药物组合物及其治疗自身免疫疾病的用途的制作方法

本发明涉及用于治疗自身免疫疾病的化合物和方法，特别是用于治疗类风湿关节炎、银屑病关节炎、银屑病、狼疮、幼年型类风湿关节炎、多发性硬化、炎性肠病和/或克罗恩病。

发明背景

以下对发明背景的讨论意在促进对本发明的理解。然而，应当理解的是，该讨论不是确认或承认所提及的任何材料在本申请的优先权日在任何管辖内是公布的、已知的或是公知常识的一部分。

自身免疫是免疫系统的细胞(淋巴细胞)或产物(抗体)与身体自身组织的成分反应，导致体内明显的病理。自身免疫可根据攻击的靶标产生多种临床病状，其共同特征包括自身反应性t细胞和b细胞的扩增、自身抗体的产生和组织损伤。人类中诱导自身免疫的机制是多样的、复杂的并且仍然了解很少。事实上，自身免疫最令人困惑和挑战的方面是确定有助于应答启动的根本原因。虽然许多内在因素(包括年龄、性别和遗传)有助于自身免疫，但据信外在因素(诸如药物、化学物质、微生物和/或环境)可能引发自身免疫应答的启动。

自身免疫疾病是65岁以下女性死亡的十大主要原因之一。迄今为止，有多达80种类型的自身免疫疾病。根据美国自身免疫相关疾病协会(aarda)，自身免疫疾病每年直接造成超过1000亿美元的医疗费用。由于这些原因，用于治疗或减轻自身免疫相关疾病的新治疗化合物和方法的开发持续受到医学研究者和医生的极大兴趣。

人类中诱导免疫耐受的机制是多样的、复杂的并且仍然了解很少。因此，寻求用各种耐受原的人类自身免疫的新疗法，但尚未充分开发。

自身免疫疾病的非限制性实例是类风湿关节炎(ra)。ra是慢性自身免疫疾病，导致关节和周围组织的炎症。该疾病的特征在于关节炎症和疼痛并且通常以对称的方式影响关节。滑膜关节是主要受攻击的区域，产生滑膜的炎症反应、滑膜细胞的增生和过多的滑液。ra的病因不明，该疾病无法治愈。有一些针对特定生物靶标的治疗，诸如细胞因子和细胞因子受体，其改善了许多患者的护理，但仍有无应答者。因此，仍然需要替代的或改进的治疗。

免疫耐受概念临床相关转化为ra治疗的主要挑战是对导致人类免疫耐受的机制的不完全了解。这些机制是复杂的多样的，且在动物模型中不能完全再现，因此需要在人类中进行专门研究。

需要替代治疗来改善上述问题中的至少一个。

发明概述

本发明的一个目的是提供药物组合物和使用其治疗自身免疫相关疾病的方法。

因此，本发明的一方面提供治疗有需要的个体的自身免疫相关疾病的方法，其包括向个体给药治疗有效量的药物组合物，药物组合物包含具有以下通式i的化合物：

氨基酸序列-(l)n-dmard

和/或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体，其中所述氨基酸序列包含qkraaydqyghaafe-nh2(seqidno:1)，l是连接基单元，dmard是缓解疾病的抗风湿剂，-是共价键且n是0或1。

本发明的另一方面提供具有式i的化合物：

氨基酸序列-(l)n-dmard

其中所述氨基酸序列包含qkraaydqyghaafe-nh2(seqidno:1)，l是连接基单元，dmard是缓解疾病的抗风湿剂，-是共价键且n是0或1。

本发明的另一方面提供具有式i的化合物，其用作药物，以及包含所述化合物的药物组合物。

本发明的另一方面提供具有式i的化合物，其用于治疗自身免疫相关疾病。

本发明的另一方面提供药物组合物，其包含具有式i的化合物和/或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体，其中所述组合物意在用于治疗有需要的个体的自身免疫相关疾病。

根据本发明的另一方面，提供具有式i的化合物和/或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体在制备用于治疗自身免疫相关疾病的药物中的用途。

通过结合附图阅读以下本发明具体实施方案的描述，本发明的其它方面对于本领域普通技术人员会变得显而易见。

附图简述

现在会参考以下附图仅以实例的方式描述本发明。在一些以下附图中描绘的实验结果显示seqidno:1和抗风湿剂之间产生的协同效应。

图1显示制备化合物ii的合成路线。

图2a显示制备化合物iii至v的一般合成路线。

图2b显示制备化合物vi至viii的一般合成路线。1:1,4-苯二甲醇；cdi:羰基二咪唑(cas编号：530-62-1)；2:1h-咪唑-1-羧酸1,4-亚苯基双(亚甲基)酯(cas编号：107845-94-3)3:4-((((2-((4-((7-氯喹林-4-基)氨基)戊基)(乙基)氨基)乙氧基)羰基)氧基)甲基)苄基1h-咪唑-1-羧酸酯。

