用于核酸和/或蛋白有效负载递送的组合物和方法与流程

交叉引用

本申请要求于2017年6月9日提交的美国临时专利申请第62/517,346号、于2017年1月6日提交的美国临时专利申请第62/443,567号、于2017年1月6日提交的美国临时专利申请第62/443,522号以及于2016年12月14日提交的美国临时专利申请第62/434,344号的权益，所述申请均通过引用整体并入本文。

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背景技术：

将核酸和/或蛋白有效负载有效引入细胞，例如用于基因组编辑和/或改变基因表达，是治疗策略和研究方法的重要目标。为了有效地引入有效负载，重要的是适当地封装有效负载以保护其在进入细胞之前免于降解，允许进入细胞，引导有效负载远离溶酶体降解途径，并且引导递送至适当的亚细胞区室。此外，在进入细胞之后从包装中释放有效负载的定时可以影响有效负载的有效性。

许多用于有效负载递送的基于纳米颗粒的技术提供低水平的细胞转染并且在转染时的效力有限。需要增强有效负载向细胞递送的有效性的组合物和方法。

技术实现要素：

提供了用于将有效负载(例如，核酸和/或蛋白有效负载)递送至细胞(例如纳米颗粒、病毒和非病毒递送有效负载至细胞)的组合物和方法。提供了针对血清稳定性，靶向递送至特定细胞类型，通过组蛋白和核小体样支化聚合物的内源核酸包装的仿生，核内的区室特异性解包，可变定时释放动力学设计的纳米颗粒及其使用方法。在一些实施方案中，主题纳米颗粒包括核和包封所述核的可脱落层(例如，在细胞递送期间提供所述核的暂时稳定化)，其中所述核包括(i)阴离子聚合物组合物；(ii)阳离子聚合物组合物；(iii)阳离子多肽组合物；(iv)核酸和/或蛋白有效负载；其中：(a)所述阴离子聚合物组合物包括阴离子氨基酸的d-异构体的聚合物和阴离子氨基酸的l-异构体的聚合物，和/或(b)所述阳离子聚合物组合物包括阳离子氨基酸的d-异构体的聚合物和阳离子氨基酸的l-异构体的聚合物。在一些情况下，阴离子氨基酸的d-异构体的聚合物相对于阴离子氨基酸的l-异构体的聚合物以10:1至1:10范围的比率存在。在一些情况下，阳离子氨基酸的d-异构体的聚合物相对于阳离子氨基酸的l-异构体的聚合物以10:1至1:10范围的比率存在。

在一些情况下，本公开的纳米颗粒包括包围可脱落层的表面涂层。表面涂层可包括靶向配体，其提供与靶细胞的表面分子的靶向结合。在一些情况下，靶向配体(用或不用接头)与锚定结构域缀合，例如，用于将靶向配体锚定到纳米颗粒的可脱落层。

还提供了多层纳米颗粒，其包括作为核的一部分的第一有效负载(例如，dna供体模板)，其中所述核被第一可脱落层包围，第一可脱落层被包括第二有效负载(例如，基因编辑工具)的中间层包围，并且中间层被第二可脱落层包围。在一些情况下，第二可脱落层涂覆有表面涂层(例如，包括靶向配体的表面涂层)。

还提供了包括两种或更多种纳米颗粒的纳米颗粒制剂，其中第一纳米颗粒的有效负载包括供体dna模板且第二纳米颗粒的有效负载包括基因编辑工具(例如，(i)crispr/cas指导rna；(ii)编码crispr/cas指导rna的dna；(iii)编码可编程基因编辑蛋白的dna和/或rna；和/或(iv)可编程基因编辑蛋白)。

还提供了作为同一包装的一部分共同递送多种有效负载(例如，两种或更多种有效负载)的方法。例如，提供了将核酸和/或蛋白有效负载递送至靶细胞的方法，其中该方法包括使真核靶细胞与病毒或非病毒递送载体接触，所述载体包括(a)基因编辑工具；(b)诱导靶细胞增殖和/或使靶细胞分化偏向的核酸或蛋白药剂。

附图说明

当结合附图阅读时，从以下详细描述中可以最好地理解本发明。需要强调的是，根据惯例，附图的各种特征不是按比率的。相反，为了清楚起见，各种特征的尺寸被任意扩大或缩小。附图中包括以下附图。

图1描绘了测试核酸有效负载凝聚的各种参数(例如阳离子:阴离子电荷比)的荧光测定法的结果。结果显示，例如，为2的电荷比对于编码cas9和指导rna分子的质粒的凝聚很有效。

图2描绘产生的纳米颗粒核的粒度和ζ电位分布。数据是使用metrixzetaviewnta仪器获得的。纳米颗粒大小(峰值)为128.8nm，ζ电位(峰值)为+10.5mv(100％)。

图3描绘了稳定化纳米颗粒核(由可脱落层包封的核)的粒度和ζ电位分布。数据是使用metrixzetaviewnta仪器获得的。稳定化核的大小为110.6nm，ζ电位为-42.1mv(95％)。

图4描绘的数据显示具有外壳(外涂层)的纳米颗粒包括rvg9r，即融合至9-arg肽序列(作为阳离子锚定结构域)的狂犬病病毒糖蛋白(rvg)，其特征粒度为115.8nm且ζ电位为-3.1mv(100％)。最佳外涂层产生从-50mv(对于涂覆二氧化硅的核)到0和-10mv之间(添加外壳之后)的ζ电位转变。

图5描绘了细胞培养实验的结果，其中使用不同的纳米颗粒来递送核酸有效负载。该图比较了包括聚(d-谷氨酸)作为核的一部分(除聚(l-精氨酸)之外)的纳米颗粒与不包含聚(d-谷氨酸)的纳米颗粒。三行代表重复。

图6(图a-d)描绘了与纳米颗粒接触的神经干细胞的显微镜图像，所述纳米颗粒包括crispr/cas9表达载体作为核酸有效负载。纳米颗粒的核包括用荧光团(fitc)标记的聚(l-精氨酸)(阳离子聚合物)。内体和细胞核分别用lysotracker(红色)和hoescht3342(蓝色)染色。在接种后16小时将纳米颗粒(和作为对照的lipofectamine3000)引入细胞。在成像之前，将细胞与hoescht3342和lysotrackerred一起温育。图c-d显示了条形图，其量化纳米颗粒核与细胞核和内体的共同定位。

图7(图a-b)描绘用包括编码gfp的mrna作为核酸有效负载的纳米颗粒转染的外周血单核细胞(pbmc)的显微图像。该图像证明，用包括核的纳米颗粒可以将mrna表达延长至16天，所述核具有限定比率的阴离子氨基酸的d-异构体的聚合物和阴离子氨基酸的l-异构体的聚合物。在这种情况下，使用具有2:1比率的聚(d-谷氨酸)与聚(l-谷氨酸)的纳米颗粒核在16天时产生最大表达(图a＝4天；图b＝16天)。

图8描绘主题纳米颗粒的示例实施方案的图示。

图9描绘主题纳米颗粒的示例实施方案的图示。在这种情况下，纳米颗粒是多层的，具有被第一可脱落层包围的核(其包括第一有效负载)，第一可脱落层被中间层(其包括另外的有效负载)包围，中间层被第二可脱落层包围，第二可脱落层有表面涂层(即，包括外壳)。

图10(图a-b)描绘主题纳米颗粒表面涂层的递送分子的示例构造的图示。所描绘的递送分子包括与锚定结构域缀合的靶向配体，所述锚定结构域与纳米颗粒的可脱落层以静电方式相互作用。注意，靶向配体可以在n-或c-末端缀合(每个图的左侧)，但也可以在内部位置缀合(每个图的右侧)。图a中的分子包括接头，而图b中的分子则不包括接头。

图11提供了家族bgpcr的示意图，突出显示了在评估靶向配体时要考虑的单独结构域，例如，用于与变构/亲和力n-末端结构域和正构内体-分选/信号传导结构域结合。(图改编自siu、faiyiu等人,《自然(nature)》499.7459(2013):444-449)。

图12提供了鉴定用于靶向配体的插入和/或取代(例如，用半胱氨酸残基取代)，使得保持亲和力并且靶向配体参与促进核酸释放和限制核酸降解的长内体循环途径的内部氨基酸位置的实例。在这种情况下，靶向配体是毒蜥外泌肽-4并且氨基酸位置10、11和12被鉴定为可能插入和/或取代(例如，用半胱氨酸残基取代，例如s11c突变)的位点。图示出了模拟的毒蜥外泌肽-4(seqidno:1)与胰高血糖素-gcgr(4ers)以及glp1-glp1r-ecd复合物(pdb:3iol)的已知晶体结构的比对以及在3维空间中旋转的pdb渲染。

图13示出了作为三元fgf2-fgfr1-肝素复合物(pdb上的1fq9)的一部分的tbfgf片段。确定cknggfflrihpdgrvdgvreks(突出显示的)(seqidno:43)对于fgfr1的亲和力是重要的。

图14提供了用于确定hfkdpk(seqidno:5)是可以用于配体-受体正构活性和亲和力的肽的比对和pdb3d渲染。

图15提供了用于确定lesnnynt(seqidno:6)是可以用于配体-受体正构活性和亲和力的肽的比对和pdb3d渲染。

图16提供了可以用作主题纳米颗粒的一部分(例如，作为含有nls的肽；作为含有nls的肽、含有nls的肽、阴离子聚合物、阳离子聚合物和/或阳离子多肽等的一部分/与之缀合)的核定位信号(nls)的非限制性实例。该图改编自kosugi等人，《生物化学杂志》(jbiolchem.)2009年1月2日；284(1):478-85。[第1类，从上到下seqidno:201-221)；第2类，从上到下(seqidno:222-224)；第4类，从上到下(seqidno:225-230)；第3类，从上到下(seqidno:231-245)；第5类，从上到下(seqidno:246-264)]。

图17(图a-b)描绘了小鼠(图a)和人(图b)造血细胞谱系，以及已经鉴定为谱系内各种细胞的标志物的图示。

图18(图a-b)描绘了可用于影响细胞分化和/或增殖的mirna(图a)和蛋白(图b)因子的图示。

图19提供了具有有效负载：具有肽核酸(pna)结合位点的vwf-egfppdna的纳米颗粒上的凝聚曲线。

图20提供了具有有效负载：与hbbgrna复合的nls-cas9-nlsrnp的纳米颗粒上的凝聚曲线。

图21提供了具有有效负载：hbbgrna的纳米颗粒上的凝聚曲线。

图22提供了具有有效负载：hbbgrna的纳米颗粒上的凝聚曲线。

图23提供了具有有效负载：与hbbgrna复合的nls-cas9-nlsrnp的纳米颗粒上的凝聚曲线。

图24提供了具有有效负载：具有肽核酸(pna)结合位点的vwf-egfppdna的纳米颗粒上的凝聚曲线。

图25提供了具有有效负载：具有肽核酸(pna)结合位点的vwf-egfppdna的纳米颗粒上的凝聚曲线。

图26提供了具有有效负载：具有hbbgrna的nls-cas9-nls的rnp的纳米颗粒上的凝聚曲线。

图27提供了具有有效负载：具有肽核酸(pna)结合位点的vwf-egfppdna的纳米颗粒上的凝聚曲线。

图28提供了具有有效负载：cy5_egfpmrna的纳米颗粒上的凝聚曲线。

图29提供了具有有效负载：block-italexafluor555sirna的纳米颗粒上的凝聚曲线。

图30提供了具有有效负载：与hbbgrna复合的nls-cas9-egfprnp的纳米颗粒上的凝聚曲线。

图31提供了当使用具有alexa555block-itsirna作为有效负载的纳米颗粒时收集的数据。

图32提供了当使用由nls-cas9-gfp和hbb引导rna形成的核糖核蛋白(rnp)作为有效负载的纳米颗粒时收集的数据。

图33提供了当使用具有cy5egfpmrna作为有效负载的纳米颗粒时收集的数据。

图34提供了当使用具有有效负载：具有cy5标记的肽核酸(pna)结合位点的vwf-egfppdna的纳米颗粒时收集的数据。

图35提供了来自示出了通过加入阳离子多肽cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c，然后加入ple100并且通过进一步向rnp中加入阳离子多肽来降低荧光强度的sybrgold排斥测定的数据。

图36提供了来自示出了通过加入阳离子多肽cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c，然后加入ple100并且通过进一步向sirna中加入阳离子多肽并且进一步加入sybrgold而引起的荧光强度变化的sybrgold排斥测定的数据。

图37提供了来自示出了通过加入阳离子多肽组蛋白肽h2a，然后加入cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c，并且通过进一步向具有hbbgrna和sybrgold的nls-cas9-egfp的rnp中加入ple100而引起的荧光强度变化的sybrgold排斥测定的数据。

图38提供了来自示出了通过一起加入阳离子多肽组蛋白肽h4和cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c，并且通过进一步向具有hbbgrna和sybrgold的nls-cas9-egfp的rnp中加入ple100而引起的荧光强度变化的sybrgold排斥测定的数据。

图39提供了来自示出了通过加入阳离子多肽cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c并且通过进一步向mrna中加入ple100而引起的荧光强度变化的sybrgold排斥测定的数据。

图40提供了来自示出了通过加入组蛋白h4并且通过进一步向mrna中加入cd45-msiglec-(4gs)2_9r_c和ple100而引起的荧光强度变化的sybrgold排斥测定的数据。

图41提供了来自示出了通过加入组蛋白h2a并且通过进一步向mrna中加入cd45-msiglec-(4gs)2_9r_c和ple100而引起的荧光强度变化的sybrgold排斥测定的数据。

图42提供了来自示出了通过加入阳离子多肽cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c，然后加入ple100而引起的荧光强度变化的来自嵌入vwf_egfppdna的sybrgold排斥测定的数据。

图43提供了来自示出了通过加入组蛋白h4，然后加入阳离子多肽cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c，然后加入ple100而引起的荧光强度变化的来自嵌入vwf_egfppdna的sybrgold排斥测定的数据。

图44提供了来自示出了通过加入组蛋白h4，然后加入阳离子多肽cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c，然后加入ple100而引起的荧光强度变化的来自嵌入vwf_egfppdna的sybrgold排斥测定的数据。

图45(图a-c)提供了与复合物大小分布、二氧化硅涂覆大小和ζ电位分布以及配体涂覆的/官能化的颗粒大小和ζ电位分布有关的数据。

图46提供了与支化组蛋白肽缀合物先导颗粒有关的数据。

图47提供了与项目hsc.001.001相关的数据(参见表5)。

图48提供了与项目hsc.001.002相关的数据(参见表5)。

图49提供了与项目hsc.002.01(靶向配体-esellg_mesel_(4gs)2_9r_n)相关的数据(参见表5)。

图50提供了与项目hsc.002.02(靶向配体-esellg_mesel_(4gs)2_9r_c)相关的数据(参见表5)。

图51提供了与项目hsc.002.03(靶向配体-cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c)相关的数据(参见表5)。

图52提供了与项目hsc.002.04(靶向配体-cy5mrna-sio2-peg)相关的数据(参见表5)。

图53提供了与项目blood.002.88(靶向配体-cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c)相关的数据(参见表5)。

图54提供了与项目blood.002.89(靶向配体-cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c)相关的数据(参见表5)。

图55提供了与项目blood.002.90相关的数据(参见表5)。

图56提供了与项目blood.002.91(plr50)相关的数据(参见表5)。

图57提供了与项目blood.002.92(靶向配体-cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c)相关的数据(参见表5)。

图58提供了与项目tcell.001.1相关的数据(参见表5)。

图59提供了与项目tcell.001.3相关的数据(参见表5)。

图60提供了与项目tcell.001.13相关的数据(参见表5)。

图61提供了与项目tcell.001.14相关的数据(参见表5)。

图62提供了与项目tcell.001.16相关的数据(参见表5)。

图63提供了与项目tcell.001.18相关的数据(参见表5)。

图64提供了与项目tcell.001.28相关的数据(参见表5)。

图65提供了与项目tcell.001.29相关的数据(参见表5)。

图66提供了与项目tcell.001.31相关的数据(参见表5)。

图67提供了与项目tcell.001.33相关的数据(参见表5)。

图68提供了与项目tcell.001.43相关的数据(参见表5)。

图69提供了与项目tcell.001.44相关的数据(参见表5)。

图70提供了与项目tcell.001.46相关的数据(参见表5)。

图71提供了与项目tcell.001.48相关的数据(参见表5)。

图72提供了与项目tcell.001.58相关的数据(参见表5)。

图73提供了与项目tcell.001.59相关的数据(参见表5)。

图74提供了与项目cynobm.002.82相关的数据(参见表5)。

图75提供了与项目cynobm.002.83相关的数据(参见表5)。

图76提供了与项目cynobm.002.84相关的数据(参见表5)。

图77提供了与项目cynobm.002.85相关的数据(参见表5)。

图78提供了与项目cynobm.002.86相关的数据(参见表5)。

图79提供了与项目cynobm.002.76相关的数据(参见表5)。

图80提供了与项目cynobm.002.77相关的数据(参见表5)。

图81提供了与项目cynobm.002.78相关的数据(参见表5)。

图82提供了与项目cynobm.002.79相关的数据(参见表5)。

图83提供了与项目cynobm.002.80相关的数据(参见表5)。

图84提供了与cynobm.002样品的未转染对照相关的数据。

图85提供了与nls-cas9-egfpbcl11agrnarnp的lipofectaminecrisprmax递送相关的数据。

图86提供了与项目cynobm.002rnp-仅对照相关的数据(参见表5)。

图87提供了与项目cynobm.002.82相关的数据(参见表5)。

图88提供了与项目cynobm.002.83相关的数据(参见表5)。

图89提供了与项目cynobm.002.84相关的数据(参见表5)。

图90提供了与项目cynobm.002.85相关的数据(参见表5)。

图91提供了与项目cynobm.002.86相关的数据(参见表5)。

图92提供了与项目cynobm.002.75相关的数据(参见表5)。

图93提供了与项目cynobm.002.76相关的数据(参见表5)。

图94提供了与项目cynobm.002.77相关的数据(参见表5)。

图95提供了与项目cynobm.002.78相关的数据(参见表5)。

图96提供了与项目cynobm.002.79相关的数据(参见表5)。

图97提供了与项目cynobm.002.80相关的数据(参见表5)。

图98提供了与项目cynobm.002.81相关的数据(参见表5)。

图99提供了cynobm.002rnp-仅对照的定性图像。

图100提供了与项目hsc.004高含量筛选相关的数据(参见表5)。

图101提供了与项目tcell.001高含量筛选相关的数据(参见表5)。

图102提供了与项目tcell.001(参见表5)lipofectaminecrisprmax对照相关的数据。

图103提供了与项目tcell.001.1相关的数据(参见表5)。

图104提供了与项目tcell.001.2相关的数据(参见表5)。

图105提供了与项目tcell.001.3相关的数据(参见表5)。

图106提供了与项目tcell.001.4相关的数据(参见表5)。

图107提供了与项目tcell.001.5相关的数据(参见表5)。

图108提供了与项目tcell.001.6相关的数据(参见表5)。

图109提供了与项目tcell.001.7相关的数据(参见表5)。

图110提供了与项目tcell.001.8相关的数据(参见表5)。

图111提供了与项目tcell.001.9相关的数据(参见表5)。

图112提供了与项目tcell.001.10相关的数据(参见表5)。

图113提供了与项目tcell.001.11相关的数据(参见表5)。

图114提供了与项目tcell.001.12相关的数据(参见表5)。

图115提供了与项目tcell.001.13相关的数据(参见表5)。

图116提供了与项目tcell.001.14相关的数据(参见表5)。

图117提供了与项目tcell.001.15相关的数据(参见表5)。

图118提供了与项目tcell.001的阴性对照相关的数据(参见表5)。

图119提供了与项目blood.002相关的数据(参见表5)。

图120提供了与项目tcell.001.27相关的数据(参见表5)。

图121描绘了crisprrnp(可能的有效负载)的电荷密度图，其允许确定是否应添加阴离子或阳离子肽/材料以在蛋白表面上形成稳定的带电层。

图122描绘了睡美人转座子(sleepingbeautytransposons)(可能的有效负载)的电荷密度图，其允许确定是否应添加阴离子或阳离子肽/材料以在蛋白表面上形成稳定的带电层。

图123描绘了在(2)加入阳离子锚作为(2a)锚-接头-配体或独立的阳离子锚，添加或不添加(2b)后续多层化学、多种核酸或带电治疗剂的共同递送或通过交联进行层稳定之前的(1)锚定到crisprrnp表面上的阳离子位点的示例性阴离子肽(9-10个氨基酸长，大约按比率缩放到10nm直径的crisprrnp)。

图124描绘了基于可以包含cas9rnp或任何均匀或两性离子带电表面的核模板的添加顺序和静电基质组合物的实例。

图125提供了与il2r结合的il2的模型结构。

图126提供了单链cd3抗体片段的模型结构。

图127提供了与n-乙酰神经氨酸(neu5ac)复合的唾液酸粘附素n-末端的模型结构。

图128提供了干细胞因子(scf)的模型结构。

图129提供了在ckit受体片段的合理设计期间产生的示例图像。

图130提供了在ckit受体片段的合理设计期间产生的示例图像。

图131提供了在ckit受体片段的合理设计期间产生的示例图像。

图132提供了来自分析合理设计的ckit受体片段的圆二色性数据。

图133描绘了合理设计的ckit受体片段的稳定构象的模型。

图134描绘了其中htp与阳离子聚合物主链的侧链缀合的支化组蛋白结构的实例。右侧的聚合物代表前体主链分子并且左侧的分子是支化结构的片段的实例。

具体实施方式

如上所述，提供了用于将有效负载(例如，核酸和/或蛋白有效负载)纳米颗粒递送至细胞的组合物和方法。在一些实施方案中，主题纳米颗粒包括核和包封所述核的可脱落层(例如，在细胞递送期间提供所述核的暂时稳定化)，其中所述核包括(i)阴离子聚合物组合物；(ii)阳离子聚合物组合物；(iii)阳离子多肽组合物；(iv)核酸和/或蛋白有效负载；其中：(a)所述阴离子聚合物组合物包括阴离子氨基酸的d-异构体的聚合物和阴离子氨基酸的l-异构体的聚合物，和/或(b)所述阳离子聚合物组合物包含阳离子氨基酸的d-异构体的聚合物和阳离子氨基酸的l-异构体的聚合物。在一些情况下，阴离子氨基酸的d-异构体的聚合物相对于阴离子氨基酸的l-异构体的聚合物以10:1至1:10范围的比率存在。在一些情况下，阳离子氨基酸的d-异构体的聚合物相对于阳离子氨基酸的l-异构体的聚合物以10:1至1:10范围的比率存在。

