译后修饰包括，例如，n-连接或o-连接的碳水化合物链；n末端或c末端的加工；化学部分与氨基酸骨架的附接；n-连接或o-连接碳水化合物链的化学修饰；以及由于原核宿主细胞表达的添加或缺失n末端甲硫氨酸残基。
编码nope细胞外结构域(ecd)多肽的核酸分子
在一些实施方案中，提供了包含编码nopeecd或nopeecd融合分子的多核苷酸的核酸分子。还提供了包含编码nopeecd融合分子的多核苷酸的核酸分子，其中nopeecd和融合配偶体被翻译为单个多肽。
在一些实施方案中，编码nopeecd的多核苷酸包含编码信号肽的核苷酸序列，当翻译时，所述核苷酸序列将与nopeecd的n末端融合。如以上所讨论，信号肽可以是天然nope信号肽，或可以是另一种异源信号肽。在一些实施方案中，包含编码感兴趣的基因的多核苷酸的核酸分子是适于在选择的宿主细胞中表达的表达载体。
可以使用本领域常规的重组dna技术构建核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子是适于在选择的宿主细胞中表达的表达载体。
多肽表达和产生载体
提供了包含编码nopeecd的多核苷酸的载体。还提供了包含编码nopeecd融合分子的多核苷酸的载体。这样的载体包括但不限于dna载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。
在一些实施方案中，选择被优化用于在cho或cho来源的细胞或nso细胞中表达多肽的载体。示例性这样的载体描述于例如runningdeer等人,biotechnol.prog.20:880-889(2004)中。
在一些实施方案中，选择载体用于在动物(包括人类)中体内表达nope细胞外结构域(ecd)多肽。在一些这样的实施方案中，一种或更多种多肽(polypeptideorpolypeptides)的表达处于以组织特异性方式起作用的一种或更多种启动子(apromoterorpromoters)的控制下。例如，肝脏特异性启动子描述于例如pct公布第wo2006/076288号中。
宿主细胞
在多种实施方案中，nopeecd和/或包含任何这些的融合分子可以在原核细胞，诸如细菌细胞；或真核细胞，诸如真菌细胞，植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达。这样的表达可以例如根据本领域已知的程序进行。可以用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于包括cos7细胞的cos细胞；包括293-6e细胞的293细胞；包括cho-s和dg44细胞的cho细胞；per.
将一种或更多种核酸引入期望的宿主细胞中可以通过任何方法完成，所述任何方法包括但不限于磷酸钙转染、deae-右旋糖酐介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性示例性方法描述于例如sambrook等人,molecularcloning,alaboratorymanual,第3版coldspringharborlaboratorypress(2001)。根据任何合适的方法，核酸可以在期望的宿主细胞中被瞬时或稳定地转染。
在一些实施方案中，根据任何合适的方法，一种或更多种多肽可以在已经用编码该多肽的一种或更多种核酸分子工程化或转染的动物中被体内产生。
多肽的纯化
nopeecd和包含任何这些的融合分子可以通过任何合适的方法纯化。这样的方法包括但不限于使用亲和基质或疏水相互作用层析。合适的亲和配体包括与nope(诸如肌生成抑制蛋白)结合的任何配体或与融合配偶体结合的任何配体。此外，蛋白a、蛋白g、蛋白a/g或抗体亲和柱可用于与fc融合配偶体结合以纯化融合分子。
在一些实施方案中，疏水相互作用层析，例如丁基或苯基柱，也用于纯化一些多肽。许多纯化多肽的方法是本领域已知的。
制品
在一些实施方案中，提供了制品或试剂盒，所述制品或试剂盒含有可用于检测生物标志物(例如nope或肌生成抑制蛋白)或用于治疗、预防和/或诊断以上描述的紊乱的材料。制品包含容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页(packageinsert)。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料，诸如玻璃或塑料形成。在一些实施方案中，容器容纳组合物并且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有由皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)，所述组合物单独(byitself)或与另一种组合物组合有效治疗、预防和/或诊断状况。标签或包装插页指示，组合物用于治疗选择的状况。在一些实施方案中，制品可以包含(a)具有在其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的nope细胞外结构域(ecd)多肽；(b)具有在其中含有组合物的第二容器，其中该组合物包含另外的治疗剂。制品可以还包含指示组合物可以用于治疗特定状况的包装插页。可选地或另外地，制品可以还包含第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌性注射用水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(ringer'ssolution)和右旋糖溶液。制品可以还包括从商业和使用者的立场合意的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。
在一些实施方案中，本发明的分子可以单独地或与其他治疗性化合物组合包装为试剂盒。在一个实施方案中，治疗性化合物是抗癌剂。在另一个实施方案中，治疗性化合物是免疫抑制剂。试剂盒可以包含有助于向患者施用单位剂量的任选的组件，诸如用于重构粉末形式的小瓶、用于注射的注射器、定制的iv输送系统、吸入器等。另外地，单位剂量试剂盒可以含有制备和施用组合物的说明。试剂盒可以被制造为用于一个患者的单次使用单位剂量、用于特定患者的多于一次使用(以恒定剂量或其中单独化合物随着疗法进展可以在效力上变化)；或者试剂盒可以含有适于施用至多于一个患者的多于一个剂量(“散装包装”)。试剂盒组件可以被组装在纸箱、泡罩包装、瓶、管子等中。
实施例
以下讨论的实施例意图纯粹是示例本发明，而不应该被认为是以任何方式限制本发明。实施例不意图表示以下实验是所进行的所有或仅有的实验。作出了努力以确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指示，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度以摄氏度计，且压力处于大气压或接近大气压。
实施例1：某些nope-ecd融合蛋白的构建、表达和纯化