图3.根据临床应答，效应t细胞和调节性t细胞功能不同：a.在试验开始(t0)和研究结束(tend)时通过facs比较seqidno.1临床应答者和安慰剂临床无应答者中效应t细胞(teff)(cd4+cd127+)的pd-1的表达。b.对facs分选的teff分析il-17和rorc。用il-17a细胞内染色teff，并通过facs分析。c.通过facs在seqidno.1治疗的临床应答者中测定调节性t细胞(treg)(cd4+cd25++cd127-)频率(pbmc的百分数％)。在t0和tend时，临床应答者的pbmc中的treg频率没有差异(t0对tend，7.773+/-1.432对7.610+/-1.519，n＝4，t-检验p0.8537)。值是平均值和标准误差。d.seqidno.1治疗的临床应答者中的treg功能性(在tend时测量为teff增殖的抑制％(y轴))显著高于安慰剂临床无应答者中的(安慰剂临床无应答者对seqidno.1临床应答者，-76.21+/-3.665对8.443+/-4.677，n＝2对3，t-检验p0.0010)。值是平均值和标准误差。

图4.临床应答者中与免疫调节有关的基因的表达：与安慰剂临床无应答者(浅灰色柱)相比，临床应答者(用式i化合物治疗)中调节分子的基因表达显著更高。

图5.pd-1积极有助于treg功能：a.通过cfse稀释测定treg抑制teff增殖的能力。描绘了代表性临床应答者。根据表中所示的表型通过facs分选treg细胞，并在10mg/ml的seqidno.1存在下与teff一起孵育。b.在与10mg/ml的seqidno.1一起孵育后，在tend时临床应答者的treg细胞上的pd-1的表达与t0时相比显著增加(分别地，总treg的41％对13.3％为pd-1+，t(x)＝14.6，p<0.01)。c.在与10mg/ml的seqidno.1一起孵育后，代表性临床无应答者的treg(cd4+cd25++cd127-)细胞上的pd-1的表达在t0(15.5％)和tend(12.7％)之间无差异(t(x)＝0，p＝0.5)。曲线下面的白色区域线描绘t0，灰色区域描绘tend。t(x)＝概率划分(probabilitybinning)。％pd-1+tred表示为总treg群(两个组中的图)的百分比。d.在用抗-pd1抗体处理后与未处理的培养物相比，pd+treg(cd4+cd25++cd127-pd1+)细胞上磷酸化stat5(pstat5)的表达显著减少(抗-pd1处理中12％pstat5染色对未处理的培养物中38.9％染色，t(x)＝46.5，p<0.01)。在存在或不存在抗-pd1抗体的情况下，与teff和apc一起孵育5天后，通过facs染色pd-1+treg细胞。细节在方法中。曲线下面的白色区域线描绘抗-pd1处理的，灰色区域描绘未处理的。t(x)＝概率划分。e.通过免疫荧光显微术检查treg中的pstat5。根据方法中概述的步骤制备细胞、染色和载玻片。使用imagej(rasband,w.s.,imagej,http://rsb.info.nih.gov/ij/,1997-2009)计算用抗-pd-1处理的每个细胞的平均pstat5表达，其由每单位面积的平均积分密度测定。未处理的对抗-pd-1处理的：38.79对33.07，标准差4.27对2.53，n＝1，t-检验p<0.0001。f.抗-pd1抗体处理后与未处理的培养物相比，teff中的磷酸化stat3(pstat3)表达显著升高(抗-pd1处理中12％pstat5染色对未处理的培养物中38.9％染色，t(x)＝46.5，p<0.01)。在存在或不存在抗-pd1抗体的情况下孵育5天后，通过facs染色teff。细节在方法中。曲线下面的白色区域线描绘抗-pd1处理的，灰色区域描绘未处理的。t(x)＝概率划分。g.分选tend时临床应答者(n＝5)的总treg、pd-1+treg和pd-1-treg，并通过taqman测量ctla-4、foxp3、il-10和tgf-β的rna表达。数据表示为gapdh的2(-dct)×100。seqidno.1临床应答者中在tend时pd-1+treg中的tgf-β基因表达显著高于tend时的pd-1-treg中的(18.99+/-3.412对2.693+/-1.434，n＝5p＝0.0130)。相反，ctla-4、foxp3和il-10的表达在treg的不同亚群之间无差异。

图6.用羟氯喹(hcq)通过操作mdc体外产生pd-1+t细胞：a-e.体外选择性地用hcq处理来自健康成人的单核细胞衍生的、lps诱导的树突细胞(mdc)。当mdc用hcq处理时，hla-dr(mfi:100对20.8,t(x)11.2,p<0.01)、cd83(mfi:1329对991,t(x)41.4,p<0.01)和cd86(mfi:37983对34170,t(x)19.7,p<0.01)的表达减少，但是il-10(mfi:453对1045,t(x)235,p<0.01)和cd200(mfi:264对409,t(x)74.3,p<0.01)的表达增加。f-g.将cd4+分选的细胞与mdc处理组共培养另外的24小时。当与hcq处理的mdc共培养时，t细胞中的pd-1(mfi:187对212,t(x)＝26.4,p<0.01)和细胞内pd-1(mfi:46对222,t(x)161,p<0.01)的表达增加。h.与无hcq的mdc共培养(灰色柱)相比，与mdc+hcq共培养(深灰柱)的t细胞中的调节分子ctla-4(1.74对15.06)、foxp3(3.06对12.27)、il-10(3.71对7.57)和tgfβ(15.00对23.85)的基因表达上调。数据表示为gapdh的2(-dct)×100。

图7.式ⅰ化合物的提出的作用机制的示意图。

图8.seqidno:1肽氨基酸序列免疫疗法重塑类风湿关节炎患者的免疫组。(a)用seqidno:1肽氨基酸序列治疗前的健康个体和类风湿关节炎患者的免疫特征。(b)seqidno:1氨基酸序列hcq应答者和安慰剂hcq无应答者的免疫特征。(c)用t细胞染色组1和accense集群软件分析调节性t细胞区室。(d)seqidno:1hcq应答者的富集结点的确定。(e)表达gitr、pd-1、pd-l1、ctla-4和hla-dr的foxp3+treg的百分比。