在一些情况下，本公开的纳米颗粒包括包围可脱落层的表面涂层。表面涂层可包括靶向配体，其提供与靶细胞的表面分子的靶向结合。在一些情况下，靶向配体(用或不用接头)与锚定结构域缀合，例如，用于将靶向配体锚定到纳米颗粒的可脱落层。

还提供了多层纳米颗粒，其包括作为核的一部分的第一有效负载(例如，dna供体模板)，其中所述核被第一可脱落层包围，第一可脱落层被包括第二有效负载(例如，基因编辑工具)的中间层包围，并且中间层被第二可脱落层包围。在一些情况下，第二可脱落层涂覆有表面涂层(例如，包括靶向配体的表面涂层)。

还提供了包括两种或更多种纳米颗粒的纳米颗粒制剂，其中第一纳米颗粒的有效负载包括供体dna模板且第二纳米颗粒的有效负载包括基因编辑工具(例如，(i)crispr/cas指导rna；(ii)编码crispr/cas指导rna的dna；(iii)编码可编程基因编辑蛋白的dna和/或rna；和/或(iv)可编程基因编辑蛋白)。

在描述本发明的方法和组合物之前，应理解本发明不限于所描述的特定方法或组合物，因此当然可以改变。也应理解，本文使用的术语仅仅为了描述具体实施方案的目的，并且不旨在是限制性的，因为本发明的范围仅仅由所附的权利要求限制。

在提供值的范围时，应理解，除非上下文明确另外指出，该范围的上限和下限之间的至下限十分之一单位的每个中间值也具体地公开。在所述范围内的任何所述值或中间值与所述范围内的任何其他所述值或中间值之间的每个较小范围包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在所述范围内，并且在较小的范围内包括任一界限、不包括两个界限或包括两个界限的每个范围也包括在本发明内，遵从该叙述的范围中任何具体排除的界限。在叙述的范围包括一个或两个界限时，排除了那些包括的界限中的一个或两个的范围也包括在本发明内。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然类似或等效于本文所描述的那些方法和材料的任何方法和材料均可以用于实践或测试本发明，但是现在描述了一些潜在的以及优选的方法和材料。本文提及的所有公开案均以引用的方式并入本文中，从而公开和描述与所引用公开案相关的方法和/或材料。应当理解，在有矛盾的情况，本公开取代并入的出版物的任何公开内容。

当阅读了本公开，对本领域技术人员显而易见，本文描述和阐释的每个单个实施方案具有分开的组分和特征，其可容易与任何其他数个实施方案的特征分开或结合，而不背离本发明的精神或范围。任何记载的方法可以按照所记载事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。

应注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用的单数形式“一”、“一种(一个)”以及“所述(该)”包括多个指示物。因此，例如，提及“细胞”时包含多个此类细胞并且提及“所述核酸内切酶”时包含提及本领域技术人员已知的一个/种或多个/种核酸内切酶及其等同物等。应当进一步指出，权利要求书可以撰写成排除任何要素(例如，任何任选的要素)。这样，本陈述旨在用作使用这种排除性术语，如结合权利要求要素而叙述的“唯一”、“仅仅”等，或使用“否定”限制的前置基础。

本文论述的出版物仅仅提供其在本申请的申请日之前的公开内容。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权先于该出版物公开。另外，所提供的公开日期可不同于可能需要独立确认的实际公开日期。

方法和组合物

提供了用于将核酸、蛋白和/或核糖核蛋白有效负载递送到细胞的方法和组合物。在一些实施方案中，主题纳米颗粒包括(i)由(ii)可脱落层包封的核，并且在一些情况下，所述可脱落层被(iii)表面涂层包围，所述表面涂层可包括靶向配体。除了以下描述之外，国际专利申请公开号wo2015042585特此通过引用整体并入本文。

i.纳米颗粒核

主题纳米颗粒的核包括阴离子聚合物组合物(例如，聚(谷氨酸))、阳离子聚合物组合物(例如，聚(精氨酸)、阳离子多肽组合物(例如，组蛋白尾肽)和有效负载(例如，核酸和/或蛋白有效负载)。在一些情况下，所述核通过阳离子氨基酸聚合物和有效负载在阴离子氨基酸聚合物存在下(并且在一些情况下在阳离子多肽组合物的阳离子多肽存在下)的凝聚产生。在一些实施方案中，与阳离子聚合物与有效负载的缀合物相比，构成核的组分的凝聚可介导提高的转染效率。在纳米颗粒核中包含阴离子聚合物可延长纳米颗粒在细胞内停留和有效负载释放的持续时间。

对于核的阳离子和阴离子聚合物组合物，可以控制d-异构体聚合物与l-异构体聚合物的比率以便控制有效负载的定时释放，其中d-异构体聚合物与l-异构体聚合物的比率增加引起稳定性增加(有效负载释放速率降低)，这例如可以使得由主题纳米颗粒递送的有效负载实现更持久的基因表达。在一些情况下，改变纳米颗粒核内d-与l异构体多肽的比率可导致基因表达谱(例如，由有效负载分子编码的蛋白的表达)为约1-90天(例如，1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30、3-25、3-20、3-15、3-10、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15或5-10天)。有效负载释放的控制(例如，当递送基因编辑工具时)对于进行基因组编辑可特别有效，例如，在需要同源定向修复的一些情况下。

在一些实施方案中，纳米颗粒包括核和包封所述核的可脱落层，其中所述核包括：(a)阴离子聚合物组合物；(b)阳离子聚合物组合物；(c)阳离子多肽组合物；(d)核酸和/或蛋白有效负载，其中(a)和(b)中的一种包括氨基酸的d-异构体聚合物，(a)和(b)中的另一种包括氨基酸的l-异构体聚合物，其中d-异构体聚合物与l-异构体聚合物的比率在10:1至1.5:1的范围内(例如，8:1至1.5:1、6:1至1.5:1、5:1至1.5:1、4:1至1.5:1、3:1至1.5:1、2:1至1.5:1、10:1至2:1；8:1至2:1、6:1至2:1、5:1至2:1、10:1至3:1；8:1至3:1、6:1至3:1、5:1至3:1、10:1至4:1；4:1至2:1、6:1至4:1或10:1至5:1)，或1:1.5至1:10的范围内(例如，1:1.5至1:8、1:1.5至1:6、1:1.5至1:5、1:1.5至1:4、1:1.5至1:3、1:1.5至1:2、1:2至1:10、1:2至1:8、1:2至1:6、1:2至1:5、1:2至1:4、1:2至1:3、1:3至1:10、1:3至1:8、1:3至1:6、1:3至1:5、1:4至1:10、1:4至1:8、1:4至1:6或1:5至1:10)。在一些此类情况下，d-异构体聚合物与l-异构体聚合物的比率不是1:1。在一些此类情况下，阴离子聚合物组合物包括选自聚(d-谷氨酸)(pdea)和聚(d-天冬氨酸)(pdda)的阴离子聚合物，其中(任选地)阳离子聚合物组合物可包括选自聚(l-精氨酸)、聚(l-赖氨酸)、聚(l-组氨酸)、聚(l-鸟氨酸)和聚(l-瓜氨酸)的阳离子聚合物。在一些情况下，阳离子聚合物组合物包含选自聚(d-精氨酸)、聚(d-赖氨酸)、聚(d-组氨酸)、聚(d-鸟氨酸)和聚(d-瓜氨酸)的阳离子聚合物，其中(任选地)阴离子聚合物组合物可包括选自聚(l-谷氨酸)(plea)和聚(l-天冬氨酸)(plda)的阴离子聚合物。

在一些实施方案中，纳米颗粒包括核和包封所述核的可脱落层，其中所述核包括(i)阴离子聚合物组合物；(ii)阳离子聚合物组合物；(iii)阳离子多肽组合物；(iv)核酸和/或蛋白有效负载，其中(a)所述阴离子聚合物组合物包含阴离子氨基酸的d-异构体的聚合物和阴离子氨基酸的l-异构体的聚合物，和/或(b)所述阳离子聚合物组合物包括阳离子氨基酸的d-异构体的聚合物和阳离子氨基酸的l-异构体的聚合物。在一些此类情况下，所述阴离子聚合物组合物包含选自聚(d-谷氨酸)(pdea)和聚(d-天冬氨酸)(pdda)的第一阴离子聚合物；并且包含选自聚(l-谷氨酸)(plea)和聚(l-天冬氨酸)(plda)的第二阴离子聚合物。在一些情况下，所述阳离子聚合物组合物包含选自聚(d-精氨酸)、聚(d-赖氨酸)、聚(d-组氨酸)，聚(d-鸟氨酸)和聚(d-瓜氨酸)的第一阳离子聚合物；并且包含选自聚(l-精氨酸)、聚(l-赖氨酸)、聚(l-组氨酸)、聚(l-鸟氨酸)和聚(l-瓜氨酸)的第二阳离子聚合物。在一些情况下，阴离子氨基酸的d-异构体的聚合物相对于所述阴离子氨基酸的l-异构体的聚合物以10:1至1:10范围的比率存在。在一些情况下，阳离子氨基酸的d-异构体的聚合物相对于阳离子氨基酸的l-异构体的聚合物以10:1至1:10范围的比率存在。

纳米颗粒组分的敏感性

在一些实施方案中，可通过选择特定类型的蛋白,例如作为核的一部分(例如，阳离子多肽组合物的一部分、阳离子聚合物组合物的一部分和/或阴离子聚合物组合物的一部分)来控制有效负载释放的时间。例如，可能希望延迟有效负载释放持续特定时间范围，或直到有效负载存在于特定细胞位置(例如，细胞溶质、细胞核、溶酶体、内体)或在特定条件下(例如，低ph、高ph等)。因此，在一些情况下，使用对特定蛋白活性(例如，酶活性)敏感的蛋白(例如，作为核的一部分)，例如，是特定蛋白活性(例如，酶活性)的底物，并且这与对普遍存在的细胞机制(例如一般降解机制)敏感大不相同。对特定蛋白活性敏感的蛋白在本文中称为“酶敏感蛋白”(esp)。esp的说明性实例包括但不限于：(i)作为基质金属蛋白酶(mmp)活性(细胞外活性的实例)的底物的蛋白，例如包含mmp识别的基序的蛋白；(ii)作为组织蛋白酶活性(细胞内内体活性的实例)的底物的蛋白，例如包含组织蛋白酶识别的基序的蛋白；(iii)作为甲基转移酶和/或乙酰转移酶活性(细胞内核活性的实例)的底物的蛋白，诸如组蛋白尾肽(htp)，例如包含可被酶促甲基化/去甲基化的基序和/或可以酶促乙酰化/去乙酰化的基序的蛋白。例如，在一些情况下，核酸有效负载与蛋白(诸如组蛋白尾肽)凝聚，所述蛋白是乙酰转移酶活性的底物，并且蛋白的乙酰化导致蛋白释放有效负载-因此，人们可以运动通过选择使用或多或少对乙酰化敏感的蛋白来对有效负载释放进行控制。

在一些情况下，主题纳米颗粒的核包括酶中性多肽(enp)，其是多肽均聚物(即，具有重复序列的蛋白)，其中该多肽不具有特定活性并且是中性的。例如，与都具有特定活性的nls序列和htp不同，enp没有特定活性。

在一些情况下，主题纳米颗粒的核包括酶保护多肽(epp)，其是对酶活性具有抗性的蛋白。pp的实例包括但不限于：(i)包括d-异构体氨基酸(例如d-异构体聚合物)的多肽，其可以抵抗蛋白水解降解；(ii)自我保护结构域，诸如聚谷氨酰胺重复结构域(例如，qqqqqqqqqq)(seqidno:170)。

通过控制作为主题纳米颗粒的一部分(例如，纳米颗粒核的一部分)的敏感蛋白(esp)、中性蛋白(enp)和受保护蛋白(epp)的相对量，可以控制有效负载的释放。例如，与使用更多的epp相比，使用更多的esp通常可以导致有效负载更快地释放。此外，使用更多的esp通常可以导致有效负载的释放，这取决于一组的特定条件/环境，例如导致esp敏感的蛋白(例如酶)活性的条件/环境。

阴离子聚合物组合物

阴离子聚合物组合物可以包含一种或多种阴离子氨基酸聚合物。例如，在一些情况下，主题阴离子聚合物组合物包含选自以下的聚合物：聚(谷氨酸)(pea)、聚(天冬氨酸)(pda)及其组合物。在一些情况下，给定的阴离子氨基酸聚合物可以包含天冬氨酸和谷氨酸残基的混合。每种聚合物可以作为l-异构体或d-异构体的聚合物存在于组合物中，其中d-异构体在靶细胞中更稳定，因为它们需要更长的时间来降解。因此，在纳米颗粒核中包含d-异构体聚(氨基酸)延迟了核降解(以及随后的有效负载释放)。因此有效负载释放速率可以被控制并且与d-异构体的聚合物与l-异构体的聚合物的比率成比率，其中d-异构体与l-异构体的较高比率增加了有效负载释放的持续时间(即，降低释放速率)。换句话说，d-异构体和l-异构体的相对量可以调节纳米颗粒核的定时释放动力学以及对降解和有效负载释放的酶促敏感性。

在一些情况下，主题纳米颗粒的阴离子聚合物组合物包含阴离子氨基酸聚合物(例如，聚(谷氨酸)((pea)和聚(天冬氨酸)(pda))的d-异构体的聚合物和l-异构体的聚合物。在一些情况下，d-与l-异构体比率在10:1-1:10的范围内(例如，8:1-1:10、6:1-1:10、4:1-1:10、3:1-1:10、2:1-1:10、1:1-1:10、10:1-1:8、8:1-1:8、6:1-1:8、4:1-1:8、3:1-1:8、2:1-1:8、1:1-1:8、10:1-1:6、8:1-1:6、6:1-1:6、4:1-1:6、3:1-1:6、2:1-1:6、1:1-1:6、10:1-1:4、8:1-1:4、6:1-1:4、4:1-1:4、3:1-1:4、2:1-1:4、1:1-1:4、10:1-1:3、8:1-1:3、6:1-1:3、4:1-1:3、3:1-1:3、2:1-1:3、1:1-1:3、10:1-1:2、8:1-1:2、6:1-1:2、4:1-1:2、3:1-1:2、2:1-1:2、1:1-1:2、10:1-1:1、8:1-1:1、6:1-1:1、4:1-1:1、3:1-1:1或2:1-1:1)。

因此，在一些情况下，阴离子聚合物组合物包含第一阴离子聚合物(例如，氨基酸聚合物)，所述第一阴离子聚合物是d-异构体的聚合物(例如，选自聚(d-谷氨酸)(pdea)和聚(d-天冬氨酸)(pdda))；并且包含第二阴离子聚合物(例如，氨基酸聚合物)，所述第二阴离子聚合物是l-异构体的聚合物(例如，选自聚(l-谷氨酸)(plea)和聚(l-天冬氨酸)(plda))。在一些情况下，第一阴离子聚合物(d-异构体)与第二阴离子聚合物(l-异构体)的比率在范围10:1-1:10的范围内(例如，8:1-1:10、6:1-1:10、4:1-1:10、3:1-1:10、2:1-1:10、1:1-1:10、10:1-1:8、8:1-1:8、6:1-1:8、4:1-1:8、3:1-1:8、2:1-1:8、1:1-1:8、10:1-1:6、8:1-1:6、6:1-1:6、4:1-1:6、3:1-1:6、2:1-1:6、1:1-1:6、10:1-1:4、8:1-1:4、6:1-1:4、4:1-1:4、3:1-1:4、2:1-1:4、1:1-1:4、10:1-1:3、8:1-1:3、6:1-1:3、4:1-1:3、3:1-1:3、2:1-1:3、1:1-1:3、10:1-1:2、8:1-1:2、6:1-1:2、4:1-1:2、3:1-1:2、2:1-1:2、1:1-1:2、10:1-1:1、8:1-1:1、6:1-1:1、4:1-1:1、3:1-1:1或2:1-1:1)。

在一些实施方案中，主题纳米颗粒的核的阴离子聚合物组合物包含(例如，除阴离子聚合物的任何前述实例之外或代替阴离子聚合物的任何前述实例)糖胺聚糖、糖蛋白、多糖、聚(甘露糖醛酸)、聚(古洛糖醛酸)、肝素、硫酸肝素、软骨素、硫酸软骨素、角质素、硫酸角质素、聚集蛋白聚糖、聚(葡糖胺)或包括其任何组合的阴离子聚合物。

在一些实施方案中，核内的阴离子聚合物可以具有的分子量范围为1-200kda(例如，1-150kda、1-100kda、1-50kda、5-200kda、5-150kda、5-100kda、5-50kda、10-200kda、10-150kda、10-100kda、10-50kda、15-200kda、15-150kda、15-100kda或15-50kda)。作为实例，在一些情况下，阴离子聚合物包含分子量约为15kda的聚(谷氨酸)。

在一些情况下，阴离子氨基酸聚合物包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基可以促进例如与接头、nls和/或阳离子多肽(例如，组蛋白或htp)的缀合。例如，半胱氨酸残基可用于通过巯基化学(例如，二硫键)和/或胺反应性化学进行交联(缀合)。因此，在一些实施方案中，阴离子聚合物组合物的阴离子氨基酸聚合物(例如，聚(谷氨酸)(pea)、聚(天冬氨酸)(pda)、聚(d-谷氨酸)(pdea)、聚(d-天冬氨酸)(pdda)、聚(l-谷氨酸)(plea)、聚(l-天冬氨酸)(plda))包含半胱氨酸残基。在一些情况下，所述阴离子氨基酸聚合物在n-末端和/或c-末端上包含半胱氨酸残基。在一些情况下，所述阴离子氨基酸聚合物包含内部半胱氨酸残基。

在一些情况下，所述阴离子氨基酸聚合物包含(和/或缀合)核定位信号(nls)(在下文更详细地描述)。因此，在一些实施方案中，阴离子聚合物组合物的阴离子氨基酸聚合物(例如，聚(谷氨酸)(pea)、聚(天冬氨酸)(pda)、聚(d-谷氨酸)(pdea)、聚(d-天冬氨酸)(pdda)、聚(l-谷氨酸)(plea)、聚(l-天冬氨酸)(plda))包含一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个或者四个或更多个)nls(和/或与其缀合)。在一些情况下，所述阴离子氨基酸聚合物在n-末端和/或c-末端上包含nls。在一些情况下，所述阴离子氨基酸聚合物包含内部nls。

在一些情况下，当产生主题纳米颗粒核时，在阳离子聚合物之前添加阴离子聚合物。

阳离子聚合物组合物

阳离子聚合物组合物可包含一种或多种阳离子氨基酸聚合物。例如，在一些情况下，主题阳离子聚合物组合物包含选自以下的聚合物：聚(精氨酸)(pr)、聚(赖氨酸)(pk)、聚(组氨酸)(ph)、聚(鸟氨酸)、聚(瓜氨酸)及其组合。在一些情况下，给定的阳离子氨基酸聚合物可以包含精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸和瓜氨酸残基的混合(以任何方便的组合形式)。每种聚合物可以作为l-异构体或d-异构体的聚合物存在于组合物中，其中d-异构体在靶细胞中更稳定，因为它们需要更长的时间来降解。因此，在纳米颗粒核中包含d-异构体聚(氨基酸)延迟了核降解(以及随后的有效负载释放)。因此有效负载释放速率可以被控制并且与d-异构体的聚合物与l-异构体的聚合物的比率成比率，其中d-异构体与l-异构体的较高比率增加了有效负载释放的持续时间(即，降低释放速率)。换句话说，d-异构体和l-异构体的相对量可以调节纳米颗粒核的定时释放动力学以及对降解和有效负载释放的酶促敏感性。

在一些情况下，主题纳米颗粒的阳离子聚合物组合物包括阳离子氨基酸聚合物(例如，聚(精氨酸)(pr)、聚(赖氨酸)(pk)、聚(组氨酸)(ph)、聚(鸟氨酸)、聚(瓜氨酸))的d-异构体聚合物和l-异构体聚合物。在一些情况下，d-与l-异构体比率在10:1-1:10的范围内(例如，8:1-1:10、6:1-1:10、4:1-1:10、3:1-1:10、2:1-1:10、1:1-1:10、10:1-1:8、8:1-1:8、6:1-1:8、4:1-1:8、3:1-1:8、2:1-1:8、1:1-1:8、10:1-1:6、8:1-1:6、6:1-1:6、4:1-1:6、3:1-1:6、2:1-1:6、1:1-1:6、10:1-1:4、8:1-1:4、6:1-1:4、4:1-1:4、3:1-1:4、2:1-1:4、1:1-1:4、10:1-1:3、8:1-1:3、6:1-1:3、4:1-1:3、3:1-1:3、2:1-1:3、1:1-1:3、10:1-1:2、8:1-1:2、6:1-1:2、4:1-1:2、3:1-1:2、2:1-1:2、1:1-1:2、10:1-1:1、8:1-1:1、6:1-1:1、4:1-1:1、3:1-1:1或2:1-1:1)。

