用于植物药的基于机理的质量控制的制作方法
根据美国法典第35卷第119(e)节，本申请要求于2016年6月22日提交的美国临时专利申请号62/353,313的优先权，其以引用方式被完全并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明在国家卫生研究院(nih)授予的ca154295的政府支持下进行。政府对这项发明有一定的权利。
发明背景
几个世纪以来，世界各地的人们一直在使用草药和植物药。今天，从草药中分离出的草药组合物、草药提取物和化合物在治疗一系列疾病和失调症方面发挥着重要作用，许多今天最常用的药物，如阿司匹林，就是以草药疗法开始的。
为了可靠地使用植物药治疗疾病，严格的质量控制是很重要的。与合成的药物组合物不同，合成的药物组合物可以更容易地控制和配制，植物药来源于生物衍生的植物物质。根据遗传变异、生长条件、种植和收获的时间以及制备植物药时植物物质的年龄，每种植物可含有不同浓度的一系列化合物。
由于这种差异，通常观察到不同批次的同一植物药可以具有不同的体内活性，这取决于单个植物的多样性以及制备方法的差异。还经常观察到，尽管不同批次的草药体内活性不同，使用标准化学分析方法(如色谱法和质谱法)，不同批次的草药仍然可以共享非常相似的化学特征(profiles)。通过这些化学分析方法无法检测到的微小杂质或成分变化可能会对植物药的整体活性产生剧烈的影响。因此，很难简单地通过化学分析方法来确定特定批次的草药组合物是否具有期望的体内活性。
phy906是基于黄芩汤草药混合物的草药混合物提取物，其在1800年前首次在中文文本中描述，并且已经被用于治疗胃肠道症状。phy906由黄芩(s)、甘草(g)、芍药(p)和枣(z)四种草药组成。phy906目前根据cgmp(现行药品生产和质量管理规范)制造。在临床试验中，phy906被证明能提高对癌症的化疗的治疗指数。
在本领域中，对于植物药和其它草药组合物的质量和潜在功效的测定方法存在尚未满足的需求，植物药和其它草药组合物不完全依赖于化学分析。本发明满足了这种未满足的需求。
技术实现要素：
本发明包括评价草药组合物测试批次的质量和潜在体内活性的方法，该方法包括使草药组合物的测试批次接受一种或多种生物分析方法，该生物分析方法选自：
(a)信号转导活性响应测定；以及
(b)基因表达测定；
然后将生物分析方法的测试批次结果与从具有已知体内活性水平的草药组合物的已知批次得到的结果进行比较；
其中对测试批次结果和已知批次结果之间的差异的测量提供对测试批次草药组合物的质量和潜在体内活性的评价。
在某些实施方式中，草药组合物包含一种或多种成分，该成分选自由黄芩(s)、甘草(g)、芍药(p)和枣(z)的草药提取物，其任何馏分和存在于草药提取物或其馏分中的任何活性化学物质组成的组。在其它实施方式中，草药组合物是phy906，其中phy906包含3:2:2:2(s:g:p:z)比例的黄芩(s)、甘草(g)、芍药(p)和枣(z)的草药提取物。
在某些实施方式中，信号转导活性响应测定包括一种或多种测定，该测定选自荧光素酶报告测定和酶测定组成的组。
在某些实施方式中，信号转导活性响应测定包括对选自炎症酶、细胞生长和分化酶以及内分泌和激素酶中的一种或多种酶的信号转导活性响应的测量。在其它实施方式中，一种或多种酶选自由tnfa-nfkb、tlr2-nfkb、tlr4-nfkb、il6-stat3、ifng-stat1/1、infa-state1/2、dex-gr、cox-2、inos、nrf2、tgfb-smad2/3、tpa-ap1、creb、wnt3a-lef/b-cat、vd3-vdr、er-α、er-β、dht-ar和醛固酮-mr组成的组。
在某些实施方式中，基因表达测定包括：用草药组合物处理hepg2细胞24小时，提取产生的mrna，并通过qrt-pcr分析对mrna进行量化。
在某些实施方式中，基因表达分析包括对一个或多个编码蛋白的基因进行测量，该蛋白具有选自炎症、抗氧化、生长和分化、代谢和细胞-细胞相互作用的功能。在其它实施方式中，一个或多个基因选自由icam、irf5、akr1c1、ho1、gclc、gclm、轴蛋白2、gdf15、igfbp3、okl38、pim1、sertad、sos1、bhmt2、cpt1a、slc7a11、cd24、emp2和krt23组成的组。
