药物组合物及其用于治疗癌症和自身免疫疾病的用途的制作方法
本申请要求2016年6月15日提交的美国专利申请号15/183,340的权益。该优先权申请的内容通过引用整体并入本文。
背景技术：
癌症治疗已经随时间进展变得更靶向和对患者具有更少的毒性。传统的化学疗法经常具有高水平的全身毒性。靶向疗法使用小分子或生物制品(例如，治疗性抗体)来抑制在癌症发展中涉及的选定细胞蛋白的活性，并造成比传统化学疗法少得多的副作用。免疫疗法诸如靶向免疫检验点(例如，pd-1和pd-l1)的那些和涉及嵌合抗原受体t(car-t)细胞的那些目的在于支持患者自身的抗癌免疫防御，且已经作为有前途的新治疗范例出现。
在癌症治疗中已经被靶向的细胞蛋白之一是布鲁顿酪氨酸激酶(btk)。btk是蛋白酪氨酸激酶的tec家族的一个成员。btk含有具有普列克底物蛋白同源性(ph)、tec同源性(th)、src同源性3(sh3)、src同源性2(sh2)和酪氨酸激酶或src同源性1(tk或sh1)的结构域(akinleye等人,“ibrutinibandnovelbtkinhibitorsinclinicaldevelopment,”journalofhematology&oncology,2013,6:59)。btk基因在不同淋巴样区域中的适当表达在正常b-细胞发育中起关键作用。btk也参与b细胞活化和存活的信号转导途径(kurosaki,“molecularmechanismsinbcellantigenreceptorsignaling,”curropimm,1997,9(3):309-18)。
btk在多种受体下游起作用，所述受体包括b-细胞受体(bcr)、生长因子和趋化因子的受体、和先天性免疫受体。btk开始宽范围的细胞过程，诸如细胞增殖、存活、分化、运动性、附着、血管生成、细胞因子产生和抗原呈递，并在血液学恶性肿瘤和免疫障碍中起重要作用。在慢性淋巴细胞白血病(cll)的小鼠模型中，证实了btk表达水平会设定恶性转化的阈值；btk过表达会加速白血病和增加死亡率(kil等人,“bruton’styrosinekinasemediatedsignalingenhancesleukemogenesisinamousemodelforchroniclymphocyticleukemia,”amjbloodres,2013,3(1):71-83)。
依鲁替尼(ibrutinib)(也商业上称作
技术实现要素：
本发明涉及抑制癌细胞和治疗癌症的方法，并涉及抑制淋巴细胞(例如，b细胞)和治疗免疫障碍的方法。在这些方法中，使用btk抑制剂诸如本文描述的多氟取代的吡唑并嘧啶化合物和哺乳动物雷帕霉素靶标(mammaliantargetofrapamycin)(mtor)的抑制剂。在某些实施方案中，也使用第三种药物，诸如b-细胞淋巴瘤2(bcl-2)或pi3激酶的抑制剂或免疫调节药物(imid)。申请人已经发现，本文描述的药物的特定组合具有意外高的协同效应且可以有效地克服抗药性和疾病复发。本文描述的组合疗法由于使用的更低剂量而比单一疗法安全得多，且可以因为更好的治疗效果而缩短治疗周期。
本文描述的发明的一个方面涉及一种用于治疗癌症诸如淋巴样恶性肿瘤(lymphoidmalignancy)(例如，慢性淋巴细胞白血病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤)的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的(i)btk抑制剂、(ii)mtor激酶抑制剂和(iii)bcl-2抑制剂或imid。在某些实施方案中，所述淋巴样恶性肿瘤是多发性骨髓瘤，其目前用imid或它与其它药物的现有组合来治疗，但是该疾病仍然存在显著的未得到满足的医学需要。
本发明的另一个方面涉及用于治疗免疫障碍诸如自身免疫病(例如，类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮)的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的(a)布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂和(b)哺乳动物雷帕霉素靶标(mtor)激酶抑制剂。
在某些实施方案中，所述btk抑制剂选自由式i、ii、ia、ib、iia或iib表示的化合物、依鲁替尼、acalabrutinib、bgb-3111、spebrutinib、ono-4059、hm71224、rn486、cnx-774、cgi-1746和其它btk抑制剂及其对映异构体、非对映异构体和药学上可接受的盐，其中前述式是：
其中：
每个r1是f；
r2是f；
r3是h或d；
n是1、2、3或4；且
m是1或2，
或其对映异构体或非对映异构体或其药学上可接受的盐或前药。
在某些实施方案中，所述btk抑制剂选自：化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物20及其对映异构体、非对映异构体和药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述btk抑制剂是化合物3或其对映异构体、非对映异构体或药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述btk抑制剂是化合物5或其对映异构体、非对映异构体或药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述btk抑制剂是依鲁替尼、acp-196(acalabrutinib)、bgb-3111、spebrutinib、ono-4059、hm71224、rn486、4-(4-((4-((3-丙烯酰氨基苯基)氨基)-5-氟嘧啶-2-基)氨基)苯氧基)-n-甲基吡啶酰胺(cnx-774)、n-[3-[4,5-二氢-4-甲基-6-[[4-(4-吗啉基羰基)苯基]氨基]-5-氧代吡嗪基]-2-甲基苯基]-4-(1,1-二甲基乙基)-苯甲酰胺(cgi-1746)、avl-292(cc-292)、prn1008、m7583、m2951、biib068、ct-1530、ac0058ta、arq531、gs-4059、redx08608、rxc005、bms-986142、tp-0158、sns-062和bi-btk-1或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述mtor激酶抑制剂选自：依维莫司、雷帕霉素、[7-(6-氨基-3-吡啶基)-2,3-二氢-1,4-苯并氧氮杂
在某些实施方案中，所述mtor激酶抑制剂是依维莫司或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述mtor激酶抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述imid是来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、revlimid、cc-112或cc-220或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述bcl-2抑制剂选自：venetoclax(abt-199)、navitoclax、abt-737、tw-37、sabutoclax、奥巴克拉、其它已知的bcl-2抑制剂、及其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述bcl-2抑制剂是venetoclax(abt-199)、bi-97c1(sabutoclax)、navitoclax、奥巴克拉、4-[4-[[2-(4-氯苯基)苯基]甲基]哌嗪-1-基]-n-[4-[[(2r)-4-(二甲基氨基)-1-苯硫基丁(phenylsulfanylbutan)-2-基]氨基]-3-硝基苯基]磺酰基苯甲酰胺(abt-737)、n-[4-(2-叔丁基苯基)磺酰基苯基]-2,3,4-三羟基-5-[(2-丙烷-2-基苯基)甲基]苯甲酰胺(tw-37)、apg-1252、s55746或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述方法包括给癌症患者施用治疗有效量的(a)依鲁替尼或其药学上可接受的盐、(b)依维莫司或其药学上可接受的盐和(c)venetoclax或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述方法包括给癌症患者施用治疗有效量的(a)依鲁替尼或其药学上可接受的盐、(b)雷帕霉素或其药学上可接受的盐和(c)venetoclax或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述方法包括给癌症患者施用治疗有效量的(a)化合物3或其对映异构体、非对映异构体或药学上可接受的盐、(b)依维莫司或其药学上可接受的盐和(c)venetoclax或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述方法包括给癌症患者施用治疗有效量的(a)化合物3或其对映异构体、非对映异构体或药学上可接受的盐、(b)雷帕霉素或其药学上可接受的盐和(c)venetoclax或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述方法包括给癌症患者施用治疗有效量的(a)化合物5或其对映异构体、非对映异构体或药学上可接受的盐、(b)依维莫司或其药学上可接受的盐和(c)venetoclax或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述方法包括给癌症患者施用治疗有效量的(a)化合物5或其对映异构体、非对映异构体或药学上可接受的盐、(b)雷帕霉素或其药学上可接受的盐和(c)venetoclax或其药学上可接受的盐。
在以上实施方案中的某些中，所述bcl-2抑制剂诸如venetoclax(abt-199)、bi-97c1(sabutoclax)、navitoclax、奥巴克拉、4-[4-[[2-(4-氯苯基)苯基]甲基]哌嗪-1-基]-n-[4-[[(2r)-4-(二甲基氨基)-1-苯硫基丁-2-基]氨基]-3-硝基苯基]磺酰基苯甲酰胺(abt-737)、n-[4-(2-叔丁基苯基)磺酰基苯基]-2,3,4-三羟基-5-[(2-丙烷-2-基苯基)甲基]苯甲酰胺(tw-37)、apg-1252、s55746可以用imid诸如沙利度胺、revlimid、来那度胺、泊马度胺、cc-112、cc-220替换。
在某些实施方案中，所述方法包括给具有免疫障碍的患者施用治疗有效量的(a)依鲁替尼、化合物3或化合物5和(b)依维莫司或雷帕霉素。
在某些实施方案中，以任意次序依次施用所述btk抑制剂、所述mtor激酶抑制剂和所述bcl-2抑制剂或imid中的每一种。
在某些实施方案中，一起施用所述btk抑制剂、所述mtor激酶抑制剂和所述bcl-2抑制剂或imid中的每一种，例如，在三种药物组合物中并行施用，或在相同共配制的药物组合物中施用。