图9.seqidno:1的治疗效果归因于调节性t细胞的表型和功能的改变。(a)治疗开始(t0)和结束(tend)时seqidno:1应答者的teff细胞中炎症基因的表达。(b)在t0和tend时seqidno:1治疗的临床应答者中treg的频率。(c)seqidno:1应答者和无应答者中分离的treg的抑制能力。

图10.treg上pd-1的表达决定了其抑制能力，并且可能由stat通路介导。(a)通过用seqidno:1刺激，临床应答者的treg上的pd-1的表达上调，但在临床无应答者中不上调。(b)seqidno:1治疗在tend时对pd-1+和pd-1-的抑制能力。(c)在存在抗-pd-1抗体、抗-pd-l1抗体或两者时的抑制能力。(d)用抗-pd-1抗体治疗后pd-1+treg上的pstat5的表达。(e)pstat5表达染色的treg的代表性共聚焦显微镜图像。(f)pstat5表达的定量。(g)ctla-4、foxp3、il-10和tgfβ在总treg、pd-1+treg和pd-1-treg上的表达。(h)应答者和无应答者的teff细胞的pd-1表达。(i)抗-pd-1抗体治疗后通过流式细胞术测量的pstat3的表达。

图11.成功的seqidno:1治疗诱导致耐受性记忆t细胞。(a)用t细胞2染色组和accense集群软件分析记忆t细胞。(b)seqidno:1hcq应答者的富集结点的确定。以红色突出显示的是存在于seqidno:1应答者中但不存在于无应答者中的细胞群。(c)表达cd69和tgfβ的记忆t细胞(cd4+cd45ro+)的百分比。(d)seqidno:1和安慰剂治疗的个体的医生全面评估分数。(e)评估seqidno:1和安慰剂治疗的个体的关节疼痛。(f)关节肿胀评分。

图12.共同给药羟氯喹(hcq)通过改变dc的表型和诱导pd-1+调节性t细胞来提供与seqidno:1治疗的协同作用。(a)在hcq存在下成熟的单核细胞衍生的dc上活化标志物和致耐受性标志物的表达分别降低和升高。(b)与用hcq预处理的dc共培养后在cd4+t细胞上treg相关标志物的表达。(c)在dc和hcq存在下培养的t细胞中调节分子的基因表达。

图13.t细胞上表面和活化标志物的染色组。

图14.a.在试验开始(t0)和研究结束(tend)时通过facs比较seqidno.1临床应答者和安慰剂临床无应答者中效应t细胞(teff)(cd4+cd127+)的ltbp4的表达。b.抑制pd-1或或者抑制pd-1和对抑制teff增殖的作用。

发明详述

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本文主题所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。如本文所使用的，提供以下定义以便于理解本发明。

在整个文档中，除非另有相反说明，否则术语“包含”、“由……组成”、“具有”等，应被理解为非穷举的，或换句话说，意指“包括但不限于”。

此外，在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(include)”或变体诸如“包括(includes)或(including)”会被理解为表明包括所述整数或整数组但不排除任何其他整数或整数组。

如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”和“该(the)”包括复数引用，除非上下文另有明确说明。

“可水解的”连接基指连接基体系，其中氨基酸序列和缓解疾病的抗风湿剂以自然形式释放。可水解的同义词是“可降解的”或“可释放的”连接基。连接基还起到确保在药物递送过程中生物活性化合物的瞬时稳定共轭的作用。在各种实施方案中，连接基还包含至少一个共轭体系。

如说明书中所使用的，“取代的芳族环”和“取代的杂芳族环”指芳族环和杂芳族环被一个、两个或三个取代基取代，取代基独立地选自直链烷基、支链烷基、芳基、氯、溴、碘、氨基、羧基和羟基。

如说明书中所使用的，术语“烷基”指饱和或不饱和基团，其包含碳和氢原子。

如说明书中所使用的，术语“共轭体系”是p-轨道与离域电子连接的体系。共轭体系由几个多重键产生，每个键由单键分开。具有至少一个共轭体系的化合物/部分可以是环状的、非环状的、线性的或混合的。

本发明人发现几种新的化合物，其能够在受自身免疫相关疾病(特别是类风湿关节炎)影响的人类中同时诱导免疫耐受，并减少关节炎的疼痛和肿胀，缓解疾病特性。此外，本发明人还发现该化合物还能用于治疗疾病，诸如类风湿关节炎、银屑病关节炎、银屑病、狼疮、幼年型类风湿关节炎、多发性硬化、炎性肠病和/或克罗恩病。