因此，在一些情况下，阳离子聚合物组合物包含第一阳离子聚合物(例如，氨基酸聚合物)，所述第一阳离子聚合物是d-异构体的聚合物(例如，选自聚(d-精氨酸)、聚(d-赖氨酸)、聚(d-组氨酸)、聚(d-鸟氨酸)和聚(d-瓜氨酸))；并且包含第二阳离子聚合物(例如，氨基酸聚合物)，所述第二阳离子聚合物是l-异构体的聚合物(例如，选自聚(l-精氨酸)、聚(l-赖氨酸)、聚(l-组氨酸)、聚(l-鸟氨酸)和聚(l-瓜氨酸))。在一些情况下，第一阳离子聚合物(d-异构体)与第二阳离子聚合物(l-异构体)的比率在10:1-1:10的范围内(例如，8:1-1:10、6:1-1:10、4:1-1:10、3:1-1:10、2:1-1:10、1:1-1:10、10:1-1:8、8:1-1:8、6:1-1:8、4:1-1:8、3:1-1:8、2:1-1:8、1:1-1:8、10:1-1:6、8:1-1:6、6:1-1:6、4:1-1:6、3:1-1:6、2:1-1:6、1:1-1:6、10:1-1:4、8:1-1:4、6:1-1:4、4:1-1:4、3:1-1:4、2:1-1:4、1:1-1:4、10:1-1:3、8:1-1:3、6:1-1:3、4:1-1:3、3:1-1:3、2:1-1:3、1:1-1:3、10:1-1:2、8:1-1:2、6:1-1:2、4:1-1:2、3:1-1:2、2:1-1:2、1:1-1:2、10:1-1:1、8:1-1:1、6:1-1:1、4:1-1:1、3:1-1:1或2:1-1:1)。

在一些实施方案中，主题纳米颗粒的核的阳离子聚合物组合物包含(例如，除阳离子聚合物的任何前述实例之外或代替阳离子聚合物的任何前述实例)聚(乙烯亚胺)；聚(酰氨基胺)(pamam)；聚(天冬酰胺)；多肽(例如，用于形成用于核凝聚的“蜘蛛网”状支)；电荷官能化聚酯；阳离子多糖；乙酰化氨基糖；脱乙酰壳多糖或包括其任何组合的阳离子聚合物(例如，以线性或支化的形式)。

在一些实施方案中，核内的阳离子聚合物可以具有的分子量范围为1-200kda(例如，1-150kda、1-100kda、1-50kda、5-200kda、5-150kda、5-100kda、5-50kda、10-200kda、10-150kda、10-100kda、10-50kda、15-200kda、15-150kda、15-100kda或15-50kda)。作为实例，在一些情况下，阳离子聚合物包含例如分子量为约29kda的聚(l-精氨酸)。作为另一个实例，在一些情况下，阳离子聚合物包含分子量为约25kda(pei)的线性聚(乙烯亚胺)。作为另一个实例，在一些情况下，阳离子聚合物包含分子量为约10kda的支化聚(乙烯亚胺)。作为另一个实例，在一些情况下，阳离子聚合物包含分子量为约70kda的支化聚(乙烯亚胺)。在一些情况下，阳离子聚合物包含pamam。

在一些情况下，阳离子氨基酸聚合物包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基可以促进例如与接头、nls和/或阳离子多肽(例如，组蛋白或htp)的缀合。例如，半胱氨酸残基可用于通过巯基化学(例如，二硫键)和/或胺反应性化学进行交联(缀合)。因此，在一些实施方案中，阳离子聚合物组合物的阳离子氨基酸聚合物(例如，聚(精氨酸)(pr)；聚(赖氨酸)(pk)；聚(组氨酸)(ph)；聚(鸟氨酸)和聚(瓜氨酸)；聚(d-精氨酸)(pdr)；聚(d-赖氨酸)(pdk)；聚(d-组氨酸)(pdh)；聚(d-鸟氨酸)和聚(d-瓜氨酸)；聚(l-精氨酸)(plr)；聚(l-赖氨酸)(plk)；聚(l-组氨酸)(plh)；聚(l-鸟氨酸)和聚(l-瓜氨酸))包含半胱氨酸残基。在一些情况下，所述阳离子氨基酸聚合物在n-末端和/或c-末端上包含半胱氨酸残基。在一些情况下，所述阳离子氨基酸聚合物包含内部半胱氨酸残基。

在一些情况下，所述阳离子氨基酸聚合物包含(和/或缀合)核定位信号(nls)(在下文更详细地描述)。因此，在一些实施方案中，阳离子聚合物组合物的阳离子氨基酸聚合物(例如，聚(精氨酸)(pr)；聚(赖氨酸)(pk)；聚(组氨酸)(ph)；聚(鸟氨酸)和聚(瓜氨酸)；聚(d-精氨酸)(pdr)；聚(d-赖氨酸)(pdk)；聚(d-组氨酸)(pdh)；聚(d-鸟氨酸)和聚(d-瓜氨酸)；聚(l-精氨酸)(plr)；聚(l-赖氨酸)(plk)；聚(l-组氨酸)(plh)；聚(l-鸟氨酸)和聚(l-瓜氨酸))包含(和/或缀合至)一个或两个(例如，两个或更多个、三个或更多个或者四个或更多个)nls。在一些情况下，所述阳离子氨基酸聚合物在n-末端和/或c-末端上包含nls。在一些情况下，所述阳离子氨基酸聚合物包含内部nls。

阳离子多肽组合物

在一些实施方案中，纳米颗粒的阳离子多肽组合物可介导稳定性、亚细胞区室化和/或有效负载释放。作为一个实例，主题纳米颗粒核内的组蛋白的n-末端片段(通常称为组蛋白尾肽)在某些情况下不但能够通过各种组蛋白修饰去质子化，如在组蛋白乙酰转移酶介导的乙酰化的情况下，而且可以介导纳米颗粒核的组分(例如，有效负载)的有效核特异性解包。在一些情况下，阳离子多肽组合物包含组蛋白和/或组蛋白尾肽(例如，阳离子多肽可以是组蛋白和/或组蛋白尾肽)。在一些情况下，阳离子多肽组合物包含含有nls的肽(例如，阳离子多肽可以是含有nls的肽)。在一些情况下，阳离子多肽组合物包含含有线粒体定位信号的肽(例如，阳离子多肽可以是包含线粒体定位信号的肽)。

组蛋白尾肽(htp)

在一些实施方案中，主题纳米颗粒的阴离子多肽组合物包含组蛋白肽或组蛋白肽的片段，诸如n-末端组蛋白尾(例如，h1、h2(例如，h2a、h2ax、h2b)、h3或h4组蛋白的组蛋白尾)。组蛋白的尾部片段在本文中称为组蛋白尾肽(htp)。因为此类蛋白(组蛋白和/或htp)可以与作为主题纳米颗粒核的一部分的核酸有效负载凝聚，包含一个或多个组蛋白或htp(例如，作为阳离子多肽组合物的一部分)的核在本文中有时称为核小体--模拟核。组蛋白和/或htp也可以作为单体包含在内，并且在一些情况下，当核酸有效负载凝聚成纳米颗粒核时，可以形成二聚体、三聚体、四聚体和/或八聚体。在一些情况下，htp不但能够通过各种组蛋白修饰去质子化，如在组蛋白乙酰转移酶介导的乙酰化的情况下，而且可以介导核组分的有效核特异性解包(例如，释放有效负载)。包含组蛋白和/或htp的核的运输可能依赖于利用通过高尔基体和内质网的逆行运输的替代内吞途径。此外，一些组蛋白包括先天核定位序列，并且核中包含nls可以将核(包括有效负载)引导至靶细胞的细胞核。

在一些实施方案中，主题阳离子多肽组合物包含具有h2a、h2ax、h2b、h3或h4蛋白的氨基酸序列的蛋白。在一些情况下，主题阳离子多肽组合物包含具有对应于组蛋白的n-末端区域的氨基酸序列的蛋白。例如，片段(htp)可以包含组蛋白的前5个、前10个、前15个、前20个、前25个、前30个、前35个、前40个、前45个或前50个n-末端氨基酸。在一些情况下，主题htp包含来自组蛋白的n-末端区域的5-50个氨基酸(例如，5-45个、5-40个、5-35个、5-30个、5-25个、5-20个、8-50个、8-45个、8-40个、8-35个、8-30个、10-50个、10-45个、10-40个、10-35个或10-30个氨基酸)。在一些情况下，主题阳离子多肽包含5-150个氨基酸(例如，5-100个、5-50个、5-35个、5-30个、5-25个、5-20个、8-150个、8-100个、8-50个、8-40个、8-35个、8-30个、10-150个、10-100个、10-50个、10-40个、10-35个或10-30个氨基酸)。

在一些情况下，阳离子多肽组合物的阳离子多肽(例如，组蛋白或htp，例如，h1、h2、h2a、h2ax、h2b、h3或h4)包含翻译后修饰(例如，在一些情况下，对一个或多个组氨酸、赖氨酸、精氨酸或其它互补残基进行修饰)。例如，在一些情况下，阳离子多肽甲基化(和/或易于甲基化/去甲基化)；乙酰化(和/或易于乙酰化/去乙酰化)；巴豆酰化(和/或易于巴豆酰化/去巴豆酰化)；泛素化(和/或易于泛素化/去泛素化)；磷酸化(和/或易于磷酸化/去磷酸化)；sumo化(和/或易于sumo化/去sumo化)；法尼基化(和/或易于法尼基化/去法尼基化)；硫酸化(和/或易于硫酸化/脱硫)或以其它方式被翻译后修饰。在一些情况下，阳离子多肽组合物的阳离子多肽(例如，组蛋白或htp，例如，h1、h2、h2a、h2ax、h2b、h3、或h4)是p300/cbp底物(例如，参见以下的示例htp，例如seqnos.129-130)。在一些情况下，阳离子多肽组合物的阳离子多肽(例如，组蛋白或htp，例如，h1、h2、h2a、h2ax、h2b、h3或h4)包含一个或多个硫醇残基(例如，可以包含硫酸化或易于硫酸化的半胱氨酸和/或甲硫氨酸残基)(例如，作为硫代硫酸盐硫转移酶底物)。在一些情况下，阳离子多肽的阳离子多肽(例如，组蛋白或htp，例如，h1、h2、h2a、h2ax、h2b、h3或h4)在c-末端上酰胺化。组蛋白h2a、h2b、h3和h4(和/或htp)可以在其任何赖氨酸处单甲基化、二甲基化或三甲基化以促进或抑制转录活性并且改变核特异性释放动力学。

阳离子多肽可以用期望的修饰合成或者可以在体外反应中被修饰。可替换的是，可以在细胞群中表达阳离子多肽(例如，组蛋白或htp)并且可以分离/纯化期望的修饰蛋白。在一些情况下，主题纳米颗粒的阳离子多肽组合物包含甲基化htp，例如包含h3k4(me3)的htp序列-包含如seqidno:75或88)所示氨基酸序列。在一些情况下，阳离子多肽组合物的阳离子多肽(例如，组蛋白或htp，例如h1、h2、h2a、h2ax、h2b、h3或h4)包含c-末端酰胺。

组蛋白和htp的实例

实例包含但不限于以下序列：

h2a

sgrgkqggkarakaktrssr(seqidno:62)[1-20]

sgrgkqggkarakaktrssraglqfpvgrvhrllrkggg(seqidno:63)[1-39]

msgrgkqggkarakaktrssraglqfpvgrvhrllrkgnyaervgagapvylaavleyltaeilelagnaardnkktriiprhlqlairndeelnkllgkvtiaqggvlpniqavllpkkteshhkakgk(seqidno:64)[1-130]

h2ax

ckatqasqey(seqidno:65)[134–143]

kktsatvgpkapsggkkatqasqey(seqidno:66)[kk120-129]msgrgktggkarakaksrssraglqfpvgrvhrllrkghyaervgagapvylaavleyltaeilelagnaardnkktriiprhlqlairndeelnkllggvtiaqggvlpniqavllpkktsatvgpkapsggkkatqasqey(seqidno:67)[1-143]

h2b

pepa-k(cr)–sapapk(seqidno:68)[1-11h2bk5(cr)]

[cr:巴豆酰化(crotonylated)(巴豆酰化)(crotonylation)]

pepaksapapk(seqidno:69)[1-11]

aqkkdgkkrkrsrke(seqidno:70)[21-35]

mpepaksapapkkgskkavtkaqkkdgkkrkrsrkesysiyvykvlkqvhpdtgisskamgimnsfvndiferiageasrlahynkrstitsreiqtavrlllpgelakhavsegtkavtkytssk(seqidno:71)[1-126]

h3

artkqtar(seqidno:72)[1-8]

art-k(me1)-qtarks(seqidno:73)[1-8h3k4(me1)]

art-k(me2)-qtarks(seqidno:74)[1-8h3k4(me2)]

art-k(me3)-qtarks(seqidno:75)[1-8h3k4(me3)]

artkqtark-ps-tggka(seqidno:76)[1-15h3ps10]

artkqtarkstggkaprkwc-nh2(seqidno:77)[1-18wc,酰胺]

artkqtarkstgg-k(ac)-aprkq(seqidno:78)[1-19h3k14(ac)]

artkqtarkstggkaprkql(seqidno:79)[1-20]

artkqtar-k(ac)-stggkaprkql(seqidno:80)[1-20h3k9(ac)]

artkqtarkstggkaprkqla(seqidno:81)[1-21]

artkqtar-k(ac)-stggkaprkqla(seqidno:82)[1-21h3k9(ac)]

artkqtar-k(me2)-stggkaprkqla(seqidno:83)[1-21h3k9(me1)]

artkqtar-k(me2)-stggkaprkqla(seqidno:84)[1-21h3k9(me2)]

artkqtar-k(me2)-stggkaprkqla(seqidno:85)[1-21h3k9(me3)]

art-k(me1)-qtarkstggkaprkqla(seqidno:86)[1-21h3k4(me1)]

art-k(me2)-qtarkstggkaprkqla(seqidno:87)[1-21h3k4(me2)]

art-k(me3)-qtarkstggkaprkqla(seqidno:88)[1-21h3k4(me3)]

artkqtar-k(ac)-ps-tggkaprkqla(seqidno:89)[1-21h3k9(ac),ps10]

art-k(me3)-qtar-k(ac)-ps-tggkaprkqla(seqidno:90)[1-21h3k4(me3),k9(ac),ps10]

artkqtarkstggkaprkqlac(seqidno:91)[1-21cys]

artkqtar-k(ac)-stggkaprkqlatka(seqidno:92)[1-24h3k9(ac)]

artkqtar-k(me3)-stggkaprkqlatka(seqidno:93)[1-24h3k9(me3)]

artkqtarkstggkaprkqlatkaa(seqidno:94)[1-25]

art-k(me3)–qtarkstggkaprkqlatkaa(seqidno:95)[1-25h3k4(me3)]

tkqtar-k(me1)-stggkapr(seqidno:96)[3-17h3k9(me1)]

tkqtar-k(me2)-stggkapr(seqidno:97)[3-17h3k9(me2)]

tkqtar-k(me3)-stggkapr(seqidno:98)[3-17h3k9(me3)]

kstgg-k(ac)–aprkq(seqidno:99)[9-19h3k14(ac)]

qtarkstggkaprkqlask(seqidno:100)[5-23]

aprkqlatkaarksapatggvkkph(seqidno:101)[15-39]

atkaarksapatggvkkphryrpg(seqidno:102)[21-44]

kaarksapa(seqidno:103)[23-31]

kaarksapatgg(seqidno:104)[23-34]

kaarksapatggc(seqidno:105)[23-34cys]

kaar-k(ac)-sapatgg(seqidno:106)[h3k27(ac)]

kaar-k(me1)-sapatgg(seqidno:107)[h3k27(me1)]

kaar-k(me2)-sapatgg(seqidno:108)[h3k27(me2)]

kaar-k(me3)-sapatgg(seqidno:109)[h3k27(me3)]

at-k(ac)–aarksapstggvkkphryrpg(seqidno:110)[21-44h3k23(ac)]

atkaark-ps–apatggvkkphryrpg(seqidno:111)[21-44ps28]

artkqtarkstggkaprkqlatkaarksapatggv(seqidno:112)[1-35]

stggv-k(me1)-kphry(seqidno:113)[31-41h3k36(me1)]

stggv-k(me2)-kphry(seqidno:114)[31-41h3k36(me2)]

stggv-k(me3)-kphry(seqidno:115)[31-41h3k36(me3)]

gtvalreirryq-k(ac)-stellir(seqidno:116)[44-63h3k56(ac)]

artkqtarkstggkaprkqlatkaarksapatggvkkphryrpgtvalre(seqidno:117)[1-50]

tellirklpfqrlvreiaqdf-k(me1)-tdlrfqsaai(seqidno:118)[h3k79(me1)]

eiaqdfktdlr(seqidno:119)[73-83]

eiaqdf-k(ac)-tdlr(seqidno:120)[73-83h3k79(ac)]

eiaqdf-k(me3)-tdlr(seqidno:121)[73-83h3k79(me3)]

rlvreiaqdfktdlrfqssav(seqidno:122)[69-89]

rlvreiaqdfk-(me1)-tdlrfqssav(seqidno:123)[69-89h3k79(me1),酰胺]

rlvreiaqdfk-(me2)-tdlrfqssav(seqidno:124)[69-89h3k79(me2)，酰胺]

rlvreiaqdfk-(me3)-tdlrfqssav(seqidno:125)[69-89h3k79(me3)，酰胺]

krvtimpkdiqlarrirgera(seqidno:126)[116-136]

martkqtarkstggkaprkqlatkvarksapatggvkkphryrpgtvalreirryqkstellirklpfqrlmreiaqdfktdlrfqssavmalqeacesylvglfedtnlcvihakrvtimpkdiqlarrirgera(seqidno:127)[1-136]

h4

sgrgkgg(seqidno:128)[1-7]

rgkggkglgkga(seqidno:129)[4-12]

sgrgkggkglgkggakrhrkv(seqidno:130)[1-21]

kglgkggakrhrkvlrdnwc-nh2(seqidno:131)[8-25wc，酰胺]

sgrg-k(ac)-gg-k(ac)-glg-k(ac)-gga-k(ac)–rhrkvlrdngsgsk(seqidno:132)[1-25h4k5,8,12,16(ac)]

sgrgkggkglgkggakrhrk-nh2(seqidno:133)[1-20h4prmt7(蛋白精氨酸甲基转移酶7)底物，m1]

sgrg-k(ac)–ggkglgkggakrhrk(seqidno:134)[1-20h4k5(ac)]

sgrgkgg–k(ac)-glgkggakrhrk(seqidno:135)[1-20h4k8(ac)]

sgrgkggkglg-k(ac)-ggakrhrk(seqidno:136)[1-20h4k12(ac)]

sgrgkggkglgkgga-k(ac)-rhrk(seqidno:137)[1-20h4k16(ac)]

kglgkggakrhrkvlrdnwc-nh2(seqidno:138)[1-25wc，酰胺]

msgrgkggkglgkggakrhrkvlrdniqgitkpairrlarrggvkrisgliyeetrgvlkvflenvirdavtytehakrktvtamdvvyalkrqgrtlygfgg(seqidno:139)[1-103]

因此，主题阳离子多肽组合物的阳离子多肽可以包含具有seqidno:62-139中的任一个所示氨基酸序列的氨基酸序列。在一些情况下，主题阳离子多肽组合物的阳离子多肽包含与seqidno:62-139中任一个所示氨基酸序列具有80％或更高的序列同一性(例如，85％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，主题阳离子多肽组合物的阳离子多肽包含与seqidno:62-139中任一个所示氨基酸序列具有90％或更高的序列同一性(例如，95％或更高、98％或更高、99％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。阳离子多肽可以包含任何方便的修饰，并且上文讨论了多种这种设想的修饰，例如甲基化、乙酰化、巴豆酰化、泛素化、磷酸化、sumo化、法尼基化、硫酸化等。

在一些情况下，阳离子多肽组合物的阳离子多肽包含与seqidno:94所示氨基酸序列具有80％或更高的序列同一性(例如，85％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，阳离子多肽组合物的阳离子多肽包含与seqidno:94所示氨基酸序列具有95％或更高的序列同一性(例如，98％或更高、99％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，阳离子多肽组合物的阳离子多肽包含seqidno:94所示的氨基酸序列。在一些情况下，阳离子多肽组合物的阳离子多肽包含由h3k4(me3)(seqidno:95)表示的序列，所述阳离子多肽包括人组蛋白3蛋白的前25个氨基酸，并且在赖氨酸4上三甲基化(例如，在一些情况下在c-末端上酰胺化)。

在一些实施方案中，阳离子多肽组合物的阳离子多肽(例如，组蛋白或htp，例如，h1、h2、h2a、h2ax、h2b、h3或h4)包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基可以促进与：阳离子(或者在一些情况下为阴离子)氨基酸聚合物、接头、nls和/或其它阳离子多肽的缀合(例如，在一些情况下形成支化组蛋白结构)。例如，半胱氨酸残基可用于通过巯基化学(例如，二硫键)和/或胺反应性化学进行交联(缀合)。在一些情况下，所述半胱氨酸残基是内部的。在一些情况下，所述半胱氨酸残基定位于n-末端和/或c-末端处。在一些情况下，阳离子多肽组合物的阳离子多肽(例如，组蛋白或htp，例如h1、h2、h2a、h2ax、h2b、h3或h4)包含添加半胱氨酸残基的突变(例如，插入或取代)。包含半胱氨酸的htp的实例包含但不限于：

ckatqasqey(seqidno:140)-来自h2ax

artkqtarkstggkaprkqlac(seqidno:141)-来自h3

artkqtarkstggkaprkwc(seqidno:142)

kaarksapatggc(seqidno:143)-来自h3

kglgkggakrhrkvlrdnwc(seqidno:144)-来自h4

martkqtarkstggkaprkqlatkvarksapatggvkkphryrpgtvalreirryqkstellirklpfqrlmreiaqdfktdlrfqssavmalqeacesylvglfedtnlcvihakrvtimpkdiqlarrirgera(seqidno:145)-来自h3

在一些实施方案中，阳离子多肽组合物的阳离子多肽(例如，组蛋白或htp，例如，h1、h2、h2a、h2ax、h2b、h3或h4)与主题纳米颗粒的核的阳离子(和/或阴离子)氨基酸聚合物缀合。作为实例，组蛋白或htp可以通过半胱氨酸残基与阳离子氨基酸聚合物(例如，包含聚(赖氨酸)的聚合物)缀合，例如，其中用与组蛋白或htp的半胱氨酸键合的二硫化物取代聚合物的一个或多个赖氨酸的一个或多个吡啶基二硫化物基团。

