用于使用电穿孔对脂肪组织进行微创体内转染的方法和装置与流程

本申请要求2016年9月23日提交的标题为“methodanddeviceforminimallyinvasiveinvivotransfectionofadiposetissueusingelectroporation”的美国临时专利申请序列号62/398,932和2017年3月31日提交的标题为“methodanddeviceforminimallyinvasiveinvivotransfectionofadiposetissueusingelectroporation”的62/480,180的优先权，所述申请中的每一者的全部内容都并入本文。

本发明涉及一种使用电穿孔对脂肪组织进行微创体内转染的方法和装置。

背景技术：

在二十世纪七十年代，人们发现电场可用于给细胞打孔而不会对细胞造成永久性损伤。这一发现使穿过细胞壁将大分子、离子和水引入细胞的细胞质中成为可能。在一些情况下，电穿孔可用于局部治疗(诸如头颈癌)，以将化学物质和其他化合物引入肿瘤中。在这些手术过程中，患者可能进行或可能不进行全身麻醉，因此必须使疼痛和非随意肌运动最小化。

骨骼肌是体内电穿孔(ep)介导的dna递送的充分表征的靶标。肌细胞能够长时间产生和分泌蛋白质，并且已经反复证明ep增强的dna疫苗接种到肌肉中能够产生免疫应答。皮肤是ep的另一个常见靶标；其易于进入，并且包含多种免疫细胞。皮肤的天然免疫功能及其高细胞更新速率通常导致对ep增强的dna递送的快速、强烈的体液应答。然而，肌肉epdna递送的应用由于皮下脂肪的可变厚度而变得复杂，从而防止“一刀切”的方法，因为不同的脂肪厚度导致刺入肌肉组织中的不同针穿透深度。

历史上，脂肪组织被视为主要用于以脂滴形式储存能量的惰性组织。因此，ep增强的dna程序尚未涉及这一特定的组织层。然而，最近的研究表明，皮下脂肪实际上起着许多动态作用。脂肪组织包含许多干细胞和免疫细胞，并通过分泌大量激素而充当内分泌器官，分泌许多局部信号，并且包含精细的毛细血管网。实现脂肪组织体内转染的任何尝试一直局限于需要施行者切下患者皮肤样品并将其物理移除以允许与脂肪组织直接接触的手术技术。这些治疗极具侵入性，并且不适用于临床装置。

技术实现要素：

一种对脂肪层组织中的脂肪细胞进行电穿孔的方法包括：提供具有第一接触表面的第一电极，所述第一接触表面具有第一周边；提供具有第二接触表面的第二电极，所述第二接触表面具有第二周边；获得组织折叠并将所述组织折叠定位在所述第一电极与所述第二电极之间，使得所述第一电极的所述第一接触表面面向所述第二电极的所述第二接触表面，从而在它们之间产生处理区。定位在所述处理区内的所述组织包括脂肪层组织。所述方法包括将电信号施加到所述第一电极和所述第二电极。

一种用于与组织折叠(其包括皮肤层、脂肪层和平滑肌层)一起使用的电穿孔装置包括框架、耦接到所述框架的第一电极、以及耦接到所述框架、与所述第一电极相对的第二电极。所述第一电极具有限定第一周边的第一接触表面，并且所述第二电极具有限定第二周边的第二接触表面。所述第一接触表面和所述第二接触表面在它们之间限定处理区。所述第一电极和所述第二电极被构造成使得定位在所述处理区内的所述组织包括皮肤层、脂肪层和表面肌层。

附图说明

图1是本发明的电穿孔装置的示意图。

图2是电穿孔装置的可选实施方案。

图3是沿图2的线3-3截取的剖视图。

图4是板状电极的透视图。

图5是板状电极的可选实施方案的透视图。

图6是示出应用于组织折叠的图5的板状电极的电场分布图。

图7是示出应用于组织折叠的图4的板状电极的电场分布图。

图8是应用于组织折叠的双板状电极设置的透视图。

图9是图8所示设置的电场模拟。

图10是图8所示设置的电流密度图。

图11是应用于组织折叠的针入式三电极设置的透视图。

图12是图11所示设置的电场模拟。

图13是图11所示设置的电流密度图。

图14是应用于组织折叠的三电极板设置的透视图。

图15是图14所示设置的电场模拟。

图16是图14所示设置的电流密度图。

图17：豚鼠脂肪垫数据。质粒：gfp处于0.5mg/ml，250μl。电参数：200v、3个脉冲、100毫秒持续时间、200毫秒延迟。绿色区域表示表达gfp的细胞。组织切片为100μm厚。

图18：图17的高倍放大。

图19：豚鼠脂肪组织数据。细胞边界周围的表达gfp的个体脂肪细胞围绕脂滴所驻留的非表达性内部。许多个体细胞已被转染。质粒：gfp处于0.5mg/ml，250μl。电参数：200v、3个脉冲、100毫秒持续时间、200毫秒延迟。

图20：兔脂肪组织数据。绿色＝gfp表达。红色＝脂质(油红o染色)。蓝色＝细胞核(dapi染色)。质粒：gfp处于0.5mg/ml，250μl。电参数：200v、3个脉冲、100毫秒持续时间、200毫秒延迟。

图21：豚鼠脂肪组织的共焦图像。许多细胞核不与任何转染区域相关联。gfp全部在细胞边缘周围表达。质粒：gfp处于0.5mg/ml，250μl。电参数：200v、3个脉冲、100毫秒持续时间、200毫秒延迟。

图22：注射体积在约50μl与200μl之间的情况下，转染区域没有明显改变。质粒：红色荧光蛋白(rfp)处于0.5mg/ml，250μl。电参数：200v、3个脉冲、100毫秒持续时间、200毫秒延迟。

图23：多次注射之后进行的单个电穿孔事件。每个注射部位都清晰可见。数字表示注射顺序。质粒：gfp处于0.5mg/ml，250μl。电参数：200v、3个脉冲、100毫秒持续时间、200毫秒延迟。

图24：不同的脉冲强度和数量可产生更亮的gfp信号(更多的转染细胞)。质粒：gfp处于0.5mg/ml，250μl。电参数：200v、3个脉冲、100毫秒持续时间、200毫秒延迟。

图25：使用ep将dmab递送到脂肪中。在进行dnaep之前将透明质酸酶预处理2小时。质粒＝pgx9249。箭头分别表示第一次处理和第二次处理。x轴是自上次处理以来的天数。处理1：1mg的总dna、200v、3个脉冲、100毫秒持续时间。处理2：2mg的总dna、75v、8个脉冲、100毫秒持续时间。

图26：与图25相同的研究，示出个体豚鼠dmab浓度。以红色突出显示的动物接受9100毫秒延迟的快速脉冲而不是1秒延迟脉冲。

图27：胰岛素针与喷射注射器-脂肪组织中的流体分布。染料＝亚甲蓝。无ep。

图28：(用酶预处理的)脂肪组织的酶组织分解改善了流体分布。染料＝亚甲蓝。

图29和图30：ep优化。记录了脉冲数增加情况下的电阻(图29)和电流(图30)的趋势。还记录了由于肌肉抽搐导致的100v处理的变异性。脉冲持续时间＝100毫秒。脉冲延迟＝100毫秒。

图31：免疫原性比较。将dna电穿孔到脂肪和侧腹部皮肤中。参数：电压和处理体积。

图32：组织-电极组件的3d计算机模型。非侵入性ep，其中组织折叠在两个板状电极之间。

图33：另一种组织-电极组件的3d计算机模型。使用直接插入组织中的平行针状电极的侵入性ep。

图34：使用200v激励电压来模拟针状电极(上图)和板状电极(下图)构型的不同组织类型内的电场分布。直方图(从左到右：脂肪、肌肉、皮肤)量化了每种组织类型内的高于50v/cm的电场的电场分布。右图示出定量分析中使用的电场分布，其中轮廓和标签为皮肤(s)、脂肪(a)和肌肉(m)。每个比例尺段(白色或黑色)长度为10mm，并且总比例尺长度为20mm。

图35：染料注射到豚鼠皮下脂肪垫中。a.单次100μl注射后的完整脂肪垫。b.沿纵分平面剖切以示出组织内的流体分布的单个部位注射。c.五次50μl注射后的完整脂肪垫。箭头表示注射部位。

图36：脂肪-ep程序，示出a.在应用电极之前修剪的肩胛间区域。b.处理部位夹持在两个非侵入性板状电极之间。c.所夹持处理部位的后视图。

图37：上图：在以50v至200v的范围进行非侵入性脂肪-ep之后的整个豚鼠脂肪垫中的gfp报告基因构建体表达(绿色)分布。下图：在没有ep(左图)情况下或在200v的脂肪-ep(右图)情况下接受质粒dna注射的豚鼠的处理部位处的荧光信号的比较。标记表示胶原隔膜(*)、表达gfp的脂肪细胞(箭头)和高自发荧光区域(箭头记号)。比例尺为10mm(上图)或100μm(下图)。

图38：在以200v进行脂肪-ep之后的完整豚鼠脂肪垫(左图)用于进一步的组织学分析，其中虚线表示剖切平面。(右图)将左侧的切片沿虚线切割成100μm厚的组织切片。用未染色组织的明场彩色图像覆盖gfp(绿色)。比例尺为10mm(左图)和1mm(右图)。

图39：示出单焦平面(中间列)和两个不同的3-d透视图(右边两列)中的gfp表达(绿色)和核(蓝色)的共焦图像。

图40：在以200v进行脂肪-ep之后的基因表达动力学和组织学变化。用于gfp表达的比例尺(上图)为10mm，并且用于h&e染色切片的比例尺(下图)为200μm。