因此，本发明的一方面提供治疗有需要的个体的自身免疫相关疾病的方法，其包括向个体给药治疗有效量的药物组合物，药物组合物包含具有以下通式i的化合物：

氨基酸序列-(l)n-dmard

其中所述氨基酸序列包含qkraaydqyghaafe-nh2(seqidno:1)，l是连接基单元，dmard是缓解疾病的抗风湿剂，-是共价键且n是0或1。

如说明书和所附权利要求中所使用的，seqidno:1是氨基酸序列，其包含qkraaydqyghaafe-nh2。

在各种实施方案中，dmard是缓解疾病的抗风湿剂，其包含具有以下核心结构(a)的喹啉衍生物：

在各种实施方案中，所述喹啉衍生物包含具有以下结构(b)的氯喹衍生物：

其中r选自羟基、氯、溴、碘、羧酸酯和醛。

在各种实施方案中，所述氯喹衍生物是羟氯喹。羟氯喹是具有以下结构的化合物：

在各种实施方案中，术语“治疗”指与自身免疫疾病症相关的临床体征和/或症状由于所进行的行为而减轻或减少。在各种实施方案中，术语“治疗”可指pd-1、pd-l1、ctla-4或foxp3中任一种的细胞表达的增加。

在各种实施方案中，术语自身免疫相关疾病指免疫系统的细胞(淋巴细胞)或产物(抗体)与身体自身组织的成分反应，导致体内明显的病理。特别地，自身免疫相关疾病指包括以下疾病的疾病中的任一种：类风湿关节炎、银屑病关节炎、银屑病、狼疮、幼年型类风湿关节炎、多发性硬化、炎性肠病和/或克罗恩病。

在各种实施方案中，术语个体指哺乳动物。在各种实施方案中，哺乳动物是人类。

如本文所使用的术语“治疗有效量”或“有用剂量”指能够减少或减轻个体中自身免疫相关疾病症状的药物化合物或组合物的量。在各种实施方案中，可以通过比较它们的体外活性或体内活性来确定具有式i的化合物的有用剂量。用于治疗所需要的具有式i的化合物及其药学上可接受的载体或其活性盐或衍生物的量不仅会随所选择的特定盐而变化，还会随给药途径、所治疗病状的性质以及患者的年龄和病状而变化，并且最终会由主治医生或临床医生决定。

在各种实施方案中，式i化合物的药学上可接受的盐可以使用本领域公知的标准步骤获得，例如，通过使足够碱性化合物(诸如胺)与合适的酸反应得到生理上可接受的阴离子。还可以制备羧酸的碱金属(例如，钠、钾或锂)盐或碱土金属(例如钙)盐。

在各种实施方案中，所述药物组合物还包含具有式i的化合物的药学上可接受的盐和/或其药学上可接受的载体。

在各种实施方案中，缓解疾病的抗风湿剂指羟氯喹化合物。

在各种实施方案中，具有式i的化合物选自：

其中n＝1至10；

其中n＝1至10；

其中n＝1至10。

在各种实施方案中，连接基是稳定但可水解的连接基，其在酸性条件下释放seqidno:1和羟氯喹。在各种实施方案中，可水解的连接基包含可水解部分。在各种实施方案中，可水解部分包含具有以下结构的羰基官能团：

在各种实施方案中，可水解的连接基还包含至少一个共轭体系。在各种实施方案中，可水解的连接基还包含至少一个任选取代的芳族环或杂芳族环。在各种实施方案中，芳族环是5-、6-或7-元环。在各种实施方案中，杂芳族环是5-、6-或7-元环。

以下路线1是经酸处理后以具有芳族环和可水解部分的连接基释放hcq和seqidno:1(肽)的预期机制。hcq和seqidno:1会没有优先地被释放，其中酸性溶液中水解的驱动力是苄正离子的稳定性，并且二氧化碳(co2)通过一系列中间体释放。

在各种实施方案中，自身免疫相关疾病选自类风湿关节炎、银屑病关节炎、银屑病、狼疮、幼年型类风湿关节炎、多发性硬化、炎性肠病和/或克罗恩病。

在各种实施方案中，包含式i的化合物和/或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物适合口服或肠胃外(通过静脉内、腹膜内、肌内、局部或皮下途径)向个体给药。在各种实施方案中，给药途径是黏膜给药、摄入、经鼻给药、支气管给药和结肠给药。在各种实施方案中，活性化合物还可以通过输注或注射局部给药、静脉内给药、鼻内给药(直接或雾化)、皮下给药或腹膜内给药。可以在水中制备活性化合物或其盐的溶液，任选地与无毒表面活性剂混合。也可以在甘油、液体聚乙二醇、三乙酰甘油及其混合物中和在油中制备分散体。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。对于局部给药，本发明化合物可以纯的形式应用，即，当它们是液体时。然而，通常会期望将它们作为组合物或制剂联合皮肤病学上可接受的载体向皮肤给药，所述载体是固体或液体。优选地，药物组合物适合口服向个体给药。

在各种实施方案中，式i化合物的治疗有效量或有用剂量为约1mg至100mg。优选地，有效量或有用剂量为约10mg至50mg。优选地，具有式i的化合物的有效量为约1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100mg的量。在各种实施方案中，包含式i化合物和药学上可接受的载体的药物组合物每天给药至少一次。在各种实施方案中，组合物每天给药至少两次。

在各种实施方案中，方法还包括在向个体给药治疗有效量的药物组合物之前在采集自个体的样品中测量细胞表达谱，并在向个体给药治疗有效量的药物组合物之后在采集自个体的第二样品中测量第二细胞表达谱；其中pd-1、pd-l1、ctla-4或foxp3中任一个的表达增加表明该个体对治疗有应答。在各种实施方案中，治疗之前采集的第一样品和治疗之后采集的第二样品作为血液样品。在各种实施方案中，细胞为外周血单个核细胞(pbmc)。在各种实施方案中，治疗之前指直接治疗前。在各种实施方案中，治疗之后指治疗开始后1或2天。在各种实施方案中，治疗之后指1至6个月疗程之后，为直接该疗程中最终治疗后或该疗程中最终治疗后1个月后。