修饰的/支化结构

在一些实施方案中，主题阳离子多肽组合物的阳离子多肽具有线性结构。在一些实施方案中，主题阳离子多肽组合物的阳离子多肽具有支化结构。

例如，在一些情况下，阳离子多肽(例如，htp；例如，具有半胱氨酸残基的htp)与阳离子聚合物(例如，聚(l-精氨酸)、聚(d-赖氨酸)、聚(l-赖氨酸)、聚(d-赖氨酸))的末端(例如，在其c-末端处)缀合，从而形成延伸的线性多肽。在一些情况下，一个或多个(两个或更多个、三个或更多个等)阳离子多肽(例如，htp；例如具有半胱氨酸残基的htp)与阳离子聚合物(例如，聚(l-精氨酸)、聚(d-赖氨酸)、聚(l-赖氨酸)、聚(d-赖氨酸))的一个或多个末端(例如，在其c-末端处)缀合，从而形成延伸的线性多肽。在一些情况下，阳离子聚合物具有范围为4,500-150,000da)的分子量。

作为另一个实例，在一些情况下，一个或多个(两个或更多个，三个或更多个等)阳离子多肽(例如，htp；例如具有半胱氨酸残基的htp)与阳离子聚合物(例如，聚(l-精氨酸)、聚(d-赖氨酸)、聚(l-赖氨酸)、聚(d-赖氨酸))的侧链(例如，在其c-末端处)缀合，从而形成支化结构(支化多肽)。

通过纳米颗粒核的组分(例如，主题阳离子多肽组合物的组分)形成支化结构在一些情况下可以增加可以实现的核(例如，核酸有效负载的)凝聚的量。因此，在一些情况下，期望使用形成支化结构的组分。支化结构的各种类型是目的支化结构，并且可以产生的支化结构的实例(例如，使用如htp等主题阳离子多肽；例如，具有半胱氨酸残基的htp；类肽；聚酰胺等)包含但不限于：刷状聚合物；网状(例如蜘蛛网)；接枝聚合物；星形聚合物；梳状聚合物；聚合物网络；树状聚合物等。

作为实例，图134描绘了刷状类型支化结构。在一些情况下，支化结构包含2-30个阳离子多肽(例如，htp)(例如，2-25个、2-20个、2-15个、2-10个、2-5个、4-30个、4-25个、4-20个、4-15个或4-10个阳离子多肽)，其中每个阳离子多肽可以与支化结构的其它阳离子多肽相同或不同(参见，例如，图134)。在一些情况下，阳离子聚合物具有范围为4,500-150,000da)的分子量。在一些情况下，阳离子聚合物(例如，聚(l-精氨酸)、聚(d-赖氨酸)、聚(l-赖氨酸)、聚(d-赖氨酸))的5％或更多(例如，10％或更多、20％或更多、25％或更多、30％或更多、40％或更多或者50％或更多)的侧链与主题阳离子多肽(例如，htp；例如，具有半胱氨酸残基的htp)缀合。在一些情况下，阳离子聚合物(例如，聚(l-精氨酸)、聚(d-赖氨酸)、聚(l-赖氨酸)、聚(d-赖氨酸))的高达50％(例如，高达40％、高达30％、高达25％、高达20％、高达15％、高达10％或高达5％)的侧链与主题阳离子多肽(例如，htp；例如，具有半胱氨酸残基的htp)缀合。因此，htp可以从如阳离子氨基酸聚合物等聚合物的主链中分支出来。

在一些情况下，可以使用如类肽(多肽)、聚酰胺、树状聚合物等组分促进支化结构的形成。例如，在一些情况下，类肽(例如，多肽)用作具有主题递送分子的组合物的一部分，例如，以产生网状(例如，蜘蛛网状)结构，所述网状结构在一些情况下可以促进凝聚。

本文中的一个或多个天然或修饰的多肽序列可以用末端或间断的精氨酸、赖氨酸或组氨酸序列修饰。在一个实施例中，每个多肽包含在纳米颗粒核内的相等的胺摩尔浓度中。在该实施例中，每个多肽的c-末端可以用5r(5个精氨酸)修饰。在一些实施方案中，每个多肽的c-末端可以用9r(9个精氨酸)修饰。在一些实施方案中，每个多肽的n-末端可以用5r(5个精氨酸)修饰。在一些实施方案中，每个多肽的n-末端可以用9r(9个精氨酸)修饰。在一些情况下，h2a、h2b、h3和/或h4组蛋白片段(例如，htp)各自与fkfl组织蛋白酶b蛋白水解切割结构域或rgffp组织蛋白酶d蛋白水解切割结构域串联桥接。在一些情况下，h2a、h2b、h3和/或h4组蛋白片段(例如，htp)可以由5r(5个精氨酸)、9r(9个精氨酸)、5k(5个赖氨酸)、9k(9个赖氨酸)、5h(5个组氨酸)或9h(9个组氨酸)阳离子间隔结构域串联桥接。在一些情况下，一个或多个h2a、h2b、h3和/或h4组蛋白片段(例如，htp)在其n-末端处与鱼精蛋白二硫键合。

为了说明如何产生支化组蛋白结构，提供了制备的示例方法。这种方法的一个实例包含以下：共摩尔比率的组蛋白h2ax[134-143]、组蛋白h3[1-21cys]、组蛋白h3[23-34cys]、组蛋白h4[8-25wc]以及sv40t-ag衍生的nls的共价修饰可以在与10％吡啶基二硫化物修饰的聚(l-赖氨酸)[mw＝5400、18000或45000da；n＝30、100或250]的反应中进行。在典型的反应中，可以将29μl、700μm的cys-修饰的组蛋白/nls(20nmol)水溶液加入到57μl、0.2m的磷酸盐缓冲液(ph8.0)中。其次，然后可以将14μl、100μm的吡啶基二硫化物保护的聚(赖氨酸)溶液添加到组蛋白溶液中以使最终体积达到100μl，其中吡啶基二硫化物基团与半胱氨酸残基的比率为1:2。该反应可以在室温下进行3小时。所述反应可以重复四次并且可以通过在343nm处的吡啶-2-硫酮的吸光度来确定缀合度。

作为另一个实例，摩尔比为0:1、1:4、1:3、1:2、1:1、1:2、1:3、1:4或1:0的组蛋白h3[1-21cys]肽、组蛋白h3[23-34cys]肽的共价修饰可以在与10％吡啶基二硫化物修饰的聚(l-赖氨酸)或聚(l-精氨酸)[mw＝5400、18000或45000da；n＝30、100或250]的反应中进行。在典型的反应中，可以将29μl、700μm的cys-修饰的组蛋白(20nmol)水溶液加入到57μl、0.2m的磷酸盐缓冲液(ph8.0)中。其次，然后可以将14μl、100μm的吡啶基二硫化物保护的聚(赖氨酸)溶液添加到组蛋白溶液中以使最终体积达到100μl，其中吡啶基二硫化物基团与半胱氨酸残基的比率为1:2。该反应可以在室温下进行3小时。所述反应可以重复四次并且可以通过在343nm处的吡啶-2-硫酮的吸光度来确定缀合度。

在一些情况下，阴离子聚合物与靶向配体缀合。

核定位序列(nls)

在一些实施方案中，阳离子多肽组合物的阳离子多肽(例如，组蛋白或htp，例如h1、h2、h2a、h2ax、h2b、h3或h4)包括(和/或缀合至)一个或多个(例如，两个或更多个，三个或更多个，或四个或更多个)核定位序列(nls)。因此，在一些情况下，主题纳米颗粒的阳离子多肽组合物包括含有nls的肽。在一些情况下，主题纳米颗粒的组蛋白蛋白(或htp)包括一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个)天然核定位信号(nls)。在一些情况下，主题纳米颗粒的组蛋白(或htp)包含与组蛋白异源的一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个)nls(即，作为组蛋白/htp的一部分天然存在的nls，例如，可以人为添加nls)。在一些情况下，htp在n-和/或c-末端包括nls。

在一些实施方案中，阳离子聚合物组合物的阳离子氨基酸聚合物(例如，聚(精氨酸)(pr)；聚(赖氨酸)(pk)；聚(组氨酸)(ph)；聚(鸟氨酸)；聚(瓜氨酸)；聚(d-精氨酸)(pdr)；聚(d-赖氨酸)(pdk)；聚(d-组氨酸)(pdh)；聚(d-鸟氨酸)；聚(d-瓜氨酸)；聚(l-精氨酸)(plr)；聚(l-赖氨酸)(plk)；聚(l-组氨酸)(plh)；聚(l-鸟氨酸)和聚(l-瓜氨酸))包含(和/或缀合至)一个或两个(例如，两个或更多个、三个或更多个或者四个或更多个)nls。在一些情况下，所述阳离子氨基酸聚合物在n-末端和/或c-末端上包含nls。在一些情况下，所述阳离子氨基酸聚合物包含内部nls。

在一些实施方案中，阴离子聚合物组合物的阴离子氨基酸聚合物(例如，聚(谷氨酸)(pea)、聚(天冬氨酸)(pda)、聚(d-谷氨酸)(pdea)、聚(d-天冬氨酸)(pdda)、聚(l-谷氨酸)(plea)、聚(l-天冬氨酸)(plda))包含一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个或者四个或更多个)nls(和/或与其缀合)。在一些情况下，所述阴离子氨基酸聚合物在n-末端和/或c-末端上包含nls。在一些情况下，所述阴离子氨基酸聚合物包含内部nls。

可以使用任何方便的nls(例如，与组蛋白、htp、阳离子氨基酸聚合物、阴离子氨基酸聚合物等缀合)。实例包括但不限于1类和2类‘单颗粒nls'，以及3-5类的nls(参见例如图16，其改编自kosugi等人，《生物化学杂志》(jbiolchem.)2009年1月2日；284(1):478-85)。在一些情况下，nls具有下公式：(k/r)(k/r)x10-12(k/r)3-5。在一些情况下，nls具有以下公式：k(k/r)x(k/r)。

在一些实施方案中，阳离子多肽组合物的阳离子多肽包括一个或多个(例如，两个或更多个，三个或更多个，或四个或更多个)nls。在一些情况下，阳离子多肽不是组蛋白或组蛋白片段(例如，不是htp)。因此，在一些情况下，阳离子多肽组合物的阳离子多肽是含nls的肽。

在一些情况下，含nls的肽包含半胱氨酸残基，其可以促进缀合至：阳离子(或在一些情况下为阴离子)氨基酸聚合物、接头、htp的组蛋白和/或其他阳离子多肽(例如，在某些情况下，作为支化组蛋白结构的一部分)。例如，半胱氨酸残基可用于通过巯基化学(例如，二硫键)和/或胺反应性化学进行交联(缀合)。在一些情况下，所述半胱氨酸残基是内部的。在一些情况下，所述半胱氨酸残基定位于n-末端和/或c-末端处。在一些情况下，阳离子多肽组合物的含nls的肽包括添加半胱氨酸残基的突变(例如，插入或取代)(例如，相对于野生型氨基酸序列)。

可用作含nls的肽(或与任何方便的阳离子多肽如htp或阳离子聚合物或阳离子氨基酸聚合物或阴离子氨基酸聚合物缀合)的nls的实例包括但不限于(其中一些包括半胱氨酸残基)：

pkkkrkv(seqidno:151)(t-agnls)

pkkkrkvedpyc(seqidno:152)-sv40t-ag衍生的nls

pkkkrkvgpkkkrkvgpkkkrkvgpkkkrkvgc(seqidno:153)(nlssv40)

cygrkkrrqrrr(seqidno:154)-半胱氨酸-tat的n-末端半胱氨酸

csippevkfnkpfvyli(seqidno:155)

drqikiwfqnrrmkwkk(seqidno:156)

pkkkrkvedpyc(seqidno:157)-sv40t-ag衍生的nls的c-末端半胱氨酸

paakrvkld(seqidno:158)[cmycnls]

对于可以使用的nls的非限制性实例，参见例如kosugi等人，《生物化学杂志》(jbiolchem.)2009年1月2日；284(1):478-85，例如，参见本公开的图16。

线粒体定位信号

在一些实施方案中，主题纳米颗粒的阳离子多肽(例如，组蛋白或htp，例如h1、h2、h2a、h2ax、h2b、h3或h4)、阴离子聚合物和/或阳离子聚合物包括(和/或缀合至)一个或多个(例如，两个或更多个，三个或更多个，或四个或更多个)线粒体定位序列。可以使用任何方便的线粒体定位序列。线粒体定位序列的实例包括但不限于：pedeiwlpepesvdvpakpistssmmmp(seqidno:149)、sdhb的线粒体定位序列、单/二/三苯基膦或其他膦、vamp1a、vamp1b、dgat2的67个n端氨基酸和bax的20个n端氨基酸。

有效负载

本公开的纳米颗粒包括由核酸和/或蛋白构成的有效负载。例如，在一些情况下，主题纳米颗粒用于递送核酸有效负载(例如，dna和/或rna)。核酸有效负载可以是任何目的核酸，例如，核酸有效负载可以是线性的或环状的，并且可以是质粒；病毒基因组；rna(例如，如mrna等编码rna或如引导rna、短干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微rna(mirna)等非编码rna)；dna等。在一些情况下，所述核酸有效负载是rnai剂(例如，shrna、sirna、mirna等)或编码rnai剂的dna模板。在一些情况下，所述核酸有效负载是sirna分子(例如，靶向mrna的sirna分子，靶向mirna的sirna分子)。在一些情况下，所述核酸有效负载是lna分子(例如，靶向mirna的lna分子)。在一些情况下，所述核酸有效负载是mirna。在一些情况下，所述核酸有效负载包含编码目的蛋白(例如，一种或多种重编程和/或转分化因子，如oct4、sox2、klf4、c-myc、nanog和lin28；例如，单独或以任何期望的组合，如(i)oct4，sox2，klf4和c-myc；(ii)oct4，sox2，nanog和lin28；等；基因编辑核酸内切酶；治疗性蛋白；等)的mrna。在一些情况下，所述核酸有效负载包含非编码rna(例如，rnai剂、crispr/cas引导rna等)和/或编码非编码rna的dna分子。在一些实施方案中，核酸有效负载包括编码il2rα和il12rγ的核酸(dna和/或mrna)(例如，以调节靶细胞的行为或存活)，并且在一些情况下，有效负载在7-90天(例如，7-80、7-60、7-50、7-40、7-35或7-30天)的过程中在细胞内从主题纳米颗粒释放。在一些实施方案中，核酸有效负载包含编码bcl-xl的核酸(dna和/或mrna)(例如，以防止由于fas或tnfα受体的接合而导致的靶细胞凋亡)。在一些实施方案中，核酸有效负载包含编码foxp3的核酸(dna和/或mrna)(例如，以促进靶向t细胞中的免疫效应表型)。在一些实施方案中，核酸有效负载包含编码scf的核酸(dna和/或mrna)。在一些实施方案中，核酸有效负载包含编码hoxb4的核酸(dna和/或mrna)。在一些实施方案中，核酸有效负载包含编码sirt6的核酸(dna和/或mrna)。在一些实施方案中，核酸有效负载包含靶向(降低微rna的表达)如mir-155等微rna的核酸分子(例如，sirna、lna等)(参见，例如，mir库(base)登录号：mi0000681和mi0000177)。在一些实施例中，核酸有效负载包含靶向ku70的sirna和/或靶向ku80的sirna。

术语“核酸有效负载”包含修饰的核酸。同样，术语“rnai剂”和“sirna”包含修饰的核酸。例如，核酸分子可以是模拟物；可以包含修饰的糖骨架、一个或多个修饰的核苷间连接(例如，一个或多个硫代磷酸酯和/或杂原子核苷间连接)、一个或多个修饰的碱基等。在一些实施例中，主题有效负载包含三链形成肽核酸(pna)(参见，例如，mcneer等人,《基因疗法》(genether.)2013年6月；20(6)：658-69)。因此，在一些情况下，主题核包含pna。在一些情况下，主题核包含pna和dna。

主题核酸有效负载(例如，sirna)可以具有吗啉代骨架结构。在一些情况下，主题核酸有效负载(例如，sirna)可以具有一个或多个锁核酸(lna)。合适的糖取代基包含甲氧基(-o-ch3)、氨基丙氧基(--och2ch2ch2nh2)、烯丙基(-ch2-ch＝ch2)、-o-烯丙基(--o--ch2—ch＝ch2)以及氟(f)。2'-糖取代基可以在阿拉伯糖(上)位置或核糖(下)位置。合适的碱基修饰包含合成核碱基和天然核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫代胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基(-c＝c-ch3)尿嘧啶和胞嘧啶以及其它嘧啶碱基的炔基衍生物；6-偶氮尿嘧啶；胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤素；8-氨基；8-硫醇；8-硫代烷基；8-羟基和其它8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤基尤其是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；2-f-腺嘌呤；2-氨基腺嘌呤；8-氮鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤；以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。进一步修饰的核碱基包含三环嘧啶，如吩恶嗪胞苷(1h-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并恶嗪-2(3h)-酮)；吩噻嗪胞苷(1h-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3h)-酮)；g-钳位，如取代的吩恶嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-h-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并恶嗪-2(3h)-酮)；咔唑胞苷(2h-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)；吡啶并吲哚胞苷(h-吡啶并(3',2':4,5)吡咯并(2,3-d)嘧啶-2-酮)。

在一些情况下，核酸有效负载可以包含缀合物部分(例如，增强核酸有效负载的活性、稳定性、细胞分布或细胞摄取的一个缀合物部分)。这些部分或缀合物可以包含与如伯羟基基团或仲羟基基团等官能团共价结合的缀合物基团。缀合物基团包含但不限于嵌入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、提高寡聚物的药效性质的基团以及提高寡聚物的药代动力学性质的基团。合适的缀合物基团包含但不限于胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素以及染料。提高药效性质的基团包含改善摄取、提高抗降解性和/或增强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。增强药代动力学性质的基团包含改善主题核酸的摄取、分布、代谢或排泄的基团。

任何方便的多核苷酸都可以用作主题核酸有效负载。实例包含但不限于：rna和dna的种类，其包含mrna、m1a修饰的mrna(在腺苷的位置1处的单甲基化)、sirna、mirna、适配子、shrna、aav衍生的核酸和支架、吗啉代rna、类肽和肽核酸、cdna、dna折纸、具有合成核苷酸的dna和rna、具有预定义二级结构的dna和rna、前述的多聚体和寡聚体以及其序列可以编码如期望表达的任何蛋白或多肽等其它产物的有效负载。

在一些情况下，主题纳米颗粒的有效负载包含蛋白。蛋白有效负载的实例包含但不限于：可编程基因编辑蛋白(例如，转录激活因子样(tal)效应子(tale)；tale核酸酶(talen)；锌指蛋白(zfp)；锌指核酸酶(zfn)；如格氏嗜盐碱杆菌argonaute(ngago)等dna引导的多肽；如cas9、casx、casy、cpf1等crispr/casrna引导的多肽等)；转座子(例如，i类或ii类转座子-例如，piggybac、睡美人、tc1/mariner、tol2、pif/harbinger、hat、mutator、merlin、transib、helitron、maverick、青蛙王子、minos、himar1等)；大范围核酸酶(例如，i-scei、i-ceui、i-crei、i-dmoi、i-chui、i-diri、i-flmui、i-flmuii、i-anil、i-sceiv、i-csmi、i-pani、i-panii、i-panmi、i-sceii、i-ppoi、i-sceiii、i-ltri、i-gpii、i-gzei、i-onui、i-hjemi、i-msoi、i-tevi、i-tevii、i-teviii、pi-mlei、pi-mtui、pi-pspi、pi-tlii、pi-tliii、pi-scev等)；megatals(参见，例如，boissel等人,《核酸研究(nucleicacidsres)》2014年2月；42(4):2591–2601)；scf；bcl-xl；foxp3；hoxb4；以及sirt6。对于以上任何蛋白，主题纳米颗粒的有效负载可以包含编码蛋白的核酸(dna和/或mrna)和/或可以包含实际蛋白。

基因编辑工具

在一些情况下，核酸有效负载包含或编码基因编辑工具(即，基因编辑系统，例如，如可编程基因编辑系统等位点特异性基因编辑系统的组分)。例如，核酸有效负载可以包含以下一种或多种：(i)crispr/cas引导rna；(ii)编码crispr/cas引导rna的dna；(iii)编码如锌指蛋白(zfp)(例如，锌指核酸酶-zfn)、转录激活因子样效应子(tale)蛋白(例如，融合到核酸酶-talen)、如格氏嗜盐碱杆菌argonaute(ngago)等dna引导的多肽和/或crispr/casrna引导的多肽(例如，cas9、casx、casy、cpf1等)等可编程基因编辑蛋白的dna和/或rna；(iv)dna供体模板；(v)编码位点特异性重组酶(例如，cre重组酶、dre重组酶、flp重组酶、kd重组酶、b2重组酶、b3重组酶、r重组酶、hin重组酶、tre重组酶、phic31整合酶、bxb1整合酶、r4整合酶、λ整合酶、hk022整合酶、hp1整合酶等)的核酸分子(dna，rna)；(vi)编码解离酶和/或转化酶(例如，gln、hin、γδ3、tn3、sin、beta等)的dna；以及(vii)转座子和/或衍生自转座子(例如，如tn3、tn5、tn7、tn9、tn10、tn903、tn1681等细菌转座子；如tc1/mariner超家族转座子、piggybac超家族转座子、hat超家族转座子、piggybac、睡美人、青蛙王子、minos、himar1等真核转座子)的dna。在一些情况下，主题纳米颗粒用于递送蛋白有效负载，例如，如zfp(例如，zfn)、tale(例如，talen)、如格氏嗜盐碱杆菌argonaute(ngago)等dna引导的多肽和/或crispr/casrna引导的多肽(例如，cas9、casx、casy、cpf1等)等基因编辑蛋白；位点特异性重组酶(例如，cre重组酶、dre重组酶、flp重组酶、kd重组酶、b2重组酶、b3重组酶、r重组酶、hin重组酶、tre重组酶、phic31整合酶、bxb1整合酶、r4整合酶、λ整合酶、hk022整合酶、hp1整合酶等)；解离酶/转化酶(例如，gln、hin、γδ3、tn3、sin、beta等)；和/或转座酶(例如，与转座子相关的转座酶，如细菌转座子，如tn3、tn5、tn7、tn9、tn10、tn903、tn1681等；或者如tc1/mariner超家族转座子、piggybac超家族转座子、hat超家族转座子、piggybac、睡美人、青蛙王子、minos、himar1等真核转座子)。在一些情况下，纳米颗粒用于递送核酸有效负载和蛋白有效负载，并且在一些此类情况下，有效负载包括核糖核蛋白复合物(rnp)。