将编码人类nope(基因id57722)和小鼠nope(基因id56741)细胞外结构域(ecd)-fc融合分子的构建体克隆到载体ptt5(biotechnologyresearchinstitute,montreal,canada)中并由该载体ptt5表达。使用pcr和常规诱变技术构建人类或小鼠nopeecd-fc融合分子的截短衍生物。亲本构建体中人类和小鼠nopeecd-fc部分的主要蛋白序列和结构域结构示于图1中。产生界定了对nope功能重要的结构域的截短的nopeecd-fc衍生物。图2以名称和简要描述列出了这些实施例中使用的多种nope-fc融合蛋白。
对于体内确认实验(例如，实施例2)，通过bacmam技术将含有人类cd33信号序列代替天然信号序列的mnope(23-956)ecd-fc克隆到bacmam载体中以便在cho或hek细胞中分泌性表达。使用mabselectsure蛋白a亲和装置，随后使用superdex-200尺寸排阻层析纯化分泌的蛋白。对于体外结合实验(实施例3)，通过对在cddg44(invitrogen,grandisland,ny)中生长的cho-3e7细胞的pei介导的瞬时转染实现nope-ecd-fc及其衍生物的产生。通过hitrap蛋白a柱(gehealthcare,pittsburg,pa)纯化分泌的蛋白。
实施例2：nope增加体内肌肉质量
进行确定编码mnope(1-955)ecd-fc的dna载体的流体动力学尾静脉注射是否对体内肌肉生长具有影响的实验。将雌性balbc小鼠(charlesriverlabs,wilmington,ma)随机分为2个处理组，每组10只小鼠。在第0天，对小鼠进行瘦质量分析(
我们用纯化的蛋白确认了这些发现。按实施例1中所述构建、瞬时表达和纯化mnope(23-956)ecd-fc，。将雌性balbc小鼠(charlesriverlabs,wilmington,ma)随机分为2个处理组，每组10只小鼠。在第0天，如上文概括的，对小鼠进行瘦质量分析以建立基线测量值。记录基线测量值后，每周两次给小鼠施用媒介物或45mg/kg纯化的重组mnope(23-956)ecd-fc蛋白。在第6天、第11天、第14天、和第17天，测量瘦质量。nope暴露在第一剂量的6天内显示对出瘦质量的合成代谢作用(图3c)。在整个研究过程中，瘦质量的增加持续存在。在17天后，收获器官并称重。在暴露于mnope(23-956)ecd-fc的动物中，瘦质量合成代谢转化为骨骼肌和心脏重量的显著增加，而肝脏保持不变(图3d)。这些结果确认，我们通过流体动力学转染观察到全身暴露于nope引起小鼠中的肌肉合成代谢。
实施例3：nope在体外结合肌生成抑制蛋白
使用
简而言之，根据制造商的说明，将抗人类抗体(gelifesciences,ny,usa)与cm4芯片经由胺偶联连接。通过与抗人类抗体的相互作用，hnope(1-957)ecd-fc和mnope(1-955)ecd-fc两者被捕获在芯片上。无nopeecd-fc的流通池(flowcell)用作参考对照。肌生成抑制蛋白和肌生成抑制蛋白前体从&dsystems(mn,usa)购买。注射一个剂量反应的肌生成抑制蛋白或肌生成抑制蛋白前体，然后监测随时间的解离。使用langmuir1:1结合模型使用biacoret100评价软件包计算nopeecd-fc蛋白或作为肌生成抑制蛋白结合的阳性对照，活化素受体2b-fc(r&dsystems,mn,usa)的缔合常数、解离常数和亲和力。人类nope(1-957)ecd-fc和小鼠nope(1-955)ecd-fc对mstn的亲和力分别为0.2nm和0.8nm，而阳性对照actr2b-fc的亲和力为2.5nm。nopeecd-fc和actr2b-fc不与mstn前体结合。如图4中所示，nope蛋白对肌生成抑制蛋白具有类似的亲和力，且不与肌生成抑制蛋白前体结合。
实施例4：结构功能研究鉴定nope的功能结构域
为了理解nope和肌生成抑制蛋白之间相互作用的功能意义，我们采用基于细胞的报告物测定来测试nope抑制肌生成抑制蛋白信号传导的能力。另外，我们按实施例1中所述创建了界定nope的重要功能结构域的截短的突变体。将cignallentismad2/3萤光素酶(qiagen)转化到hek293细胞中并用于测试nope蛋白抑制肌生成抑制蛋白依赖性smad2/3活化的能力。生成肌生成抑制蛋白剂量应答曲线以确定smad2/3活性的ec80。0.1nm肌生成抑制蛋白的ec80以mnope(1-955)ecd-fc、hnope(1-957)ecd-fc、hnope(1-427)ecd-fc、hnope(1-620)ecd-fc和hnope(427-955)ecd-fc的剂量应答激发。如图5中所显示，与nope的相互作用导致肌生成抑制蛋白活性的中和。hnope(1-957)ecd-fc&hnope(1-620)ecd-fc对抑制肌生成抑制蛋白的ic50分别为0.5nm和0.17nm。mnope(1-955)ecd-fc具有0.068nm的ic50，比hnope(1-957)ecd-fc高7倍，并且比hnope(1-620)ecd-fc高2.5倍。hnope(1-427)ecd-fc和hnope(427-955)ecd-fc不抑制肌生成抑制蛋白诱导的smad2/3活化(图5)。
进行确定流体动力学尾静脉注射nope蛋白是否对体内肌肉生长具有影响的实验。将雌性balbc小鼠(charlesriverlabs,wilmington,ma)随机分为4个处理组，每组10只小鼠(图6)。在第0天，如实施例2中所述，对小鼠进行瘦质量分析以建立基线测量值。记录基线测量值后，通过流体动力学对小鼠转染mnope(1-955)ecd-fc、mnope(1-619)ecd-fc或mnope(623-955)ecd-fc或媒介物。在第7天和第14天，测量瘦质量。mnope(1-955)ecd-fc以及mnope(1-619)ecd-fc暴露在7天暴露内显示出对瘦质量的合成代谢作用。在整个研究过程中，瘦质量的增加持续存在。14天后，收获瘦质量器官并称重以确认瘦质量的增加是肌肉特异性的。在暴露于mnope(1-955)ecd-fc和mnope(1-619)ecd-fc的动物中，瘦质量合成代谢转化为骨骼肌的显著增加，而肝脏未受影响。mnope(623-955)ecd-fc对瘦质量或肌肉重量没有影响。
序列的表格
序列表
<110>戊瑞治疗有限公司
葛兰素史克知识产权开发有限公司
艾米·w·许
亚尼内·鲍尔斯
亚伦·柯蒂斯·辛肯
艾伦·詹姆斯·拉塞尔
沃伦·詹姆斯·罗克
<120>用于治疗病理性肌肉损失和虚弱的nope
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<223>小鼠nope前体(1-1252)，具有信号肽。
<400>3
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<220>
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<400>4
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<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>人类nope细胞外结构域(ecd)(1-957)，具有信号肽。
<400>5