本发明的另一方面提供药物组合物，其包含有效量的具有式i的化合物和其药学上可接受的载体，其用于治疗有需要的个体的自身免疫相关疾病，其中所述化合物包含通式i：

氨基酸序列-(l)n-dmard

且其中所述氨基酸序列包含qkraaydqyghaafe-nh2(seqidno:1)，dmard是缓解疾病的抗风湿剂，l是连接基单元，-是共价键且n是0或1。

药物组合物中提及的术语以与上述类似术语相似的方式定义。

本发明的另一方面提供具有式i的化合物：

氨基酸序列-(l)n-dmard

其中所述氨基酸序列包含qkraaydqyghaafe-nh2(seqidno:1)，l是连接基单元，-是共价键且n是0或1。

根据本发明的另一方面，提供具有式i的化合物和/或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体在制备用于治疗自身免疫相关疾病的药物中的用途。

化合物的用途中提及的术语以与上述类似术语相似的方式定义。

通过以相等比例同时将生物活性化合物有效地递送至靶标，连接基在增强生物活性化合物的治疗参数中起关键作用。连接基有助于有效控制两种生物活性化合物的相对比例，其以相等比例递送至靶组织。连接基还提供易于给药的优点，其不需要单独服用seqidno:1和抗风湿剂，从而为有需要的患者提供便利。通过连接基将两种生物活性化合物连接，连接基还有助于有需要的患者较好地遵守含有两种生物活性化合物的药物的剂量。连接基还通过将生物活性化合物同时递送至靶组织而提供生物活性化合物潜在改善的功效，由此增强生物活性化合物对两种不同且功能互补的免疫细胞亚群的协同效应。此外，连接基优选是无毒和/或易于合成的。

还应理解，没有连接基，所需肽seqidno:1的比例必须大于抗风湿药物的比例，因为seqidno:1在一个末端含有谷氨酰胺(q)氨基酸，seqidno:1摄入后在其达到靶组织之前容易降解(数据未显示)。本领域技术人员对此在合成上具有较少的兴趣，由于其通常涉及制备肽的多步合成。在连接基的存在下，seqidno:1肽和抗风湿药物可以以相等比例给药，因为连接基保护肽免于降解并因此增强肽的稳定性。

实施例

式i化合物的合成

可以设计各种合成路线用于制备式i化合物。化合物ⅱ和化合物ⅲ-ⅴ的合成路线分别在图1和图2a中描绘。这些包括传统的固相合成、boc-保护的hcq的制备或对硝基苯酚酯boc-hcq的制备，和在其他官能团的传统偶联和侧链去保护后将这些用于最终化合物的制备等。这些步骤或者其他相似的合成方法(如果需要)可以由本领域普通技术人员设计和实施。化合物ⅴ-ⅷ的合成路线在图2b中描绘。首先，连接基1,4-苯二甲醇首先被1,1’-羰基二咪唑(cdi)活化产生化合物2.(1h-咪唑-1-羧酸1,4-亚苯基双(亚甲基)酯。cas编号：107845-94-3)。化合物2和hcq的缩合产生化合物3.(4-((((2-((4-((7-氯喹林-4-基)氨基)戊基)(乙基)氨基)乙氧基)羰基)氧基)甲基)苄基1h-咪唑-1-羧酸酯cas编号未指定)。同时，用肼可去除的保护基团保护的赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸制备seqidno:1(肽)。化合物3和受保护的seqidno:1反应得到共轭的4，4经去保护步骤产生最终共轭物5。如果需要，会进行额外步骤以保护/去保护hcq的氨基和/或精氨酸的胍基，以获得最终产物。化合物ⅸ、ⅹ和ⅺ的合成类似于化合物ⅴ-ⅷ的合成路线。

本领域技术人员应该进一步理解，可以组合上述特征的变体和组合，不是替代物或取代物，以形成落入本发明预期范围内的进一步的实施方案。

治疗机制

这些结果为进一步开发这种治疗人类自身免疫疾病的方法提供机制原理。该研究还鉴定了treg亚群，其在体内和体外是可诱导的，并且是检测耐受诱导和细胞免疫疗法的潜在工具。

这里采用的模型是基于对t细胞表位的免疫耐受的假设，诸如seqidno.1可能是有助于类风湿关节炎患者的炎症，可能导致可检测的临床改善。共有96例患有早期类风湿关节炎的患者(他们未被允许使用氨甲蝶呤或生物制剂)对seqidno.1检测黏膜耐受。如果患者在研究期间的任何时间符合应答标准，则将患者定义为“应答者”。这种方法是安全的，并且导致的临床效力与单独使用氨甲蝶呤相当。seqidno.1治疗与外周血单个核细胞(pbmc)的免疫偏离有关，其特征在于肿瘤坏死因子α(tnfα)的产生减少和白细胞介素10(il-10)的产生增加。

观察到对seqidno.1的临床应答者(acr，美国风湿病学会标准，在终点有应答或更高)(本文称为临床应答者)的pbmc中的程序性死亡1(pd-1)显著更高的表达(数据未显示)。pd-1首先被描述为有助于慢性病毒感染和癌症中t细胞无反应性和衰竭。