根据系统的性质和期望的结果，基因编辑系统(例如，如可编程基因编辑系统等位点特异性基因编辑系统)可以包含单个组分(例如，zfp、zfn、tale、talen、位点特异性重组酶、解离酶/整合酶、转座酶、转座子等)或者可以包含多种组分。在一些情况下，基因编辑系统包含至少两种组分。例如，在一些情况下，基因编辑系统(例如可编程基因编辑系统)包含(i)供体模板核酸；以及(ii)基因编辑蛋白(例如，可编程基因编辑蛋白，如zfp、zfn、tale、talen；如格氏嗜盐碱杆菌argonaute(ngago)等dna引导的多肽；如cas9、casx、casy或cpf1等crispr/casrna引导的多肽)或编码基因编辑蛋白的核酸分子(例如，如质粒或mrna等dna或rna)。作为另一个实例，在一些情况下，基因编辑系统(例如，可编程基因编辑系统)包含(i)crispr/cas引导rna，或编码crispr/cas引导rna的dna；以及(ii)crispr/casrna引导的多肽(例如，cas9、casx、casy、cpf1等)，或编码rna引导的多肽的核酸分子(例如，如质粒或mrna等dna或rna)。作为另一个实例，在一些情况下，基因编辑系统(例如可编程基因编辑系统)包含(i)ngago类似的引导dna；以及(ii)dna引导的多肽(例如，ngago)，或编码dna引导的多肽的核酸分子(例如，如质粒或mrna等dna或rna)。在一些情况下，基因编辑系统(例如可编程基因编辑系统)包含至少三种组分：(i)供体dna模板；(ii)crispr/cas引导rna，或编码crispr/cas引导rna的dna；以及(iii)crispr/casrna引导的多肽(例如，cas9、casx、casy、cpf1)，或编码rna引导的多肽的核酸分子(例如，如质粒或mrna等dna或rna)。在一些情况下，基因编辑系统(例如可编程基因编辑系统)包含至少三种组分：(i)供体dna模板；(ii)ngago类似的引导dna，或编码ngago类似的引导dna的dna；以及(iii)dna引导的多肽(例如，ngago)，或编码dna引导的多肽的核酸分子(例如，如质粒或mrna等dna或rna)。

在一些实施方案中，主题纳米颗粒用于递送基因编辑工具。换句话说，在一些情况下，有效负载包含一个或多个基因编辑工具。本文中使用的术语“基因编辑工具”指的是基因编辑系统的一个或多个组分。因此，在一些情况下，有效负载包含基因编辑系统并且在一些情况下，有效负载包含基因编辑系统的一个或多个组分(即，一个或多个基因编辑工具)。例如，靶细胞可能已经包含基因编辑系统的组分中的一个组分并且用户只需要添加其余的组分。在这种情况下，主题纳米颗粒的有效负载不一定包含给定基因编辑系统的所有组分。因此，在一些情况下，有效负载包含一个或多个基因编辑工具。

作为说明性实例，靶细胞可能已经包含基因编辑蛋白(例如，zfp；tale；dna引导的多肽(例如，ngago)；crispr/casrna引导的多肽，如cas9、casx、casy、cpf1等；如cre重组酶、dre重组酶、flp重组酶、kd重组酶、b2重组酶、b3重组酶、r重组酶、hin重组酶、tre重组酶、phic31整合酶、bxb1整合酶、r4整合酶、λ整合酶、hk022整合酶、hp1整合酶等位点特异性重组酶；如gin、hin、γδ3、tn3、sin、beta等溶解酶/转化酶；转座酶等)和/或编码所述蛋白的dna或rna，并且因此有效负载可以包含以下中的一个或多个：(i)供体模板；以及(ii)crispr/cas引导rna，或编码crispr/cas引导rna的dna；或ngago类似的引导dna。同样地，靶细胞可能已经包含crispr/cas引导rna和/或编码引导rna的dna或ngago类似的引导dna，并且有效负载可以包含以下中的一个或多个：(i)供体模板；以及(ii)crispr/casrna引导的多肽(例如，cas9、casx、casy、cpf1等)，或编码rna引导的多肽的核酸分子(例如，如质粒或mrna等dna或rna)；或dna引导的多肽(例如，ngago)，或编码dna引导的多肽的核酸分子。

如本领域普通技术人员将理解的，基因编辑系统不需要是“编辑”核酸的系统。例如，应充分认识到，基因编辑系统可以用于以多种方式修饰靶核酸(例如，dna和/或rna)，而不会在靶dna中产生双链断裂(dsb)。例如，在一些情况下，双链靶dna被切口(一条链被切割)，并且在一些情况下(例如，在基因编辑蛋白缺乏核酸酶活性的一些情况下，例如，crispr/casrna引导多肽可能在催化核酸酶结构域中具有突变)，靶核酸根本未被切割。例如，在一些情况下，具有或不具有核酸酶活性的crispr/cas蛋白(例如，cas9、casx、casy、cpf1)与异源蛋白结构域融合。异源蛋白结构域可以为融合蛋白提供活性，如(i)dna修饰活性(例如，核酸酶活性、甲基转移酶活性、去甲基化酶活性、dna修复活性、dna损伤活性、脱氨活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性，重组酶活性，聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性或糖基化酶活性)；(ii)转录调节活性(例如，与转录抑制因子或激活因子的融合)；或(iii)修饰与靶dna缔合的蛋白(例如组蛋白)的活性(例如甲基转移酶活性、去甲基化酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、去腺苷酸化活性、sumo化活性、去sumo化活性、核糖基化活性、去核糖基化活性、豆蔻酰化活性或去豆蔻酰化活性)。因此，基因编辑系统可以用于以不切割靶核酸的方式修饰靶核酸的应用中，并且还可以用于调节来自靶dna的转录的应用中。

有关可编程基因编辑工具的另外的信息(例如，如cas9、casx、casy和cpf1等crispr/casrna指导的蛋白；如锌指核酸酶等锌指蛋白；如talen等tale蛋白；crispr/cas引导rna等等)参照例如dreier等人,(2001)《生物化学杂志(jbiolchem)》276:29466-78；dreier等人,(2000)《生物化学杂志》303:489-502；liu等人,(2002)《生物化学杂志》277:3850-6)；dreier等人,(2005)《生物化学杂志》280:35588-97；jamieson等人,(2003)《自然评论药物发现(naturerevdrugdiscov》2:361-8；durai等人,(2005)《核酸研究》33:5978-90；segal,(2002)《方法(methods)》26:76-83；porteus和carroll,(2005)《自然生物技术(natbiotechnol)》23:967-73；pabo等人,(2001)《生物化学年鉴(annurevbiochem)》70:313-40；wolfe等人,(2000)《生物物理和生物分子结构年鉴(annrevbiophysbiomolstruct)》29:183-212；segal和barbas,(2001)《生物技术新见(curropinbiotechnol)》12:632-7；segal等人,(2003)《生物化学(biochemistry)》42:2137-48；beerli和barbas,(2002)《自然生物技术》20:135-41；carroll等人,(2006)《自然实验手册(natureprotocols)》1:1329；ordiz等人,(2002)《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》99:13290-5；guan等人,(2002)《美国国家科学院院刊》99:13296-301；sanjana等人,《自然实验手册》,7:171-192(2012)；zetsche等人,《细胞(cell)》2015年10月22日；163(3)：759-71；makarova等人,《自然评论微生物学(natrevmicrobiol.)》2015年11月；13(11):722-36；shmakov等人,《分子细胞(molcell)》2015年11月5日；60(3):385-97；jinek等人,《科学(science)》2012年8月17日；337(6096):816-21；chylinski等人,《rna生物学(rnabiol.)》2013年5月；10(5):726-37；ma等人,《生物医学国际化研究(biomedresint.)》2013；2013:270805；hou等人,《美国科学院院报(procnatlacadsciusa.)》2013年9月24日；110(39):15644-9；jinek等人,《elife》2013；2:e00471；pattanayak等人,《自然生物技术》2013年9月；31(9):839-43；qi等人,《细胞》2013年2月28日；152(5):1173-83；wang等人,《细胞》2013年5月9日；153(4):910-8；auer等人,《基因组研究(genomeres.)》2013年10月31日；chen等人,《核酸研究》2013年11月1日；41(20):e19；cheng等人,《细胞研究(cellres.)》2013年10月；23(10):1163-71；cho等人,《遗传学(genetics)》2013年11月；195(3):1177-80；dicarlo等人,《核酸研究》2013年4月；41(7):4336-43；dickinson等人,《自然方法(natmethods)》2013年10月；10(10):1028-34；ebina等人,《科学报告(scirep.)》2013；3:2510；fujii等人,《核酸研究》2013年11月1日1；41(20):e187；hu等人,《细胞研究》2013年11月；23(11):1322-5；jiang等人,《核酸研究》2003年11月1日；41(20):e188；larson等人,《自然实验手册》2013年11月；8(11):2180-96；mali等人,《自然方法》2013年10月；10(10):957-63；nakayama等人,《遗传学》2013年12月；51(12):835-43；ran等人,《自然实验手册》2013年11月；8(11):2281-308；ran等人,《细胞》2013年9月12日；154(6):1380-9；upadhyay等人,《g3(bethesda)》2013年12月9日；3(12):2233-8；walsh等人,《美国科学院院报》2013年9月24日；110(39):15514-5；xie等人,《分子植物(molplant)》2013年10月9日；yang等人,《细胞》2013年9月12日；154(6):1370-9；briner等人,《分子细胞》2014年10月23日；56(2):333-9；burstein等人,《自然》2016年12月22日-印刷前的电子出版物；gao等人,《自然生物技术》2016年7月,34(7):768-73；以及国际专利申请公开第wo2002099084号；第wo00/42219号；第wo02/42459号；第wo2003062455号；第wo03/080809号；第wo05/014791号；第wo05/084190号；第wo08/021207号；第wo09/042186号；第wo09/054985号；和第wo10/065123号；美国专利申请公开第20030059767号、第20030108880号、第20140068797号；第20140170753号；第20140179006号；第20140179770号；第20140186843号；第20140186919号；第20140186958号；第20140189896号；第20140227787号；第20140234972号；第20140242664号；第20140242699号；第20140242700号；第20140242702号；第20140248702号；第20140256046号；第20140273037号；第20140273226号；第20140273230号；第20140273231号；第20140273232号；第20140273233号；第20140273234号；第20140273235号；第20140287938号；第20140295556号；第20140295557号；第20140298547号；第20140304853号；第20140309487号；第20140310828号；第20140310830号；第20140315985号；第20140335063号；第20140335620号；第20140342456号；第20140342457号；第20140342458号；第20140349400号；第20140349405号；第20140356867号；第20140356956号；第20140356958号；第20140356959号；第20140357523号；第20140357530号；第20140364333号；第20140377868号；第20150166983号；和第20160208243号；以及美国专利第6,140,466号；第6,511,808号；第6,453,242号；第8,685,737号；第8,906,616号；第8,895,308号；第8,889,418号；第8,889,356号；第8,871,445号；第8,865,406号；第8,795,965号；第8,771,945号；和第8,697,359号；这些文献中的全部内容通过引用以其全文并入本文。

在一些实施方案中，多于一种有效负载作为相同包装(例如，纳米颗粒)的一部分递送，例如，在一些情况下，不同有效负载是不同核的一部分。将多种有效负载作为相同包装(例如，纳米颗粒)的一部分递送的一个优点是每种有效负载的效率不被削弱。作为说明性实例，如果有效负载a和有效负载b在两个单独的包装(分别为包装a和包装b)中递送，则效率倍增，例如，如果包装a和包装b各自具有1％的转染效率，将有效负载a和有效负载b递送到相同细胞的几率为0.01％(1％x1％)。然而，如果有效负载a和有效负载b都作为相同包装的一部分(例如，相同纳米颗粒-包装a的一部分)递送，则将有效负载a和有效负载b递送到同一细胞的几率为1％，比0.01％提高100倍。

同样地，在包装a和包装b各自具有0.1％转染效率的情况下，将有效负载a和有效负载b递送到相同细胞的几率为0.0001％(0.1％x0.1％)。然而，如果在这种情况下有效负载a和有效负载b都作为相同包装的一部分(例如，相同纳米颗粒-包装a的一部分)递送，则将有效负载a和有效负载b递送到相同细胞的几率为0.1％，比0.0001％提高1000倍。

因此，在一些实施方案中，一种或多种基因编辑工具(例如，如上所述)与(例如，作为相同纳米颗粒的一部分)蛋白(和/或编码蛋白的dna或mrna)和/或提高基因组编辑效率的非编码rna组合递送。在一些情况下，一种或多种基因编辑工具(例如，如上所述)与(例如，作为相同纳米颗粒的一部分)蛋白(和/或编码蛋白的dna或mrna)和/或控制细胞分裂和/或分化的非编码rna组合递送。在一些情况下，一种或多种基因编辑工具(例如，如上所述)与(例如，作为相同纳米颗粒的一部分)蛋白(和/或编码蛋白的dna或mrna)和/或使细胞dna修复机制偏向非同源末端连接(nhej)或同源定向修复(hdr)的非编码rna组合递送。

作为上述的非限制性实例，在一些实施方案中，一种或多种基因编辑工具可以与以下一种或多种组合递送：scf(和/或编码scf的dna或mrna)、hoxb4(和/或编码hoxb4的dna或mrna)、bcl-xl(和/或编码bcl-xl的dna或mrna)、sirt6(和/或编码sirt6的dna或mrna)、抑制mir-155的核酸分子(例如，sirna和/或lna)、降低ku70表达的核酸分子(例如，sirna、shrna、微rna)和降低ku80表达的核酸分子(例如，sirna、shrna、微rna)。

对于可以与基因编辑工具组合递送的微rna的实例，参见图18a。例如，以下微rna可用于以下目的：用于阻断多能干细胞向外胚层谱系的分化：mir-430/427/302(参见，例如，mirbase登录号：mi0000738、mi0000772、mi0000773、mi0000774、mi0006417、mi0006418、mi0000402、mi0003716、mi0003717和mi0003718)；用于阻断多能干细胞向内胚层谱系的分化：mir-109和/或mir-24(参见，例如，mirbase登录号：mi0000080、mi0000081、mi0000231和mi0000572)；用于驱动多能干细胞向内胚层谱系的分化：mir-122(参见，例如，mirbase登录号：mi0000442和mi0000256)和/或mir-192(参见，例如，mirbase登录号：mi0000234和mi0000551)；用于驱动外胚层祖细胞向角化细胞命运的分化：mir-203(参见，例如，mirbase登录号：mi0000283、mi0017343和mi0000246)；用于驱动神经嵴干细胞向平滑肌命运的分化：mir-145(参见，例如，mirbase登录号：mi0000461、mi0000169和mi0021890)；用于驱动神经干细胞向神经胶质细胞命运和/或神经元命运的分化：mir-9(参见，例如，mirbase登录：mi0000466、mi0000467、mi0000468、mi0000157、mi0000720和mi0000721)和/或mir-124a(参见，例如，mirbase登录号：mi0000443、mi0000444、mi0000445、mi0000150，mi0000716和mi0000717)；用于阻断中胚层祖细胞向软骨细胞命运的分化：mir-199a(参见，例如，mirbase登录：mi0000242、mi0000281、mi0000241和mi0000713)；用于驱动中胚层祖细胞向成骨细胞命运的分化：mir-296(参见，例如，mirbase登录号：mi0000747和mi0000394)和/或mir-2861(参见，例如，mirbase登录号：mi0013006和mi0013007)；用于驱动中胚层祖细胞向心肌命运的分化：mir-1(参见，例如，mirbase登录号：mi0000437、mi0000651、mi0000139、mi0000652、mi0006283)；用于阻断中胚层祖细胞向心肌命运的分化：mir-133(参见，例如，mirbase登录：mi0000450、mi0000451、mi0000822、mi0000159、mi0000820、mi0000821和mi0021863)；用于驱动中胚层祖细胞向骨骼肌命运的分化：mir-214(参见，例如，mirbase登录号：mi0000290和mi0000698)、mir-206(参见，例如，mirbase登录号：mi0000490和mi0000249)、mir-1和/或mir-26a(参见，例如，mirbase登录号：mi0000083、mi0000750、mi0000573和mi0000706)；用于阻断中胚层祖细胞向骨骼肌命运的分化：mir-133(参见，例如，mirbase登录：mi0000450、mi0000451、mi0000822、mi0000159、mi0000820、mi0000821和mi0021863)、mir-221(参见，例如，mir碱基登录：mi0000298和mi0000709)和/或mir-222(参见，例如，mirbase登录号：mi0000299和mi0000710)；用于驱动造血祖细胞向分化的分化：mir-223(参见，例如，mirbase登录号：mi0000300和mi0000703)；用于阻断造血祖细胞向分化的分化：mir-128a(参见，例如，mirbase登录号：mi0000447和mi0000155)和/或mir-181a(参见，例如，mirbase登录号：mi0000269、mi0000289、mi0000223和mi0000697)；用于驱动造血祖细胞向淋巴祖细胞分化：mir-181(参见，例如，mirbase登录：mi0000269、mi0000270、mi0000271、mi0000289、mi0000683、mi0003139、mi0000223、mi0000723、mi0000697、mi0000724、mi0000823和mi0005450)；用于阻断造血祖细胞向淋巴祖细胞分化：mir-146(参见，例如，mirbase登录：mi0000477、mi0003129、mi0003782、mi0000170和mi0004665)；用于阻断造血祖细胞向骨髓祖细胞分化：mir-155、mir-24a和/或mir-17(参见，例如，mirbase登录号：mi0000071和mi0000687)；用于驱动淋巴祖细胞向t细胞命运的分化：mir-150(参见，例如，mirbase登录号：mi0000479和mi0000172)；用于阻断骨髓祖细胞向粒细胞命运的分化：mir-223(参见，例如，mirbase登录号：mi0000300和mi0000703)；用于阻断骨髓祖细胞向单核细胞命运的分化：mir-17-5p(参见，例如，mirbase登录号：mimat0000070和mimat0000649)、mir-20a(参见，例如，mirbase登录号：mi0000076和mi0000568)，和/或mir-106a(参见，例如，mirbase登录号：mi0000113和mi0000406)；用于阻断骨髓祖细胞向红细胞命运的分化：mir-150(参见，例如，mirbase登录：mi0000479和mi0000172)、mir-155、mir-221(参见，例如，mirbase登录号：mi0000298和mi0000709)和/或mir-222(参见，例如，mirbase登录号：mi0000299和mi0000710)；和用于驱动骨髓祖细胞向红细胞命运的分化：mir-451(参见，例如，mirbase登录号：mi0001729、mi0017360、mi0001730和mi0021960)和/或mir-16(参见，例如，mirbase登录号：mi0000070、mi0000115、mi0000565和mi0000566)。

对于可以与基因编辑工具组合递送(例如，作为蛋白或作为编码蛋白的dna或rna)的信号传导蛋白(例如，细胞外信号传导蛋白)的实例，参见图18b。相同的蛋白可以与靶向配体类似的方式用作主题纳米颗粒的外壳的一部分，例如，以便使接收纳米颗粒的靶细胞中的分化偏向。例如，以下信号传导蛋白(例如，细胞外信号传导蛋白)可用于以下目的：用于驱动造血干细胞向共同淋巴祖细胞谱系分化：il-7(参见，例如，ncbi基因id3574)；用于驱动造血干细胞向共同骨髓祖细胞谱系分化：il-3(参见，例如，ncbi基因id3562)、gm-csf(参见，例如，ncbi基因id1437)和/或m-csf(参见，例如，ncbi基因id1435)；用于驱动共同淋巴祖细胞向b细胞命运的分化：il-3、il-4(参见，例如，ncbi基因id：3565)和/或il-7；用于驱动共同淋巴祖细胞向自然杀伤细胞命运的分化：il-15(参见，例如，ncbi基因id3600)；用于驱动共同淋巴祖细胞向t细胞命运的分化：il-2(参见，例如，ncbi基因id3558)、il-7和/或notch(参见，例如，ncbi基因id4851、4853、4854、4855)；用于驱动共同淋巴祖细胞向树突细胞命运的分化：flt-3配体(参见，例如，ncbi基因id2323)；用于驱动共同骨髓祖细胞向树突细胞命运的分化：flt-3配体、gm-csf和/或tnf-α(参见，例如，ncbi基因id7124)；用于驱动共同骨髓祖细胞向粒细胞-巨噬细胞祖细胞谱系分化：gm-csf；用于驱动共同骨髓祖细胞向巨核细胞-红细胞祖细胞谱系分化：il-3、scf(参见，例如，ncbi基因id4254)和/或tpo(参见，例如，ncbi基因id7173)；用于驱动巨核细胞-红细胞祖细胞向巨核细胞命运的分化：il-3、il-6(参见，例如，ncbi基因id3569)、scf和/或tpo；用于驱动巨核细胞-红细胞祖细胞向红细胞命运的分化：促红细胞生成素(参见，例如，ncbi基因id2056)；用于驱动巨核细胞向血小板命运的分化：il-11(参见，例如，ncbi基因id3589)和/或tpo；用于驱动粒细胞-巨噬细胞祖细胞向单核细胞谱系分化：gm-csf和/或m-csf；用于驱动粒细胞-巨噬细胞祖细胞向成髓细胞谱系分化：gm-csf；用于驱动单核细胞向单核细胞衍生的树突细胞命运的分化：flt-3配体、gm-csf、ifn-α(参见，例如，ncbi基因id3439)和/或il-4；用于驱动单核细胞向巨噬细胞命运的分化：ifn-γ、il-6、il-10(参见，例如，ncbi基因id3586)和/或m-csf；用于驱动成髓细胞向中性粒细胞命运的分化：g-csf(参见，例如，ncbi基因id1440)、gm-csf、il-6和/或scf；用于驱动成髓细胞向嗜酸性粒细胞命运的分化：gm-csf、il-3和/或il-5(参见，例如，ncbi基因id3567)；并且用于驱动成髓细胞向嗜碱性粒细胞命运的分化：g-csf、gm-csf和/或il-3。