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<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>人类nopeecd(25-955)，不具有信号肽。
<400>6
gluleuleuleuproglngluthrthrvalgluleusercysglyval
151015
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202530
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145150155160
glugluproargleuilevalleuproasnglyvalleuglnileleu
165170175
aspvalglngluseraspalaglyprotyrargcysvalalathrasn
180185190
seralaargglnhispheserglnglualaleuleuservalalahis
195200205
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210215220
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225230235240
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245250255
aspglylysproileserthraspvalilevalleuglyargthrasn
260265270
leuleuilealaasnalaglnprotrphisserglyvaltyrvalcys
275280285
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290295300
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305310315320
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325330335
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340345350
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355360365
thrglnileglyleuglnaspalaglytyrtyrglncysvalalaglu
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385390395400
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ser
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<212>prt
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210215220
alaserleuthrvalalaleuargglyserleuglualathrarggly
225230235240
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phevalsertrpvalargglnaspglylysproileserthraspval
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340345350
phevalcysargalaserglygluproargproalaleuhistrpleu
355360365
hisaspglyileproleuargproasnglyargvallysvalglngly
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glnleuvalproglyargleutyrgluvallysleuvalalapheasn
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lyshisgluaspglytyralaalavaltrplysglylysthrglulys
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145150155160
proglugluserargleuilethrleuproasnglyvalleuglnile
165170175
leuaspvalglnaspseraspalaglysertyrargcysvalalathr
180185190
asnseralaargglnargpheserglnglualaserleuthrvalala
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leuargglyserleuglualathrargglyglnaspvalvalileval
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glygluproargproalaleuhistrpleuhisaspglyileproleu
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argproasnglyargvallysvalglnglyglyglyglyserleuval
355360365
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405410415
leuserserserservalleuvalalatrpgluargprogluleuhis
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<220>
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<212>prt
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<220>
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<400>19
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290295300
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325330335
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<220>
<223>人类肌生成抑制蛋白前体(具有信号序列)。)
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65707580
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<211>352