因此，本文测试的第一个假设为通过用seqidno.1治疗是否诱导cd4+/cd127+效应t细胞(teff)无反应性。在临床应答者或无应答者中，teff表达pd-1的百分比在试验开始和结束之间没有显著变化(图3a-y轴：总teff群中pd-1+％。应答者：6.312+/-1.428对4.930+/-1.433，n＝5，t-检验p＝0.2157，(平均值+/-c.(平均值的标准误差))。无应答者，3.230+/-1.136对3.111+/-0.8345，n＝6，t-检验p＝0.9248，(平均值+/-标准误差))。此外，teff能够增殖成常规多克隆刺激物(数据未显示)。这表明teff上pd-1表达水平不足以诱导无反应性，其他机制必须发挥作用。

进一步分析seqidno.1治疗的临床应答者中的teff表明白细胞介素17a(il-17a)的表达显著降低(图3b，左侧两个柱)，连同il-23受体表达降低(未显示)。相反，在安慰剂治疗的临床无应答者中检测到il-17a表达的增加。除了il-17a的表达降低外，分选的teff表现出th-17相关转录因子rorc的表达显著降低，其通过taqman测量(图3b，右侧两个柱)。因此，用seqidno.1成功治疗诱导了teff的免疫偏离，同时降低了产生促炎性细胞因子的能力。

在图3by轴中：teff产生il-17a(前面两个柱，通过facs测量)和rorc的表达(通过taqman测量)两者在tend和t0之间的净变化％。在teff细胞中，临床应答者的细胞内il-17a的表达在tend时与在t0时相比显著更低(t0对tend，8.003+/-0.07839％对4.873+/-0.6933％，n＝3，t-检验p0.05)，然而在临床无应答者中il-17a的表达增加(t0对tend，3.980+/-1.520％对8.860+/-3.309％，n＝2，t-检验p0.2224)。对于taqman，裂解细胞团块用于mrna分离和cdna合成，并检测rorc的表达。分析结果为gapdh的百分比。临床应答者中teff的rorc基因的表达在tend时显著低于在t0时(t0对tend，3.382+/-0.684对1.670+/-0.714，n＝5，t-检验p0.0035)。相反，在临床无应答者中teff的rorc的表达在t0和tend时无差异(t0对tend，2.510+/-1.180对2.875+/-1.205，n＝2，t-检验p0.8487)。值是平均值和标准误差。

然而，teff免疫偏离可能不是实现临床控制起作用的唯一机制。在一些自身免疫疾病以及类风湿关节炎中，已经证明调节性t细胞(treg)在频率和/或功能上是不足的。

在临床应答者中未检测到试验开始时和结束时之间cd4+/cd25++/cd127-treg的频率的变化(图3c)。在试验结束时发现tred的抑制能力在治疗应答者和安慰剂无应答者之间的高度显著差异(图3d)。该差异表明在用seqidno.1治疗的临床应答者中treg功能的恢复(图3d和5a)。

然而，不论是teff的免疫偏离或是treg活性的恢复都没有直接解释为什么与临床无应答者相比pd-1、其配体和其他与t细胞调节有关的分子(诸如foxp3和ctla-4)在临床应答者的pbmc中是显著升高的，特别是对服用了式ⅰ组合物的临床应答者(图4)。两组在试验开始(t0)时都服用了相当剂量的羟氯喹(hcq)。将来自t0的pbmc与10mg/mlseqidno.1体外孵育48小时，并如前所述进行taqman。数据表示为gapdh的2(-dct)×100。pd-1，0.3595+/-0.1033对0.9310+/-0.1961，n＝5，p0.0327pd-l1，0.1400+/-0.05308对1.080+/-0.1926，n＝6，p0.0005ctla-4，0.2667+/-0.07313对4.809+/-2.606，n＝6，p0.0588foxp3，0.2678+/-0.1267对2.329+/-0.9527，n＝6，p0.0422p值通过t-检验获得。

我们假设pd-1的表达可能与活性调节性t细胞的功能有关而不是仅仅与t细胞无反应性有关。最近的文献确实提出了pd-1相关通路对treg功能的积极作用。

在该体系中，通过facs分选的pd-1+treg(cd4+/cd25++/pd-1+/cd127-)明显抑制teff增殖，而pd-1-treg没有显示出相当的抑制能力(图5a)。有趣的是，pd-1+treg的总抑制能力在试验开始时和结束时之间没有差异(图5a)。然而，观察到整个treg群中pd-1+treg频率的显著增加(图5b)。临床无应答者的treg不是这种情况(图5c)。因此，在总treg群(pool)中，pd-1+treg与pd-1-treg的比例变得倾斜，可能解释了在试验结束时抑制能力的提高。

在抗-pd-1抗体存在下，pd-1+treg的抑制能力显著降低(抑制降低56.94％)，因此表明在抑制机制中pd-1分子的功能性作用。此外，阻断pd-1导致pd-1+treg表达磷酸化stat-5的数量减少72％(通过facs测量)(p<0.01，图5d)。这些发现通过共聚焦显微镜证实(图5e)，继发于用抗-pd-1抗体处理pd-1+treg的培养，pstat5统计学显著减少(p<0.001)。这些发现可直接将pd-1信号通路与treg的功能联系起来。的确，stat-5磷酸化控制foxp3的表达和功能性treg的发育。pd-1的结合(engagement)可导致经il-2受体的结合对stat-5经典磷酸化通路的替代。据信，人类中表达pd-1的treg代表抗原特异性t细胞的通用(versatile)群体，通过旋转(pivoting)pd-1结合的复杂调控机制以精细调节与特定情况有关的treg功能。可以假设继发于pd-1结合的通路不仅仅是抑制性的，而是可以根据条件和微环境调节treg的功能和稳态。