可以与基因编辑工具组合递送的蛋白的实例(例如，作为蛋白和/或核酸，诸如编码所述蛋白的dna或rna)包括但不限于：sox17、hex、oskm(oct4/sox2/klf4/c-myc)和/或bfgf(例如，以驱动向肝干细胞谱系的分化)；hnf4a(例如，以驱动向肝细胞命运的分化)；聚(i:c)、bmp-4、bfgf和/或8-br-camp(例如，以驱动向内皮干细胞/祖细胞谱系的分化)；vegf(例如，以驱动向动脉内皮命运的分化)；sox-2、brn4、myt1l、neurod2、ascl1(例如，以驱动向神经干细胞/祖细胞谱系的分化)；和bdnf、fcs、毛喉素(forskolin)和/或shh(例如，以驱动向神经元、星形胶质细胞和/或少突胶质细胞命运的分化)。

可以与基因编辑工具组合递送(例如，作为蛋白和/或核酸，如编码所述蛋白的dna或rna)的信号传导蛋白(例如，细胞外信号传导蛋白)的实例包括但不限于：细胞因子(例如，il-2和/或il-15，例如，用于激活cd8+t细胞)；配体和/或调节notch、wnt和/或smad信号传导途径中的一种或多种的信号传导蛋白；scf；干细胞分化因子(例如sox2、oct3/4、nanog、klf4、c-myc等)；和用于后续分离/纯化/浓缩的临时表面标记“标签”和/或荧光报告因子。例如，成纤维细胞可以通过sox2的递送转化为神经干细胞，而在oct3/4和小分子“表观遗传重置因子”的存在下它将变成心肌细胞。在有亨廷顿氏病(huntington’sdisease)或cxcr4突变的患者中，这些成纤维细胞可分别编码与神经元和心肌细胞相关的患病表型性状。通过在单个包装中递送基因编辑校正和这些因子，可以显著降低由于引入的一种或多种但不是所有因子/有效负载而产生的有害影响的风险。

因为可以控制有效负载释放的时间和/或位置(在本公开的其他地方有更详细的描述)，所以将多个有效负载包装在相同包装(例如，相同纳米颗粒)中并不妨碍人们实现不同有效负载的不同释放时间和/或位置。例如上述蛋白(和/或编码蛋白的dna或mrna)和/或非编码rna的释放可以与作为相同包装的一部分的所述一个或多个基因编辑工具的释放分别控制。例如，控制细胞增殖和/或分化，或控制向nhej或hdr的偏向的蛋白和/或核酸(例如，dna、mrna、非编码rna、mirna)可以比所述一种或多种基因编辑工具更早释放或者可以比所述一种或多种基因编辑工具更晚释放。这可以例如通过使用多于一层可脱落层和/或通过使用多于一个核来实现(例如，其中一个核具有与另一个核不同的释放曲线，例如，使用不同的d-与l-异构体比率，使用不同的esp:enp:epp比率等)。

ii.可脱落层(可脱落涂层)

在一些实施方案中，主题纳米颗粒包括包围(包封)核的可脱落层(在本文中也称为“瞬态稳定层”)。在一些情况下，主题可脱落层可在初始细胞摄取之前和期间保护有效负载。例如，没有可脱落层，在细胞内化期间可能会损失大部分有效负载。一旦处于细胞环境内，可脱落层“脱落”(例如，该层可以是ph-和/或谷胱甘肽敏感的)，暴露所述核的组分。

在一些情况下，主题可脱落层包括二氧化硅。在一些情况下，当主题纳米颗粒包括可脱落层(例如，二氧化硅)时，尽管细胞摄取的可能性降低，但仍可观察到更高的细胞内递送效率。不希望受任何特定理论的束缚，用可脱落层(例如，二氧化硅涂层)涂覆纳米颗粒核可以密封该核，使其稳定直至该层脱落，这导致有效负载释放(例如，在预期亚细胞区室内进行处理时)。通过受体介导的内吞作用进入细胞后，纳米颗粒脱落其最外层，可脱落层在内体的酸化环境或细胞溶质的还原环境中降解，并暴露所述核，在一些情况下暴露定位信号如核定位信号(nls)和/或线粒体定位信号。而且，由可脱落层包封的纳米颗粒核可以在血清中稳定并且可以适于体内施用。

可以使用任何所需可脱落层，并且本领域的普通技术人员可以考虑他们希望有效负载在靶细胞中释放的情况(例如，条件，诸如低ph)(例如，内体、细胞溶质、细胞核、溶酶体等)。根据期望可脱落涂层脱落(并因此释放有效负载)的时间、位置和/或条件，可能更需要不同的可脱落层。例如，可脱落层可以是酸不稳定的。在一些情况下，可脱落层是阴离子可脱落层(阴离子涂层)。在一些情况下，可脱落层包含二氧化硅、类肽、聚半胱氨酸和/或陶瓷(例如，生物陶瓷)。在一些情况下，可脱落层包括以下中的一种或多种：钙、锰、镁、铁(例如，可脱落层可以是磁性的，例如fe3mno2)和锂。这些中的每一种均可包括磷酸盐或硫酸盐。因而，在某些情况下，可脱落物包括以下中的一种或多种：磷酸钙、硫酸钙、磷酸锰、硫酸锰、磷酸镁、硫酸镁、磷酸铁、硫酸铁、磷酸锂和硫酸锂；其中每一种都可以对可脱落层将要“脱落”的方式和/或条件产生特定影响。因此，在一些情况下，可脱落层包括以下中的一种或多种：二氧化硅、类肽、聚半胱氨酸、陶瓷(例如生物陶瓷)、钙、磷酸钙、硫酸钙、锰、磷酸锰、硫酸锰、镁、磷酸镁、硫酸镁、铁、磷酸铁、硫酸铁、锂、磷酸锂和硫酸锂(其任意组合)(例如，可脱落层可以是二氧化硅、类肽、聚半胱氨酸、陶瓷(例如，生物陶瓷)、磷酸钙、硫酸钙、磷酸锰、硫酸锰、磷酸镁、硫酸镁、磷酸铁、硫酸铁、磷酸锂、硫酸锂或其组合的涂层)。在一些情况下，可脱落层包括二氧化硅(例如，可脱落层可以是二氧化硅涂层)。在一些情况下，可脱落层包括藻酸盐凝胶。

在一些情况下，需要不同有效负载的不同释放时间。例如，在一些情况下，希望早先释放有效负载(例如，在接触靶细胞的0.5-7天内)，并且在一些情况下，希望稍晚释放有效负载(例如，在接触靶细胞的6-30天内)。例如，在一些情况下，可能需要在接触靶细胞的0.5-7天内(例如，在接触靶细胞的0.5-5天、0.5-3天、1-7天、1-5天、1-3天内)释放有效负载(例如，基因编辑工具，诸如crispr/cas指导rna，编码所述crispr/cas指导rna的dna分子，crispr/cas指导的多肽，和/或编码所述crispr/casrna指导的多肽的核酸分子)。在一些情况下，可能需要在接触靶细胞的6-40天内(例如，在接触靶细胞的6-30、6-20、6-15、7-40、7-30、7-20、7-15、9-40、9-30、9-20或9-15天内)释放有效负载(例如，dna供体模板，例如，用于同源定向修复-hdr)。在一些情况下，可通过在不同时间递送具有不同有效负载的纳米颗粒来控制释放时间。在一些情况下，可以通过同时递送纳米颗粒(作为不同制剂的一部分或作为相同制剂的一部分)来控制释放时间，其中纳米颗粒的组分被设计为实现所需释放时间。例如，可以使用降解更快或更慢的可脱落层，或多或少抗降解的核组分，或多或少易于解凝的核组分等-以及任何或所有组分可以以任何方便的组合选择以实现所需定时。

在一些情况下，期望相对于另一有效负载(例如，一种或多种基因编辑工具)延迟一种有效负载(例如，dna供体模板)的释放。例如，在一些情况下，第一纳米颗粒包括供体dna模板，因为有效负载被设计成使得有效负载在接触靶细胞的6-40天内(例如，在接触靶细胞的6-30、6-20、6-15、7-40、7-30、7-20、7-15、9-40、9-30、9-20或9-15天内)释放，而第二纳米颗粒包括一种或多种基因编辑工具(例如，zfp或编码zfp的核酸，tale或编码tale的核酸，zfn或编码zfn的核酸，talen或编码talen的核酸，crispr/cas指导rna或编码crispr/cas指导rna的dna分子，crispr/casrna指导的多肽或编码crispr/casrna指导的多肽的核酸分子等)，因为有效负载被设计成使得有效负载在接触靶细胞的0.5-7天内(例如，在接触靶细胞的0.5-5天、0.5-3天、1-7天、1-5天或1-3天内)释放。第二纳米颗粒可以是与第一纳米颗粒相同制剂的一部分或不同制剂的一部分。

在一些情况下，纳米颗粒包括多于一种有效负载，其中期望有效负载在不同时间释放。这可以通过多种不同方式实现。例如，纳米颗粒可以具有多于一个核，其中一个核由可以提前(例如，在接触靶细胞的0.5-7天内，例如，在接触靶细胞的0.5-5天、0.5-3天、1-7天、1-5天或1-3天内)释放有效负载(例如，sirna、mrna和/或基因组编辑工具，诸如zfp或编码zfp的核酸，tale或编码tale的核酸，zfn或编码zfn的核酸，talen或编码talen的核酸，crispr/cas指导rna或编码crispr/cas指导rna的dna分子，crispr/casrna指导的多肽或编码crispr/casrna指导的多肽的核酸分子等)的组分制成而另一个由可以在延迟(例如，在接触靶细胞的6-40天内，例如在接触靶细胞的6-30、6-20、6-15、7-40、7-30、7-20、7-15、9-40、9-30、9-20或9-15天内)释放有效负载(例如，dna供体模板)的组分制成。

作为另一个实例，纳米颗粒可以包括一个以上的可脱落层，其中外部可脱落层脱落(释放有效负载)之后，内部可脱落层脱落(释放另一有效负载)。在一些情况下，内部有效负载是dna供体模板(例如，用于同源定向修复-hdr)并且外部有效负载是一种或多种基因编辑工具(例如，zfp或编码zfp的核酸，tale或核酸编码tale的酸，zfn或编码zfn的核酸，talen或编码talen的核酸，crispr/cas指导rna或编码crispr/cas指导rna的dna分子，crispr/casrna指导的多肽或编码crispr/casrna指导的多肽的核酸分子等)。内部和外部有效负载可以是任何所需有效负载，并且其中一种或两种可以包括例如一种或多种sirna和/或一种或多种mrna。因此，在一些情况下，纳米颗粒可具有多于一个可脱落层并且可设计成早先释放(例如，在接触靶细胞的0.5-7天内，例如，在接触靶细胞的0.5-5天、0.5-3天、1-7天、1-5天或1-3天内)一种有效负载(例如，sirna、mrna、基因组编辑工具，诸如zfp或编码zfp的核酸，tale或编码tale的核酸，zfn或编码zfn的核酸，talen或编码talen的核酸，crispr/cas指导rna或编码crispr/cas指导rna的dna分子，crispr/casrna指导的多肽或者编码crispr/casrna指导的多肽的核酸分子等)，而稍晚(例如，在接触靶细胞的6-40天内，例如，在接触靶细胞的6-30、6-20、6-15、7-40、7-30、7-20、7-15、9-40、9-30、9-20或9-15天内)释放另一种有效负载(例如，sirna、mrna、dna供体模板)。

在一些实施方案中(例如，在上文描述的实施方案中)，改变的基因表达的时间可以用作有效负载释放时间的代表。作为说明性实例，如果期望确定到第12天是否已释放有效负载，则可以在第12天测定纳米颗粒递送的预期结果。例如，如果预期结果是例如通过递送sirna降低靶细胞的靶基因的表达，则可以测定/监测靶基因的表达以确定sirna是否已经释放。作为另一个实例，如果预期结果是例如通过递送编码目标蛋白的dna或mrna来表达目标蛋白，则可以测定/监测目标蛋白的表达以确定有效负载是否已经释放。作为又一个实例，如果预期结果是例如通过切割基因组dna和/或插入供体dna模板来改变靶细胞的基因组，可以测定/监测来自靶基因座的表达和/或基因组改变的存在以确定有效负载是否已经释放。

因此，在一些情况下，可脱落层提供纳米颗粒组分的阶段性释放。例如，在一些情况下，纳米颗粒具有多于一个(例如，两个、三个或四个)可脱落层。例如，对于具有两个可脱落层的纳米颗粒，此类纳米颗粒从最内部到最外部可以具有：核，例如具有第一有效负载；第一可脱落层、中间层，例如具有第二有效负载；和包围中间层的第二可脱落层(参见，例如图9)。此类构造(多个可脱模层)便于各种所需有效负载的阶段性释放。作为进一步的说明性实例，具有两个可脱落层的纳米颗粒(如上所述)可以包括在核中的一种或多种所需基因编辑工具(例如，以下中的一种或多种：dna供体模板，crispr/cas指导rna，编码crispr/cas指导rna的dna等)，以及在中间层中的另一种所需基因编辑工具(例如，以下中的一种或多种：可编程基因编辑蛋白，诸如

crispr/cas蛋白、zfp、zfn、tale、talen等；编码可编程基因编辑蛋白的dna或rna；crispr/cas指导rna；编码crispr/cas指导rna的dna；等等)-其呈任何所需的组合。

在实施例部分中可以找到添加可脱落层(例如，以适当停留时间(流速)通过微流体混合芯片的两种溶液)的实例。

替代包装(例如，脂质制剂)

在一些实施方案中，主题核(例如，包括上述组分和/或构造的任何组合)是基于脂质的递送系统，例如阳离子脂质递送系统的一部分(参见，例如，chesnoy和huang,《生物物理学与生物分子结构年评》(annurevbiophysbiomolstruct.)2000,29:27-47；hirko等人，《当代药物化学》(currmedchem.)2003年7月10日(14):1185-93；和liu等人，《当代药物化学》(currmedchem.)2003年7月10日(14):1307-15)。在一些情况下，主题核(例如，包括上述组分和/或构造的任何组合)未被可脱落层包围。如上所述，核可包括阴离子聚合物组合物(例如，聚(谷氨酸))、阳离子聚合物组合物(例如，聚(精氨酸)、阳离子多肽组合物(例如，组蛋白尾肽)和有效负载(例如，核酸和/或蛋白有效负载)。

在核是基于脂质的递送系统的一部分的一些情况下，设计核时考虑了定时和/或定位释放。例如，在一些情况下，核包括esp、enp和/或epp，并且在一些此类情况下，这些组分成比率存在，使得有效负载释放延迟到核(例如，如上所述)遇到所需条件(例如，细胞位置、细胞条件诸如ph、特定酶的存在等)。在一些此类实施方案中，核包括阴离子氨基酸的d-异构体的聚合物和阴离子氨基酸的l-异构体的聚合物，并且在一些情况下，d-和l-异构体的聚合物相对于彼此，在特定比率范围内(例如，如上所述)存在。在一些情况下，核包括阳离子氨基酸的d-异构体的聚合物和阳离子氨基酸的l-异构体的聚合物，并且在一些情况下，d-和l-异构体的聚合物相对于彼此，在特定比率范围内(例如，如上所述)存在。在一些情况下，核包括阴离子氨基酸的d-异构体的聚合物和阳离子氨基酸的l-异构体的聚合物，并且在一些情况下，d-和l-异构体的聚合物相对于彼此，在特定比率范围内(例如，如上所述)存在。在一些情况下，核包括阴离子氨基酸的l-异构体的聚合物和阳离子氨基酸的d-异构体的聚合物，并且在一些情况下，d-和l-异构体的聚合物相对于彼此，在特定比率范围内(例如，如上所述)存在。在一些情况下，核包括含有nls(例如，如上所述)的蛋白。在一些情况下，核包括htp(例如，如上所述)。

阳离子脂质是非病毒载体，可用于基因递送并具有使质粒dna凝聚的能力。在合成n-[1-(2,3-二油氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵用于脂质转染后，改善阳离子脂质的分子结构已成为活跃领域，包括头基、接头和疏水结构域修饰。修饰包括使用多价聚胺，其可以通过增强的表面电荷密度改善dna结合和递送，以及使用基于甾醇的疏水性基团如3b-[n-(n′,n′-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇，其可以限制毒性。辅助脂质如二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)可用于通过增强的脂质体疏水性和六方晶反相转变来改善转基因表达，以促进内体逃逸。在一些情况下，脂质制剂包括以下中的一种或多种：dlin-dma、dlin-k-dma、dlin-kc2-dma、dlin-mc3-dma、98n12-5、c12-200、胆固醇、peg-脂质、脂聚胺、地塞米松-精胺(ds)和二取代的精胺(d2s)(例如，由地塞米松与聚胺精胺缀合产生)。dlin-dma、dlin-k-dma、dlin-kc2-dma、98n12-5、c12-200和dlin-mc3-dma可以通过本领域概述的方法合成(参见，例如，heyes等人，《控制释放杂志》(j.controlrelease)，2005,107,276-287；semple等人，《自然生物技术》(naturebiotechnology)，2010,28,172-176；akinc等人，《自然生物技术》(naturebiotechnology)，2008,26,561-569；love等人，pnas,2010,107,1864-1869；国际专利申请公开wo2010054401；其全部通过引用整体并入本文。

各种基于脂质的递送系统的实例包括但不限于以下出版物中描述的那些：国际专利公开号wo2016081029；美国专利申请公开号us20160263047和us20160237455；和美国专利号9,533,047；9,504,747；9,504,651；9,486,538；9,393,200；9,326,940；9,315,828；和9,308,267；其全部通过引用整体并入本文。

因此，在一些情况下，主题核被脂质(例如，阳离子脂质，诸如lipofectamine转染试剂)包围。在一些情况下，主题核存在于脂质制剂(例如，脂质纳米颗粒制剂)中。脂质制剂可包括脂质体和/或脂质复合物(lipoplex)。脂质制剂可包括乙醇稀释形成的自发性囊泡(snalp)脂质体(例如，包含阳离子脂质和中性辅助脂质的脂质体可涂覆有聚乙二醇(peg)和/或鱼精蛋白)。

脂质制剂可以是基于类脂质(lipidoid)的制剂。已经广泛描述了类脂质的合成，并且含有这些化合物的制剂可以包括在主题脂质制剂中(参见，例如，mahon等人，《生物共轭化学》(bioconjugchem.)201021:1448-1454；schroeder等人，《内科杂志》(jinternmed.)2010267:9-21；akinc等人，《自然生物科技》(natbiotechnol.)200826:561-569；love等人，《美国国家科学协会公报》(procnatlacadsciusa.)2010107:1864-1869；和siegwart等人，《美国国家科学协会公报》(procnatlacadsciusa.)2011108:12996-3001；其全部通过引用整体并入本文)。在一些情况下，主题脂质制剂可包括以下中的一种或多种(以任何所需组合)：1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(dopc)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(dope)；n-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)；1,2-二油酰氧基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)；双十八烷基酰胺基甘氨酰精胺(dogs)；n-(3-氨基丙基)-n,n-二甲基-2,3-双(十二烷氧基)-1(gap-dlrie)；溴化丙炔；十六烷基三甲基溴化铵(ctab)；6-月桂基己鸟氨酸(lhon)；1-(2,3-二油酰氧基丙基)-2,4,6-三甲基吡啶(20c)；2,3-二油烯基氧基-n-[2(精胺甲酰氨基-乙基)-n,n-二甲基-1(dospa)；三氟乙酸丙胺；1,2-二油烯基-3-三甲基铵-丙烷(dopa)；n-(2-羟乙基)-n,n-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1(mdrie)；溴丙铵；二肉豆蔻氧基丙基二甲基羟乙基溴化铵(dmri)；3β-[n-(n',n'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇dc-chol；双胍-tren-胆固醇(bgtc)；1,3-二脱氧-2-(6-羧基-精)-丙酰胺(dosper)；二甲基十八烷基溴化铵(ddab)；双十八烷基酰胺基甘氨酰亚精胺(dsl)；rac-[(2,3-双十八烷氧基丙基)(2-羟乙基)]-二甲基铵(clip-1)；氯化rac-[2(2,3-双十六烷氧基丙基(clip-6)；氧基甲氧基)乙基]三甲基溴化铵；乙基二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(edmpc)；1,2-二硬脂酰氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷(dsdma)；1,2-二肉豆蔻酰基-三甲基铵丙烷(dmtap)；o,o'-二肉豆蔻基-n-赖氨酰天冬氨酸(dmke)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(dsepc)；n-棕榈酰基d-赤型-鞘氨醇氨基甲酰-精胺(ccs)；n-叔丁基-n0-十四烷基-3-十四烷基氨基丙脒；双c14脒；十八烯氧基[乙基-2-十七烯基-3-羟乙基]咪唑啉(dotim)；氯化n1-胆甾基氧基羰基-3,7-二氮杂壬烷-1,9-二胺(cdan)；2-[3-[双(3-氨基丙基)氨基]丙基氨基]-n-[2-[二(十四烷基)氨基]-2-氧代乙基]乙酰胺(rpr209120)；双十四烷基氨基甲酰甲基-乙酰胺；1,2-二亚油氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlindma)；2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环；dlin-kc2-dma；亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯；dlin-mc3-dma；dlin-k-dma；98n12-5；c12-200；胆固醇；peg-脂质；脂聚胺；地塞米松-精胺(ds)；和二取代的精胺(d2s)。

iii.表面涂层(外壳)