在某些实施方案中，每天一次或多次将所述btk抑制剂、所述mtor激酶抑制剂和所述bcl-2抑制剂或imid中的每一种口服施用给所述受试者。
在某些实施方案中，所述btk抑制剂的每日剂量是在5mg和1000mg之间。在某些实施方案中，所述mtor激酶抑制剂的每日剂量是在0.1mg和10mg之间。在某些实施方案中，所述imid的每日剂量是在1mg和30mg之间。在某些实施方案中，所述btk抑制剂、所述mtor激酶抑制剂和所述imid的总每日剂量是300mg或更少。
在某些实施方案中，所述btk抑制剂的每日剂量是在5mg和1000mg之间。在某些实施方案中，所述mtor激酶抑制剂的每日剂量是在0.1mg和10mg之间。在某些实施方案中，所述bcl-2抑制剂的每日剂量是在10mg和1000mg之间。在某些实施方案中，所述btk抑制剂、所述mtor激酶抑制剂和所述bcl-2抑制剂的总每日剂量是500mg或更少。
在某些实施方案中，所述癌症是选自小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、弥漫性大b细胞性淋巴瘤(dlbcl)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(wm)、滤泡淋巴瘤(fl)、套细胞淋巴瘤(mcl)、边缘带淋巴瘤(mzl)和多发性骨髓瘤(mm)的b-细胞恶性肿瘤。
在某些实施方案中，所述癌症选自：脑肿瘤、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、宫颈癌、子宫内膜癌、结直肠癌、肾癌、食管癌、腺癌、甲状腺癌、骨癌、皮肤癌、结肠癌、女性生殖道肿瘤、淋巴瘤和睾丸癌。
在某些实施方案中，在用20mg/kg或更低的btk抑制剂、mtor激酶抑制剂和bcl-2抑制剂的总每日剂量治疗14天以后，所述方法有效地使scid小鼠中的tmd-8淋巴瘤异种移植物的平均肿瘤体积减小至少80％。
本文描述的发明的另一个方面涉及一种药物组合物，其包含btk抑制剂、mtor激酶抑制剂、bcl-2抑制剂和药学上可接受的载体。
本文描述的发明的另一个方面涉及一种药物试剂盒，其包含第一口服剂量的btk抑制剂、第二口服剂量的mtor激酶抑制剂和第三口服剂型(dosageform)的bcl-2抑制剂或imid。在某些实施方案中，所述药物试剂盒进一步包含关于在有此需要的受试者中施用所述剂型以治疗癌症的说明书。
本文描述的发明的另一个方面涉及一种用于治疗癌症或自身免疫病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的(a)布鲁顿氏酪氨酸激酶(btk)抑制剂和(b)哺乳动物雷帕霉素靶标(mtor)激酶抑制剂。
在某些实施方案中，所述方法包括给所述受试者施用治疗有效量的(a)依鲁替尼或其药学上可接受的盐和(b)依维莫司或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，所述方法包括给所述受试者施用治疗有效量的(a)化合物3或其药学上可接受的盐和(b)依维莫司或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，所述方法包括给所述受试者施用治疗有效量的(a)化合物5或其药学上可接受的盐和(b)依维莫司或其药学上可接受的盐。
本公开内容的另一个方面涉及一种用于治疗淋巴样恶性肿瘤的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的(a)布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂、(b)pi3k抑制剂和(c)bcl-2抑制剂。在某些实施方案中，所述btk抑制剂和所述bcl-2抑制剂可以选自上述的化合物，且所述pi3k抑制剂是btg226、gedatolisib、apitolisib、omipalisib、dactolisib、duvelisib、idelalisib或其药学上可接受的盐。
本公开内容的再一个方面涉及一种用于治疗淋巴样恶性肿瘤的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的(a)布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂、(b)pi3k抑制剂和(c)免疫调节药物(imid)。在某些实施方案中，每种抑制剂选自上述的化合物。
这些和其它特征、以及它们的组构和运行方式将从下述详细描述变得显而易见。
附图说明
图1a的图显示了多剂量的化合物1和3对tmd-8淋巴瘤异种移植物scid小鼠模型中的肿瘤体积的抗肿瘤作用。“p.o.,bid*14”:口服每天2次，持续14天。
图1b的图显示了化合物1和3对tmd-8淋巴瘤异种移植物scid小鼠模型中的肿瘤重量的抗肿瘤作用。
图2的图显示了化合物3、化合物15和它们的组合在tmd-8淋巴瘤异种移植物scid小鼠模型中的抗肿瘤作用。
图3的图显示了化合物3、8和15和它们的组合在tmd-8淋巴瘤异种移植物scid小鼠模型中的抗肿瘤作用。
图4的图显示了化合物3、14和16和它们的组合在tmd-8淋巴瘤异种移植物scid小鼠模型中的抗肿瘤作用。
图5的图显示了化合物3、14和15和它们的组合在tmd-8淋巴瘤异种移植物scid小鼠模型中的抗肿瘤作用。
图6的图显示了化合物3、14和15和它们的组合在dohh-2淋巴瘤异种移植物scid小鼠模型中的抗肿瘤作用。
图7的图显示了化合物3、14和15和它们的组合在dohh-2淋巴瘤异种移植物scid小鼠模型中的抗肿瘤作用。
图8的图显示了化合物3和9在抗性的wsu-dlcl2scid小鼠模型中的抗肿瘤作用。
图9的图显示了化合物3、14和15和它们的组合在抗性的wsu-dlcl2scid小鼠模型中的抗肿瘤作用。
图10的图显示了不同剂量组合的化合物3、14和15的三元组合在tmd-8淋巴瘤异种移植物scid小鼠模型中的抗肿瘤作用。
图11的图显示了化合物3或9与化合物14和15的三元组合在dohh2小鼠模型中的抗肿瘤作用。
图12的图显示了不同剂量组合的化合物3、化合物12和化合物14或化合物8的一元、二元和三元组合在tmd-8小鼠模型中的抗肿瘤作用。
图13的图显示了在佐剂诱导的关节炎(aia)研究中的试验动物的爪体积。将数据显示为平均值±sem。
图14是来自每组aia研究的h&e染色的一组代表性摄影图像。
图15的图显示了胶原诱导的关节炎(cia)研究的临床评分。将数据显示为平均值±sem。
图16是来自每组(40个)cia研究h&e染色的一组代表性摄影图像。
发明详述
控制细胞生长、增殖、存活和凋亡的信号转导途径是复杂的和相关的。申请人已经发现，(i)btk介导的信号传递途径、(ii)mtor激酶介导的信号传递途径和(iii)bcl-2介导的信号传递途径或被免疫调节药物(imid)靶向的信号转导途径的并行阻断会在治疗涉及btk的癌症(诸如血液学恶性肿瘤(hematologicalmalignancies))中提供与靶向这些途径中的仅一种的单一疗法相比惊人的优良效力。
申请人还已经发现，(i)btk介导的信号传递途径和(ii)mtor激酶介导的信号传递途径的并行阻断会在治疗涉及btk的免疫障碍(诸如自身免疫疾病、炎症和超敏反应)中提供与仅靶向任一种途径的单一疗法相比惊人的优良效力。
在本发明的一个方面，申请人已经发现了btk、mtor和bcl-2抑制剂的组合使用靶向由这三种细胞蛋白介导的信号转导的意外强的协同效应。在信号传递途径之间的关联是非常复杂的。参见，例如，roschewski等人,“diffuselargeb-celllymphoma—treatmentapproachesinthemolecularera,”natrevclinoncol,2014,11(1):12-23，其内容通过引用整体并入本文。本组合表现出的优越协同效应是惊人的，因为并非抗癌药物的所有组合都具有协同效应，更别提用本组合看到的量级的协同效应了。例如，申请人已经发现，alk抑制剂色瑞替尼(ceritinib)和btk抑制剂依鲁替尼不具有协同效应；申请人还已经发现，jak1/2抑制剂鲁索替尼(ruxolitinib)和btk抑制剂或mtor抑制剂或免疫调节药物不具有协同效应。
但是，已经发现本发明的“二合一(twoinone)”和“三合一(threeinone)”组合疗法是协同的且优于单一疗法。所述“二合一”药物组合各自包含以下的应用：
(i)btk抑制剂和(ii)mtor激酶抑制剂；
(i)btk抑制剂和(ii)imid；
(i)btk抑制剂和(ii)topk抑制剂；
(i)btk抑制剂和(ii)pi3k抑制剂；或
(i)topk抑制剂和(ii)pi3k抑制剂。
所述“三合一”药物组合各自包含以下的应用：
(i)btk抑制剂、(ii)mtor激酶抑制剂和(iii)免疫调节药物(imid)；
(i)btk抑制剂、(ii)mtor激酶抑制剂和(iii)bcl-2抑制剂；
(i)abtk抑制剂、(ii)pi3k抑制剂和(iii)bcl-2抑制剂；或者
(i)btk抑制剂、(ii)pi3k抑制剂和(iii)免疫调节药物(imid)。
在下面进一步描述了这些抑制剂中的每一种。
单一靶向疗法(单一疗法)需要较长期的治疗且经常由于靶(例如，癌性的)细胞中的基因突变而随时间导致抗药性和疾病复发。实际上，已经在患者中观察到对btk抑制剂依鲁替尼的抗性。本发明的组合疗法防止了抗药性，因为它们会抑制靶细胞中的潜在补偿途径。本发明因而给具有难治疾病(诸如药物抗性的癌症)的患者带来了新的希望。这些疗法也具有比单一靶向药物更好的安全性谱和更宽的治疗窗，因为在这些组合疗法中的药物的协同效应使得健康护理提供者能够在低得多的剂量使用单一药物，从而减少这些药物的副作用。
申请人的研究已经证实，本发明的组合疗法实现了比单一疗法高100倍的治疗效果，但是在更低的单一药物剂量。在不同的异种移植物小鼠模型中，1/18化合物3(btk抑制剂)+1/6依维莫司(mtor抑制剂)+1/6泊马度胺(imid)的组合的经口管饲施用实现了比在完全剂量的三种药物中的每一种远远更好的治疗效果。在小鼠模型中，“二合一”组合导致了在15-天治疗周期中的完全肿瘤消退，且“三合一”组合导致了在甚至更短的治疗周期(9天)中的完全肿瘤消退。重要的是，不同于在单一靶向疗法中，肿瘤在治疗终止以后12天内没有回弹(rebound)。
申请人已经发现，“三合一”药物组合物在低至10nm的btk抑制剂浓度在仅48小时的温育时间以后可以抑制多达95％的肿瘤细胞生存力，并且百分比随着更长的温育时间(例如，72-96小时)增加。申请人还已经证实，所述组合物的体外细胞生存力抑制与它们的体内肿瘤生长抑制相关联。因而预见到，本组合物在低至10nm的单一药物浓度可以导致癌症减轻或完全消失。目前，单一靶向疗法或双途径组合疗法在1,000nm的药物浓度会有效地抑制肿瘤细胞的生长。例如，venetoclax(一种bcl-2抑制剂)在1,000nm、100nm和10nm分别使tmd-8肿瘤细胞生存力抑制了37.6％、18.8％和11.1％。包含相同浓度的venetoclax和1,000nm、100nm和10nm的化合物3(btk抑制剂；下文)的本发明的“二合一”药物组合物分别使tmd-8细胞生存力抑制了85.97％、79.99％和65.36％。包含100nm的venetoclax、1,000nm、100nm和10nm的化合物3以及100nm的pi3k抑制剂的“三合一”药物组合物分别使tmd-8细胞生存力抑制了95.56％、95.30％和94.62％。包含100nm的venetoclax、1,000nm、100nm和10nm的化合物3以及100nm的mtor抑制剂依维莫司的“三合一”药物组合物分别使tmd-8细胞生存力抑制了93.44％、94.73％和94.65％。从现有的知识不可推断出本发明的组合物的显著协同效应。