在某些实施方式中，一种或多种生物分析方法比化学成分分析方法更好地区分草药组合物的活性批次和草药组合物的非活性批次。在其它实施方式中，化学成分分析方法包括lc-ms(液相色谱法-质谱分析法)。
在某些实施方式中，如果测试批次结果在已知批次结果的约90％和约110％之间，则确定测试批次具有与已知批次足够相似的质量和潜在体内活性。
在某些实施方式中，通过lc-ms进一步分析草药组合物的测试批次的质量。
本发明还提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括通过使草药组合物接受一种或多种选自以下的生物分析方法来评价phy906的测试批次的质量和潜在体内功效：
(a)信号转导活性响应测定；以及
(b)基因表达测定；
将生物分析方法的结果与从具有已知体内活性水平的phy906的已知批次得到的结果进行比较；
其中对测试批次结果和已知批次结果之间的差异的测量提供对测试批次草药组合物的质量和潜在体内活性的评价，
并且如果phy906的测试批次在生物分析方法中显示出与phy906的已知批次相似的活性，则将phy906的测试批次给予受试者。
附图说明
结合附图阅读，将更好地理解本发明的具体实施方式的以下详细描述。为了说明本发明的目的，在附图中示出了具体实施方式。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示的实施方式的精确安排和工具。
图1a-1d示出了phy906的不同批次和f(市售黄芩汤提取物混合物)中体内活性和化学相似性之间的比较。描绘的结果表明，化学分析与生物效应之间缺乏相关性。图1a报告了phy906的不同批次和f对cpt11抗肿瘤活性和荷结肠瘤的bdf1小鼠体重保护作用的影响。图1b报告了用lc-ms检测到的phy906的化学相似性分析。图1c是报告phy906的不同批次和f中的化学相似性的表，其中“1”表示相同的化学特征，“0”表示完全不同的化学特征，没有重叠。图1d以基于化学特征的聚类分析报告图1c中的信息。
图2a-2c报道了phy906不同批次和f中的信号转导活性响应分析。描绘的结果表明转导活性响应与生物活性之间密切相关。图2a报道了使用不同荧光素酶报告细胞系和酶测定，phy906的不同批次和f对信号转导活性响应的影响。图2b是报告phy906的不同批次和f的信号转导活性响应的相关分析的表，其中“1”表示相同的信号转导活性，“0”表示完全不同的信号转导活性。图2c以基于信号转导活性响应的聚类分析报告图2b中的信息。
图3a-3c报道了phy906的不同批次和f中的基因表达分析。描绘的结果表明基因表达与生物活性之间密切相关。图3a报告了phy906的不同批次和f对选择基因表达的影响。用phy906或f处理hepg2细胞24h，提取mrna进行qrt-pcr分析。图3b是报告phy906和f的基因表达的相关分析的表，其中“1”表示相同的基因表达，“0”表示完全不同的基因表达。图3c以基于基因表达的聚类分析报告图3b中的信息。
具体实施方式
本发明在一个方面涉及意想不到的发现，即具有几乎相同的化学分析特征的草药组合物可以具有高度差异的体内活性。本发明还涉及一种意想不到的发现，即生物测定，包括信号转导活性响应测定和基因表达测定，是比化学分析特征更好的草药组合物的潜在体内活性的预测物(predictors)。
在某些实施方式中，本发明涉及评价草药组合物的批次质量的方法，该方法包括使草药组合物接受一种或多种生物分析方法。在某些实施方式中，草药组合物包含一种或多种成分，该成分选自由黄芩(s)、甘草(g)、芍药(p)和枣(z)的草药提取物，其任何馏分和存在于草药提取物或其馏分中的任何活性化学物质组成的组。
定义
如本文中所使用的，以下术语中的每一个都在本节中具有与其相关联的含义。
除非另有定义，这里使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，仍然描述了示例性方法和材料。
通常，本文中使用的术语和药理学、天然产物化学和有机化学中的实验室步骤是本领域公知的和常用的。