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>人类肌生成抑制蛋白前体(不具有信号序列)。
<400>22
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202530
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225230235240
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245250255
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260265270
asptrpileilealaprolysargtyrlysalaasntyrcyssergly
275280285
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290295300
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305310315320
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325330335
iletyrglylysileproalametvalvalaspargcysglycysser
340345350
<210>23
<211>109
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>小鼠肌生成抑制蛋白。
<400>23
asppheglyleuaspcysaspgluhisserthrgluserargcyscys
151015
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202530
ilealaprolysargtyrlysalaasntyrcysserglyglucysglu
354045
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65707580
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859095
lysileproalametvalvalaspargcysglycysser
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<211>376
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>小鼠肌生成抑制蛋白前体(具有信号序列)。
<400>24
metmetglnlysleuglnmettyrvaltyriletyrleuphemetleu
151015
ilealaalaglyprovalaspleuasngluglysergluarggluglu
202530
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354045
thrargtyrserargileglualailelysileglnileleuserlys
505560
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65707580
leuleuproargalaproproleuarggluleuileaspglntyrasp
859095
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100105110
hisalathrthrgluthrileilethrmetprothrgluseraspphe
115120125
leumetglnalaaspglylysprolyscyscysphephelyspheser
130135140
serlysileglntyrasnlysvalvallysalaglnleutrpiletyr
145150155160
leuargprovallysthrprothrthrvalphevalglnileleuarg
165170175
leuilelysprometlysaspglythrargtyrthrglyileargser
180185190
leulysleuaspmetserproglythrglyiletrpglnserileasp
195200205
vallysthrvalleuglnasntrpleulysglnprogluserasnleu
210215220
glyilegluilelysalaleuaspgluasnglyhisaspleualaval
225230235240
thrpheproglyproglygluaspglyleuasnpropheleugluval
245250255
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260265270
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325330335
alaglyprocyscysthrprothrlysmetserproileasnmetleu
340345350
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355360365
valvalaspargcysglycysser
370375
<210>25
<211>351
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>小鼠肌生成抑制蛋白前体(不具有信号序列)。
<400>25
gluglysergluargglugluasnvalglulysgluglyleucysasn
151015
alacysalatrpargglnasnthrargtyrserargileglualaile
202530
lysileglnileleuserlysleuargleugluthralaproasnile
354045
serlysaspalaileargglnleuleuproargalaproproleuarg
505560
gluleuileaspglntyraspvalglnargaspaspserseraspgly
65707580
serleugluaspaspasptyrhisalathrthrgluthrileilethr
859095
metprothrgluserasppheleumetglnalaaspglylysprolys
100105110
cyscysphephelyspheserserlysileglntyrasnlysvalval
115120125
lysalaglnleutrpiletyrleuargprovallysthrprothrthr
130135140
valphevalglnileleuargleuilelysprometlysaspglythr
145150155160