已经证实本组合疗法不仅在敏感的tmd-8肿瘤模型中是非常有效的，而且在不敏感的dohh2肿瘤模型以及抗性的和难治的wsu-dlcl肿瘤模型中是非常有效的。例如，根据以前的报道在480mg/kg/天的高剂量经口管饲给小鼠的化合物ez-6438(组蛋白甲基转移酶ezh2抑制剂)抑制wsu-dlcl肿瘤模型中的肿瘤生长(knutson等人,“selectiveinhibitionofezh2byepz-6438leadstopotentantitumoractivityinezh2-mutantnon-hodgkinlymphoma,”mol.can.ther,2014,13(4):842-54)，但是这发明的“三合一”组合在对于组合的所有三种药物仅21mg/kg/天是有效的。
在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合包含(i)btk抑制剂、(ii)mtor激酶抑制剂和(iii)imid或bcl-2抑制剂。在其中通过经口管饲法(该施用途径可以避免药代动力学的不确定性和与例如腹膜内注射或静脉内注射相比更准确地评价口服药物组合物的可制药性)施用所述药物的体内动物模型中，这样的“三合一”组合导致肿瘤移植物的完全消失，且在治疗结束以后12天没有观察到肿瘤回弹。其它组合仅抑制肿瘤生长，且必须连续地施用才能使肿瘤生长受到抑制(atbay)。依维莫司单一疗法在高剂量(3mg/kg)可以导致肿瘤移植物的完全消失，但是在治疗结束以后肿瘤快速地回弹。因而，本发明的“三合一”药物组合不仅造成完全肿瘤消退，而且也防止肿瘤复发。
在下面更详细地描述了在本组合疗法中有用的各种药物。
btk抑制剂
在本发明中有用的btk抑制剂可以是本领域已知的那些，包括、但不限于
依鲁替尼(j&j/abbvie),
acp-196或acalabrutinib(acerta/astrazeneca),
bgb-3111(beigene),
spebrutinib,
ono-4059(onopharmaceutical),
hm71224(hanmipharmaceutical/lilly),
rn486(roche)，
4-(4-((4-((3-丙烯酰氨基苯基)氨基)-5-氟嘧啶-2-基)氨基)苯氧基)-n-甲基吡啶酰胺(cnx-774)，
n-[3-[4,5-二氢-4-甲基-6-[[4-(4-吗啉基羰基)苯基]氨基]-5-氧代吡嗪基]-2-甲基苯基]-4-(1,1-二甲基乙基)-苯甲酰胺(cgi-1746)，
avl-292或cc-292(celgene)，
prn1008(principiabio)，
m7583(merckserono),
m2951(merckserono)，
biib068(biogen)，
ct-1530(centaurusbiopharma)，
ac0058ta(aceabiosciences)，
arq531(arqule)，
gs-4059(gilead/ono)，
redx08608(redxpharma)，
rxc005(redxpharma)，
bms-986142(bristol-myersquibb)，
tp-0158(toleropharma)，
sns-062(sunesispharma),和
bi-btk-1(boehringeringelheim)。
它们也可以是在2016年3月18日提交的pct公开wo2015/165279和美国申请号15/075,033所描述的多氟代化合物，其公开内容通过引用整体并入本文。除了小分子以外，还可以使用其它化学实体，诸如btk的反义rna、sirna、肽基抑制剂和抗体抑制剂。在某些实施方案中，所述抑制剂不可逆地结合btk。在某些实施方案中，所述抑制剂可以结合突变的btk，诸如具有在c481处的突变(例如，c481s突变)的btk。在某些实施方案中，可以替代btk抑制剂或在btk抑制剂之外使用btk介导的信号传递途径的其它成员的抑制剂。例如，蛋白激酶c(pkc)β的抑制剂诸如恩扎妥林和索曲妥林可以用作btk抑制剂的替代物。
在某些实施方案中，有用的btk抑制剂包括具有下式(式i、ii、ia、ib、iia和iib)之一的结构的那些或它们的药学上可接受的盐、和它们的各对映异构体或非对映异构体或其盐。
氮原子可以与其它原子形成三个键。除了氢以外的任何原子必须画出。作为化学家的典型实践，可以将或不将氢清楚地画出。例如，r-n是指r-nh2，r-nc(＝o)-w是指r-nh(c＝o)-w。
其中：
每个r1是f；
r2是f；
r3是h或d；
n是1、2、3或4；且
m是1或2，
或其对映异构体或非对映异构体、或其药学上可接受的盐或前药。
上式的化合物可以包含一种或多种稳定的同位素或放射性同位素，包括、但不限于，2h、3h、13c、14c、15n和18o。例如，在式(i)的化合物中的乙烯基的双键的末端处的1h可以被2h替换以减少由双键的氧化/还原造成的药物灭活。
本文中使用的“前药”是可以在体内代谢以产生药物的无生物活性的化合物。例如，btk抑制剂的前药可以是在氨基基团(例如，酰胺、氨基甲酸酯或聚乙二醇)处的前药。
本文中使用的术语“药学上可接受的盐”表示与酸或碱形成的盐，包括、但不限于，(a)酸加成盐：无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸和其它有机酸)，和有机酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸和抗坏血酸)；和(b)碱加成盐，金属阳离子(诸如锌、钙、钠和钾)的形成。
btk抑制剂的合成方案
成功地设计了一种新颖的用于合成吡唑并嘧啶化合物的方法。下面显示了代表性的合成方案。除非另外指出，否则在以下反应方案和讨论中，r1、r2、r3、m和n具有上面定义的相同含义。
方案1
在碱性条件(例如碳酸钾)下在合适的溶剂(例如dmf)中将氟取代的起始原料a1用取代的苯酚b1处理以产生中间体c1。然后在碱性条件(例如乙酸钾)下在合适的溶剂(例如1,4-二
方案2
用碱(例如，碳酸钾)在合适的溶剂(例如dmf)中使3-氟-4-溴苯酚与1-氟-3-硝基苯反应以产生中间体c2。用适当的还原剂(例如，铁粉和氯化铵)在适当的溶剂(例如，乙醇和水)中将得到的硝基化合物c2还原成胺d2，随后用亚硝酸钠和氟化氢吡啶处理以产生氟取代的中间体e2。然后在碱性条件(例如乙酸钾)下在合适的溶剂(例如，1,4-二
方案3
用适当的催化剂(例如，醋酸铜)使3-氟-4-溴苯酚与3-氟苯基硼酸反应以产生中间体b3。然后用合适的催化剂(例如，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(ii))使中间体b3与双(频哪醇合)二硼反应以产生中间体c3。在碱性条件(例如，乙酸钾)下在合适的溶剂(例如，1,4-二
方案4
使胺i1与丁-2-炔酸反应以形成酰胺ii。如果ii是外消旋的，通过sfc手性拆分可以得到光学活性化合物h3和i3。
方案5
经由mitsunobu反应或置换反应从化合物f1形成中间体a5。在碱性条件(例如，磷酸钾)下在合适的溶剂(例如，1,4-二
方案6
使胺i1与丁-2-炔酸反应以形成酰胺iia。
表1显示了这些化合物以及化合物7和20的结构和名称。
表1代表性的化合物
注：如果在结构和名称之间存在差异，以结构为准。
可以如在marostica等人,“populationpharmacokineticmodelofibrutinib,abrutontyrosinekinaseinhibitor,inpatientswithbcellmalignancies,”cancerchemotherpharmacol,2015,75:111-121中所述执行所述化合物的药代动力学分析。该出版物的内容通过引用整体并入本文。
通过众所周知的方法可以执行所述化合物的毒性和毒物动力学(tk)研究。申请人的tk研究表明，本文描述的btk-抑制性化合物在28-天大鼠和狗研究中具有比依鲁替尼更好的安全性谱。例如，化合物3表现出以下有利特征：
(i)比依鲁替尼更高的未观察到的副作用水平(noael)；
(ii)在第1天在大鼠中在40mg/kg的相同剂量比依鲁替尼高5-14倍的暴露；
(iii)当以40mg/kg施用给大鼠时，auc(曲线下面积)13,700h*ng/ml(雄性)和17,300h*ng/ml(雌性)，与此相比，40mg/kg的依鲁替尼为1,000h*ng/ml(雄性)和3300h*ng/ml(雌性)(根据美国fdanda申请号205552orig1s000_药理学评论)；
(iv)当以15mg/kg施用给狗时，auc3,550(雄性)和2,930(雌性)h*ng/ml，与此相比，24mg/kg的依鲁替尼的auc1,780(雄性)和1,850(雌性)h*ng/ml((根据美国fdanda申请号205552orig1s000_药理学综述)；
(v)在第1天和第28天之间没有药物暴露的显著差异，和
(vi)在雄性和雌性之间没有药物暴露的显著差异。
这些特征表明，与依鲁替尼相比，化合物3具有低毒性、优良的药代动力学和优越的生物利用度。
mtor激酶抑制剂
哺乳动物雷帕霉素靶标(mtor)是充当细胞生长、增殖、代谢和凋亡的关键调节剂的蛋白激酶。在本发明的组合疗法中有用的mtor激酶的抑制剂包括、但不限于：
依维莫司，
雷帕霉素，
[7-(6-氨基-3-吡啶基)-2,3-二氢-1,4-苯并氧氮杂
n-乙基-n'-[4-[5,6,7,8-四氢-4-[(3s)-3-甲基-4-吗啉基]-7-(3-氧杂环丁基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-基]苯基]-脲(gdc-0349(genentech))，
3-(2,4-双((s)-3-甲基吗啉代)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基)-n-甲基苯甲酰胺(azd2014(astrazeneca))，
(5-(2,4-双((s)-3-甲基吗啉代)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-甲氧基苯基)甲醇(azd8055)，
gsk105965，
3-(2-氨基苯并[d]
坦罗莫司，
地磷莫司，
pi-103，
nvp-bez235，
wjd008，
xl765，
sf-1126，
torin1，
pp242，
pp30，
ku-0063794，
wye-354，
wye-687，
way-600，
ink128，
osi-027，
gedatolisib或pf-05212384(pfizer)，
cc-223(celgene)，
ly3023414(lilly)，
pqr309(piqur治疗剂)，
lxi-15029(luoxinpharma)，