如本文所使用的，冠词“一”和“一个”指的是一个或多于一个(即，至少一个)冠词的语法对象。举例来说，“一个元素”是指一个元素或多个元素。
如本发明所用，术语“癌症”被定义为以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散，也可以通过血流和淋巴系统扩散到身体的其它部位。各种癌症的实例包括但不限于骨癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
在一个方面，与受试者有关的术语“共同给予的”和“共同给予”是指将本发明的化合物和/或组合物与也可治疗或预防本文所预想的疾病或失调症的化合物和/或组合物一起给予于受试者。在某些实施方式中，共同给予的化合物和/或组合物单独给予，或作为单一治疗方法的一部分以任何种类的组合给予。共同给予的化合物和/或组合物可以在各种固体、凝胶和液体配制剂下，以任何种类的组合配制成固体和液体的混合物，并配制成溶液。
如本文所用，术语“提取物”是指衍生自天然存在的来源(如草药或其它植物材料)的化合物或药物的浓缩制剂或溶液。提取物可通过多种方法制备，包括将草药浸泡在溶液中，或将草药干燥和研磨成粉末并将粉末溶解在溶液中。在溶液中溶解一定量的所需化合物后，可通过除去一部分溶剂来进一步浓缩提取物。提取物也可以被过滤或离心以从溶液中除去任何固体物质。
如本文所用，术语“黄芩汤”是指包含甘草(g)、芍药(p)、黄芩(s)、枣(z)的草药组合物。黄芩汤可以有多种不同的配制剂，包括phy906和f。
如本文所用，短语“抑制”是指将分子、反应、相互作用、基因和/或蛋白质的表达、稳定性、功能或活性降低可测量的量或完全阻止。抑制剂是例如结合、部分或完全阻断刺激、降低、阻止、延迟激活、失活、脱敏或下调蛋白质或基因的稳定性、表达、功能和活性的化合物，例如拮抗剂。
如本文所用，术语“phy906”是指包含甘草(g)、芍药(p)、黄芩(s)和枣(z)的特定草药组合物。phy906可以指，例如，根据标准操作程序制备的以3:2:2:2的比例包含s、g、p和z的特定组合物。
如本文所用，考虑给予的术语“受试者”、“患者”或“个体”包括但不限于人类(即，任何年龄组的男性或女性，例如，儿科受试者(例如，婴儿、儿童、青少年)或成人受试者(例如，年轻人、中年人或老年人))和/或其它灵长类(例如，食蟹猴、恒河猴)；哺乳动物，包括市售有关的哺乳动物，如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫和/或狗；和/或鸟类，包括市售有关的鸟类，例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑和/或火鸡。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指当给予患者时，治疗、最小化和/或改善疾病或失调症的症状的本发明化合物的量。构成“治疗有效量”的本发明化合物的量将根据化合物、疾病状态及其严重程度、待治疗患者的年龄等变化。治疗有效量可由本领域普通技术人员考虑他自己的知识和本公开常规地确定。
如本文所用，术语“治疗(treatment或treating)”定义为对受试者应用或给予治疗剂，即，在本发明中有用的化合物(单独或与另一种药剂组合)，或对来自具有癌症、癌症症状或发展癌症的可能性的受试者(例如，用于诊断或离体应用)的分离组织或细胞系应用或给予治疗剂，其目的是痊愈、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改良或影响癌症、癌症症状或发展癌症的可能性。这类治疗可以根据从药物基因组学领域获得的知识，专门定制或修改。
范围：贯穿本公开，可以以范围形式呈现本发明的各个方面。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应当被解释为对本发明的范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了该范围内的所有可能的子范围以及各个数值。例如，诸如1至6的范围的描述应当被认为已经具体公开了子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个和部分数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。其适用与范围的宽度无关。