argtyrthrglyileargserleulysleuaspmetserproglythr
165170175
glyiletrpglnserileaspvallysthrvalleuglnasntrpleu
180185190
lysglnprogluserasnleuglyilegluilelysalaleuaspglu
195200205
asnglyhisaspleualavalthrpheproglyproglygluaspgly
210215220
leuasnpropheleugluvallysvalthraspthrprolysargser
225230235240
argargasppheglyleuaspcysaspgluhisserthrgluserarg
245250255
cyscysargtyrproleuthrvalasppheglualapheglytrpasp
260265270
trpileilealaprolysargtyrlysalaasntyrcysserglyglu
275280285
cysgluphevalpheleuglnlystyrprohisthrhisleuvalhis
290295300
glnalaasnproargglyseralaglyprocyscysthrprothrlys
305310315320
metserproileasnmetleutyrpheasnglylysgluglnileile
325330335
tyrglylysileproalametvalvalaspargcysglycysser
340345350
<210>26
<211>232
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>fcc237s。
<400>26
gluprolysserserasplysthrhisthrcysproprocysproala
151015
progluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolyspro
202530
lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval
354045
valaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrval
505560
aspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglugln
65707580
tyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln
859095
asptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysala
100105110
leuproalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnpro
115120125
arggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthr
130135140
lysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproser
145150155160
aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr
165170175
lysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr
180185190
serlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphe
195200205
sercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys
210215220
serleuserleuserproglylys
225230
<210>27
<211>228
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>示例性fc#1。
<400>27
gluarglyscyscysvalglucysproprocysproalaproproval
151015
alaglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleu
202530
metileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalser
354045
hisgluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspglyvalglu
505560
valhisasnalalysthrlysproargglugluglnpheasnserthr
65707580
pheargvalvalservalleuthrvalvalhisglnasptrpleuasn
859095
glylysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleuproalapro
100105110
ileglulysthrileserlysthrlysglyglnproarggluprogln
115120125
valtyrthrleuproproserarggluglumetthrlysasnglnval
130135140
serleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealaval
145150155160
glutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpro
165170175
prometleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthr
180185190
valasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysserval
195200205
methisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleu
210215220
serproglylys
225
<210>28
<211>229
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>示例性fc#2。
<400>28
gluserlystyrglyproprocysprosercysproalaprogluphe
151015
leuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr
202530
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