sar245409(sanofi)，和
其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，依维莫司可以是优选的。依维莫司已经被美国食品和药品管理局批准由于治疗乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、肾血管肌脂瘤(angiomyolipoma)和结节性硬化症。另外，依维莫司已经在低剂量被用于治疗器官移植排斥，因为器官移植也会活化mtor。申请人考虑，本发明的组合疗法也可以用在这些背景下。
除了小分子以外，还可以使用其它化学实体，诸如mtor的反义rna、sirna、肽基抑制剂和抗体抑制剂。进一步，可以替代mtor抑制剂或在mtor抑制剂之外使用mtor介导的信号传递途径的其它成员的抑制剂。例如，可以替代mtor抑制剂或在mtor抑制剂之外使用磷酸肌醇磷脂3-激酶(pi3k)的抑制剂诸如btg226、gedatolisib、apitolisib、omipalisib、dactolisib、duvelisib和idelalisib。也可以替代mtor抑制剂或在mtor抑制剂之外使用akt(蛋白激酶b)的抑制剂诸如8-[4-(1-氨基环丁基)苯基]-9-苯基-2h-[1,2,4]三唑并[3,4-f][1,6]萘啶-3-酮；二盐酸盐(mk-2206)。
免疫调节药物
免疫调节药物(imid)是一类药物，其包括沙利度胺和它的结构和功能类似物。对于癌细胞而言，imid具有抗血管生成性质、抗增殖性质和促细胞凋亡性质。imid会刺激t淋巴细胞以诱导增殖、细胞因子产生和细胞毒性，从而增加t细胞的抗癌活性。imid可用于治疗多种炎症性疾病和自身免疫疾病。imid也可用于治疗肿瘤疾病，诸如血液学肿瘤，例如，多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征，以及某些实体瘤。与沙利度胺相比，imid诸如来那度胺、泊马度胺、cc-112(celgene)和cc-220(celgene)具有改善的效能和减少的副作用。
bcl-2抑制剂
b-细胞淋巴瘤2蛋白(bcl-2)是程序性细胞死亡(细胞凋亡)的一种重要调节剂。在本发明中有用的bcl-2抑制剂包括、但不限于：
venetoclax或abt-199(abbvie/genentech)，
bi-97c1或sabutoclax，
navitoclax，
奥巴克拉，
4-[4-[[2-(4-氯苯基)苯基]甲基]哌嗪-1-基]-n-[4-[[(2r)-4-(二甲基氨基)-1-苯硫基丁-2-基]氨基]-3-硝基苯基]磺酰基苯甲酰胺(abt-737)，
n-[4-(2-叔丁基苯基)磺酰基苯基]-2,3,4-三羟基-5-[(2-丙烷-2-基苯基)甲基]苯甲酰胺(tw-37)，
apg-1252(ascentagepharma)，
s55746(servier)，和
其药学上可接受的盐。
除了小分子以外，还可以使用其它化学实体，诸如bcl-2的反义rna、sirna、肽基抑制剂和抗体抑制剂。进一步，可以替代bcl-2抑制剂或在bcl-2抑制剂之外使用bcl-2介导的信号传递途径的其它成员的抑制剂。
另外的组合
本发明的组合疗法可以进一步与其它治疗剂组合，诸如topk抑制剂(例如，ots964((r)-9-(4-(1-(二甲基氨基)丙烷-2-基)苯基)-8-羟基-6-甲基噻吩并[2,3-c]喹啉-4(5h)-酮)(oncotherapyscience))、另一种酪氨酸激酶抑制剂(例如，阿昔替尼、达沙替尼、icotinib)、拓扑异构酶抑制剂(例如，托泊替康)、鞘氨醇-1-磷酸受体激动剂(例如，芬戈莫德、krp-203)、抗-t细胞免疫球蛋白(例如atgam)、抗-il-2受体抗体(例如达克珠单抗)、酰胺(ctx)、异环磷酰胺(ifo)、阿霉素(adm)、柔红霉素(dnr)、长春新碱(vcr)、长春碱(vbl)、依托泊苷(vp16)、vermeer(卫萌)、卡铂(cbp)和甲氨蝶呤(mtx)环孢素a、他克莫司、西罗莫司、依维莫司、硫唑嘌呤、布喹那、来氟米特、lea-29y、抗-cd3抗体(例如okt3)、阿司匹林、b7-cd28阻断分子(例如贝拉西普、阿巴他塞)、cd40-cd154阻断分子(抗-cd40抗体)、对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、吡罗昔康和抗炎类固醇(例如泼尼松龙或地塞米松)。
疾病
本发明的组合疗法可以治疗多种btk抑制在其中有益的病症。这些病症包括、但不限于(1)自身免疫疾病，诸如慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、炎性肠病、与慢性萎缩性胃炎有关的恶性贫血、古德帕斯彻氏综合征、寻常型天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化、急性特发性神经炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、全身性血管炎、硬皮病、天疱疮、混合性结缔组织病、多发性硬化、自身免疫性溶血性贫血和自身免疫性甲状腺疾病；(2)超敏反应疾病，诸如血清病、哮喘、变应性鼻炎、药物变态反应；和(3)炎性疾病，诸如角膜炎、鼻炎、口炎、腮腺炎、咽炎、扁桃体炎、气管炎、支气管炎、肺炎、心肌炎、胃炎、胃肠炎、胆囊炎和阑尾炎。所述疗法也可以用于治疗移植中的排斥。
本发明的组合疗法还可以用于治疗多种癌症，包括血液学恶性肿瘤诸如b-细胞恶性肿瘤，例如，小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、幼淋巴细胞白血病(prolymphocyticleukemia)(pll)、急性淋巴细胞白血病(all)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、richter氏综合征、弥漫性大b细胞性淋巴瘤(dlbcl)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(wm)、滤泡淋巴瘤(fl)、多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤(mcl))、边缘带淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。
在某些实施方案中，将本发明的组合疗法用作第一线疗法，以治疗尚未用另一种药物治疗相同病症的患者。在其它实施方案中，将本发明的组合疗法用作第二、第三或第四线疗法，其中患者没有成功地(例如，难治或复发)用另一种药物例如利妥昔单抗(其靶向b细胞上的cd20)、chop(环磷酰胺-羟基柔红霉素-安可平-泼尼松疗法)或利妥昔单抗+chop(r-chop)治疗相同病症。
药物组合物和施用
可以将本发明的组合疗法中的各种药物以被健康护理提供者认为适合患者的任意次序单独地施用给患者。它们还可以同时施用；或以杂合(hybrid)方式施用，也就是说，例如，同时施用各种药物中的两种，并与第三种药物分开。
还可以将所述组合疗法中的各种药物共配制或提供在药物试剂盒中。在某些实施方案中，所述共配制的药物组合物或所述药物试剂盒包含btk抑制剂、mtor抑制剂和imid作为活性成分。在其它实施方案中，所述共配制的药物组合物或所述药物试剂盒包含btk抑制剂、mtor抑制剂和bcl-2抑制剂作为活性成分。在其它实施方案中，所述共配制的药物组合物或所述药物试剂盒包含btk抑制剂、pi3k抑制剂和bcl-2抑制剂作为活性成分。在其它实施方案中，所述共配制的药物组合物或所述药物试剂盒包含btk抑制剂、pi3k抑制剂和imid作为活性成分。在某些实施方案中，所述共配制的药物组合物或所述药物试剂盒包含两种或三种选自btk抑制剂、mtor激酶抑制剂、imid、bcl-2抑制剂和pi3k抑制剂的化合物作为活性成分。
本发明还包括前述活性成分的组合，其用于治疗btk抑制在其中有益的疾病，包括、但不限于癌症诸如淋巴样恶性肿瘤(例如，上面列举的b-细胞恶性肿瘤)和免疫障碍诸如自身免疫疾病和炎症。在本发明中进一步包括前述活性成分的组合在制备用于治疗这些疾病的药物中的用途。
可以使用常用于药物制备的载体、赋形剂和其它添加剂来制备含有本发明的活性成分或其药学上可接受的盐的药物组合物。
施用形式可以是口服剂型，诸如片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉末剂(powder)、乳剂、糖浆剂、混悬剂、液体制剂；或非口服剂型，诸如用于静脉内、皮下或肌肉内注射、栓剂、透皮植入或吸入的形式。应当考虑患者的症状、年龄、性别、重量和其它有关的医学信息，以便适当地确定药物的剂量。一般而言，对于口服施用，成年患者的药物的每日剂量是约0.001mg/kg至100mg/kg，每天以单个剂量或分成每天的2-4个亚剂量施用；对于静脉内施用，成年患者的每日剂量是0.0001mg/kg至10mg/kg，每天施用一次或多次。
在本发明中，用于口服施用的固体组合物可以是片剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂等。在这样的固体组合物中，可以将一种或多种活性物质与至少一种惰性赋形剂(例如，乳糖、甘露醇、葡萄糖、羟丙基纤维素、微晶纤维素、淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮、硅酸镁铝等)混合。所述组合物可以含有惰性添加剂诸如润滑剂(例如硬脂酸镁)、崩解剂(例如，羧甲基淀粉钠)和溶出助剂。如果必要的话，可以给片剂或丸剂涂布适当的包衣诸如糖包衣或胃或肠溶包衣剂。
用于口服施用的液体组合物包括药学上可接受的乳剂、溶液、水性或油性混悬剂、糖浆剂、酏剂和常用惰性稀释剂(例如，净化水和乙醇)。除了惰性稀释剂以外，所述组合物还可以含有添加剂诸如增溶剂、润湿剂、助悬剂和甜味剂、矫味剂、矫味剂和防腐剂。
用于胃肠外施用的注射剂可以包括无菌的水性或非水性液体制剂、混悬剂和乳剂。稀的水性溶液可以包括蒸馏水和生理盐水。非水性的稀溶液可以包括丙二醇、聚乙二醇、植物油、醇(例如，乙醇)和聚山梨酯80。这样的组合物可以进一步含有等渗剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂、溶解助剂等。通过穿过细菌截留滤器过滤、加入杀细菌剂或辐照，可以将所述组合物灭菌。另外，可以将这些组合物制成无菌的固体组合物并在使用前溶解或悬浮在无菌水或注射用无菌溶剂中。
用于透粘膜施用(诸如吸入和鼻吸收)的药物组合物可以是固体、液体或半固体使用状态，且可以根据常规方法制备。例如，可以加入赋形剂诸如乳糖、淀粉、ph调节剂、防腐剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂和增稠剂等。可以使用合适的吸入或吹入装置。例如，可以使用计量剂量吸入器装置。增压的气溶胶喷雾还可以与合适的推进剂(例如，氯氟烷烃、氢氟烷烃或合适的气体诸如二氧化碳)一起使用。
以下实施例意图例证本发明的方法和材料。本领域技术人员显而易见的本领域中通常遇到的所述条件和参数的合适修改和适应是在本发明的精神和范围内。
工作实施例
实施例1-btk抑制剂的合成
化合物1和化合物2