本文使用以下缩写词：
cgmp现行药品生产和质量管理规范
f黄芩汤的市售配制剂
g甘草(glycyrrhizauralensisfisch)，又名中国甘草(chineseliquorice)
hqt黄芩汤
p芍药(paeonialactiflorapall)，又名中国芍药(chinesepeony)
pcr聚合酶链反应
qrt-pcr定量逆转录聚合酶链反应
s黄芩(scutellariabaicalensisgeorgi)，又名黄芩(baikalskullcap)
或scute
star信号转导活性响应
z枣(ziziphusjujubemill)，又称红枣(reddate)或大枣(chinesedate)
质量确定方法
本发明包括评价草药组合物的批次的质量和潜在体内功效的方法，该方法包括使草药组合物接受一种或多种生物分析方法，该生物分析方法选自：
(a)信号转导活性响应测定；以及
(b)基因表达测定；
然后将生物分析方法的结果与从具有已知体内活性水平的草药组合物的批次得到的结果进行比较，其中对测试批次结果和已知批次结果之间的差异的测量提供对测试批次草药组合物的质量和潜在体内活性的评价。
在某些实施方式中，草药组合物包含一种或多种成分，该成分选自由黄芩(s)、甘草(g)、芍药(p)和枣(z)的草药提取物，其任何馏分和存在于草药提取物或其馏分中的任何活性化学物质组成的组。在其它实施方式中，草药组合物是phy906，其中phy906包含3:2:2:2(s:g:p:z)比例的黄芩(s)、甘草(g)、芍药(p)和枣(z)的草药提取物。在其它实施方式中，草药组合物可包含衍生自任何其它植物或草药来源、其任何馏分、或存在于植物或草药来源或其馏分中的任何活性化学物质的成分或提取物。
在某些实施方式中，可通过选自一种或多种荧光素酶报告测定和/或酶测定的信号转导活性响应测定来确定草药组合物的测试批次的质量和潜在功效。在其它实施方式中，信号转导活性响应测定测量一种或多种酶，其选自由tnfa-nfkb、tlr2-nfkb、tlr4-nfkb、il6-stat3、ifng-stat1/1、infa-state1/2、dex-gr、cox-2、inos、nrf2、tgfb-smad2/3、tpa-ap1、creb、wnt3a-lef/b-cat、vd3-vdr、er-α、er-β、dht-ar和醛固酮-mr组成的组。
在某些实施方式中，可通过基因表达测定来确定草药组合物的测试批次的质量和潜在功效，该测定包括用草药组合物处理hepg2细胞约24小时，提取产生的mrna并通过qrt-pcr分析定量mrna。在其它实施方式中，测量编码负责选自炎症、抗氧化、生长和分化、代谢和细胞-细胞相互作用的功能的蛋白的一个或多个基因的基因表达。在其它实施方式中，测量选自由以下组成的组的一个或多个基因的基因表达：icam、irf5、akr1c1、ho1、gclc、gclm、axin2、gdf15、igfbp3、okl38、pim1、sertad、sos1、bhmt2、cpt1a、slc7a11、cd24、emp2和krt23。
在某些实施方式中，本发明的生物分析方法比化学成分分析方法更准确地区分草药组合物的活性批次和草药组合物的非活性批次。在某些实施方式中，与通过标准化学分析方法相比，通过本发明的生物测定的结果，草药组合物的活性批次彼此之间的相关性更强。在某些实施方式中，本发明的方法可以区分草药组合物的活性批次和草药组合物的非活性批次，即使当它们共享具有大于90％相似性的化学分析特征时也是如此。在其它实施方式中，生物分析方法比化学成分分析方法更好地区分草药组合物的活性批次和草药组合物的非活性批次。在某些实施方式中，如果测试批次结果在已知批次结果的约85％和约115％之间，则认为测试批次具有足够相似的质量和潜在的体内活性。在其它实施方式中，如果测试批次结果在已知批次结果的约90％和约110％之间，则认为测试批次具有足够相似的质量和潜在的体内活性。在其它实施方式中，如果测试批次结果在已知批次结果的约95％和约105％之间，则认为测试批次具有足够相似的质量和潜在的体内活性。