体外pd-1抑制还导致teff中stat-3磷酸化的增加(图5f)。stat-3活化诱导teff朝向th-17表型(图5f)。这些发现强调了pd-1+treg对teff的可能的直接下调机制。的确，如图3b中所示，由seqidno.1的耐受诱导teff产生的il-17降低。这种效果取决于有效的pd-1+treg的功能，并且可以通过丢失pd-1+treg的功能来逆转，从而导致teff产生il-17。

基于这些组合数据，可以论证pd-1对于继发于表位特异性免疫疗法的适应性免疫的调节是必需的。

为了进一步表征pd-1+treg的功能，从facs分选的cd4+/cd25++/cd127-总treg、pd-1+treg和pd-1-treg中提取mrna，并通过qpcr检测与treg功能相关的各种基因的表达。ctla-4、foxp3和il-10的表达(他们都是treg的特征)在pd-1+treg和pd-1-treg之间似乎没有差异。然而，与pd-1-treg相比，tgf-β的表达在pd-1+treg中显著更高(图5g)。当在抑制试验中加入抗-tgf-β抗体时，观察到pd-1+treg的抑制能力的相当大的降低(84.97％)。因此，tgf-β可能在pd-1+treg的功能中起相关的作用。

这些数据首次描述了人类自身免疫疾病中treg亚群的诱导，其对于临床相关免疫耐受的发生是关键的。这些treg可以在表型上和功能上通过pd-1的表达和通过tgf-β的产生来表征。这些发现得到越来越多的证据证实，这些证据指出了表达pd-1的t细胞的特征不仅仅是无反应性。

该机制可导致与研究的治疗方案有关的pd-1+treg的开发。以下数据指导了该方法：i)ii期试验的事后评估显示，当与seqidno.1治疗组合使用时，hcq的先前使用有利于临床控制。ii)pd-1、pd-l1、ctla-4和foxp3在用式ⅰ化合物治疗的临床应答者中是显著上调的(图4)。

假设hcq治疗通过诱导抗原呈递细胞中的功能变化参与treg细胞上的pd-1表达的诱导。为了检验该假设，在体外用hcq处理健康对照的单核细胞衍生的、lps诱导的树突细胞(成熟的dc，mdc)。与没有hcq的培养物相比，观察到hla-dr、cd83和cd86的表达显著减少(图6a-c)。相反，当用hcq处理mdc时，观察到il-10和cd200的表达显著增加(图6d&e)。

在图6a-e中，深色线代表mdc对照组，而浅灰区域代表用hcq处理的mdc组。mfi＝平均荧光指数。在图6f-g中，深色线代表与mdc对照组共培养的cd4+细胞，而浅灰色区域代表与用hcq预处理的mdc组共培养的cd4+细胞。mfi＝平均荧光指数。

然后将分选的cd4+t细胞与mdc共培养额外的24小时。与没有hcq的mdc培养的cd4+细胞相比，与先前暴露于hcq的mdc培养的cd4+细胞上调了pd-1(图6f-g)、foxp3、il-10、ctla-4和tgf-β(图6h)的表达。

这些数据可以在体外再现一些通过成功疗法在体内诱导的情况。可以表明，在seqidno.1(另外的促炎性表位)存在下，在致耐受性环境的情况下，hcq通过诱导mdc的功能和表型的变化而在体内作为表位特异性免疫治疗的免疫佐剂起作用。这种变化有利于pd-1+t细胞的发育，其发挥调节功能，在teff中诱导免疫偏离。

总而言之，本文描述的数据提供对交叉免疫通路的多样性和复杂性的洞察，这些通路在类风湿关节炎和可能的其他人类自身免疫疾病中诱导临床相关耐受是必需的。一种这样的通路依赖于可以在体内和体外诱导的treg的pd-1+亚群，因此提供了通过药理学或细胞疗法诱导耐受性的潜在新工具(图7)。

已确定seqidno:1治疗与t细胞亚群中的免疫偏离有关，其特征在于肿瘤坏死因子α(tnfα)和il-10的分别地减少和增加。此外，还发现来自seqidno:1临床应答者的外周血单个核细胞(pbmc)表达显著更高水平的程序性细胞死亡-1(pd-1)蛋白，其先前报道有助于病理状况(诸如慢性病毒感染和癌症)中的t细胞无反应性和衰竭。

健康个体和类风湿关节炎患者的免疫特征的集群分析揭示了各种免疫细胞区室中的严重干扰(图8)。用seqidno:1治疗实现的免疫耐受重塑类风湿患者的免疫组(图8b)。通过利用t细胞上的表面和活化标志物的染色组来研究免疫耐受背后的潜在免疫机制(图13)。鉴于调节性t细胞(treg)在调节效应t细胞(teff)的促炎性作用中的重要作用，评估了seqidno:1应答者和安慰剂无应答者的treg区室的任何表型差异(图8c)。t-sne集群显示，在seqidno:1临床应答者中更显著代表的t细胞亚群是cd4+t细胞，其特征在于cd25、hla-dr和gitr表达(图8d)。手动选择(gating)cd4+foxp3+treg显示，seqidno:1应答者中较高百分比的treg表达糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白(gitr)、pd-1和人白细胞抗原-抗原d相关(hla-dr)(图8e)。这表明seqidno:1应答者中发现的t细胞是活化的treg，其可能有助于诱导耐受。