1-((r)-3-(4-氨基-3-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮
1-((s)-3-(4-氨基-3-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮
步骤a：
将碳酸钾(68.0g,492.1mmol,2.0当量)和化合物1,2,3,4,5-五氟苯(49.6g,295.3mmol,1.2当量)加入3-氟-4-溴苯酚(47.0g,246.1mmol,1.0当量)在dmf(500ml)中的溶液中。将反应物在100℃搅拌12小时。在减压下除去溶剂。将残余物溶解在乙酸乙酯(300ml)中，用水(100ml)和盐水(100ml×2)洗涤。将有机相经无水硫酸钠干燥，并浓缩以得到标题化合物(78g,收率：93％)。
步骤b：
将3-(4-溴-3-氟苯氧基)-1,2,4,5-四氟苯(73g,215.3mmol,1.0当量)、双(频哪醇合)二硼(65.6g,258.4mmol,1.2当量)、乙酸钾(31.6g,322.9mmol,1.5当量)和(dppf)pdcl2(9.4g,12.8mmol,0.06当量)加入1,4-二
步骤c：
将nis(250g,1.11mol,1.5当量)加入1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(100g,0.74mol,1.0当量)在dmf(800ml)中的溶液中。将反应物在氮气下在80～85℃搅拌16小时。将反应混合物过滤。将滤饼用乙醇(1000ml×3)洗涤以得到标题化合物(184g,收率：95％)。
步骤d：
在0℃将三乙胺(15g,150mmol,3.0当量)和甲磺酰氯(6.3g,55mmol,1.1当量)依次逐滴加入3-羟基-哌啶-1-甲酸酯(10.0g,50mmol,1.0当量)在二氯甲烷(100ml)中的溶液中。将反应物在20℃搅拌1小时，然后用饱和的nahco3(100ml)猝灭。将得到的混合物用二氯甲烷(200ml×3)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩以得到标题化合物(13g,收率：95％)。
步骤e：
在0℃将碳酸铯(20.2g,62mmol,2.0当量)和3-(甲基磺酰氧基)哌啶-1-甲酸酯(13g,46.5mmol,1.5当量)加入3-碘-1h-吡唑并[3,4-d]-嘧啶-4-胺(8.1g,31mmol,1.0当量)在dmf(50ml)中的溶液中。将反应物在80℃搅拌过夜。冷却至室温以后，将混合物穿过硅藻土过滤，并在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱法(洗脱液:乙酸乙酯)纯化以得到标题化合物(5g,收率：25％)。
步骤f：
将3-(4-氨基-3-碘-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(7.6g,17.1mmol,1.0当量)、2-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(8.6g,22.3mmol,1.3当量)、磷酸钾(7.3g,34.2mmol,2.0当量)和pd-118(0.56g,0.855mmol,0.05当量)加入1,4-二
步骤g：
在0℃将hcl/etoac(20ml,4mol/l)加入3-(4-氨基-3-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(6.8g,11.8mmol)在乙酸乙酯(50ml)中的溶液中。将反应物在室温搅拌1小时，然后浓缩以得到标题化合物盐酸盐(5.2g,收率：86％)。
步骤h：
在0℃将三乙胺(887mg,8.7mmol,3.0当量)和丙烯酰氯(0.26g,2.9mmol,1.0当量)依次逐滴加入3-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-1-(哌啶-3-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(1.5g,2.9mmol,1.0当量)在二氯甲烷(10ml)中的溶液中。将反应物在0℃搅拌1小时，用水(5ml)猝灭，用二氯甲烷(50ml)稀释，并用水(30ml×2)和饱和盐水(30ml)洗涤。将有机相经无水硫酸钠干燥并浓缩以得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱法纯化以得到标题化合物(洗脱液:石油醚:乙酸乙酯＝1:0～1:1)(0.94g,收率：64％)。
lc/ms(方法:uflc):rt＝3.130min；m/z＝531.1[m+h]+；总运行时间＝7.000min。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.22(s,1h),8.00-7.91(m,1h),7.55-7.46(m,1h),7.27(dd,j＝2.4,10.8hz,1h),7.12(dd,j＝2.4,8.8hz,1h),6.88-6.65(m,1h),6.13-6.02(m,1h),5.70-5.56(m,1h),4.71-4.65(m,1h),4.54-4.51(m,0.5h),4.20-4.17(m,1h),4.07-4.04(m,0.5h),3.67-3.60(m,0.5h),3.17-3.12(m,1h),2.98-2.94(m,0.5h),2.26-2.21(m,1h),2.11-2.06(m,1h),1.92-1.89(m,1h),1.58-1.54(m,1h)。
步骤i：
将外消旋体1-(3-(4-氨基-3-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮(750mg)通过sfc手性拆分(co2:c2h5oh(0.2％dea),v/v,200ml/min)分离以得到化合物11-((r)-3-(4-氨基-3-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮(280mg,ee:100％)和化合物21-((s)-3-(4-氨基-3-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮(330mg,ee:98％)。
化合物1：
lc/ms(方法:uflc):rt＝3.002min；m/z＝531.1[m+h]+；总运行时间＝7.000min。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.36(s,1h),7.58(t,j＝8.4hz,1h),7.09-7.04(m,1h),6.94-6.88(m,2h),6.62-6.54(m,1h),6.32-6.25(m,1h),5.73-5.63(m,1h),5.56-5.51(m,1h),4.90-4.85(m,1.5h),4.59-4.56(m,0.5h),4.21-4.17(m,0.5h),4.04-4.01(m,0.5h),3.76-3.71(m,0.5h),3.40-3.35(m,0.5h),3.22-3.15(m,0.5h),2.93-2.87(m,0.5h),2.39-2.27(m,2h),2.04-1.68(m,2h)。
化合物2：
lc/ms(方法:uflc):rt＝3.006min；m/z＝531.1[m+h]+；总运行时间＝7.000min。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.24(s,1h),7.62(t,j＝8.4hz,1h),7.50-7.45(m,1h),7.09-7.01(m,2h),6.85-6.63(m,1h),6.21-6.09(m,1h),5.77-5.61(m,1h),4.63-4.59(m,1h),4.23-4.07(m,1.5h),3.90-3.85(m,0.5h),3.51-3.45(m,0.5h),3.34-3.17(m,1.5h),2.40-2.23(m,2h),2.08-2.05(m,1h),1.75-1.71(m,1h)。
化合物3
方法1：
步骤a：
在0℃和在氮气气氛下将diad(27.6g,137.5mmol,1.5当量)逐滴加入3-碘-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(24g,92mmol,1.0当量)、(s)-3-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(26g,137.5mmol,1.5当量)和pph3(36g,137.5mmol,1.5当量)在四氢呋喃(720ml)中的混合物中。将反应物在0℃搅拌1小时，然后在室温搅拌过夜。在减压下除去溶剂以后，将乙腈(200ml)加入残余物。将混合物在室温搅拌2小时并过滤。将滤饼用乙腈(20ml)洗涤并干燥以得到标题化合物(25g,收率：63％)。
步骤b：
将(r)-3-(4-氨基-3-碘-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(25g,58mmol,1.0当量)、2-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(30g,75.4mmol,1.3当量)、磷酸钾(25g,116mmol,2.0当量)和pd-118(750mg,1.16mmol,0.02当量)加入1,4-二
步骤c：
在0℃将hcl/etoac(100ml,4mol/l)加入(3r)-3-(4-氨基-3-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(60g,粗制物)在乙酸乙酯(100ml)中的溶液中。将反应物在室温搅拌1小时并浓缩至干燥以得到标题化合物的盐酸盐。将水(500ml)加入反应烧瓶中，用乙酸乙酯(300ml×3)萃取。将水相调至ph＝9，然后用乙酸乙酯(300ml×3)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩以得到标题化合物(24g,两步收率：90％)。
步骤d：
在-5℃将naoh(10％,94ml)加入3-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-1-((r)-吡咯烷-3-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(.23.5g,50.75mmol,1.0当量)在四氢呋喃(470ml)中的溶液中，然后逐滴加入丙烯酰氯(5.97g,66mmol,1.3当量)。将反应物在-5℃搅拌1小时，用饱和盐水(100ml)猝灭，并用乙酸乙酯(200ml×3)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥，并浓缩以得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱法(洗脱液:石油醚:乙酸乙酯＝1:3～1:1)纯化。将得到的产物溶解在甲醇(500ml)中并过滤。将水(1500ml)加入搅拌的滤液中，搅拌2小时并过滤。将滤饼在减压下干燥以得到标题化合物(16.5g,收率：63％)。