在某些实施方式中，本发明的方法还包括通过lc-ms分析草药组合物的批次。
在某些实施方式中，本发明的方法可用于确定任何草药或植物组合物的批次的质量和/或潜在体内功效。
治疗方法
本发明还提供治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括通过使phy906接受一种或多种生物分析方法来评价该草药组合物的测试批次的质量和潜在体内功效，该生物分析方法选自：
(a)信号转导活性响应测定；以及
(b)基因表达测定；
将生物分析方法的结果与从具有已知体内活性水平的phy906的已知批次得到的结果进行比较；并且如果phy906的测试批次在生物分析方法中显示出与phy906的已知批次具有相似的活性，则将phy906的测试批次给予受试者。
在某些实施方式中，本发明的治疗方法可适用于任何已知的植物或草药组合物或药物。在其它实施方式中，本发明的治疗方法可适用于其它疾病或失调症的治疗。
试剂盒
本发明还涉及用于确定草药组合物批次的质量和潜在体内活性的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒包含选自信号转导活性响应测定和基因表达测定的一种或多种生物测定材料。在其它实施方式中，试剂盒还包含使用本发明的测定确定草药组合物批次的质量和潜在体内活性的说明书。
本领域技术人员将认识到，或者能够使用不超过常规的实验来明确本文所述的特定程序、实施方式、权利要求和实施例的许多等同物。这样的等同物被认为在本发明的范围内并且被所附权利要求所涵盖。例如，应当理解，反应条件的改变，包括但不限于反应时间、反应大小/体积和具有本领域公认的替代物的实验试剂，以及使用不超过常规的实验，都在本申请的范围内。
应当理解，无论在本文哪里提供的值和范围，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应当被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，这些值和范围所包含的所有值和范围都意味着包含在本发明的范围内。此外，本申请还考虑落入这些范围内的所有值以及值的范围的上限或下限。范围的描述应当被认为已经具体地公开了该范围内的所有可能的子范围以及单个数值，以及在适当时范围内的数值的部分整数。例如，诸如1至6的范围的描述应当被认为已经具体公开了子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。其适用与范围的宽度无关。
下面的实施例进一步说明了本发明的方面。然而，它们绝不是对本文阐述的本发明的教导或公开的限制。
实施例
现在参照以下实施例描述本发明。提供这些示例仅仅是为了说明的目的，并且本发明绝不应当被解释为限于这些实施例，而是应当被解释为包含由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变型。
材料和方法
草药提取物的制备
phy906由四种草药的传统热水提取物构成：分别为黄芩(s)、芍药(p)、甘草(g)和枣(z)，比例为3:2:2:2，并且按照标准操作程序制备。该提取物包含具有多种生物学和药理学性质的多种植物化学物质的复杂混合物。此时，不可能从整个混合物中鉴定相关生物活性植物化学物质的子集。为此，使用高级化学和生物度量来表征phy906产品。
phy906的原料经预先挑选，以符合phytoceuticatm所订的严格规格，以供草药制造商台湾的suntenpharmaceuticals验收。
将干燥的phy906(100mg)溶解在1毫升80℃水中。将混合物涡旋1分钟，再置于80℃水浴中30分钟，每10分钟涡旋1分钟。然后将样品在环境温度的水浴中冷却5分钟，以10,000rpm离心10分钟(eppendorfmodel5810r，usa)，并将所得上清液过滤(0.2μm)灭菌。对于随后的lc/ms分析，用980μl水稀释20μl淡褐色提取物的等分试样。提取和稀释后的最终标称浓度为每毫升水2毫克干重phy906粉末提取物。对于生物实验，将100毫克/毫升标称浓度的储备溶液在适当的缓冲液或培养基中稀释到所需的最终浓度。