图41和图42：对用编码流感抗原的质粒dna进行的脂肪-ep和id-ep疫苗接种的豚鼠抗体应答。在第0周、第3周、第6周和第21周用25μg质粒对豚鼠进行疫苗接种。图41：在豚鼠中进行不同脂肪-ep处理方法的体液免疫原性动力学，其中id-ep(皮肤)用于比较(n＝4)。图42：相同的免疫原性数据，按ep电压进行分组(对于脂肪hv和脂肪lv，n＝8；对于皮肤，n＝4)。数据是几何平均滴度±标准误差。脂肪-ep处理参数缩写为：hv＝高电压(200v)，lv＝低电压(50v)，并且对于图41的曲线图，dna注射部位数以数字(1或5)表示。

图43：对用编码流感抗原的质粒dna进行的脂肪-ep和id-ep疫苗接种的豚鼠t细胞免疫应答。在第0周、第3周、第6周和第21周用25μg质粒对豚鼠进行疫苗接种，并在最后一次疫苗接种后18天进行elispot。示出肽库1的结果。处理组按ep部位(皮肤或脂肪)进行划分，并且脂肪-ep处理进一步按电压(hv＝200v，lv＝50v)和质粒注射部位数(1或5)进行划分。数据为几何平均值±标准误差(n＝4)。

图44是耦接到电穿孔装置的板状电极的可选实施方案的透视图。

图45是用在测试受试者上的图44的电穿孔装置的照片。

图46至图48：绝缘卡钳和非绝缘卡钳应用于四只豚鼠的平均电数据，特别地，电流数据(图46)、电压数据(图47)和电阻数据(图48)。

具体实施方式

本发明人开发了一种以微创方式对脂肪层组织进行体内靶向和转染的电穿孔装置和方法。更具体地，处理利用多个板状电极结合注射机构将组织区域暴露于可预先测量的一定体积的试剂，然后在同一组织区域内产生电场，所述电场被构造为靶向脂肪层，从而在对应的脂肪细胞中引起电穿孔。

i)定义

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员之一通常所理解的相同的含义。在相冲突的情况下，以本文件(包括定义)为准。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但以下描述了优选的方法和材料。本文所提及的所有公布、专利申请、专利以及其他参考文献的全文以引用方式并入本文。本文所公开的材料、方法和实施例仅是例示性的，并不意图为限制性的。

如本文所用，术语“包括(comprise)”、“包括(include)”、“具有(having)”、“具有(having)”、“可”、“包含”以及其变型意图是不排除另外动作或结构的可能性的开放式连接词、术语或词语。除非上下文另外清楚规定，否则单数形式“一个”、“一种”以及“所述(the)”包括复数引用。本公开还涵盖“包括本文所呈现的实施方案或要素”、“由本文所呈现的实施方案或要素组成”以及“基本上由本文所呈现的实施方案或要素组成”的其他实施方案，无论是否明确地提出。

如本文所用，术语“约”在应用于一个或多个目标值时是指与所说明的参考值相似的值。在某些方面，术语“约”是指在所说明的参考值的任一方向上的(大于或小于)20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值范围，除非另外说明或以另外的方式从上下文显而易见(除了这样的数值将超过可能值的100％)。

“试剂”可意指多肽、多核苷酸、小分子或其任何组合。如pct/us2014/070188中详述的，试剂可以是编码抗体、其片段、其变体或其组合的重组核酸序列，所述专利申请以引用方式并入本文。“试剂”可意指包括多肽、多核苷酸、小分子或其任何组合的组合物。如pct/us2014/070188中详述的，组合物可包括编码抗体、其片段、其变体或其组合的重组核酸序列，所述专利申请以引用方式并入本文。例如，可在水或缓冲液中配制试剂。例如，缓冲液可以是盐水-柠檬酸钠(ssc)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。缓冲液的离子含量可以增加电导率，从而导致目标组织中的电流增加。所配制的多核苷酸的浓度可在1μg/ml与20mg/ml之间。例如，所配制的多核苷酸的浓度可以是1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、750μg/ml、1mg/ml、10mg/ml、15mg/ml或20mg/ml。

“抗体”可意指类别igg、igm、iga、igd或ige的抗体，或片段、其片段或衍生物，包括fab、f(ab')2、fd以及单链抗体及其衍生物。所述抗体可以是从哺乳动物的血清样品中分离出的抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，其对所需的表位或从其衍生的序列表现出足够的结合特异性。抗体可以是如本文所述的合成抗体。

如本文中可互换使用的“抗体片段”或“抗体的片段”是指包含抗原结合部位或可变区的完整抗体的一部分。所述部分不包括完整抗体的fe区的恒定重链结构域(即，ch2、ch3或ch4，这取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括但不限于fab片段、fab'片段、fab'-sh片段、f(ab')2片段、fd片段、fv片段、双抗体、单链fv(scfv)分子、包含仅一个轻链可变结构域的单链多肽、包含轻链可变结构域的三个cdr的单链多肽、包含仅一个重链可变区的单链多肽、以及包含重链可变区的三个cdr的单链多肽。

如本文所用的“片段”意指编码能够在哺乳动物中引发免疫应答的多肽的核酸序列或其部分。所述片段可以是选自编码下文所述的蛋白质片段的各种核苷酸序列的至少一种的dna片段。“片段”还可以是指能够在哺乳动物中引发免疫应答的多肽序列或其一部分。

如本文所用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可意指氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成的或天然与合成的修饰或组合。

如本文所用的“多核苷酸”或“寡核苷酸”或“核酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。多核苷酸可以是单链的或者双链的或可包含双链或者单链序列两者的部分。多核苷酸可以是dna、基因组和cdna、rna或杂合体。多核苷酸可包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合、以及碱基的组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、以及合成或非天然存在的核苷酸和核苷。多核苷酸可通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。

如本文所用的“受试者”可意指哺乳动物。哺乳动物可以是人、黑猩猩、豚鼠、猪、猕猴、狗、猫、马、牛、小鼠、大鼠或其他非人灵长类动物。

如关于核酸在本文中使用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列大致相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与其大致相同的序列杂交的核酸。

“变体”可进一步定义为通过氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列上有所不同、但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或促进免疫应答的能力。变体还可意指具有与参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，所述参考蛋白质具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即，以相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。这些微小变化可部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如本领域中所理解的(kyte等人，j.mol.biol.，1982年，第157卷，第105-132页)。所述氨基酸的亲水指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知，具有相似亲水指数的氨基酸可被取代并仍然保留蛋白质功能。在一个方面，亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可用于揭示将产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的背景下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽的最大局部平均亲水性，这是已报道与抗原性和免疫原性良好关联的有用度量。如本领域中所理解，用亲水性值相似的氨基酸进行取代可产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用亲水性值处在彼此的±2范围内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者都受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于这些氨基酸相对的相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其他特性所揭示的。

变体可以是在全基因序列或其片段的全长上大致相同的核酸序列。核酸序列可在基因序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。变体可以是在氨基酸序列或其片段的全长上大致相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在氨基酸序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

如本文所用的“载体”意指包含复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是dna或rna载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并优选地是dna质粒。

对于本文数值范围的叙述，明确地涵盖具有相同精确度的介于其间的每个中间数字。例如，对于6-9的范围，除6和9之外，还涵盖数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确地涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

ii)电穿孔装置

本发明涉及一种电穿孔装置，其包括具有多个非侵入性板状电极的施用装置。所述电穿孔装置还可包括向板状电极提供电穿孔信号的功率源，其中，当电极与生物样品电接触时，供应给电极的电穿孔信号主要被脂肪层组织吸收，使得在目标脂肪层中产生电场。此电场导致电穿孔在对应的脂肪细胞的细胞壁内发生，从而提高细胞膜的渗透性，并允许将例如试剂引入细胞中。如图1所示，本发明的电穿孔装置10包括壳体14，所述壳体14包括电穿孔(ep)信号发生器18；施用装置22，所述施用装置22可移除地耦接到壳体14；以及注射装置26，所述注射装置26用于在电穿孔发生之前将预定体积的试剂(诸如脂质)注射到样品的脂肪层中。

如图1所示，本发明的手持式施用装置22包括框架30；耦接到所述框架30的第一电极34，其中所述第一电极34具有第一接触表面38；以及耦接到所述框架30的第二电极42，其中所述第二电极42具有第二接触表面46，使得第一接触表面38和第二接触表面46彼此面对并且基本上对齐。在使用期间，施用装置22被构造为允许使用者操纵框架30，从而致使第一接触表面38与第二接触表面46之间的距离改变。出于本申请的目的，第一接触表面38与第二接触表面46之间的距离在本文中称为“电极距离50”。

施用装置22的框架30包括基部54和多个弹性臂58，每个弹性臂58从基部54延伸以产生对应的远侧端部62。当进行组装时，每个远侧端部62被构造成使第一电极34和第二电极42中的相应一者与其耦接。在所示实施方案中，臂58被构造成使得使用者可使臂58弹性变形，从而允许远侧端部62及其对应的电极34、42移动。例如，对应的电极34、42可相对于彼此独立地或一前一后地移动。在所示实施方案中，框架30包括两个臂58(图1)；然而，在可选实施方案中，框架30可包括更多或更少的臂58，以用于支撑处理期望目标组织所必要的多个电极。

如图2所示，施用装置22'的可选实施方案包括框架30'，所述框架30'具有从其延伸的三个臂58a'、58b'、58c'。更具体地，框架30'包括两个相对的臂58a'、58b'，其被构造来支撑第一电极34和第二电极42，使得第一接触表面38和第二接触表面46彼此面对并且基本上对齐。框架30'还包括第三臂58c'，其被构造来支撑第三电极66'，使得第三电极66'的第三接触表面68’被定位成垂直于第一接触表面38'和第二接触表面46’。在可选的施用装置22'中，电极距离50'被定义为第一接触表面38’与第二接触表面46'之间的距离(即，两个彼此面对的接触表面之间的距离)。