在一些情况下，可脱落层(涂层)本身涂有附加层，本文称为“外壳”、“外涂层”或“表面涂层”。表面涂层可以起到多种不同的作用。例如，表面涂层可以增加递送效率和/或可以使主题纳米颗粒靶向特定细胞类型。表面涂层可包括肽、聚合物或配体-聚合物缀合物。表面涂层可包括靶向配体。例如，可以将一种或多种靶向配体(有或无接头结构域)的水溶液添加到有涂层的纳米颗粒悬浮液(涂覆有可脱落层的纳米颗粒的悬浮液)。例如，在一些情况下，(锚定结构域的)质子化锚定残基的最终浓度为25至300μm。在一些情况下，添加表面涂层的过程产生单分散的颗粒悬浮液，其平均粒度为50至150nm且ζ电位为0至-10mv。

在一些情况下，表面涂层与最外面的可脱落层以静电方式相互作用。例如，在一些情况下，纳米颗粒具有两个可脱落层(例如，从最内部到最外部：核，例如具有第一有效负载；第一可脱落层、中间层，例如具有第二有效负载；和包围中间层的第二可脱落层)，并且外壳(表面涂层)可以与第二可脱落层相互作用(例如，静电)。在一些情况下，纳米颗粒仅有一个可脱落层(例如，阴离子二氧化硅层)，并且外壳在一些情况下可以与可脱落层以静电方式相互作用。

因此，在可脱落层(例如，最外面的可脱落层)是阴离子型的情况下(例如，在可脱落层是二氧化硅涂层的一些情况下)，如果表面涂层包含阳离子组分，则表面涂层可与可脱落层以静电方式相互作用。例如，在一些情况下，表面涂层包括递送分子，其中靶向配体与阳离子锚定结构域缀合。阳离子锚定域与可脱落层以静电方式相互作用并将递送分子锚定到纳米颗粒上。同样地，在可脱落层(例如，最外面的可脱落层)是阳离子型的情况下，如果表面涂层包含阴离子组分，则表面涂层可与可脱落层以静电方式相互作用。

在一些实施方案中，表面涂层包括细胞穿透肽(cpp)。在一些情况下，阳离子氨基酸的聚合物可以充当cpp(也称为'蛋白转导结构域'-ptd)，这是用于指利于穿过脂质双层、胶束、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜的多肽、多核苷酸、碳水化合物或有机或无机化合物的术语。附着于另一分子的ptd(例如，嵌入主题纳米颗粒的可脱落层和/或与之相互作用)，其范围可以从小的极性分子到大的大分子和/或纳米颗粒，促进分子穿过膜，例如，从细胞外空间到细胞内空间，或细胞溶质到细胞器(例如，细胞核)内。

cpp的实例包括但不限于最小十一肽蛋白转导结构域(对应于包含ygrkkrrqrrr(seqidno:160)的hiv-1tat的残基47-57；包含足以引导进入细胞的多个精氨酸(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或10-50个精氨酸)的聚精氨酸序列；vp22结构域(zender等人(2002)《癌症基因疗法》(cancergenether.)9(6):489-96)；果蝇触角足蛋白转导结构域(noguchi等人(2003)《糖尿病》(diabetes)52(7)：1732-1737)；截短的人降钙素肽(trehin等人(2004)《药学研究》(pharm.research)21:1248-1256)；聚赖氨酸(wender等人(2000)《美国国家科学协会公报》(proc.natl.acad.sci.usa)97:13003-13008)；rrqrrtsklmkr(seqidno:161)；transportangwtlnsagyllgkinlkalaalakkil(seqidno:162)；kalaweaklakalakalakhlakalakalkcea(seqidno:163)；和rqikiwfqnrrmkwkk(seqidno:164)。示例性cpp包括但不限于：ygrkkrrqrrr(seqidno:160)、rkkrrqrrr(seqidno:165)、3个精氨酸残基至50个精氨酸残基的精氨酸均聚物、rkkrrqrr(seqidno:166)、yaraaarqara(seqidno:167)、thrlprrrrrr(seqidno:168)和ggrrarrrrrr(seqidno:169)。在一些实施方案中，cpp是可活化的cpp(acpp)(aguilera等人(2009)《整合生物学》(integrbiol)(camb)6月；1(5-6):371-381)。acpp包含通过可切割接头与匹配的聚阴离子(例如，glu9或“e9”)连接的聚阳离子cpp(例如，arg9或“r9”)，其将净电荷降低至接近零，从而抑制粘附和摄入细胞。在切割接头后，聚阴离子被释放，局部地暴露出聚精氨酸及其固有的粘附性，从而“激活”acpp以穿过膜。

在一些情况下，可以通过使有涂层的核(被可脱落层包围的核)与包含cpp的组合物(例如，溶液)接触来将cpp添加到纳米颗粒中。然后cpp可与可脱落层相互作用(例如，静电)。

在一些情况下，表面涂层包括阳离子氨基酸的聚合物(例如，聚(精氨酸)如聚(l-精氨酸)和/或聚(d-精氨酸)，聚(赖氨酸)如聚(l-赖氨酸)和/或聚(d-赖氨酸)，聚(组氨酸)如聚(l-组氨酸)和/或聚(d-组氨酸)，聚(鸟氨酸)如聚(l-鸟氨酸)和/或聚(d-鸟氨酸)，聚(瓜氨酸)如聚(l-瓜氨酸)和/或聚(d-瓜氨酸)等。因此，在一些情况下，表面涂层包括聚(精氨酸)，例如聚(l-精氨酸)。

在一些实施方案中，表面涂层包括七肽如selank(tkprpgp-seqidno:147)(例如，n-乙酰基selank)和/或semax(mehfpgp-seqidno:148)(例如，n-乙酰基semax)。因此，在一些情况下，表面涂层包括selank(例如，n-乙酰基selank)。在一些情况下，表面涂层包括semax(例如，n-乙酰基semax)。

在一些实施方案中，表面涂层包括递送分子。递送分子包括靶向配体，并且在一些情况下，靶向配体与锚定结构域(例如阳离子锚定结构域)缀合。在一些情况下，靶向配体通过插入接头与锚定结构域(例如阳离子锚定结构域)缀合。

靶向配体

多种靶向配体(例如，作为主题递送分子的一部分)可以用作表面涂层的一部分，并且可以设想许多不同的靶向配体。在一些实施例中，所述靶向配体是野生型蛋白质的片段(例如，结合结构域)。例如，在一些情况下，主题递送分子的肽靶向配体可以具有4-50个氨基酸(例如，4-40个、4-35个、4-30个、4-25个、4-20个、4-15个、5-50个、5-40个、5-35个、5-30个、5-25个、5-20个、5-15个、7-50个、7-40个、7-35个、7-30个、7-25个、7-20个、7-15个、8-50个、8-40个、8-35个、8-30个、8-25个、8-20个或8-15个氨基酸)的长度。靶向配体可以是野生型蛋白质的片段，但在一些情况下，所述靶向配体相对于野生型氨基酸序列具有突变(例如，插入、缺失、取代)(即，相对于相应的野生型蛋白质序列的突变)。例如，靶向配体可以包含增加或减少与靶细胞表面蛋白的结合亲和力的突变。

在一些情况下，靶向配体是抗体的抗原结合区(例如，scfv)。“fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链fv种类中，该区域由紧密、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链fv种类(scfv)中，一个重链和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以以类似于双链fv种类中的“二聚体”结构缔合。关于scfv的综述，参见pluckthun，在《单克隆抗体药理学》(thepharmacologyofmonoclonalantibodies)第113卷，rosenburg和moore编辑，springer-verlag，纽约，第269-315页(1994)。

在一些情况下，靶向配体包括病毒糖蛋白，其在一些情况下与普遍存在的表面标志物如硫酸肝素蛋白多糖结合，并且可以通过胞膜边缘波动相关过程在一些细胞群中诱导微小细胞增多。聚(l-精氨酸)是靶向配体的另一个实例，其也可用于结合表面标志物如硫酸肝素蛋白多糖。

在一些情况下，靶向配体可以包括添加半胱氨酸残基的突变，其可以促进与接头和/或锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)的缀合。例如，半胱氨酸可用于通过巯基化学(例如，二硫键)和/或胺反应性化学进行交联(缀合)。

在一些情况下，靶向配体包含内部半胱氨酸残基。在一些情况下，靶向配体在n-末端和/或c-末端处包含半胱氨酸残基。在一些情况下，为了包含半胱氨酸残基，靶向配体例如相对于相应的野生型序列发生突变(例如，插入或取代)。因此，本文所述的任何靶向配体可通过在半胱氨酸残基中插入和/或取代(例如，半胱氨酸残基的内部、n-末端、c-末端插入或取代)来修饰。

所谓“相应的”野生型序列是指从中衍生或可能已经衍生出主题序列的野生型序列(例如，与目的序列具有高度序列同一性的野生型蛋白质序列)。例如，对于具有一个或多个突变(例如，取代、插入)但反之与野生型序列高度相似的靶向配体，与所述靶向配体最相似的氨基酸序列可以被视作是相应的野生型氨基酸序列。

相应的野生型蛋白质/序列不必是100％相同的(例如，可以是85％或更多相同的、90％或更多相同的、95％或更多相同的、98％或更多相同的、99％或更多相同的等)(在被修饰的一个或多个位置的外部)，但靶向配体以及相应的野生型蛋白质(例如，野生型蛋白质的片段)可以与预期的细胞表面蛋白结合，并且保持足够使它们可以被视作是同源的序列同一性(被修饰的区域的外部)。可以使用任何方便的方法(例如，使用如blast、muscle、t-coffee等任何方便的序列比较/比对软件)鉴别/评估“相应的”野生型蛋白质序列的氨基酸序列。

可用作表面涂层的一部分的靶向配体的实例(例如，作为表面涂层的递送分子的一部分)包括但不限于表1中列出的那些。可以用作主题递送分子的一部分的靶向配体的实例包含但不限于表3中列出的那些靶向配体(表3中列出的多个序列包含通过接头(例如，ggggsggggs)与阳离子多肽结构域(例如，9r、6r等)缀合的靶向配体(例如，第2行的snrwldvk)。可以包含在靶向配体中的氨基酸序列的实例包含但不限于：npkltrmltfkfy(seqidno:xx)(il2)、tsvgkypntgyygd(seqidno:xx)(cd3)、snrwldvk(siglec)、ekfilkvrpafkav(seqidno:xx)(scf)；ekfilkvrpafkav(seqidno:xx)(scf)、ekfilkvrpafkav(seqidno:xx)(scf)、snysiidklvnivddlvecvkens(seqidno:xx)(ckit)和ac-snysaibadkaibanaibaddaibaeaibakens(seqidno:xx)(ckit)。因此，在一些情况下，靶向配体包含与npkltrmltfkfy(seqidno:xx)(il2)、tsvgkypntgyygd(seqidno:xx)(cd3)、snrwldvk(siglec)、ekfilkvrpafkav(seqidno:xx)(scf)；ekfilkvrpafkav(seqidno:xx)(scf)、ekfilkvrpafkav(seqidno:xx)(scf)或snysiidklvnivddlvecvkens(seqidno:xx)(ckit)具有85％或更高(例如，90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或者100％)的序列同一性的氨基酸序列。

表1.靶向配体的实例

靶向配体(例如，递送分子的)可以包含氨基酸序列rgd和/或与seqidno:1-12中任一个所示氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，靶向配体包含氨基酸序列rgd和/或seqidno:1-12中任一个所示氨基酸序列。在一些实施例中，靶向配体可以包含半胱氨酸(内部、c-末端或n-末端)，并且还可以包含氨基酸序列rgd和/或与seqidnos:1-12中的任一个所示氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。

靶向配体(例如，递送分子的)可以包含氨基酸序列rgd和/或与seqidno:1-12和181-187中任一个所示氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，靶向配体包含氨基酸序列rgd和/或seqidno:1-12和181-187中任一个所示氨基酸序列。在一些实施例中，靶向配体可以包含半胱氨酸(内部、c-末端或n-末端)，并且还可以包含氨基酸序列rgd和/或与seqidnos:1-12和181-187中的任一个所示氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。

靶向配体(例如，递送分子的)可以包含氨基酸序列rgd和/或与seqidno:1-12、181-187和271-277中任一个所示氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，靶向配体包含氨基酸序列rgd和/或seqidno:1-12、181-187和271-277中任一个所示氨基酸序列。在一些实施例中，靶向配体可以包含半胱氨酸(内部、c-末端或n-末端)，并且还可以包含氨基酸序列rgd和/或与seqidnos:1-12、181-187和271-277中的任一个所示氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。

在一些情况下，靶向配体(例如，递送分子的)可以包含与seqidno:181-187和271-277中任一个所示氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，靶向配体包含seqidno:181-187和271-277中任一个所示氨基酸序列。在一些实施例中，靶向配体可以包含半胱氨酸(内部、c-末端或n-末端)，并且还可以包含氨基酸序列rgd和/或与seqidno:181-187和271-277中的任一个所示氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。

在一些情况下，靶向配体(例如，递送分子的)可以包含与seqidno:181-187中任一个所示氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，靶向配体包括seqidno:181-187中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施例中，靶向配体可以包含半胱氨酸(内部、c-末端或n-末端)，并且还可以包含与seqidno:181-187中的任一个所示氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。

在一些情况下，靶向配体(例如，递送分子的)可以包含与seqidno:271-277中任一个所示氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，靶向配体包括seqidno:271-277中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施例中，靶向配体可以包含半胱氨酸(内部、c-末端或n-末端)，并且还可以包含与seqidnos:271-277中的任一个所示氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。

本文使用术语“靶标”和“靶向结合”以指代特异性结合。术语“特异性结合(specificbinding)”、“特异性结合(specificallybinds)”等是指相对于溶液或反应混合物中的其它分子或部分的与分子的非共价或共价优先结合(例如，特异性结合相对于其它可用多肽的特定多肽的抗体或特异性结合相对于其它可用受体的特定受体的配体)。在一些实施例中，一个分子对其特异性结合的另一个分子的亲和力由10^-5m或更低(例如，10^-6m或更低、10^-7m或更低、10^-8m或更低、10^-9m或更低、10^-10m或更低、10^-11m或更低、10^-12或更低、10^-13或更低、10^-14或更低、10^-15或更低或10^-16m或更低)的kd(离解常数)表征。“亲和力”是指结合强度，增加的结合亲和力与较低的kd相关。

在一些情况下，所述靶向配体提供与选自家族bg-蛋白偶联受体(gpcr)、受体酪氨酸激酶(rtk)、细胞表面糖蛋白以及细胞-细胞粘附分子的细胞表面蛋白的靶向结合。在受体对接时考虑配体的空间布置可以用于实现适当的期望的功能选择性和内体分选偏差，例如，使得配体与靶标之间的结构功能关系不会由于靶向配体与有效负载或带电聚合物多肽结构域的缀合而被破坏。例如，与核酸、蛋白、核糖核蛋白或锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)的缀合可潜在地干扰结合裂缝。

因此，在一些情况下，当与其配体结合的期望靶标(细胞表面蛋白)的晶体结构可用时(或者当这种结构可用于相关蛋白质时)，可以使用3d结构建模和序列线程来可视化在配体与靶标之间相互作用的位点。这可以促进例如选择内部位点以放置(例如，半胱氨酸残基的)取代和/或插入。

作为实例，在一些情况下，所述靶向配体提供与家族bg蛋白偶联受体(gpcr)(也称为‘分泌素家族’)的结合。在一些情况下，所述靶向配体提供与家族bgpcr的变构-亲和结构域和正构结构域的结合以分别提供靶向结合和长内体再循环途径的接合(参见，例如，下文的实例部分以及图11和图12)。

g蛋白偶联受体(gpcr)共享共同的分子结构(具有七个推定的跨膜片段)和共同的信号传导机制，因为所述g蛋白偶联受体与g蛋白(异源三聚体gtp酶)相互作用以调节如环amp、肌醇磷酸盐、二酰基甘油和钙离子等细胞内第二信使的合成。gpcr的家族b(分泌素受体家族或‘家族2’)是小的但结构和功能多样化的蛋白质组，所述gpcr的家族b包含多肽激素的受体和被认为介导质膜处的细胞间相互作用的分子(参见，例如，harmar等人,《基因组生物学(genomebiol)》2001；2(12):reviews3013)。与分泌素受体家族的成员有关的结构生物学已经取得了重要的进展，所述进展包含其n-末端的若干个晶体结构的发表、有或没有结合配体，这些工作扩展了对配体结合的理解并且为基于结构的配体设计提供了有用平台(参见例如，poyner等人,《英国药理学杂志(brjpharmacol)》2012年5月；166(1):1-3)。

例如，通过使用毒蜥外泌肽-4配体或其衍生物(例如，半胱氨酸取代的毒蜥外泌肽-4靶向配体，如seqidno:2所示的配体)，可能期望使用主题递送分子靶向胰腺细胞表面蛋白glp1r(例如，靶向β-胰岛)。因为glp1r在脑和胰腺中很丰富，所以提供与glp1r的靶向结合的靶向配体可用于靶向脑和胰腺。因此，靶向glp1r有助于专注于治疗(例如，通过递送一种或多种基因编辑工具)疾病，如亨廷顿病(cag重复扩增突变)、帕金森氏病(lrrk2突变)、als(sod1突变)和其他cns疾病的方法(例如，治疗方法)。靶向glp1r还有助于专注于向胰腺β-胰岛递送有效负载，用于治疗疾病如i型糖尿病、ii型糖尿病和胰腺癌(例如，通过递送一种或多种基因编辑工具)的方法(例如，治疗方法)。

当使用毒蜥外泌肽-4的修饰形式靶向glp1r时，可以通过使用pdb3维渲染比对毒蜥外泌肽-4氨基酸序列即hgegtftsdlskqmeeeavrlfiewlknggpssgappps(seqidno.1)与胰高血糖素-gcgr(4ers)和glp1-glp1r-ecd复合物(pdb:3iol)的晶体结构来鉴别用于半胱氨酸取代和/或插入(例如，用于缀合到核酸有效负载)的氨基酸，所述pdb3维渲染可以在3d空间中旋转以预测交联的复合物必须面向以免破坏所述两个结合裂缝的方向(参见例如，下文的实例部分以及图11和图12)。当靶向配体(靶向家族bgpcr)的理想交联位点(例如，用于半胱氨酸残基的取代/插入的位点)与对应受体的两个结合裂缝充分正交时，高亲和力结合可以发生以及伴随着长内体再循环途径螯合(例如，用于最佳的有效负载释放)。在seqidno:1的氨基酸位置10、11和/或12处的半胱氨酸取代致使gs-偏向信号级联的双峰结合和特异性起始，β抑制蛋白的接合，和受体从肌动蛋白骨架解离。在一些情况下，这种靶向配体通过受体介导的内吞作用触发纳米颗粒的内化，这是不经由仅与gpcr’sn-末端结构域接合且不伴随正构位点接合的机制(仅结合亲和链，毒蜥外泌肽-4[31-39]也是这种情况)。

在一些情况下，主题靶向配体包含与毒蜥外泌肽-4氨基酸序列(seqidno:1)具有85％或更高(例如，90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或者100％)的同一性的氨基酸序列。在一些此类情况下，所述靶向配体在对应于seqidno:1所示氨基酸序列的l10、s11和k12的一个或多个位置处包含半胱氨酸取代或插入。在一些情况下，所述靶向配体在对应于seqidno:1所示氨基酸序列的s11的位置处包含半胱氨酸取代或插入。在一些情况下，主题靶向配体包含具有毒蜥外泌肽-4氨基酸序列(seqidno:1)的氨基酸序列。在一些情况下，靶向配体与锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)缀合(有或无接头)。

作为另一个实例，在一些情况下，根据本公开的靶向配体提供与受体酪氨酸激酶(rtk)，诸如成纤维细胞生长因子(fgf)受体(fgfr)的结合。因此，在一些情况下，靶向配体是fgf的片段(即，包含fgf的氨基酸序列)。在一些情况下，所述靶向配体与在正构结合期间被占据的所述rtk的片段结合(例如，参见以下的实例部分)。在一些情况下，所述靶向配体结合所述rtk的肝素-亲和结构域。在一些情况下，所述靶向配体提供与fgf受体的靶向结合并且包括与氨基酸序列knggfflrihpdgrvdgvreks(seqidno:4)具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，所述靶向配体提供与fgf受体的靶向结合并且包括如seqidno:4所示氨基酸序列。

在一些情况下，占据rtk的正构位点的小结构域(例如，长度为5-40个氨基酸)可以用于接合与rtk的核分选(例如，fgfr)相关的内吞途径而不接合细胞增殖以及原始致癌信号级联，所述小结构域可以是天然生长因子配体所特有的。例如，截短的bfgf(tbfgf)肽(氨基酸30-115)含有bfgf受体结合位点和肝素结合位点的一部分，并且该肽可以在不刺激细胞增殖的情况下有效地结合细胞表面上的fgfr。tbfgf的序列是krlycknggfflrihpdgrvdgvreksdphiklqlqaeergvvsikgvcanrylamkedgrllaskcvtdecffferlesnnynty(seqidno:13)(参见例如，cai等人，《国际药学杂志(intjpharm)》2011年4月15日；408(1-2):173-82)。

在一些情况下，所述靶向配体提供与fgf受体的靶向结合并且包括氨基酸序列hfkdpk(seqidno:5)(参见，例如，下文的实例部分)。在一些情况下，所述靶向配体提供与fgf受体的靶向结合，并且包括氨基酸序列lesnnynt(seqidno:6)(参见，例如，下文的实例部分)。

在一些情况下，根据本公开的靶向配体提供与细胞表面糖蛋白的靶向结合。在一些情况下，所述靶向配体提供与细胞-细胞粘附分子的靶向结合。例如，在一些情况下，所述靶向配体提供与cd34的靶向结合，cd34是作为细胞-细胞粘附因子起作用的细胞表面糖蛋白，并且是在造血干细胞(例如，骨髓)上发现的蛋白质。在一些情况下，所述靶向配体是如e-选择蛋白、l-选择蛋白或p-选择蛋白等选择蛋白的片段(例如，在选择蛋白的前40个氨基酸中发现的信号肽)。在一些情况下，主题靶向配体包含选择蛋白(例如，e-选择蛋白、l-选择蛋白、p-选择蛋白)的sushi结构域。