lc/ms(方法:uflc):rt＝3.764min；m/z＝517.0[m+h]+；总运行时间＝7.000min.。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.45(s,1h),7.70(t,j＝8.4hz,1h),7.55-7.46(m,1h),7.12-7.05(m,2h),6.70-6.55(m,1h),6.33-6.26(m,1h),5.81-5.75(m,1h),4.23-3.83(m,5h),2.68-2.55(m,2h)。
方法2：
在0℃将naoh(216mg,5.40mmol,2.5当量)加入3-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-1-((r)-吡咯烷-3-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(1.0g,2.16mmol,1.0当量)在四氢呋喃(50ml)和水(10ml)中的溶液中，然后逐滴加入氯丙酰氯(288mg,2.27mmol,1.05当量)在四氢呋喃(10ml)中的溶液。将反应物在0℃搅拌1小时，然后在60℃搅拌12小时。冷却至室温以后，加入饱和盐水(10ml)，然后用乙酸乙酯(50ml×3)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥，并浓缩以得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱法(洗脱液:石油醚:乙酸乙酯＝1:3～1:1)纯化以得到化合物3(0.8g,收率：71％)。
方法3：
将(r)-1-(3-(4-氨基-3-碘-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮(100g,0.26mmol,1.0当量)、2-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(120mg,0.31mmol,1.2当量)、碳酸钠(55mg,0.52mmol,2.0当量)和pd(pph3)4(30mg,0.026mmol,0.01当量)加入1,4-二
方法4：
化合物3和化合物4
步骤a：
在0℃将三乙胺(35g,346mmol,2.1当量)加入3-羟基-吡咯烷-1-甲酸酯(30.0g,163mmol,1.0当量)在二氯甲烷(200ml)中的溶液中，然后逐滴加入甲基氯(36.6g,321mmol,1.9当量)。将反应物在0℃搅拌3小时，用水(100ml)猝灭，用水(20ml×2)和饱和盐水(100ml)洗涤。将有机相经无水硫酸钠干燥并浓缩以得到标题化合物(45.6g,收率：100％)。
步骤b：
将碳酸铯(37g,115mmol,3.0当量)和化合物3-碘-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(10g,38mmol,1.0当量)加入3-(甲基磺酰氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(35g,134mmol,3.5当量)在dmf(300ml)中的溶液中。将反应物在85℃搅拌12h。冷却至室温以后，将混合物过滤。将滤液浓缩以得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱法(洗脱液:石油醚:乙酸乙酯＝1:1)纯化以得到标题化合物(7.0g,收率：44％)。
步骤c：
将3-(4-氨基-3-碘-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(8g,18mmol,1.0当量)、2-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(10.7g,27mmol,1.5当量)、磷酸钾(7.6g,36mmol,2.0当量)和pd-118(1.2g,1.8mmol,0.1当量)加入1,4-二
步骤d：
在0℃将hcl/etoac(20ml,4mol/l)加入3-(4-氨基-3-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(2.5g,4.4mmol)在二氯甲烷(20ml)中的溶液中。将反应物在室温搅拌1小时，然后在减压下浓缩以得到标题化合物盐酸盐(2.2g,收率：100％)。
步骤e：
将三乙胺(1.4g,12.8mmol,3.0当量)加入3-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-1-(吡咯烷-3-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(2.2g,4.4mmol,1.0当量)在二氯甲烷(50ml)中的溶液中，然后在0℃逐滴加入丙烯酰氯(0.38g,4.2mmol,0.95当量)。将反应物在0℃搅拌1小时并用水(30ml)猝灭。将水相用二氯甲烷(30ml×3)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥并浓缩以得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱法(洗脱液:乙酸乙酯)纯化以得到标题化合物(1.0g,收率：45％)。
lc/ms(方法:uflc):rt＝2.810min；m/z＝517.1[m+h]+；总运行时间＝7.000min。
步骤f：
将外消旋体1-(3-(4-氨基-3-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮通过sfc手性拆分分离以得到化合物3(280mg)和化合物4(320mg)。
化合物4：
lc/ms(方法:uflc):rt＝2.808min；m/z＝517.1[m+h]+；总运行时间＝7.000min。
化合物5
步骤a：
将1-氟-3-硝基苯(29.6g,210mmol,1.0当量)和碳酸钾(58g,420mmol,2.0当量)加入3-氟-4-溴苯酚(40g,210mmol,1.0当量)在dmf(400ml)中的溶液中。将反应物在氮气氛下在90℃搅拌12小时。在减压下除去溶剂以后，将水(300ml)加入残余物中，并然后用乙酸乙酯(300ml×3)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥并浓缩以得到标题化合物(65g,收率：100％)。
步骤b：
将氯化铵(28g,525mmol,2.5当量)和铁粉(58.8g,1.05mol,5.0当量)加入1-溴-2-氟-4-(3-硝基苯氧基)苯(65g,210mmol,1.0当量)在乙醇(300ml)和水(60ml)中的溶液中。将反应溶液在氮气下回流12小时。冷却至室温以后，将混合物穿过硅藻土过滤。将滤液浓缩以得到粗产物，将其通过hplc(c18反相柱,流动相:乙腈/水/0.7％nh4hco3,洗脱液梯度10％-100％(体积比))纯化。除去挥发性溶剂以后，将期望的级分低压冻干以得到标题化合物(19g,收率：23％)。
步骤c：
在-10℃将3-(4-溴-3-氟苯氧基)苯胺(9g,32mmol,1.0当量)分份加入吡啶-氟化氢溶液(30ml)。将得到的反应混合物在0℃搅拌30分钟，冷却至-10℃，然后逐份加入亚硝酸钠(2.42g,35mmol,1.1当量)。将反应物在20℃搅拌30分钟，然后在60℃搅拌14小时。冷却至室温以后，将混合物倒入冰-乙醇(50ml)中，用饱和nahco3溶液(50ml)稀释，然后用乙酸乙酯(50ml×3)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥并浓缩以得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱法(洗脱液:石油醚)纯化以得到标题化合物(5.8g,收率：64％)。
步骤d：
将1-溴-2-氟-4-(3-氟苯氧基)苯(5.8g,20mmol,1.0当量)、双(频哪醇合)二硼(6.1g,24mmol,1.2当量)、乙酸钾(3.9g,40mmol,2.0当量)和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.89g,1.2mmol,0.06当量)溶解在1,4-二
步骤e：
将(r)-3-(4-氨基-3-碘-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(6.5g,15.0mmol,1.0当量)、2-(2-氟-4-(3-氟苯氧基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(6.5g,19.6mmol,1.3当量)、磷酸钾(6.4g,30.1mmol,2.0当量)和pd-118(0.25g,0.39mmol,0.01当量)加入1,4-二
步骤f：
在0℃将hcl/ea(10ml,4mol/l)加入(3r)-3-(4-氨基-3-(2-氟-4-(3-氟苯氧基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(4.2g,8.27mmol)在二氯甲烷(15ml)中的溶液中。将反应物在室温搅拌1小时，然后在减压下浓缩以得到标题化合物盐酸盐(3.7g,收率：92％)。
步骤g：
在0℃将氢氧化钠(10％,15.3ml)和丙烯酰氯(0.67g,7.44mmol,0.9当量)依次逐滴加入3-(2-氟-4-(3-氟苯氧基)苯基)-1-((r)-吡咯烷-3-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(3.7g,8.27mmol,1.0当量)在四氢呋喃(20ml)中的溶液中。将反应物在室温搅拌10分钟，用饱和的nahco3(20ml)猝灭，并用二氯甲烷(30ml×3)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥并浓缩以得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱法(洗脱液:石油醚:乙酸乙酯＝1:0至1:1)纯化以得到标题化合物(2.5g,收率：65％)。
lc/ms(方法:uflc):rt＝3.178min；m/z＝463.0[m+h]+；总运行时间＝7.000min。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.36(s,1h),7.53-7.49(m,1h),7.40-7.35(m,1h),6.95-6.81(m,4h),6.41-6.39(m,2h),5.69-5.55(m,3h),4.14-3.98(m,3h),3.78-3.72(m,1h),2.71-2.54(m,2h)。
化合物6
步骤a：