施用装置22还包括调节机构56，以用于在准备处理时以及在处理期间固定或以其他方式操纵电极距离50。调节机构56包括杆70，所述杆70在框架30的两个臂58之间延伸并与其以螺纹方式接合，使得杆70相对于臂58在第一方向上的旋转致使电极距离50缩小。相反，杆70相对于臂58在与第一方向相反的第二方向上的旋转致使电极距离50增大。在所示实施方案中，杆70被构造成使得电极距离50将保持固定，除非杆70由使用者旋转(即，螺纹不能够反向驱动)。在可选实施方案中，调节机构56可包括能够在脱离接合构型与接合构型之间调节的闩锁(未示出)，在脱离接合构型中，电极距离50能够由使用者调节，在接合构型中，电极距离50是固定的。在再一些实施方案中，调节机构56可包括本领域众所周知的并且本文未描述的任何形式的调节机构。

施用装置22还可包括传感器74，所述传感器74与信号发生器18可操作地连通并且被构造为在装置10的操作期间确定电极距离50。在使用期间，传感器74向信号发生器18发送指示当前电极距离50的信号。在一些实施方案中，传感器74可包括耦接到施用装置22的框架30的电阻传感器、光学传感器等。在所示实施方案中，传感器74向信号发生器18提供允许发生器18记录电极距离50数据并在处理期间自动补偿不同的电极距离50的信号。在可选实施方案中，传感器74可在显示器(未示出)上指示距离，从而允许使用者手动补偿电极距离50。在再一些实施方案中，施用装置22可被构造成使得使用者可将预定电极距离50输入到信号发生器18中，由此施用装置22将自动调节电极34、42以产生适当的电极距离50。在再一些实施方案中，传感器在本质上可以是机械的，从而在表盘等上显示电极距离50。

如图4所示，施用装置22的第一板状电极34具有被构造成直接接触目标组织的第一接触表面38。第一板状电极34可具有任何形状。例如，形状可以是矩形。第一板状电极34还包括第一周边78，所述第一周边78围绕接触表面38延伸并限定接触表面38的范围。在使用期间，第一板状电极34与信号发生器18可操作地连通并且被构造为在处理期间与样品组织接合并产生导电性。因此，板状电极34能够将由信号发生器18产生的电穿孔信号施加到目标组织。板状电极34还能够检测目标组织的参数，诸如阻抗、电压、电流等，并将该信息中继回信号发生器18以用于诊断和反馈。在所示实施方案中，

第一板状电极34的第一接触表面38是基本上平面的；然而，在可选实施方案中，第一接触表面38的轮廓可以是曲线的。在再一些实施方案中，第一接触表面38可包括意图使电极34与目标组织之间接触的表面积的量最大化的任何形状或大小。在再一些实施方案中，施用装置可包括多个电极34，其中的每一个包括第一接触表面38，所述第一接触表面38的大小和形状被具体地设定成与患者或测试受试者的身体的特定区域相对应。在再一些实施方案中，电极的大小和形状可用于聚焦目标组织内的电场分布。在再一些实施方案中，第一接触表面38可包括在其中形成的图案或滚花。在再一些实施方案中，第一接触表面38可包括施用于其的涂层或粘合剂，以用于改善电极34与目标组织之间的导电性或夹紧度。

图5和图6示出板状电极34”的可选实施方案。如上所述，板状电极34”基本上类似于上述板状电极34并且以与板状电极34相同的方式操作。因此，在本文中将仅详细描述两个电极34”、34之间的差异。如图5中最佳地示出，板状电极34”的接触表面38”包括基部54”和多个突出部58”，每个突出部58”基本上垂直于基部54”延伸一定突出深度64”以形成远侧端部62”。在使用期间，板状电极34”的突出部58”压入目标组织中而不刺穿目标组织，从而允许突出部58”破坏并改变皮肤的顶层，由此改善目标组织内的电场分布(比较图6和图7)并且还改善夹紧度。更具体地，突出部58”针对给定的输入电压增加目标组织内所形成的电场的强度。虽然所示实施方案的突出部58”都产生类似的突出深度64”，但应当理解，每个突出部58”的大小在必要时可以不同方式设定成对目标组织产生期望的导电性和夹紧度。更进一步地，所示实施方案包括大约500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm和3mm的突出深度64”。

在所示实施方案中，电极34”的每个突出部58”的形状是基本上角锥形的。每个角锥形突出部还可具有大约500μm×500μm、600μm×600μm、700μm×700μm、800μm×800μm、900μm×900μm、1mm×1mm、1.5mm×1.5mm、2mm×2mm、2.5mm×2.5mm、3mm×3mm的基部宽度。在可选实施方案中，每个角锥形突出部的基部尺寸还可以是非正方形的。在可选实施方案中，每个突出部58”可形成被构造成在操作期间压入目标组织中并使其变形而不刺穿组织的任何其他形状。例如，突出部58”的形状可以是圆柱形、矩形、圆锥形、截头圆锥形或截头角锥形的。此外，每个突出部58”可包括例如为大约500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm或3mm的宽度。

在另一些实施方案中，每个突出部58”可被构造来刺穿目标组织。例如，此类突出部58”可包括从基部54”延伸的针(未示出)。在再一些实施方案中，此类突出部58”的形状可被设定成皮下注射针、套管针等。在再一些实施方案中，此类突出部58”可具有钝头尖端或平头尖端。在再一些实施方案中，每个突出部58”的形状可与同一电极上的其他突出部58”以不同方式设定。

如图5所示，电极34”的突出部58”以矩形阵列的形式均匀地定位在板状电极34”的基部58”上。在可选实施方案中，突出部58”可以对目标组织提供必要导电性和夹紧度所必要的任何图案进行定位。例如，突出部58”可以同心环(未示出)或其他图案进行定位。

图44和图45示出板状电极34”'的另一个可选实施方案。板状电极34”'基本上类似于上述板状电极34并且以与板状电极34相同的方式操作。因此，在本文中将仅详细描述两个电极34”'、34之间的差异。如图44中最佳地示出，板状电极34”'的接触表面38”'包括一个或多个非绝缘部分500和一个或多个绝缘部分504，在所述一个或多个非绝缘部分500中，接触表面38”'在与目标组织接触时与目标组织形成第一电阻，在所述一个或多个绝缘部分504中，接触表面38”'在与目标组织接触时与目标组织形成大于第一电阻的第二电阻。在使用期间，接触表面38”'的非绝缘部分500”'和绝缘部分504”'与目标组织的交互作用影响施加到目标组织的所得电场。特别地，通过使电极34”'的接触表面38”'的至少一部分绝缘，电极34”'将电场更好地聚焦在目标组织的脂肪层内，从而减少肌肉抽搐的量和患者所经历的疼痛。换句话说，在与不具有绝缘部分的类似形状和大小的板状电极相比时，可选板状电极34”'减少了行进通过肌肉的电流量(参见图46至图48；其示出存在至少一个绝缘部分504”'的“绝缘卡钳”与不存在绝缘部分504”'的非绝缘卡钳之间的差异)。

如图44和图45所示，板状电极34”'的绝缘部分504”'包括定位在接触表面38”'与目标组织之间以用于增加它们之间的电阻(参见图45)的绝缘材料508”'层。在所示实施方案中，电极34”'包括由绝缘材料508”'形成的护套512”'，所述护套512”'可移除地定位在电极34”'的至少一部分之上。取决于护套512”’的大小和形状，接触表面38”'的不同大小和形状可被绝缘材料508”'覆盖。在再一些实施方案中，绝缘材料508”'(例如，像涂层)可施用到电极34”'的接触表面38”'。在再一些实施方案中，绝缘材料508”'可用可移除粘合剂(未示出)施用到接触表面38”'。

第二板状电极42基本上类似于第一板状电极34并且以与第一板状电极34相同的方式操作。第二板状电极42包括第二接触表面46，所述第二接触表面46具有限定第二接触表面46的范围的第二周边60。因此，在本文中将不再详细描述第二板状电极42。尽管所示实施方案示出第二板状电极42具有与第一电极34相同的大小和形状，但是应当理解，第二电极42的大小和形状可以与第一电极34不同的方式设定。此外，第二电极42的第二接触表面46的大小和形状可以与第一电极34的第一接触表面38不同的方式设定。在再一些实施方案中，一个板状电极可包括突出部58"，而另一个电极可不包括。更进一步地，一个板状电极可包括绝缘部分504"'，而另一个电极可不包括。

如图1所示，装置10还可包括注射装置26，以将试剂注射到期望位置处的目标组织中。更具体地，注射装置26包括贮存器82，所述贮存器82被构造来在其中保持预定体积的试剂；以及注射针86，所述注射针86从贮存器82延伸并与其流体连通以产生远侧端部90。在使用期间，使用者将注射针86插入目标组织中，使得远侧端部90定位在期望深度处(即，在脂肪层104内；参见图11)。然后，使用者可将容纳在贮存器82内的流体注射穿过针86，离开远侧端部90并进入期望的组织中。虽然所示的注射装置26包括皮下注射针(即，胰岛素针)，但在可选实施方案中，应当理解还可使用喷射注射器或其他形式的注射装置。

另外，在一些实施方案中，注射装置26的针86可与信号发生器18可操作地连通，并且能够作为类似于第一板状电极34和第二板状电极42(参见图1)的电极执行。在此类实施方案中，信号发生器18可能够既将处理信号发送到针86，又将信息(诸如阻抗、电流等)接收回信号发生器18以用于诊断和反馈目的。