phy906提取物由大于75％的小于1000amu的低分子量植物化学化合物、10％大分子组分(包括蛋白质、核酸、复合碳水化合物)和5％水构成。此外，在制造的喷雾干燥步骤过程中加入按重量计10％的赋形剂不溶性纤维素。如原子吸收测量所检测的，重金属(pb、hg、cd、as)浓度均小于0.5ppm，汞和镉小于0.03ppm。通过液相色谱-质谱联用仪或气相色谱-质谱联用仪，农药水平(bhcs、ddts、pcnb)浓度小于0.2ppm。总细菌计数为260cfu/g，而未检出大肠杆菌和沙门氏菌的种。超过按重量计90％的phy906(不包括水含量(5％)和不溶性淀粉赋形剂(10％))可再提取。最终的phy906液体提取物(100mg/ml)在室温下稳定18小时，适当储存的散装(bulk)干提取物(真空包装、不透光和4℃)表现稳定多于3年。有关phy906的更多详细信息可参见：lamw，bussoms，guanf，jiangz，zhangw，gullenea，liush，chengyc，2010，“thefour-herbchinesemedicinephy906reduceschemotherapy-inducedgastrointestinaltoxicity”，sci.transl.med.2(45)：45ra59。
体内小鼠模型
将小鼠结肠38细胞(1-2×106细胞，在0.1ml磷酸盐缓冲盐水中，pbs)皮下移植到4-6周龄雌性bdf1小鼠(charlesriverlaboratories)中。10-14天后，选择肿瘤大小为150-300mm3的小鼠。除非另有说明，治疗组每组由5只小鼠组成。每天监测小鼠的肿瘤大小、体重和死亡率。肿瘤体积使用公式长×宽(2)×π/6评估。除非另有说明，治疗组每组由5只小鼠组成。phy906(批次号6、10、11和f(其为市售黄芩汤)口服(p.o.)给药4天，在大约上午十点和下午三点给药(每天两次(b.i.d)，500mg/kg)，而cpt-11(360mg/kg)于第1天腹腔内(i.p.)给予。第1天，在cpt-11给予前30分钟给药phy906。在对照组中，给予小鼠媒介物，用于腹腔内给予的pbs，或者用于口服给予的水。数据经双因素方差分析(graphpadprism6)进行分析，当++(p<0.001)、+(p<0.05)和-(p>0.05)时，差异被认为有统计学显著性。
phy906代谢产物的化学特征的lc-ms分析
lc-ms分析采用agilent1200系列高效液相色谱仪和absciex4000qtrap质谱仪联用进行。分离在alltimatmhphplc柱(5mm，4.6×250mm)上进行。流动相为乙腈(a)和0.1％甲酸水溶液(b)，梯度洗脱：0分钟，5％a；10分钟，20％a；20分钟，25％a；40分钟，30％a；45分钟，35％a；55分钟，45％a；60分钟，70％a；62分钟，90％a；67分钟，90％a；68分钟，5％a；和75分钟，5％a。流速为1.0ml/min，柱温设定在30℃。用以下电离参数进行扫描速率4000amu/s的esi负模式质谱：cad：高；tem：550.00℃；gs1：55.00；gs2：50.00；ihe：开启；is：-4250.00；dp：-40.00；ces0.00；ce：-5.00。检测的质量范围为120-800amu。使用与mzmine软件集成的自定义程序，比较峰并创建聚类分析。
确定相关系数的算法
用graphpadprism6软件确定相关系数。每个原始“如果输入(ifinput)”表代表不同的基因或不同的信号通路。每列代表不同的批次。输入基因表达或ic50或ac50的值。选择软件的“列分析(columnanalysis)”功能进行相关分析。假设样本池为高斯(gaussian)分布，进行每对列之间的相关性。也计算皮尔逊(pearson)系数。
采用minitab17软件进行聚类分析。每个原始“如果输入(ifinput)”表代表不同的基因或不同的信号通路。每列代表不同的批次。输入基因表达或ic50或ac50的值。选择聚类变量功能。选择完全连锁法和距离度量相关性进行聚类分析。