将丙炔酸(1g,14.28mmol,1.0当量)和hbr(40％水溶液,1.7ml,0.88当量)的混合物在140℃搅拌过夜。将溶剂在减压下蒸馏出。将得到的粗产物从水(4ml×3)结晶以得到标题化合物(0.76g,收率：35％)。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.76(d,j＝14hz,1h),6.55(d,j＝14hz,1h)。
步骤b：
在0～5℃将na-hg(6g,49.67mmol,2.5当量)加入(e)-3-溴丙烯酸(3g,19.87mmol,1.0当量)在d2o(30ml)中的溶液中。将反应物在室温搅拌36小时。将水相用1m盐酸调至ph＝5，然后用乙醚(20ml×5)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩以得到标题化合物(0.52g,收率：36％)。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.76(d,j＝17.2hz,1h),6.55(d,j＝17.2hz,1h)。
步骤c：
将(e)-3-氘丙烯酸(76mg,1.08mmol,1.0当量)、hatu(530mg,1.40mmol,1.3当量)和n,n-二异丙基乙胺(419mg,3.24mmol,3.0当量)加入3-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-1-((r)-吡咯烷-3-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(500mg,1.08mmol,1.0当量)在二氯甲烷(50ml)中的溶液中。将反应物在室温搅拌12小时，并浓缩以得到粗产物，将其通过hplc-分离(仪器:lc8a&gilson215,级分收集柱:synergimax-rp150*30mm*4u,流动相a:水(0.5％hcl),流动相b:乙腈,流速:30ml/min,梯度b:36％～37％,0～17分钟)纯化。除去挥发性溶剂以后，将期望的级分低压冻干以得到标题化合物盐酸盐(76mg,收率：13％)。
lc/ms(方法:uflc):rt＝2.765min；m/z＝518.1[m+h]+；总运行时间＝7.000min。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.41(s,1h),7.66(t,j＝8.4hz,1h),7.51-7.44(m,1h),7.09-7.01(m,2h),6.66-6.56(m,1h),6.28-6.23(m,1h),5.75-5.66(m,1h),4.19-4.16(m,1h),4.06-4.02(m,1.5h),3.89-3.85(m,1h),3.78-3.72(m,0.5h),2.63-2.49(m,2h)。
化合物7
步骤a：
将丙炔酸(1g,14.28mmol,1.0当量)和hbr(40％水溶液,1.7ml,0.88当量)的混合物在55℃搅拌过夜。将溶剂在减压下蒸馏出。将得到的粗产物从石油醚(4ml×3)结晶以得到标题化合物(0.3g,收率：14％)。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.16(d,j＝8.4hz,1h),6.67(d,j＝8.4hz,1h)。
步骤b：
在0～5℃将na-hg(6g,49.67mmol,2.5当量)加入(z)-3-溴丙烯酸(3g,19.87mmol,1.0当量)在d2o(30ml)中的溶液中。将反应物在室温搅拌36小时。将水相用1m盐酸调至ph＝5，然后用乙醚(20ml×5)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩以得到标题化合物(0.34g,收率：23％)。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.14(d,j＝10.4hz,1h),5.96(d,j＝10.4hz,1h)。
步骤c：
将(z)-3-氘丙烯酸(151mg,2.16mmol,1.0当量)、hatu(1.06g,2.80mmol,1.3当量)和n,n-二异丙基乙胺(838mg,6.48mmol,3.0当量)加入3-(2-氟-4-(2,3,5,6-四氟苯氧基)苯基)-1-((r)-吡咯烷-3-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(1.0g,2.16mmol,1.0当量)在二氯甲烷(50ml)中的溶液中。将反应物在室温搅拌12小时，并浓缩以得到粗产物，将其通过hplc-分离(仪器:lc8a&gilson215,级分收集柱:synergimax-rp150*30mm*4u,流动相a:水(0.5％hcl),流动相b:乙腈,流速:30ml/min,梯度b:36％～37％,0～17分钟)纯化。除去挥发性溶剂以后，将期望的级分低压冻干以得到标题化合物盐酸盐(228mg,收率：20％)。
lc/ms(方法:uflc):rt＝2.775min；m/z＝518.1[m+h]+；总运行时间＝7.000min。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.45(s,1h),7.70(t,j＝8.4hz,1h),7.52-7.46(m,1h),7.13-7.05(m,2h),6.71-6.61(m,1h),5.80-5.73(m,2h),4.23-4.20(m,1h),4.09-4.04(m,1.5h),3.93-3.90(m,1h),3.80-3.75(m,0.5h),2.67-2.56(m,2h)。
化合物20
将3-[2-氟-4-(3-氟苯氧基)苯基]-1-[(3r)-吡咯烷-3-基]吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(200.00mg,489.72umol,1.00当量)、丁-2-炔酸(41.17mg,489.72umol,1.00当量)、hatu(93.10mg,244.86umol,0.50当量)和dipea(75.95mg,587.66umol,102.64ul,1.20当量)在dcm(5.00ml)中的混合物在15-18℃搅拌2小时。tlc表明起始原料耗尽。将混合物蒸发至干燥。将残余物通过制备型hplc(柱：bostongreenods150*305u；流动相:乙腈/水/0.05％hcl,梯度:22％-52％(体积比),时间:12min)纯化以得到作为盐酸盐的标题化合物(82.00mg,收率：32.77％)。
lc/ms(方法:uflc):rt＝3.057min；m/z＝475.0[m+h]+；总运行时间7.000min。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.92(s,1h),8.34(d,j＝8.8hz,1h),7.56(br,1h),7.41-7.36(m,1h),7.00-6.86(m,5h),6.58(br,1h),5.62-5.58(m,1h),4.22-3.74(m,4h),2.65-2.50(m,2h),2.02-1.96(m,3h)。
实施例2-体外测定
btk激酶活性的抑制测定：
btk野生型标准htrf测定的酶反应混合物含有在缓冲液中的1nmbtk野生型、1μm生物素-tk1肽和30μmatp。在室温进行酶反应60分钟。将5μl0.2medta加入以猝灭反应，并然后以2nm抗体和62.5nmxl665的终浓度加入抑制剂(5μl)。将平板在室温温育60分钟，并然后在envision平板读数器中读出。将读出值通过(minratio)/(max-min)*100％的方程式转化成抑制率％。因此，使用4参数曲线拟合产生试验化合物的ic50数据。
表2代表性化合物的测定数据
肿瘤细胞活性的抑制测定：
将肿瘤细胞(tmd-8、dohh2和wsu-dlcl2)转移和附着于96-孔平板。一夜以后，加入空白缓冲液和选定浓度(0.01nm-100μm)的试验化合物溶液。温育48小时以后，加入celltiter-go以裂解细胞。记录发光信号并计算细胞生存力的抑制百分比。
表3各种化合物对tmd-8细胞系的抑制(inh％)
注：avg：平均值；sd：标准差
下面的表4证实，二元组合具有显著的肿瘤细胞生存力抑制。化合物8和13的组合、化合物14和13的组合、化合物15和13的组合以及化合物3和13的组合已经表现出对tmd-8细胞的最高抑制活性。
表4“二合一”组合物对tmd-8细胞系的抑制(inh％)
下面的表5证实，三元组合具有显著的肿瘤细胞生存力抑制。化合物3、14和12的组合以及化合物3、8和12的组合已经表现出高达95％的最高抑制活性，对于化合物3甚至在低至10nm的浓度。
表5“三合一”组合物对tmd-8细胞系的抑制(inh％)
下面的表6证实，化合物3、14和15的三元组合对多种药物抗性的wsu-dlcl2肿瘤细胞是有效的，优于单独的每种单一试剂。
表6各种化合物和“三合一”组合物对抗性的wsu-dlcl2细胞系的抑制(inh％)
下面的表7证实，化合物3、14和15的三元组合对更难以治疗的dohh-2肿瘤细胞是有效的，优于单独的每种单一试剂。
表7各种化合物和“三合一”组合物对dohh-2细胞系的抑制(inh％)
表8证实，化合物3、14和15的三元组合(在每种单一试剂的不同剂量)都对敏感的tmd-8肿瘤细胞是有效的。
表8具有不同比例的组合物对tmd-8细胞系的抑制(inh％)
实施例3-体内测定
在雄性sd大鼠中的药代动力学研究：将用于24小时内药代动力学研究的雄性sd大鼠分成两组：静脉内施用和口服施用。每组具有3只动物。对于静脉内施用组，在给药前、给药后0.0833、0.167、0.5、1、2、4、8、24h收集血液样品；对于口服施用组，在给药前、给药后0.167、0.5、1、2、4、8、24h收集血液样品。血液收集以后，应用hplc-ms/ms以确定化合物的血浆浓度。静脉内组的计算的药代动力学参数包括平均血浆清除率(clp)、平均表观稳态分布容积(vdss)、0-24h曲线下面积(auc)、0-24h平均停留时间(mrt)、半衰期(t1/2)；口服组计算的药代动力学参数包括平均峰浓度(cmax)、0-24h曲线下面积(auc)、0-24h平均停留时间(mrt)；该研究的平均相对生物利用度。
在比格犬中的药代动力学研究：将用于24小时内药代动力学研究的比格犬分成两组：静脉内施用(1mg/千克)和口服施用(3mg/千克)。每组具有3只动物。对于静脉内施用组，在给药前、给药后0.033、0.083、0.25、0.5、1、3、6、9、24h收集血液样品；对于口服施用组，在给药前、给药后0.083、0.25、0.5、1、3、6、9、24h收集血液样品。血液收集以后，应用hplc-ms/ms以确定化合物的血浆浓度。静脉内组计算的药代动力学参数包括平均血浆清除率(clp)、平均表观稳态分布容积(vdss)、0-24h曲线下面积(auc)、0-24h平均停留时间(mrt)、半衰期(t1/2)；口服组的计算的药代动力学参数包括平均峰浓度(cmax)、0-24h曲线下面积(auc)、0-24h平均停留时间(mrt)；该研究的平均相对生物利用度。
表9化合物3在大鼠中的pk参数
表10化合物3在狗中的pk参数
下面的表11表明，化合物3在大鼠中的auc显著高于依鲁替尼的auc(美国fda的nda申请号205552orig1s000_药理学综述)。