注射装置26还可包括深度限制器(未示出)，以用于控制远侧端部90在样品组织内的位置。在使用期间，可将深度限制器设置到预定深度，使得深度限制器将阻止针86的远侧端部90穿透到期望深度之外的组织中。在一些实施方案中，深度限制器可包括限定导向孔的硬止动件。在此类实施方案中，导向孔的长度决定针穿透目标组织的深度。在再一些实施方案中，深度限制器还可包括电耦接器，以用于将针86与脉冲发生器18电耦接。

iii)脂肪层的处理

上述装置可用于意图使用电穿孔通过试剂转染脂肪组织的各种治疗方法中。每种处理或“设置”提供有关在样品组织内产生的所得电场的大小、形状和特性的灵活性。每种设置还提供各种级别的侵入性。

a)双电极设置

为了施行通过双电极处理设置进行的处理，使用者首先获得患者，记录其希望处理的区域(area/region)(在下文中称为“组织区域100”)。出于本申请的目的，组织区域100可包括具有例如皮肤层104、脂肪层108和平滑肌层112中的一者或多者的皮肤组织。

皮肤层。皮肤层可具有两个部分：外表皮部分和表皮可连接到的真皮部分。在真皮下面可存在皮下层并且可包含蜂窝状组织和脂肪组织。来自真皮的纤维可向下延伸到皮下层中并将皮下层连接到皮肤层。皮下层可附着到下伏组织和器官。

表皮。表皮可由复层扁平上皮组成，并且包含角质细胞、黑素细胞和非色素性颗粒状树突细胞(例如，朗格罕氏细胞和葛兰氏细胞)。角质细胞可组织成若干层。层数可取决于身体中的位置。例如，在暴露于大的摩擦力的情况下，表皮可具有许多层，例如五层。例如，当暴露于不大的摩擦力时，表皮可具有少于五层。表皮可具有以下层中的一者或多者：基底层、棘层、颗粒层、透明层和/或角质层。

真皮。真皮可由包含胶原纤维和弹性纤维的结缔组织组成。真皮可以是薄的或厚的，这取决于身体中的位置。例如，真皮在手掌和脚底中可较厚，而在眼睑中较薄。真皮可包含血管、神经、腺体和毛囊。真皮可具有乳头区域或层，所述乳头区域或层可由包含细小的弹性纤维的疏松结缔组织组成。乳头区域还可具有突出到表皮中的真皮乳头。这些乳头可包含毛细血管、触觉小体(或梅氏小体)，这些触觉小体是对触觉敏感的神经末梢。真皮乳头可在上覆表皮中引起脊。

真皮的剩余部分可以是网状区域或层。此区域可包含密集的结缔组织和胶原纤维束以及粗大的弹性纤维束。网状区域的不同厚度可至少部分地造成皮肤厚度的差异。

脂肪层。脂肪层或组织可以是脂肪细胞在其中储存脂肪的疏松结缔组织的形式。脂肪细胞可通过细胞内的脂肪滴将其细胞质和核推到细胞边缘。每个脂肪细胞可由胶原基底膜包围以用于结构支撑，并且可与毛细管接触。脂肪细胞簇可包含在“叶”内，这些叶可通过胶原性隔膜保持在一起。在疏松结缔组织所在的任何地方都可以找到脂肪组织。脂肪组织可在皮肤下面的皮下层中。

平滑肌层。平滑肌层可定位在例如像血管的中空内部结构的壁中。平滑肌也可附着到毛囊。平滑肌层是无横纹、非随意肌肉组织，并且可受到非随意神经和一些激素的影响。平滑肌层是一种不同于心肌组织和骨骼肌组织的肌肉层。骨骼肌主要附着到骨，并且可移动骨骼的各部分。骨骼肌也是有横纹的，因为当在显微镜下检查组织时，条纹或交替的浅色和深色带状结构是可见的，并且是随意的，由此可通过有意识的控制来使其收缩和松弛。心肌组织是有横纹的和非随意的，并且形成心脏壁的大部分。

在选定处理区域的情况下，使用者获得注射装置26并将针86插入组织区域100中，使得远侧端部90定位在脂肪层108内。然后，使用者将一定体积的试剂、任选地预先测量体积的试剂注射到组织区域108的脂肪层108中，从而产生注射部位116。一旦注射完成，使用者就将针86从组织区域100移除。

在针86被移除的情况下，使用者操纵组织区域100的包含注射部位116的一部分并在其中产生折叠120。操纵组织使得包含在折叠120内的组织局限于皮肤层104、脂肪层108和平滑肌层112。折叠120中不包括骨骼肌(未示出)。所得折叠120包括第一侧124、与第一侧124相对的第二侧128、以及在第一侧124与第二侧128之间延伸的顶部132。(图8)。折叠120还限定折叠厚度134，所述折叠厚度134被定义为第一侧124与第二侧128之间的距离。

在制备折叠120之后，使用者操纵施用装置22的框架30或调节机构67，直到电极距离50略大于折叠厚度134为止。然后，使用者对施用装置22进行定位，使得每个电极34、42定位在折叠120的相对侧上，其中接触表面38、46面朝内(参见图9)。更具体地，使用者对施用装置22进行定位，使得第一板状电极34的第一接触表面38与折叠120的第一侧124接触，并且第二板状电极42的第二接触表面46与折叠120的第二侧128接触，从而在它们之间产生处理区136。一旦就位，使用者就可增大或减小电极距离50以便将折叠120有效地夹在两个电极34、42之间。

出于本申请的目的，处理区136被定义为空间体积，所述空间定位在第一电极34与第二电极42之间，并由第一接触表面38和第二接触表面46限定在两侧上，并且由在第一接触表面38的第一周边78与第二接触表面46的第二周边60之间延伸的假想阻隔件限定在剩余侧上(参见图8至图10)。这样，在使用者将第一电极34和第二电极42定位在折叠120的相对侧上之后，当前所描述处理的处理区136将包含折叠120的至少一部分和折叠120中的注射部位116的至少一部分。在所示实施方案中，在处理期间定位在处理区136内的组织局限于皮肤层104、脂肪层108和平滑肌层112。处理区136中不包括任何骨骼肌。

尽管所示实施方案示出电极34、42的接触表面38、42被放置成与折叠120直接接触，但应当理解，可利用导电凝胶(未示出)或其他物质来改善电极34、42与折叠120之间的电连通。

一旦电极34、42就位，施用装置22的传感器74就确定电极距离50并将该信息中继到信号发生器18，从而允许信号发生器18相应地设定电穿孔信号150的参数。信号发生器18还可产生测试信号(即，低电压脉冲)，其中所得电流和电压可由电极34、42检测，并且随后由信号发生器18使用以计算经处理组织的阻抗。此外，在测试信号期间由电极34、42检测的数据还可用于验证脉冲成功发射。为此，信号发生器18比较电流是否保持达脉冲持续时间，如果定时不匹配(即，多于一个或两个数据收集点丢失)，那么脉冲可被认为是不完整的。更具体地，电穿孔信号的脉冲电压158、脉冲长度162、脉冲数和/或脉冲延迟166中的至少一者可至少部分地由电极距离50确定(在下文进行描述)。在所示实施方案中，电极距离50由施用装置22的传感器74自动确定。然而，在可选实施方案中，使用者可手动测量电极距离50并将电极距离50输入到装置10中。

在所示实施方案中，电穿孔信号150由一系列电“脉冲154”组成，其中每个脉冲154以预定脉冲电压158进行递送并持续预定脉冲长度162。另外，每个单独脉冲154在时间上与相邻脉冲154隔开一定脉冲延迟166。(图26)。在所示实施方案中，电穿孔信号包括在大约50v与大约200v之间的脉冲电压158。在其他实施方案中，信号可包括在大约5v与大约10v之间的脉冲电压158。在再一些实施方案中，信号可包括大约1kv的脉冲电压158。此外，所示的电穿孔脉冲长度162为大约100微秒、200微秒、300微秒、400微秒、500微秒、600微秒、700微秒、800微秒、900微秒、1毫秒、10毫秒、50毫秒、75毫秒和100毫秒。此外，电穿孔脉冲延迟166为大约1毫秒、50毫秒、100毫秒、500毫秒和1秒。更进一步地，每个电穿孔信号包括在大约1个脉冲与大约10个脉冲之间的脉冲。总的来说，在一些实施方案中，电穿孔信号150可包括在大约200v、持续时间为大约100毫秒、脉冲之间的延迟为大约200毫秒下的3个脉冲。在其他实施方案中，电穿孔信号150可包括在大约50v、持续时间为大约100毫秒、脉冲之间的延迟为大约200毫秒下的3个脉冲。在其他实施方案中，电穿孔信号150可包括在大约50v、持续时间为100毫秒、脉冲之间的延迟为大约1秒下的10个脉冲。在其他实施方案中，电穿孔信号150可包括75v、持续时间为大约100毫秒、脉冲之间的延迟为大约100毫秒的8个脉冲。在其他实施方案中，电穿孔信号150可包括在大约500v和大约1000v之间、持续时间为大约10微秒和大约100微秒、脉冲之间的延迟为大约100毫秒至大约1秒的3个脉冲。在再一些实施方案中，电穿孔信号可包括单个脉冲。

在设定电穿孔信号的参数之后，装置10的信号发生器18将期望的信号发送到第一电极34和第二电极42，使得第一电极34中的一个充当正电极或负电极中的一者，而第二电极42充当正电极或负电极中的另一者。更具体地，信号发生器18可至少部分地根据检测到的阻抗值和电极距离50来调节电穿孔信号150的参数。在接收到电穿孔信号时，电极34、42将信号串联地传导到折叠120，从而在其中产生电场(图9和图10)。将所得电场集中在脂肪层108中，从而在折叠120内产生转染区域。更具体地，电场可产生形状为基本上球形或椭圆形的转染区域。然而，在可选实施方案中，转染区域的大小和形状可至少部分地取决于目标组织内的电场分布以及注射到目标组织中的试剂的位置和数量。此外，在与由通常用于皮下或肌内电穿孔递送的穿透针状电极构型进行的类似处理相比时，电流自由地流动通过下伏肌肉层112并且在注射部位116附近是相对较低的。电场的此类特性对于不需要免疫应答的处理可能是有益的。