star平台
下表列出的不同信号通路的荧光素酶报告细胞系。
表1
表1(续)
细胞在40μl培养基中以20000个细胞/孔接种于haft-area96孔微孔板中，并于37℃下5％co2培养箱中过夜。向细胞中加入不同剂量的从750μg/ml到83μg/ml的phy906水提取物，并置于37℃下5％co2培养箱中。在6小时时去除培养基后，用10μl裂解缓冲液(ph7.8的tris-hc25mm，dtt2mm，cdta2mm，甘油10％，tritonx-1001％)裂解细胞，并加入40μl荧光素酶反应缓冲液(ph7.8的tris-hci20mm，nahco31mm，mgso42.5mm，dtt10mm，辅酶-a锂60μm，荧光素钾225μm，atp250μ)用于使用发光微孔板读取仪读取发光。根据剂量-响应曲线确定ic50(抑制50％对照需要的浓度)或ec50(实现50％最大激活需要的浓度)。
cox-2活性测定
cox-2(caymanchemical)酶促反应按照制造商的说明书进行。用4倍体积的乙腈-甲醇(2:1)终止反应。离心后，用lc-ms定量上清液中的前列腺素类产物。色谱分离采用zorbaxsb-c18柱(100×2.1mm，agilent)在30℃下进行。流动相由线性梯度的0.05％(v/v)甲酸(a)和甲醇(b)组成：0.01-5.0分钟，60-60％b(v/v)；5.0-5.5分钟，60-80％b；5.5-35分钟，80-80％b；35-35.5分钟，80-60％b；35.5-40分钟，60-60％b。流动相流速为0.3ml/min。所有质谱实验均在api4000q-traq质谱仪上进行。将正交turbo-v源的注射器加热到550℃，以允许连接到hplc，而无需分离流动相。将超高纯氮气(n2)用作离子源气体(gs1、gs2)、幕式气体(cur)和碰撞气体(cad)，它们的流速分别为55、50、35和更高。进行负离子化的多反应监测(mrm)实验，以分别检测花生四烯酸和pge2在m/z：303→259，351.1→315处的离子跃迁。花生四烯酸和pge2的碰撞能分别设定在-20、-26v。analyst1.4.2软件控制数据采集。
inos活性测定
用比色亚硝酸盐测定测量inos活性。在ph7.3的50μl反应中使用一单位的inos酶(caymanchemical)，该反应由在0.1m4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)溶液中的2mmmgac2，0.2mmnadph，64μm四氢-l-生物蝶呤，1mg/ml牛血清白蛋白，40μmdtt，和3μmhbo2混合物组成。然后加入100μl有或没有草药提取物的l-精氨酸，混合物在37℃温育2小时。接着，加入100μlgriess试剂(1％磺胺、0.1％n-(1-萘基)乙二胺二氢和10％hcl)，并在540nm处测量光密度。
qrt-pcr方法
将2×105hepg2细胞与phy906(批次号6、10、11和f(其是市售黄芩汤))接触，并在有5％胎牛血清的rpmi1640培养基中接种于12孔组织培养板中，在37℃5％co2温育下过夜。然后用终浓度为850微克/毫升的phy906-6、phy906-10、phy906-11、f的水提取物或用水作为对照处理hepg2细胞，在37℃5％co2下温育24小时。用roche的高纯度rna分离试剂盒从hepg2细胞中提取mrna。用随机引物和逆转录酶mmlv(newenglandbiolabs，ipswich，ma)合成cdna。使用itaqtm
表2
实施例1：化学分析和体内活性的相关性
测试化学检测的标准操作方案在预测草药组合物的不同批次的体内功效方面的准确性。通过将草药组合物与cpt11共同给予荷结肠38肿瘤的bdf1小鼠测试phy906的不同批次和f(市售黄芩汤提取物混合物)的体内活性。确定hqt/cpt11治疗的抗肿瘤活性，以及治疗对受试者体重的影响。发现使用phy906配制剂生产的三种hqt组合物phy906-6、phy906-10和phy906-11共享相似的抗肿瘤和体重损失防止活性，但是发现第四种hqt组合物，即hqt的市售批次f具有较低的抗肿瘤活性，并且不能防止受试者的体重损失(图1a)。