表11化合物3在大鼠中的tk数据
下面的表12表明，化合物3在狗中的auc显著高于依鲁替尼的auc(美国fda的nda申请号205552orig1s000_药理学综述)。
表12化合物3在狗中的tk数据
体内肿瘤生长抑制研究：
通过软件将scid小鼠或裸鼠(在实验开始时体重约18g)随机地分成组以便达到各组之间的接近平均重量并控制偏差(bias)在可允许的范围内。给小鼠注射btk细胞系(tmd-8、wsu-dlcl2和dohh-2)用于肿瘤形成。每天1次或每天2次口服地施用抑制剂，共14天、21天或28天。记录体重和肿瘤体积。
接种了tmd-8或dohh2或wsu-dlcl2肿瘤细胞系的异种移植物肿瘤模型：
tmd-8是一种敏感的人弥漫性大b细胞性淋巴瘤细胞系，且dohh2是一种更难以治疗的人滤泡淋巴瘤细胞系，而wsu-dlcl2是一种多药耐药(mdr)人非霍奇金淋巴瘤细胞系。与单独的单一靶向试剂相比，药物组合疗法会在所有三种肿瘤模型中提供更好的效能。
针对雌性cb-17scid小鼠中的异种移植物模型的肿瘤生长评价了化合物(化合物3、9、14和如在图表中所示的其它化合物)和它的组合。将tmd-8、dohh2、wsu-dlcl2肿瘤细胞在37℃在含5％co2的空气下在补充了10％热灭活的胎牛血清的rpmi-1640培养基中在体外维持为悬浮培养物。每周将肿瘤细胞常规地传代培养2次。将生长在指数生长期的细胞收获并计数用于肿瘤接种。给每只小鼠在右胁腹皮下地接种在0.2ml含matrigel的pbs(1:1)中的肿瘤细胞(10×106)用于肿瘤产生。在平均肿瘤大小达到约100-200mm3以后，开始所述治疗。每组由6-10只荷瘤小鼠组成。根据预定剂量将试验物品(媒介物、化合物或组合)口服地施用给小鼠14天或21天。在治疗中每2或3天测量动物体重和肿瘤体积。
佐剂诱导的关节炎aa模型：
在雌性lewis大鼠中在佐剂诱导的关节炎(aa)模型中评价了化合物3和14的组合。在第0天用完全弗氏佐剂(cfa)在左后爪处皮下地免疫除了正常组以外的所有大鼠以诱导关节炎。在免疫接种后6天，一些大鼠开始表现出关节炎的临床征状，例如红斑和肿胀。在第13天，基于体重和临床评分，将免疫的动物重新分组成7组，包括媒介物、化合物3(5mg/kg)/化合物14(0.5mg/kg)每天2次治疗、化合物3(15mg/kg)/化合物14(1.5mg/kg)每天2次治疗、化合物3(30mg/kg)/化合物14(3mg/kg)每天1次治疗、化合物3(5mg/kg)每天2次治疗、化合物14(0.5mg/kg)每天2次治疗和阳性对照(化合物11，3mg/kg，每天2次治疗)组。口服地施用所述治疗3个连续周。在研究过程中，第13天以后每隔一天监测体重、爪体积和临床评分。在终点，收集右后爪用于使用h.e.染色的组织病理学分析。
胶原诱导的关节炎(cia)模型：
在雄性dba/1小鼠中在胶原诱发的关节炎(cia)小鼠模型中评价了化合物3和12的组合。将所述动物分成8组，包括正常组、媒介物组、5个治疗组：在第0天和第21天用200μg牛胶原(ii型)免疫所有动物(除了正常组以外)。强化免疫接种以后7天(第28天)，动物开始表现出疾病征状，具有约1的平均临床评分。在同一天，将免疫的小鼠随机分成7组：化合物3(1.5mg/kg)和化合物14(0.15mg/kg)组合疗法每天2次组、化合物3(4.5mg/kg)和化合物14(0.45mg/kg)组合疗法每天2次组、化合物3(1.5mg/kg)和化合物14(0.15mg/kg)组合疗法每天1次组、化合物3(1.5mg/kg)单独治疗每天1次组、化合物14(0.15mg/kg)单独治疗每天1次组和阳性对照组(0.2mg/kg地塞米松)，并开始给药和治疗。口服施用治疗2个连续周。在研究中监测体重和临床评分(在第二次免疫接种以后开始每周记录3次)。在研究结束时，将动物安乐死并将两个后爪收集用于组织病理学分析。
如在图4中所示，尽管mtor激酶抑制剂(例如，化合物14)的使用在15天的治疗以后导致tmd-8弥漫性大b细胞性淋巴瘤(dlbcl)小鼠模型中的肿瘤消失，但是治疗以后回弹的肿瘤在第15天以后停止。令人惊奇地，当与btk抑制剂(例如，化合物3)组合地施用mtor激酶抑制剂时，没有观察到肿瘤回弹。与此相比，如在图2-4中所示，当施用btk抑制剂和imid(例如，化合物15和16)的组合时，当施用btk抑制剂和pi3k激酶抑制剂(例如，化合物8)的组合时，当施用imid和pi3k激酶抑制剂的组合时，或当施用btk抑制剂、imid和pi3k激酶抑制剂的组合时，dlbcl肿瘤没有消失。
如在图5中所示，btk抑制剂(例如，化合物3)、mtor激酶抑制剂(例如，化合物14)和imid(例如，化合物15)的三元组合在9天的治疗以后导致tmd-8小鼠模型中的肿瘤消失，且意外地，所述肿瘤在第12天以后停止治疗以后没有回弹，且在21-天阶段的剩余时间中观察到完全消退。
如在图12中所示，btk抑制剂(例如，化合物3)、mtor激酶抑制剂(例如，化合物14)和bcl-2抑制剂(例如，化合物12)的三元组合在8天的治疗以后导致tmd-8小鼠模型中的肿瘤消失，且意外地，所述肿瘤在停止治疗以后没有回弹，且在14-天阶段的剩余时间中观察到完全消退。与此相比，当仅组合施用mtor激酶抑制剂和bcl-2抑制剂时，当仅组合施用btk抑制剂和bcl-2抑制剂时，或当与pi3k激酶抑制剂(例如，化合物8)组合施用btk抑制剂和bcl-2抑制剂时，dlbcl肿瘤没有消失。
如在图6和7中所示，在控制dohh2滤泡淋巴瘤(fl)小鼠模型中的肿瘤生长方面，btk抑制剂(例如，化合物3)和mtor激酶抑制剂(例如，化合物14)的施用表现得好于单独btk抑制剂的施用。令人惊奇地，当与imid(例如，化合物15)组合施用btk抑制剂和mtor激酶抑制剂时，dohh2小鼠模型中的肿瘤生长降低至最小水平。在两个单独实验中再现了这样的协同效应(图6和7)。
如在图8中所示，化合物3在wsu-dlcl2非霍奇金淋巴瘤小鼠模型中的效力与依鲁替尼(一种fda批准的btk抑制剂)的效力相一致。如在图9中所示，btk抑制剂(例如，化合物3)、mtor激酶抑制剂(例如，化合物14)和imid(例如，化合物15)的组合(对于组合的所有三种药物，共计21mg/kg/天)能够减少wsu-dlcl2小鼠模型中的肿瘤生长。与此相比，ezh2抑制剂epz-6438(其正在经历临床试验)仅通过在非常高的480mg/kg/天的剂量管饲给小鼠实现了对wsu-dlcl肿瘤类似的作用(参见knutson等人,mol.cancerther.,2014,13:842-854,图4a)。
此外，图10证实，三元组合疗法对tmd-8弥漫性大b细胞性淋巴瘤的效力在各种成分的不同剂量保持基本上一致。此外，图11证实，三元组合疗法对dohh2滤泡淋巴瘤的效力不限于化合物3，而是同样适用于其它btk抑制剂(例如，依鲁替尼)。
如在图13中所示，在不同剂量的btk抑制剂(例如，化合物3)和mtor激酶抑制剂(例如，化合物14)的组合协同地减小aa大鼠模型的爪体积，从而表现出与阳性对照(tofactinib)类似的效力。用单独化合物3或单独化合物14治疗的大鼠不存在这样的治疗效果。
如在图15中所示，在不同剂量的btk抑制剂(例如，化合物3)和mtor激酶抑制剂(例如，化合物14)的组合协同地降低cia小鼠模型的临床评分，从而表现出与阳性对照(地塞米松)类似的效力。用单独化合物3或单独化合物14治疗的小鼠不存在这样的治疗效果。
在下面表中显示了btk化合物的另外数据。下面表13证实，低剂量组合对肿瘤细胞是协同的且已经表现出综合致死率。在比每种单一试剂低得多的剂量，化合物3、14和15的三元组合在9天中导致完全肿瘤消退，而化合物3和14的二元组合需要15天。单一试剂的有效性低得多，或者当停止这样的试剂的施用时造成肿瘤回弹。当肿瘤消退以后，甚至当将所述三元组合的施用转换成媒介物时，用所述三元组合没有看到肿瘤回弹。
表13单一药物和组合疗法的抗肿瘤作用
表14证实，低剂量(losedose)组合是安全的，在所有治疗组和对照组之间没有任何显著的体重变化。
表14.3/14/15和9/14/15组合疗法的动物重量
表14证实，在每种试剂的不同剂量的低剂量组合是安全的，在所有治疗组和对照组之间没有任何显著的体重变化。
表15.3/14/15组合疗法的动物重量
下面的表16表明，并非所有的三元组合都具有优良的协同效应，进一步证实了使用btk/mtor/imid和btk/mtor/bcl-2的三元组合的协同效应是意外的。用这两种三元组合已经实现了抑制癌细胞的体外和体内协同效应。
表16jak1抑制与btk/imid、imid/pi3k和imid/mtor的三元组合对肿瘤细胞生存力的抑制的缺乏
下面的表17-20表明，二元组合在自身免疫动物模型中比单独的单一试剂更有效。
表17在aa研究中动物的爪体积
*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
表18在aa研究中的动物的病理学评分
***p<0.001，相对于媒介物，kruskal-wallis检验，dunn氏事后检验
表19在cia研究中在第一次免疫接种以后21天以后的临床评分
表20在cia研究中动物的病理学评分
***p<0.001，相对于媒介物，kruskal-wallis检验，dunn氏事后检验
下面的表21显示了在本发明中有用的一些化合物的结构。
表21
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。下面描述了示例性的方法和材料，但是与本文描述的那些类似或等同的方法和材料也可以用在本发明的实践或试验中。在本文中提及的所有出版物和其它参考文献通过引用整体并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。尽管在本文中引用了许多文件，该引用不会构成以下承认：这些文件中的任一篇形成本领域的常见一般知识的组成部分。
贯穿本说明书和实施方案中，词语“包含”或变体诸如“包括”或“含有”应理解为暗示包括所述的整数或整数集合，但是不排除任意其它整数或整数集合。所述材料、方法和实施例仅仅是示例性的，且无意成为限制性的。
本文中使用的术语“基本上”、“实质的”和“约”用于描述和解释小变动。当与事件或情况结合使用时，所述术语可以表示其中所述事件或情况精确地发生的情形，以及其中事件或情况发生至紧密接近的情形。例如，所述术语可以表示小于或等于±10％，诸如小于或等于±5％、小于或等于±4％、小于或等于±3％、小于或等于±2％、小于或等于±1％、小于或等于±0.5％、小于或等于±0.1％或小于或等于±0.05％。
另外，量、比率和其它数值有时在本文中以范围形式呈现。应当理解，这样的范围形式为了方便和简洁而使用，且应当灵活地理解为包括被明确地指示为范围边界的数值，而且包括被包含在该范围内的所有各个数值或子范围，如同明确地指示每个数值和子范围。例如，在约1至约200的范围内的比率应当理解为包括明确地列举的约1和约200的边界，而且包括各个比率诸如约2、约3和约4、和子范围诸如约10至约50、约20至约100，诸如此类。
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