在电穿孔完成之后，可将电极34、42从折叠120移除。

b)针入式三电极设置

为了施行通过三电极设置进行的处理，使用者首先获得患者，记录其希望处理的组织区域100。出于本申请的目的，组织区域100可包括具有例如皮肤层104、脂肪层108和平滑肌层112中的一者或多者的皮肤组织，如以上详细描述的。在选定组织区域100的情况下，使用者操纵组织区域100的一部分并在其中产生折叠120。更具体地，使用者操纵组织区域110，从而产生组织折叠120，所述折叠120包括皮肤层104、脂肪层108和平滑肌层112。折叠120中不包括骨骼肌。另外，所得组织折叠120包括第一侧124、与第一侧124相对的第二侧128、以及在第一侧124与第二侧128之间延伸的顶部132。折叠120还限定折叠厚度134，所述折叠厚度134被定义为第一侧124与第二侧128之间的距离。

在制备好折叠120的情况下，使用者获得注射装置26并将针86基本上平行于第一侧124和第二侧128纵向插入穿过折叠120。然后，使用者将预先测量体积的试剂注射到组织区域100的脂肪层108中，从而产生注射部位116。一旦注射完成，使用者就不将针86从组织100移除。

在注射部位116已产生并且针86仍然定位在组织100中的情况下，使用者操纵施用装置22的框架30或调节机构56，直到电极距离50略大于折叠厚度134为止。然后，使用者对施用装置22进行定位，使得每个电极34、42定位在折叠120的相对侧上(参见图11至图13)。更具体地，使用者对施用装置22进行定位，使得第一板状电极34的第一接触表面38与折叠120的第一侧124接触，并且第二板状电极42的第二接触表面46与折叠120的第二侧128接触，从而在它们之间产生处理区136(如上所述；参见图11至图13)。

尽管所示实施方案示出电极34、46的接触表面38、42被放置成与折叠120直接接触，但应当理解，可利用导电凝胶(未示出)或其他物质来改善电极34、42与折叠120之间的电连通。

一旦电极34、42就位，施用装置22的传感器74就确定电极距离50并相应地设定电穿孔信号的参数(如上所述)。信号发生器18还可产生测试信号(如上所述)，其中所得电流和电压可由电极34、42或针86检测，并且随后由信号发生器18使用以计算经处理组织的阻抗。在所示实施方案中，电穿孔信号150由一系列电脉冲154组成，其中每个脉冲154以预定脉冲电压158给出并持续预定脉冲长度162。另外，每个单独脉冲154在时间上与相邻脉冲154隔开一定脉冲延迟166。(参见图26)。在所示实施方案中，电穿孔信号包括在大约5v与大约500v之间的脉冲电压158。脉冲电压可以是例如5v、10v、20v、40v、60v、80v、100v、150v、200v、250v、300v、350v、400v、450v或500v。此外，所示的电穿孔脉冲长度162在大约1微秒与大约100毫秒之间。更进一步地，电穿孔脉冲延迟166在大约10毫秒与大约1秒之间。更进一步地，每个电穿孔信号包括在大约1个脉冲与大约10个脉冲之间的脉冲。在可选实施方案中，可改变电穿孔信号150的参数以实现不同试剂的最佳性能。可根据所使用的试剂、转染程度和期望的组织损伤来调节信号参数。例如，dmab构建体通常需要更低的电压、更短的脉冲持续时间和更长的脉冲间延迟，而dna疫苗通常需要更高的电压、更短的延迟和更长的脉冲。

在设定电穿孔信号的参数之后，装置10的信号发生器18将电穿孔信号发送到第一电极34、第二电极42和针86，使得针86充当正电极或负电极中的一者，而第一电极34和第二电极42一起充当正电极或负电极中的另一者。在接收到电穿孔信号时，电极34、42和针86将信号传导到折叠120，从而在其中产生电场(图12和图13)。所得电场集中在针86周围的脂肪层108中，从而减小从针86沿径向的强度。电场还产生转染区域，所述转染区域沿着针以非常细长的椭圆形状进行跟踪。另外，针86周围的电流是最高的。

在电穿孔完成后，可将电极34、42和针86从折叠120移除。

c)三板设置

为了施行通过三板设置进行的处理，使用者首先获得患者，记录其希望处理的组织区域100。出于本申请的目的，组织区域100可包括具有例如皮肤层104、脂肪层108和平滑肌层112中的一者或多者的皮肤组织，如以上详细描述的。在选定处理区域的情况下，使用者获得注射装置26并将针86插入组织区域100中，使得远侧端部90定位在脂肪层108内。然后，使用者将预先测量体积的试剂注射到组织区域108的脂肪层108中，从而产生注射部位116。一旦注射完成，使用者就将针86从组织区域100移除。

在针86被移除的情况下，使用者获得组织区域100的包含注射部位116的一部分并产生折叠120，所述折叠120包括注射部位116、皮肤层104、脂肪层108和平滑肌层112。折叠120中不包括骨骼肌。此外，所得组织的折叠120包括第一侧124、与第一侧124相对的第二侧128、以及在折叠120的第一侧124与第二侧128之间延伸的顶部132。折叠120还限定折叠厚度134，所述折叠厚度134被定义为第一侧124与第二侧128之间的距离。

在制备折叠120之后，使用者操纵施用装置22'的框架30'或调节机构56'，直到电极距离50'略大于折叠厚度134为止。然后，使用者对施用装置22'进行定位，使得第一板状电极34'的第一接触表面38'与折叠120的第一侧124接触，并且第二板状电极42'的第二接触表面46'与折叠120的第二侧128接触，从而在它们之间产生处理区136(如上所述)。使用者还对第三板状电极66'进行定位，使得第三接触表面68'与折叠120的顶部132接触，并且总体定位在第一电极34'与第二电极42'之间(参见图14至图16)，这样第三板状电极66'不直接接触第一电极34'或第二电极42'。

尽管所示实施方案示出电极34'、42'、66'的接触表面38'、46'、68'被放置成与折叠120直接接触，但应当理解，可利用耦合剂或导电凝胶(未示出)或其他物质来改善电极34'、42'、66'与折叠120之间的电连通。

一旦电极34'、42'、66'就位，施用装置22'的传感器74'确定第一电极34’与第二电极42'之间的电极距离50并相应地设定电穿孔信号的参数(如上所述)。信号发生器18还可产生测试信号(如上所述)，其中所得电流和电压可由电极34'、42'、66'检测，并且随后由信号发生器18使用以计算经处理组织的阻抗。在所示实施方案中，电穿孔信号由一系列电“脉冲154”组成，其中每个脉冲154以预定脉冲电压158给出并持续预定脉冲长度162。另外，每个单独脉冲154在时间上与相邻脉冲154隔开一定脉冲延迟166(参见图26)。在所示实施方案中，电穿孔信号包括在大约5v与大约500v之间的脉冲电压158。此外，所示的电穿孔脉冲长度162在大约1微秒与大约100毫秒之间。更进一步地，电穿孔脉冲延迟166在大约10毫秒与大约1秒之间。更进一步地，每个电穿孔信号包括在大约1个脉冲与大约10个脉冲之间的脉冲。

在设定电穿孔信号的参数之后，装置10将电穿孔信号施加到第一电极34'、第二电极42'和第三电极66'，使得第一电极34’和第二电极42'充当正电极和负电极中的一者，而第三电极66'充当正电极和负电极中的另一者。在接收到电穿孔信号时，电极34'、42'、66'将信号串联地传导到折叠120，从而在其中产生电场(图15和图16)。所得电场在第三板状电极66'的正下方是最强的，并且随着组织深度的增大而强度降低。此外，电流在皮肤层104中是强的，并且在脂肪层108中弱得多，从而在强电场之间产生期望的平衡，同时在注射部位处保持较低的电流。此类电场通常对于浅皮下脂肪中的dna注射是最佳的。

在电穿孔完成后，可将电极34'、42'、66'从折叠120移除。

iv)实施例。

实施例1。实验结果。使用上述处理的变型对雌性hartley豚鼠的皮下脂肪垫进行体内处理。在实验期间，使用者修剪靠近豚鼠颈部后部的处理区域附近的毛发。然后，使用脱毛膏将任何残余的发茬从处理区域完全除去。然后，使用胰岛素注射器将质粒注射到处理区域的脂肪层中，从而产生注射部位。然后，操纵处理区域的注射部位和皮肤组织，将皮肤、脂肪和平滑肌层与任何骨骼肌分离。然后，将所得皮肤折叠定位在一对板状电极之间，每个电极具有以导电凝胶覆盖的对应接触表面。最后，将电脉冲发送到板状电极，其中一个板状电极充当正电极而另一个板状电极充当负电极。在处理完成之后，取处理区域中的组织样品进行分析(参见图17至图30)。

染料注射研究表明，注射液优先沿着脂肪叶周围的胶原性隔膜向下行进，并且这些观察结果与gfp转染模式一致。为了表明编码蛋白质的切片，使用编码单克隆抗体的dna(dmab)进行脂肪靶向ep处理，这使得可检测全身的蛋白质水平。最后，对编码h1n1核蛋白质的质粒进行脂肪靶向的epdna疫苗接种显示出具有免疫原性。与传统的肌内注射途径相比，脂肪靶向的epdna疫苗接种可由于电压较低、注射较浅以及使用非侵入性电极而提供耐药性优势。