在治疗方案结束时，来自seqidno:1应答者的cd4+teff细胞表达显著较低水平的il-17a和ifnγ(图9a)。因此，用seqidno:1的成功治疗通过降低其产生促炎性细胞因子的能力来诱导teff细胞的免疫偏离。treg细胞数量的增加可以是这种观察的一种可能的解释。然而，treg的频率在试验开始和试验结束之间没有变化(图9b)。这表明treg活性的改变反而有助于在cd4+teff细胞中观察到的变化。从seqidno:1应答者和安慰剂无应答者中分离的treg在抑制cd4+teff细胞增殖的能力方面显著不同(图9c)，表明临床控制的建立可归因于seqidno:1应答者中treg功能的恢复或增强。

如前所述，与安慰剂无应答者相比，来自seqidno:1应答者的更大比例的cd4+foxp3+treg表达pd-1(图8e)。与该观察相一致，在与seqidno:1肽孵育后，从seqidno:1应答者而非临床无应答者中分离的treg上的pd-1的表达在tend时相对于在t0时是增加的(图10a)。先前研究已提出，pd-1相关通路对treg功能的积极作用，因此可能treg上增加的pd-1的表达可以积极地影响其功能。在seqidno:1治疗结束时，在pd-1+treg和pd-1-treg之间进行了抑制teff增殖能力的比较。pd-1+treg而非pd-1-treg能够抑制teff细胞的增殖(图10b)。此外，这种抑制作用依赖于pd-1而不是其配体pd-l1，因为抑制pd-l1不改变其控制teff增殖的能力(图10c)。

通过控制foxp3表达，stat-5的磷酸化与维持treg稳态和功能性treg的发育有关。在我们的研究中，阻断pd-1导致pd-1+treg上磷酸化stat-5(pstat-5)表达的降低(图10d)。还通过共聚焦显微镜检查pd-1+treg中的pstat-5，pd-1的阻断显著减少了pstat-5的表达，如图10e&10f中所示。因此，treg的功能可以通过stat信号通路与pd-1的表达错综复杂地相联系。

对总treg、pd-1+treg和pd-1-treg进行定量pcr，以评估treg功能的各种基因特征的表达。如图10g中所示，标志基因ctla-4、foxp3和il-10的表达在pd-1+treg和pd-1-treg之间没有差异。相反，pd-1+treg中tgfβ的表达显著高于pd-1-treg中的表达(图10g)。此外，基因阵列分析还揭示了seqidno:1应答者的pbmc中潜在型tgfβ结合蛋白4(ltbp-4)基因的边际(marginal)上调(图14a)。ltbp4编码的蛋白属于ltbp家族，其在控制tgfβ通路的活化中起关键作用。tgfβ升高的表达可代表pd-1+treg利用的抑制机制之一，因为同时抑制pd-1和tgfβ比仅抑制pd-1或tgfβ对pd-1+treg抑制teff增殖的能力的降低程度更大(图14b)。

有趣的是，pd-1在介导有效耐受中的重要性可能不仅限于其在treg上的表达。虽然teff细胞上pd-1的表达没有随seqidno:1治疗而改变，并且在应答者和无应答者中没有差异(图10h)，但抑制teff细胞上pd-1的表达导致pstat-3表达的显著升高(图10i)。已描述了stat-3活化参与teff向th17表型的极化。

用突出显示记忆t细胞区室的标志物对seqidno:1hcq应答者和安慰剂hcq无应答者的pbmc进行第二集群分析(图11a)。在seqidno:1应答者的该细胞亚群中富集的免疫表型是显示活化和致耐受性特征的记忆t细胞(图11b)。更具体地，与安慰剂无应答者相比，seqidno:1应答者中更大比例的cd4+cd45ro+记忆t细胞被活化并且具有调节特性，其分别通过更高的cd69和tgfβ表达证明(图11c)。临床停用seqidno:1后一个月评估的受试者比安慰剂的表现的更好(图11d)。因此，尽管停止治疗，参数诸如关节疼痛(图11e)和关节肿胀(图11f)的持续改善归因于活化记忆t细胞的持续存在。

在seqidno:1给药之前使用羟氯喹(hcq)对seqidno:1的治疗活性具有协同效应。从健康对照中分离单核细胞衍生的树突细胞(dc)并用脂多糖(lps)活化。在hcq存在下产生的成熟dc显示活化标志物诸如hla-dr、cd83和cd86的降低和致耐受性标志物il-10和cd200表达的升高(图12a)。然后将hcq处理的和hcq未处理的成熟dc与cd4+t细胞共培养以评估这些dc在活化t细胞中的潜能。如图12b中所示，在hcq处理的dc存在下培养的cd4+t细胞表达更多的pd-1(在表面上和细胞内)和pdl1。

此外，这些t细胞还上调ctla-4、foxp3、il-10、tgfβ的表达(图12c)。这表明hcq改变了dc的表型，其因而有利于能够对teff细胞发挥调节功能的pd-1+treg细胞的发育。

本领域技术人员应该进一步理解，可以组合上述特征的变体和组合，不是替代物或取代物，以形成落入本发明预期范围内的进一步的实施方案。

序列表

<110>新加坡健康服务有限公司

(1)s·阿尔巴尼

<120>药物组合物及其治疗自身免疫病的用途

<130>2017.p00627

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