然后，根据who指南，通过lc-ms对hqt的四个批次进行分析，以确定每种组合物的化学特征。在lc-ms光谱中指定73个特征峰，然后用于相似性分析(图1b)。使用与mzmine软件集成的定制程序，比较峰并创建聚类分析(图1c-1d)。lc-ms分析结果表明，hqt的所有4个批次共享相似的化学特征，但批次phy906-10和批次phy906-11彼此的相似性比它们与批次phy906-6或f的相似性更高，以及批次phy906-6和f彼此的相似性比它们与批次phy906-10或phy906-11的相似性更高。这一结果与体内结果形成了直接对比，在体内结果中，预期phy906-6、phy906-10和phy906-11都将共享非常相似的化学特征，而f将是一个异常值。
实施例2：信号转导活性响应测定
为了找到确定草药组合物批次的质量和潜在体内活性的更准确方法，在信号转导活性响应(star)平台中筛选hqt的四个批次(f、phy906-6、phy906-10和phy906-11)(图2a)。star平台包括17个与机制相关的荧光素酶报告细胞系和2个与hqt体内作用相关的酶测定，包括tnfa-nfkb、tlr2-nfkb、tlr4-nfkb、il6-stat3、ifng-stat1/1、infa-state1/2、dex-gr、cox-2、inos、nrf2、tgfb-smad2/3、tpa-ap1、creb、wnt3-lef/b-cat、vd3-vdr、er-α、er-β、dht-ar和醛固酮-mr。发现phy906的三个批次在荧光素酶报告细胞系和酶测定中展示出相似的ic50值，而f批次没有(图2b-2c)。基于star平台测定结果的相关性分析结果表明，phy906批次彼此共享0.95相关系数或更高，而f批次展示出较低的相关系数值。这些结果表明，star平台的生物测定结果是比lc-ms化学分析更好的hqt草药组合物批次的潜在体内活性的预测物。
实施例3：基因表达分析
用基因表达分析对hqt的四个批次进行进一步分析。针对一组与先前体内dna阵列数据相关的基因以及与phy906的假想作用机制相关的基因测试hqt批次，所述基因包括icam、irf5、akr1c1、ho1、gclc、gclm、轴蛋白2、gdf15、igfbp3、okl38、pim1、sertad、sos1、bhmt2、cpt1a、slc7a11、cd24、emp2和krt23。用hqt配制剂的其中一个的批次处理hepg2肝癌细胞24小时。然后提取产生的mrna并通过qrt-pcr进行分析(图3a)。发现phy906-6、phy906-10和phy906-11在基因表达谱中共享非常相似的活性，而f又是一个异常值(图3b-3c)。这些结果表明，基因表达分析是比lc-ms化学分析更好的hqt草药组合物批次的体内潜在活性的预测物。
本文中引用的每一个专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用其全部并入本文。虽然已经参照具体实施方式公开了本发明，但是显然本发明的其它实施方式和变型可以由本领域技术人员在不背离本发明的真正精神和范围的情况下设计。所附权利要求意在解释为包括所有这样的实施方式和等同变型。
序列表
<110>耶鲁大学
y·程
<120>用于植物药的基于机理的质量控制
<130>047162-7094wo1(00581)
<150>us62/353,313
<151>2016-06-22
<160>55
<170>patentinversion3.5
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agatcaaagggggtaagatcaaagggggtaagatcaaagggggtaagatcaaagggggta120
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<212>dna
<213>人工序列
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