在更高的放大倍数下，由于大量的转染脂肪细胞，可在亮绿色中看到脂肪细胞特有的“蜂窝”图案。还注意到亮绿色胶原性隔膜是行进通过脂肪细胞网络的绿色实线。参见图18，其中绿色转染区域对应于夹在板状电极之间的组织体积。对脂肪组织切片的更仔细观察揭示了许多脂肪细胞。因为脂滴不表达蛋白质，所以每个细胞的内部不是明亮的。相反，在每个细胞的边缘周围发现了绿色荧光蛋白(gfp)，其中发生蛋白质合成、产生、运输和修饰(参见图17、图18和图19)。

这种技术在兔中(在颈部基底处的皮下脂肪中)也得到证实。参见图20，其中油红o染色突出显示脂滴，并且gfp绿色环围绕转染细胞。核以蓝色显示。

转染的豚鼠脂肪组织的共焦图像显示蛋白质在细胞的整个边界周围产生和表达。围绕脂肪细胞的许多较小细胞不表达gfp，这与脂肪细胞的特异性程度一致(参见图21)。

注射体积可从约200μl减少至50μl而不影响转染区域的大小(参见图22)。多次注射、之后进行单次ep可以是增加转染细胞数量的一种方式(参见图23)。降低电压和增加脉冲数可改善gfp信号，从而可能表示更多的转染细胞。与200v处理相比，80v处理引起明显更弱的肌肉抽搐(参见图24)。在对脂肪的第二次处理后，在豚鼠中产生约1000ng/ml的峰值水平的dmab。使用未优化的参数进行第一次处理(参见图25)。

接受快速脉冲的豚鼠比接受具有1秒的更长脉冲间延迟的脉冲的豚鼠产生更多的dmab(参见图26)。喷射注射呈现出在整个组织中更均匀地分布dna并转染更多细胞。参见图27。组织的酶分解改善了整个组织中的流体分布(参见图28)。随着脉冲数增大，电阻减小。在25v下，电流是基本上不可检测的(参见图30)。在100v下，肌肉抽搐强烈到足以导致电气读数波动(参见图29)。

实施例2。免疫原性。向五个实验组提供体内处理，所有实验组都接受相同剂量的dna。对于所述实验，对一个组给予真皮内ep以充当阳性对照组。使用高电压或低电压和高注射体积或低注射体积的各种组合在脂肪层组织中处理剩余的四个组。四个脂肪组的脉冲电压在大约50v至大约200v之间变化，而注射参数在单个部位大约100微升至每个部位50微升的五次注射之间变化。对于每次注射，稀释质粒以增大体积而不改变总dna剂量。

如图31所示，用高电压和高注射体积处理的脂肪组比任何其他组(包括真皮内处理组)具有更强且更快的体液免疫应答(即，终点滴度)。这种应答的强度在6周中持续增加。两种低电压处理(即，在高体积和低体积情况下)在3周后几乎没有应答，并且在6周后应答很弱或没有应答。

dna注射的体积和ep的电压两者呈现出影响脂肪组织中的免疫应答。注射到组织中的试剂体积增大对应于细胞与试剂之间的接触增加。增大的体积可解决与水配制的dna施用到脂肪组织中相关的问题。另外，ep电压越高，可能经历ep的细胞越多。此外，由于较高电压导致的任何组织损伤可有助于免疫应答和相关联细胞的诱导。

实施例3。用于实施例4-9的材料和方法。为了模拟不同的ep模态，在solidworks2013(solidworks公司，concord，ma，usa)中创建两个组织模型作为3dcad组件。这两个模型由三个电各向同性的层组成：皮肤、脂肪和肌肉。在这些模型中不包括角质层，因为低至50v的电压将在几微秒内透化角质层，并且角质层对总组织电阻的贡献则变得可忽略不计。角质层的厚度为约20μm，并且非常薄的层可导致有限元分析中的伪影。为了模拟组织夹在板状电极之间，创建折叠组织的几何形状，并将接触面积测量为400cm²的两个正方形板状电极的几何形状放置在折叠的相对侧(图32)。为了在同一组织内模拟穿刺针状电极，创建扁平组织几何形状，并将两个19mm的22号针几何形状放置到组织中，其中电极间距为10mm，穿透深度为18mm(图33)。

将这两个组织电极组件输出到ansysmaxwell2015.2(ansyssoftware公司，canonsburg，pa，usa)进行有限元分析。每种组织类型的电导率值是基于文献值的，并被假设为恒定的。模型中所使用的电导率值和一般组织尺寸在表1中列出。将激励电压施加到一个电极，同时给相对的电极分配零电压，并且创建在x-y分析平面中将电极二等分的截面以使电场强度可视化。

表1.

在将电极二等分的平面处测量的厚度

动物。所有动物研究均在机构动物护理和使用委员会批准的方案下进行。使用雌性hartley豚鼠进行所有体内研究。在将动物保持处于通过吸入异氟烷的全身麻醉下的同时进行处理和血液收集。使用平行于脊柱定向的29号胰岛素针对肩胛间皮下脂肪垫(位于颈部的颈背处)进行皮下注射。对于最终研究，首先将豚鼠置于全身麻醉下，然后通过心内注射戊巴比妥进行人道安乐死。

质粒。基因表达研究利用编码绿色荧光蛋白(gfp)的质粒dna。使用编码来自甲型流感(h1n1，a/puertorico/8)的全长核蛋白质(np)的质粒dna进行免疫研究。在盐水柠檬酸钠缓冲液中制备所有质粒制剂以得到1x的最终缓冲液浓度。

染料注射研究。将亚甲蓝(sigma-aldrich公司，st.louis，mo，usa)溶解在浓度为0.5mg/ml的去离子水中。对于单部位注射，对豚鼠皮下注射100μl的亚甲蓝溶液。对于多部位注射，进行五次单独的50μl皮下注射，间隔开大约5mm。在注射后，将整个脂肪垫紧紧夹在两个板状电极之间，以模拟完整的处理方案。立即对动物实施安乐死，并对脂肪垫进行完整成像、然后沿纵分平面切开并再次成像以使组织内的染料分布可视化。

一般脂肪-ep处理程序。对处理部位进行修剪和清洁，对肩胛间区域的皮下脂肪垫进行脂肪-ep处理，同时对侧腹部进行皮肤处理。对于脂肪处理，将组织捏夹在两个手指之间以分离脂肪垫，并使用平行于脊柱定向的29号胰岛素针注射dna。紧接着dna注射，用导电凝胶对附接到相对的卡钳钳口的两个板状电极进行涂覆，然后使用这两个板状电极夹住注射部位周围的组织，并使用elgen1000控制单元(inoviopharmaceuticals，sandiego，ca)对所述组织施用脉冲。对于id-ep处理，在真皮内注射dna，之后立即使用由4×4针状电极阵列组成的表面电穿孔(sep)装置进行电穿孔。

总体成像和组织学分析。对于绿色荧光蛋白(gfp)研究，用gfp质粒进行脂肪-ep，并且在预定时间点移除完整脂肪垫，并使用fluorchemr成像系统(proteinsimple公司，sanjose，ca，usa)对其进行成像。然后将脂肪垫冷冻，从脂肪垫的转染区域切下测量为大约10mm×10mm的样品，并以30μm的厚度沿观察转染深度的横向平面或沿观察转染细胞的水平分布的冠状平面冷冻切片。将一些切片固定在4％福尔马林中，在二甲苯中进行清洁，用dapi或hoechst3342(lifetechnologies公司，carlsbad，ca)进行染色，并使用fluoromount(ebioscience公司，sandiego，ca)盖上盖玻片。将其他切片固定在福尔马林中，在二甲苯中进行清洁，用苏木精和伊红(h&e)进行染色，并使用permount(vwr公司，radnor，pa，usa)盖上盖玻片。使用配备有micropublisher3.3相机(qlmaging公司，surrey，bc，canada)的olympusbx51显微镜(olympus公司，centervalley，pa)在明场中对h&e染色的切片进行成像。用retiga3000相机(qlmaging，surrey，bc，canada)捕集荧光图像。使用zeisslsm780激光扫描共焦显微镜(carlzeiss公司，jena，germany)获得共焦图像作为整个组织的高分辨率多面板和自动缝合z型堆叠，并且使用zen2012(carlzeiss)和imaris软件(bitplane，belfast，uk)进一步处理图像。

gfp表达和细胞动力学。使用100μg的编码gfp的质粒和200v、3个脉冲、100ms持续时间和100ms脉冲间延迟的ep参数对14只豚鼠进行脂肪-ep。作为对照物，两只豚鼠用ep处理但未接受质粒注射，而另外两只豚鼠接受质粒注射但未用ep处理。在处理之后3天将对照物处死，并且在处理之后的范围为处理后3小时至14天的时间间隔(n＝2)以及在长期随访的第60天将经处理的豚鼠处死。对脂肪垫进行完整成像用于gfp表达，然后对其进行切片并用h&e染色以使处理部位处的细胞浸润迹象可视化。

免疫原性研究。用25μg的npdna处理豚鼠。使4组豚鼠(n＝4)接受如上所述的脂肪ep处理，并且每组接受单次100μl的dna注射或5次单独50μl的注射，然后进行由具有200毫秒脉冲间延迟的三个100毫秒方波脉冲组成的单次ep处理。用sep装置通过id-ep接种疫苗的豚鼠(n＝3)充当此研究的比较组，因为此方法先前已显示转染表皮细胞，但不转染皮下脂肪细胞。脂肪-ep组如下：高电压ep与1个注射部位(hv-1)、高电压ep与5个注射部位(hv-5)、低电压ep与1个注射部位(lv-1)以及低电压ep与5个注射部位(lv-5)。对于接受5次注射的豚鼠，紧接着最终注射，进行单个ep程序。所有组的质粒dna总剂量是相同的。研究设计在表2中示出。在研究持续时间内每3周收集300μl血液并将血浆储存在-20℃下直到进行分析为止。紧接着血液采集，在研究的第0周、第3周和第6周施行处理。在研究的第21周，对所有动物进行免疫接种，并且在18天之后，收集3ml血液并分离外周血单核细胞用于elispot分析。

表2.

elisa使用酶联免疫吸附测定(elisa)分析来自接种疫苗的豚鼠的血清。使用在dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(pbs)(vwr公司)中用100微升/孔的0.3μg/ml的pnp抗原(sinobiological公司，beijing，china)涂覆一整晚的96孔板(thermofisherscientific公司，waltham，ma，usa)进行elisa。对板进行洗涤，用包含3％牛血清白蛋白(bsa)(sigma-aldrich公司)和0.05％吐温-20(sigma-aldrich公司)的pbs以150微升/孔在37℃下封闭1小时，然后再次进行洗涤。将血清在包含1％bsa和0.05％吐温-20(样品稀释缓冲液)的pbs中以100微升/孔从1:50连续稀释至1:2952450，并在37℃下温育2小时。然后对板进行洗涤，并且将辣根过氧化物酶缀合的山羊抗豚鼠igg(sigma-aldrich公司)用样品稀释缓冲液稀释至1:10000，并在37℃下以100微升/孔加入每个孔达1小时。对板进行洗涤并以100微升/孔向每个孔加入四甲基联苯胺(tmb)底物溶液(vwr公司)，并在6分钟后用tmb终止试剂溶液(vwr公司)终止显色。使用spectramaxplus384读板机(moleculardevices公司，sunnyvale，ca，usa)测量每个孔中450nm处的吸光度值，并如frey等人所述地计算阳性滴度的截止值，其中阴性对照(在这种情况下，为预取血样品)的均值吸光度和标准偏差用于计算截止吸光度值。终点滴度用于所有呈现的elisa结果。

elispot。在免疫研究的第21周对接种疫苗的豚鼠进行免疫接种，并且在18天后，使用先前在内部开发的方法抽取3ml外周血并收集在edta管中以进行干扰素γ(ifn-γ)elispot。用hbss将血液稀释至1:1，并在ficoll-paqueplus(gehealthcarebiosciences公司，pittsburgh，pa，usa)上进行离心。收获血沉棕黄层并将其以1×106个活细胞/毫升的浓度重悬于r10培养基中，并以1×105个细胞/孔的密度接种于用5μg/ml初级抗ifn-γ抗体(v-e4)涂覆一整晚的96孔milliporeip板上，并用包含10％(w/v)蔗糖和2％(w/v)bsa的1xpbs进行封闭。一式三份，将pbmc与伴刀豆球蛋白a(cona)或先前发现的免疫刺激的三种不同np抗原肽库之一温育18小时。在进行洗涤以除去细胞后，向每个孔加入0.2μg生物素化的第二抗-ifn-γ抗体(n-g3)并温育2小时。然后对孔进行洗涤并向每个孔加入100μlbcip/nbt检测试剂底物达15分钟。使用ctl-immunospots6elispot读板器对板进行成像，并使用ctl-immunospot软件对斑点进行处理和计数。对于每只动物，通过减去未刺激细胞的计数对斑点计数进行归一化。

统计方法。为了比较脂肪-ep处理组的elisa滴度数据，使用ep电压、注射部位数和处理周作为因子，在所有收集的时间点上对经对数转化的滴度数据进行重复测量因素方差分析。为了比较所有处理之间的elisa滴度数据，按时间点对数据进行分层，然后使用处理组作为因子对经对数转化的数据进行单因素方差分析，并且当f检验显著时，使用tukey事后检验进行成对比较。使ii型错误最小化，并且在这种情况下没有针对多重比较的校正。首先使用因素方差分析在脂肪-ep处理组内分析elispot数据，其中ep电压和处理部位数作为因子。进行单因素方差分析以比较所有处理组(包括id-ep)的elisa数据。显著性的截止值被定义为p＜0.05，并且非显著趋势和差异的所有观察值都伴随p值。

实施例4。有限元分析和参数优化。为了从ep角度理解脂肪组织的电性质，进行了有限元分析。这实现对感兴趣的每种组织类型(在这种情况下，为皮肤、肌肉和脂肪)内的预测电场分布的量化，所述电场分布限定适于在脂肪组织中使用图32所示的电极设计进行ep的电压范围。x-y平面中的有限元分析表示，标准针状电极将强电场梯度相等地分布在皮肤、脂肪和肌肉中(图34，上图)，而板状电极几乎只在脂肪组织内产生更均匀的电场(图34，下图)。预测针状电极提供高于350v/cm至每个组织的12％-14％的场强度，而大约一半的组织接受低于150v/cm的场强度。预计板状电极在95％的经处理脂肪组织中产生150v/cm与350v/cm之间的电场，并且肌肉不接受高于100v/cm的电场。在这些模拟中，板状电极在87％的皮肤中产生低于150v/cm的电场。

有限元分析表明，非侵入性板状电极主动将电场集中到脂肪组织中，从而与针状电极相反地起作用，针状电极不加区别地为它们穿透的每个组织提供相同的电场。另外，与针状电极相比，由板状电极产生的场更均匀。

有限元模型假设每种组织类型具有恒定的电导率。最近的证据表明，电导率实际上是电场强度的函数，并因此在ep期间动态地变化。然而，这些动态模型仅在皮肤、肌肉和肿瘤组织中得到验证，因此选择恒定的电导率以避免做出可能过高估计电场分布的任何假设。此外，假设定位在电极正下方并限制电流流入下面的肌肉中的未捏夹脂肪层被压缩至1mm的厚度。这个假设是为了避免过高估计脂肪组织的绝缘能力做出的，但实际上即使在电极牢固就位的情况下，下面的脂肪也可能厚得多。模拟的结果可被认为是“最坏情况”的情形，并且在脂肪中对动态电导率模型的验证将可能增加整个脂肪中的预测电场强度。

基于整个脂肪组织中优化的经计算电场分布、其他组织类型中电场的最小化以及装置的非侵入性本质，选择板状电极用于随后的实验。板状电极的优化原型可容易地应用于临床，并且在这种有限元分析中产生的数据可外推到人类中更密集和更厚的脂肪区域。

实施例5。染料注射研究。虽然很好地表征了推注im或id注射的流体动力学性质，但是体内皮下脂肪内的流体分布不太清楚。另外，压缩板状电极之间的注射部位可能对流体分布产生的物理效应是未知的。这些动力学通过染料注射研究来进行研究，执行染料注射研究来实现脂肪内注射的流体分布的可视化。在注射和卡钳之间挤压之后，在完整的脂肪垫内可看到染料为细长的团块形状(图35，左上)。在切开脂肪之后，染料呈现出主要保留在分隔脂肪叶的胶原性隔膜内(图35，右上)。蓝染色保留在脂肪垫内，其中在上覆的皮肤或下面的肌肉中几乎不存在染色。因为染料未呈现出在电极之间挤压之后行进通过整个组织，所以对多个注射部位进行相同的染料分析，目的是增加整个脂肪组织中的dna分布。当进行五次单独的50μl染料注射、然后夹在电极板之间时，五个单独的染料部位仍然可见，但一些染料部位比其他染料部位更显著(图35，下图)。当进行切开时，每个单独的注射部位在脂肪组织内具有相似的染料分布，其中染料沿胶原性隔膜集中。

染料研究表明，一些注射物与真皮接触，但在脂肪垫外没有观察到基因表达。这一观察结果与有限元分析一致，这表明具有足以引起转染的强度的电场几乎仅在脂肪组织中产生。当进行多次注射时，一些部位比其他部位更显著，这可能是由于附近的注射部位在它们被挤压在板状电极之间时发生了合并。最强的染料染色沿分隔脂肪叶的胶原隔膜发生，并且实际上，许多转染的脂肪细胞聚集在这些隔膜周围。可能的是，电流和dna溶液主要通过这些胶原性隔膜行进，并且当dna溶液溢出这些通道并在ep之前与附近的脂肪细胞接触时发生脂肪转染。

在细胞水平上，注射部位处存在大量转染的脂肪细胞，这些转染的脂肪细胞易于通过它们的因惰性脂滴占据每个细胞中心造成的大尺寸、特征性球状形状和独特的“环形”基因表达模式来区分。对于脂肪细胞，处理呈现出高选择性，因为尽管有许多其他细胞类型占据脂肪细胞之间的空间，但gfp仅在脂肪细胞周围表达。这可能是由于ep倾向于在较低的场强下优先转染较大的细胞所致。脂肪细胞是具有非常大直径(50-100μm)的球状细胞，并且它们的形状和直径可能使得它们比其他较小的细胞类型更容易受ep影响。脂肪组织还包含许多免疫细胞、内皮细胞、干细胞和成纤维细胞，而这些其他细胞类型没有明显的广泛转染，因此这有些令人惊讶。

实施例6。脂肪细胞的体内转染。为了评估脂肪组织中报告基因构建体的体内表达，将编码gfp的质粒注射到豚鼠脂肪垫中，并使用非侵入性板状电极以范围为50v至200v的电压进行电穿孔，如实施例3中的一般脂肪-ep处理程序部分所述。处理部位和ep夹紧程序在图36中示出。在进行这些处理后3天，将完整的脂肪垫移除并在总体组织水平下进行成像。gfp仅在注射部位处皮下脂肪垫内大约5-10mm长、1-2mm宽的区域中表达，并且在信号面积或测试的ep电压之间的强度方面没有明显差异(图37，上图)。在接受质粒注射而没有脂肪-ep的动物中未检测到gfp表达。在微观细胞水平下，脂肪细胞通过它们的由于脂滴占据细胞体积的中心造成的大直径(50-100μm)和特征性球状形状来区分(图37，下图)。接受脂肪-ep的豚鼠的脂肪垫具有许多表达gfp的脂肪细胞，这些表达gfp的脂肪细胞易于通过其清晰的荧光轮廓来区分。在脂肪细胞之间的细胞外空间中存在强烈的扩散性自发荧光区域，并且胶原隔膜也发出显著的荧光。在接受质粒dna注射而没有脂肪-ep的豚鼠中，没有可检测到的表达gfp的脂肪细胞或高自发荧光的区域，并且胶原隔膜是可见的，但不太显著。进行进一步的组织学分析以使报告基因构建体的分布通过脂肪垫的深度而可视化。最强且最丰富的gfp信号定定位在与分隔脂肪叶的胶原性隔膜相邻的脂肪细胞(图38)。在上覆的皮肤层中没有检测到gfp。基因表达在脂肪中的几毫米深处检测到，并且通常与染料注射研究中观察到的流体分布一致。高分辨率共焦图像揭示了gfp以不同的点状方式在每个转染的脂肪细胞周围表达(图39)。gfp表达与脂肪细胞周围及其之间的许多核无关联，这表示脂肪内存在较小的辅助细胞群。此群包括前脂肪细胞、成纤维细胞和内皮细胞。

实施例7。基因表达动力学和组织学分析。为了研究脂肪细胞群中报告基因构建体表达的动力学，进行了时间过程研究，其中在200v脂肪-ep与非侵入性板状电极之后的限定时间点对经处理脂肪垫的样品进行移除、切片和分析。早在脂肪-ep处理后24小时就可测量到基因表达，并且表达在整个监测的60天内持续(图40，上图)。在前7天中，gfp荧光的强度或分布没有明显的定性差异。从第14天开始，信号看起来更加扩散，并且在第60天甚至更加弱且更加扩散。gfp表达的每个不同部位的直径为大约10mm。如通过在脂肪-ep之后对脂肪切片的h&e染色观察到的组织学变化在第3天开始变得明显，持续至第14天，并且到第60天，呈现出基本消退(图40，下图)。在处理后3小时或24小时，未观察到组织生理学的可检测差异。在这些早期时间点，脂肪细胞是明确限定的，脂肪储存小滴由于二甲苯清除而被识别为空洞，并且胶原性隔膜由于较深的伊红染色和许多核而可见。从第3天开始观察并持续60天的长度，处理部位处的胶原性隔膜明显更加显著，这可能是由于从浸润细胞可见大量核所致。在胶原性隔膜更显著的区域中，脂肪细胞周围的细胞外空间也变得被更多数量的细胞所占据。这些组织学变化在处理后3至7天最为显著，并且在第60天，到细胞外空间的浸润是轻微的并且胶原性隔膜内的细胞密度也得到升高，但不太明显。

在单次脂肪-ep处理后，脂肪组织显示出能够快速且持续地表达基因。在处理后3天内没有细胞浸润的组织学迹象，即使基因表达早在处理后24小时就很强烈。然而，对于高免疫原性抗原而非gfp，这些动力学可能不同。脂肪-ep呈现出主要转染脂肪细胞，从而表明免疫原性主要是由于脂肪细胞产生的抗原所致。通过使用具有大约0.065cm²接触表面积的forcep电极将ep直接施加到手术暴露的脂肪组织，可在体内选择性地转染少量脂肪细胞(20-60个细胞)。在这里，非侵入性ep技术用于使用具有大约100倍表面积的板状电极转染大量脂肪细胞。

实施例8。体液免疫原性。为了评估脂肪组织作为dna疫苗接种的目标组织的适用性以及是否可引发免疫应答，使用脂肪-ep或id-ep作为比较，用表达流感核蛋白质(pr8)抗原的构建体对豚鼠进行免疫接种，并且使用elisa测量结合滴度。脂肪-ep实验组包括：高电压ep与1个注射部位(hv-1)，高电压ep与5个注射部位(hv-5)，低电压ep与1个注射部位(lv-1)，以及低电压ep与5个注射部位(lv-5)。所有豚鼠都接受相同的总dna剂量。hv脂肪-ep和id-ep产生类似的抗体应答动力学，但与hv脂肪-ep或id-ep相比，lv脂肪-ep处理产生高度可变且通常较低的抗体应答(图41)。四种不同脂肪-ep处理之间的滴度差异使用重复测量因素方差分析来评估。电压(p＝0.0062)和时间点(p＝0.0065)对滴度有主要影响，但注射部位数(p＝0.16)对滴度无主要影响。这就说明多个注射部位提供更快的体液免疫起效，但注射部位数与时间之间的交互作用并不显著(p＝0.13)。简单主要影响分析揭示了hv脂肪-ep处理与lv脂肪-ep处理之间的滴度差异从第6周开始显著(0.0056＜p＜0.039)。在任何时间点，hv脂肪-ep与id-ep之间的滴度没有差异(0.31＜p＜0.79)，并且在所有时间点，id-ep通常提供比lv脂肪-ep高的滴度(0.075＜p＜0.12)。id-ep与lv脂肪-ep之间无显著差异可能是由于本探索性研究中id-ep的重复数(n＝3)所致。通过ep进行的dna疫苗递送(递送到脂肪组织中)用于诱导强烈的体液应答。脂肪epdna疫苗接种后的体液免疫应答显示出电压依赖性和空间分布依赖性，特别是较高的电压对于实现快速、高强度的抗体应答至关重要。这是转染脂肪细胞可引发免疫应答的首次证实。尽管在基因表达中没有电压依赖性差异，但观察到强电压依赖性。由于更多的细胞与质粒接触，对多个处理部位的积极影响是可预期的。

实施例9。细胞免疫原性。为了研究免疫应答的细胞免疫(cellulararm)，对来自免疫接种豚鼠的外周血进行elispot。hv-1(n＝3)、hv-5(n＝2)和id-ep(n＝2)由于活细胞计数低而具有较少的重复。lv-5(n＝3)有一只豚鼠在研究早期死于与此无关的原因。所有疫苗接种的豚鼠响应于所有三种肽库以及cona而产生ifn-γ。使用最具免疫原性的肽库1进行进一步分析(图43)。id-ep与hv脂肪-ep组之间的斑点计数看起来相似，并且对于lv脂肪-ep，趋势呈现出有所下降，特别是lv-1呈现出引发最弱的细胞免疫应答。在脂肪-ep处理组中，因素方差分析揭示了对数转化的斑点计数对于电压(p＝0.15)或注射部位数(p＝0.26)无显著差异，并且这两个因素(p＝0.39)之间没有交互作用。所有处理组(包括id-ep)的单因素方差分析比较结果显示对数转化的斑点计数(p＝0.31)没有显著差异。

脂肪-ep能够产生与idep相当的细胞免疫应答，并且虽然由于低重复和高变异性，这些组之间的差异并不显著，但对于接受最低电压和仅一个处理部位的那些豚鼠来说，斑点计数趋于有所降低。这些发现支持脂肪-ep免疫原性对ep电压和dna分布的依赖性，并且表明电穿孔参数和组织内的dna分布是可独立调谐以改善免疫应答的重要因素。

抗体应答的电压依赖性有两个关键因素。首先，更高的电压产生更大、更强的电场，因此可潜在地有更多的细胞被转染。已经显示，转染效率和免疫应答在其他组织(诸如皮肤和肌肉)中是电压依赖性的。然而，优化研究的结果表示，甚至在低电压下也会发生充足的转染，因此这不太可能是唯一的解释。电压依赖性抗体应答的第二种解释是较高的电压需要较高的电流，这可由于电阻加热而导致组织损伤或发炎。尽管处理部位没有外部损伤迹象，但组织学分析显示，从处理后3天开始，脂肪组织内有明显的细胞浸润。先前已表明ep具有佐剂作用。因此，观察到的细胞浸润可能与ep引起的轻微热损伤有关，并且在高电压下增强的免疫应答中起作用。尽管200v与imdnaep疫苗接种中使用的电压相似，但电流从未超过ia，这也与im-ep相似。因此，与典型的19英寸、22号针(0.88cm²)相比，相似量的电能分布在更大的表面积(6.25cm²)上，因此，与im-ep相比，脂肪dnaep处理中电极表面上的能量密度应当低大约7倍。

增加dna注射部位数对免疫原性的轻微积极作用可能是由于在ep之前与dna接触的细胞数量增加所致。已经证实，通过在单个部位处增加注射体积至50μl以上对基因表达没有可检测的益处，因此对5个不同部位分配相同剂量的dna，每个部位接受50μl注射。与单部位、相同剂量的处理相比，多部位处理可提供免疫原性益处这一事实特别是在早期时间点提供了脂肪epdna疫苗接种可通过将更多脂肪细胞暴露于dna而直接受益的证据。

结果表明，通过涉及更多脂肪细胞并提供最佳电穿孔参数可扩增免疫应答。诸如脉冲持续时间、脉冲数、脉冲间延迟和dna浓度的其他因素都可能有助于免疫应答。已经显示，id-ep是节省剂量的，但是这些免疫数据显示，脂肪-ep能够以与id-ep相同的剂量产生相似的强烈免疫应答。类似于肌肉，脂肪组织有可能容纳比id-ep大得多的剂量，而没有与im-ep相关联的耐药性和侵袭性的缺点。这些实施例证实，在优化dna递送和电穿孔参数后，脂肪靶向的dna疫苗具有免疫原性。此方法提供快速且持续的免疫应答，并且不需要侵入性针状电极。在固定剂量的dna下，免疫应答的强度和起效都随着电穿孔电压和注射部位数的增加而改善。脂肪靶向的epdna疫苗接种与im给药方案相比提供了潜在的安全性、耐受性和易用性优势，并且不受id处理的剂量或细胞更新限制。