在一些情况下，所述靶向配体包括与氨基酸序列miasqflsaltlvllikesga(seqidno:7)具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，所述靶向配体包括如seqidno:7所示氨基酸序列。在一些情况下，所述靶向配体包括与氨基酸序列mvfpwrcegtywgsrnilklwvwtllccdflihhgthc(seqidno:8)具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更多或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，所述靶向配体包括如seqidno:8所示氨基酸序列。在一些情况下，所述靶向配体包括与氨基酸序列mifpwkcqstqrdlwnifklwgwtmlccdflahhgtdc(seqidno:9)具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，靶向配体包括如seqidno:9所示氨基酸序列。在一些情况下，靶向配体包括与氨基酸序列mifpwkcqstqrdlwnifklwgwtmlcc(seqidno:10)具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，靶向配体包括如seqidno:10所示氨基酸序列。

可以用作主题靶向配体的选择蛋白的片段(例如，在选择蛋白的前40个氨基酸中发现的信号肽)可以在一些情况下获得与特异性修饰的唾液酸蛋白的强结合，例如，各种唾液酸化的路易斯^x修饰/细胞外cd34的o-唾液酸化可以导致p-选择蛋白、l-选择蛋白和e-选择蛋白对骨髓、淋巴、脾和扁桃体区室的不同亲和力。相比之下，在一些情况下，靶向配体可以是cd34的细胞外部分。在一些此类情况下，可以利用配体的唾液酸化的修饰将靶向配体差异地靶向到各种选择蛋白。

在一些情况下，根据本公开的靶向配体提供与e-选择蛋白的靶向结合。e-选择蛋白可介导肿瘤细胞与内皮细胞的粘附并且e-选择蛋白的配体可在癌症转移中发挥作用。例如，p-选择蛋白糖蛋白-1(psgl-1)(例如，源自人嗜中性粒细胞)可以作为e-选择蛋白的高效配体(例如，由内皮细胞表达)，并且主题靶向配体因此可以在一些情况下包括psgl-1氨基酸序列(或其与e-选择蛋白结合的片段)。作为另一个实例，e-选择蛋白配体-1(esl-1)可以结合e-选择蛋白，因此在一些情况下，主题靶向配体可以包括esl-1氨基酸序列(或其与e-选择蛋白结合的片段)。在一些情况下，具有psgl-1和/或esl-1氨基酸序列(或其与e-选择蛋白结合片段的)的靶向配体带有一个或多个唾液酸基路易斯修饰以便结合e-选择蛋白。作为另一个实例，在一些情况下，cd44、死亡受体-3(dr3)、lamp1、lamp2和mac2-bp可以结合e-选择蛋白，因此在某些情况下，主题靶向配体可以包括以下任何一种的氨基酸序列(或其与e-选择蛋白结合的片段)：cd44、死亡受体-3(dr3)、lamp1、lamp2和mac2-bp。

在一些情况下，根据本发明的靶向配体提供与p-选择蛋白的靶向结合。在一些情况下，psgl-1可以提供此类靶向结合。因此，在一些情况下，主题靶向配体可以在一些情况下包括psgl-1氨基酸序列(或其与p-选择蛋白结合的片段)。在一些情况下，具有psgl-1氨基酸序列(或其与p-选择蛋白结合的片段)的靶向配体带有一个或多个唾液酸基路易斯修饰以便结合p-选择蛋白。

在一些情况下，根据本公开的靶向配体提供与转铁蛋白受体的靶向结合。在一些此类情况下，所述靶向配体包括与氨基酸序列thrppmwspvwp(seqidno:11)具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，靶向配体包含seqidno:11所示的氨基酸序列。

在一些情况下，根据本发明的靶向配体提供与整联蛋白(例如，α5β1整联蛋白)的靶向结合。在一些此类情况下，所述靶向配体包括与氨基酸序列rretawa(seqidno:12)具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，靶向配体包括如seqidno:12所示氨基酸序列。在一些情况下，所述靶向配体包括与氨基酸序列rgdgw(seqidno:181)具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，靶向配体包括如seqidno:181所示氨基酸序列。在一些情况下，所述靶向配体包括氨基酸序列rgd。

在一些情况下，根据本发明的靶向配体提供与整联蛋白的靶向结合。在一些此类情况下，所述靶向配体包括与氨基酸序列gcgygrgdspg(seqidno:182)具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，所述靶向配体包括如seqidno:182所示氨基酸序列。在一些情况下，此类靶向配体在n-末端乙酰化和/或在c-末端酰胺化(nh2)。

在一些情况下，根据本公开的靶向配体提供与整合蛋白(例如，α5β3整合蛋白)的靶向结合。在一些此类情况下，所述靶向配体包括与氨基酸序列dgarycrgdcfdg(seqidno:187)具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，所述靶向配体包括如seqidno:187所示氨基酸序列。

在一些实施方案中，用于靶向脑部的靶向配体包括来自狂犬病病毒糖蛋白(rvg)的氨基酸序列(例如，ytiwmpenprpgtpcdiftnsrgkrasngggg(seqidno:183))。在一些此类情况下，所述靶向配体包括与如seqidno:183所示的氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。对于任何靶向配体(如本文其他地方所述)，rvg可以与锚定结构域(例如，9r肽序列)缀合和/或融合。例如，用作主题纳米颗粒的表面涂层的一部分的主题递送分子可包括序列ytiwmpenprpgtpcdiftnsrgkrasnggggrrrrrrrrr(seqidno:180)。

在一些情况下，根据本公开的靶向配体提供与c-kit受体的靶向结合。在一些此类情况下，所述靶向配体包括与如seqidno:184所示的氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，所述靶向配体包括如seqidno:184所示氨基酸序列。

在一些情况下，根据本发明的靶向配体提供与cd27的靶向结合。在一些此类情况下，所述靶向配体包括与如seqidno:185所示的氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，所述靶向配体包括如seqidno:185所示氨基酸序列。

在一些情况下，根据本发明的靶向配体提供与cd150的靶向结合。在一些这种情况下，所述靶向配体包括与如seqidno:186所示的氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性(例如，90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或者100％的序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，靶向配体包含seqidno:186所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，靶向配体提供与klscd27+/il-7ra-/cd150+/cd34-造血干细胞和祖细胞(hspc)的靶向结合。例如，可以引入基因编辑工具(本文其它地方所描述的)以破坏bcl11a转录因子的表达并且因此产生胎儿血红蛋白。作为另一个实例，可以直接靶向β-珠蛋白(hbb)基因以用对应的同源定向修复供体模板校正改变的e7v取代。作为一个说明性实例crispr/casrna指导的多肽(例如，cas9，casx，casy，cpf1)可以与适当的引导rna一起递送，使得其将与hbb基因上的位点结合并且在基因组中产生双链或单链断裂，启动基因组修复。在一些情况下，引入dna供体模板(单链或双链)(作为有效负载的一部分)并释放14-30天，同时可以在1-7天的过程中释放指导rna/crispr/cas蛋白复合物(核糖核蛋白复合物)。在一些情况下，有效负载可以包含用于ku70或ku80的sirna，例如，所述sirna可以用于促进同源定向修复(hdr)并且限制插入缺失形成。在一些情况下，用于sirt6的mrna在14-30d内释放以在核酸酶介导的位点特异性切割之后促进hdr驱动的供体链的插入。

在一些实施方案中，靶向配体提供与cd4+或cd8+t细胞、造血干细胞和祖细胞(hspc)或外周血单核细胞(pbmc)的靶向结合，以修饰t细胞受体。例如，可以引入一个或多个基因编辑工具(本文其它地方所描述的)以修饰t细胞受体。可以直接靶向并且用对应的同源定向修复供体模板取代t细胞受体以形成新型t细胞受体。作为一个实例，crispr/casrna引导的多肽(例如，cas9，casx，casy，cpf1)可以与适当的引导rna一起递送，使得其将与tcr基因上的位点结合并且在基因组中产生双链或单链断裂，启动基因组修复。在一些情况下，引入用于hdr的dna供体模板(单链或双链)(作为有效负载的一部分)。对于技术人员而言将显而易见的是，可以根据本公开使用其它crispr引导rna和hdr供体序列、靶向β-珠蛋白、ccr5、t细胞受体或任何其它目的基因和/或其它表达载体。

还提供了具有两种不同肽序列的递送分子，所述递送分子一起构成靶向配体。例如，在一些情况下，靶向配体是二价的(例如，异二价的)。在一些情况下，细胞穿透肽和/或硫酸肝素蛋白多糖结合配体与本公开的任何靶向配体一起用作异二价内吞触发物。异二价靶向配体可以包含来自靶向配体中的一个靶向配体的亲和序列以及来自不同靶向配体的正构结合序列(例如，已知与期望的内吞运输途径接合的一个正构结合序列)。

锚定结构域

在一些实施方案中，表面涂层包括递送分子，递送分子包括与锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)缀合的靶向配体(参见例如图10，图a-b)。在一些情况下，靶向配体与靶向配体的活性区远端的锚定结构域(或接头)缀合，例如，以保持活性。锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)可包括重复阳离子残基(例如，精氨酸、赖氨酸、组氨酸)。在一些情况下，阳离子锚定结构域的长度范围为3到30个氨基酸(例如，3-28个、3-25个、3-24个、3-20个、4-30个、4-28个、4-25个、4到24个或4-20个氨基酸)。在一些情况下，阳离子锚定结构域的长度范围为4到24个氨基酸。锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)的合适实例包括但不限于：rrrrrrrrr(9r)(seqidno:15)和hhhhhh(6h)(seqidno:16)。

在一些情况下，主题递送分子的锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)用作锚以用递送分子涂覆纳米颗粒表面，例如，使得靶向配体用于将纳米颗粒靶向到预期的细胞/细胞表面蛋白(参见，例如，图8、图9和图10)。因此，在一些情况下，锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)与纳米颗粒的带电可脱落层以静电方式相互作用。在一些情况下，稳定层具有负电荷并且因此带正电荷的锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)可以与稳定层相互作用，有效地将递送分子锚定到纳米颗粒并且用主题靶向配体涂覆纳米颗粒表面(参见，例如，图8、图9和图10)。

靶向配体与锚定结构域的缀合可以通过任何方便的技术完成并且多种不同的缀合化学将是本领域普通技术人员所知晓的。在一些情况下，缀合是通过巯基化学(例如，二硫键)。在一些情况下，使用胺反应性化学(例如，来自锚定结构域中的氨基酸残基的侧链上存在的胺)完成缀合。如上所述，靶向配体可包括可促进缀合的半胱氨酸残基。同样地，锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)可以包括可以促进缀合的半胱氨酸残基。在一些情况下，靶向配体和锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)通过作为相同多肽的一部分而缀合。

接头

在一些实施方案中，根据本公开的靶向配体通过插入接头与锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)缀合(例如，参见图10)。接头可以是蛋白接头或非蛋白接头。在一些情况下，接头可以有助于稳定性，防止补体活化，和/或相对于锚定结构域为配体提供柔性。

靶向配体与接头或接头与锚定结构域的缀合可以以多种不同的方式完成。在一些情况下，缀合是通过巯基化学(例如，二硫键；例如，在两个半胱氨酸残基之间；例如，参见图10)。在一些情况下，使用胺反应性化学完成缀合。在一些情况下，靶向配体包括半胱氨酸残基并通过半胱氨酸残基与接头缀合；和/或锚定结构域包括半胱氨酸残基并通过半胱氨酸残基与接头缀合。在一些情况下，接头是肽接头并且包括半胱氨酸残基。在一些情况下，靶向配体和肽接头由于是相同多肽的一部分而缀合；和/或锚定结构域和肽接头由于是相同多肽的一部分而缀合。

在一些情况下，主题接头是多肽并且可以称为多肽接头。应当理解，虽然考虑了多肽接头，但在一些情况下使用非多肽接头(化学接头)。例如，在一些实施方案中，接头是聚乙二醇(peg)接头。合适的蛋白接头包括长度为4个氨基酸至60个氨基酸之间(例如，长度为4-50、4-40、4-30、4-25、4-20、4-15、4-10、6-60、6-50、6-40、6-30、6-25、6-20、6-15、6-10、8-60、8-50、8-40、8-30、8-25、8-20或8-15个氨基酸)的多肽。

在一些实施方案中，主题接头是刚性的(例如，包含一个或多个脯氨酸残基的接头)。刚性接头的一个非限制性实例是gapgapgap(seqidno:17)。在一些情况下，多肽接头在n-或c-末端包含c残基。因此，在一些情况下，刚性接头选自：gapgapgapc(seqidno:18)和cgapgapgap(seqidno:19)。

可以使用具有一定柔性的肽接头。因此，在一些情况下，主题接头是柔性的。连接肽实际上可以具有任何氨基酸序列，记住：柔性接头将具有产生一般柔性肽的序列。使用小氨基酸如甘氨酸和丙氨酸可用于产生柔性肽。此类序列的产生对于本领域技术人员来说是常规的。各种不同接头可商购并且被认为适于使用。示例接头多肽包含甘氨酸聚合物(g)n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(包含例如(gs)n、gsggsn(seqidno:20)、ggsggsn(seqidno:21)和gggsn(seqidno:22)，其中n是至少为一的整数)；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物。示例接头可包含氨基酸序列，包括但不限于ggsg(seqidno:23)、ggsgg(seqidno:24)、gsgsg(seqidno:25)、gsggg(seqidno:26)、gggsg(seqidno:27)、gsssg(seqidno:28)等。普通技术人员将认识到，与上文描述的任何要素缀合的肽的设计可以包含完全或部分柔性的接头，使得所述接头可以包含柔性接头以及赋予较少柔性结构的一个或多个部分。柔性接头的其他实例包括但不限于：gggggsggggg(seqidno:29)和gggggsggggs(seqidno:30)。如上文所提到的，在一些情况下，多肽接头在n-末端和/或c-末端处包含c残基。因此，在一些情况下，柔性接头包含选自以下的氨基酸序列：gggggsgggggc(seqidno:31)、cgggggsggggg(seqidno:32)、gggggsggggsc(seqidno:33)和cgggggsggggs(seqidno:34)。

在一些情况下，主题多肽接头是内体溶解性的。内体溶解性多肽接头包括但不限于：kala(seqidno:35)和gala(seqidno:36)。如上所述，在一些情况下，多肽接头在n-或c-末端包含c残基。因此，在一些情况下，主题接头包括选自以下的氨基酸序列：ckala(seqidno:37)、kalac(seqidno:38)、cgala(seqidno:39)和galac(seqidno:40)。

巯基偶联反应的说明性实例

(例如，用于经由巯基化学，例如，使用半胱氨酸残基进行缀合)

(例如，用于将靶向配体缀合至接头，将靶向配体缀合至锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)，将接头缀合至锚定域(例如，阳离子锚定结构域)等)

二硫键

在还原状态下包含游离巯基的半胱氨酸残基在典型的二硫化物交换反应中容易与受保护的硫醇形成二硫键。

硫醚/硫酯键

半胱氨酸的巯基与马来酰亚胺和酰卤基团反应，分别形成稳定的硫醚和硫酯键。

马来酰亚胺

酰卤

叠氮化物-炔烃环加成

通过使半胱氨酸残基包含炔键的化学修饰或通过在合成肽制剂中使用l-炔丙基半胱氨酸(如下图所示)来促进这种缀合。然后借助cu促进的点击化学实现偶联。

靶向配体的实例

靶向配体的实例包括但不限于包括以下氨基酸序列的那些：

scf(靶向/结合c-kit受体)

egicrnrvtnnvkdvtklvanlpkdymitlkyvpgmdvlpshcwisemvvqlsdsltdlldkfsniseglsnysiidklvnivddlvecvkensskdlkksfkspeprlftpeeffrifnrsidafkdfvvasetsdcvvsstlspekdsrvsvtkpfmlppva(seqidno:184)；

cd70(靶向/结合cd27)

peegsgcsvrrrpygcvlraalvplvaglviclvvciqrfaqaqqqlpleslgwdvaelqlnhtgpqqdprlywqggpalgrsflhgpeldkgqlrihrdgiymvhiqvtlaicssttasrhhpttlavgicspasrsisllrlsfhqgctiasqrltplargdtlctnltgtllpsrntdetffgvqwvrp(seqidno:185)；和

含sh2结构域的蛋白1a(sh2d1a)(靶向/结合

cd150)ssglvprgshmdavavyhgkisretgeklllatgldgsyllrdsesvpgvyclcvlyhgyiytyrvsqtetgswsaetapgvhkryfrkiknlisafqkpdqgiviplqypvekkssarstqgttgiredpdvclkap(seqidno:186)

因此，靶向配体的非限制性实例(可单独使用或与其他靶向配体组合使用)包括：

9r-scf

rrrrrrrrrmegicrnrvtnnvkdvtklvanlpkdymitlkyvpgmdvlpshcwisemvvqlsdsltdlldkfsniseglsnysiidklvnivddlvecvkensskdlkksfkspeprlftpeeffrifnrsidafkdfvvasetsdcvvsstlspekdsrvsvtkpfmlppva(seqidno:189)

9r-cd70

rrrrrrrrrpeegsgcsvrrrpygcvlraalvplvaglviclvvciqrfaqaqqqlpleslgwdvaelqlnhtgpqqdprlywqggpalgrsflhgpeldkgqlrihrdgiymvhiqvtlaicssttasrhhpttlavgicspasrsisllrlsfhqgctiasqrltplargdtlctnltgtllpsrntdetffgvqwvrp(seqidno:190)

cd70-9r

peegsgcsvrrrpygcvlraalvplvaglviclvvciqrfaqaqqqlpleslgwdvaelqlnhtgpqqdprlywqggpalgrsflhgpeldkgqlrihrdgiymvhiqvtlaicssttasrhhpttlavgicspasrsisllrlsfhqgctiasqrltplargdtlctnltgtllpsrntdetffgvqwvrprrrrrrrrr(seqidno:191)

6h-sh2d1a

mgsshhhhhhssglvprgshmdavavyhgkisretgeklllatgldgsyllrdsesvpgvyclcvlyhgyiytyrvsqtetgswsaetapgvhkryfrkiknlisafqkpdqgiviplqypvekkssarstqgttgiredpdvclkap(seqidno:192)

6h-sh2d1a

rrrrrrrrrssglvprgshmdavavyhgkisretgeklllatgldgsyllrdsesvpgvyclcvlyhgyiytyrvsqtetgswsaetapgvhkryfrkiknlisafqkpdqgiviplqypvekkssarstqgttgiredpdvclkap(seqidno:193)

递送分子和组分的说明性实例

(0a)半胱氨酸缀合锚1(cca1)

[锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)-接头(gapgapgap)-半胱氨酸]

rrrrrrrrrgapgapgapc(seqidno:41)

(0b)半胱氨酸缀合锚2(cca2)

[半胱氨酸-接头(gapgapgap)-锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)]

cgapgapgaprrrrrrrrr(seqidno:42)

(1a)α5β1配体

[锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)-接头(gapgapgap)-靶向配体]

rrrrrrrrrgapgapgaprretawa(seqidno:45)

(1b)α5β1配体

[靶向配体-接头(gapgapgap)-锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)]

rretawagapgapgaprrrrrrrrr(seqidno:46)

(1c)α5β1配体-cys左

cgapgapgap(seqidno:19)

注意：这可以通过巯基化学(例如，二硫键)或胺反应性化学缀合到cca1(参见上文)。

(1d)α5β1配体-cys右

gapgapgapc(seqidno:18)

注意：这可以通过巯基化学(例如，二硫键)或胺反应性化学缀合到cca2(参见上文)。

(2a)rgdα5β1配体

[锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)-接头(gapgapgap)-靶向配体]

rrrrrrrrrgapgapgaprgd(seqidno:47)

(2b)rgda5b1配体

[靶向配体-接头(gapgapgap)-锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)]

rgdgapgapgaprrrrrrrrr(seqidno:48)

(2c)rgd配体-cys左

crgd(seqidno:49)

注意：这可以通过巯基化学(例如，二硫键)或胺反应性化学缀合到cca1(参见上文)。

(2d)rgd配体-cys右

rgdc(seqidno:50)

注意：这可以通过巯基化学(例如，二硫键)或胺反应性化学缀合到cca2(参见上文)。

(3a)转铁蛋白配体

[锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)-接头(gapgapgap)-靶向配体]

rrrrrrrrrgapgapgapthrppmwspvwp(seqidno:51)

(3b)转铁蛋白配体

[靶向配体-接头(gapgapgap)-锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)]

thrppmwspvwpgapgapgaprrrrrrrrr(seqidno:52)

(3c)转铁蛋白配体-cys左

cthrppmwspvwp(seqidno:53)

cpthrppmwspvwp(seqidno:54)

注意：这可以通过巯基化学(例如，二硫键)或胺反应性化学缀合到cca1(参见上文)。

(3d)转铁蛋白配体-cys右

thrppmwspvwpc(seqidno:55)

注意：这可以通过巯基化学(例如，二硫键)或胺反应性化学缀合到cca2(参见上文)。

(4a)e-选择蛋白配体[1-21]

[锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)-接头(gapgapgap)-靶向配体]

rrrrrrrrrgapgapgapmiasqflsaltlvllikesga(seqidno:56)

(4b)e-选择蛋白配体[1-21]

[靶向配体-接头(gapgapgap)-锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)]

miasqflsaltlvllikesgagapgapgaprrrrrrrrr(seqidno:57)

(4c)e-选择蛋白配体[1-21]-cys左

cmiasqflsaltlvllikesga(seqidno:58)

注意：这可以通过巯基化学(例如，二硫键)或胺反应性化学缀合到cca1(参见上文)。

(4d)e-选择蛋白配体[1-21]-cys右

miasqflsaltlvllikesgac(seqidno:59)

注意：这可以通过巯基化学(例如，二硫键)或胺反应性化学缀合到cca2(参见上文)。

(5a)fgf片段[26-47]

[锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)-接头(gapgapgap)-靶向配体]

rrrrrrrrrgapgapgapknggfflrihpdgrvdgvreks(seqidno:60)

注意：这可以通过巯基化学(例如，二硫键)或胺反应性化学缀合到cca1(参见上文)。

(5b)fgf片段[26-47]

[靶向配体-接头(gapgapgap)-锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)]

knggfflrihpdgrvdgvreksgapgapgaprrrrrrrrr(seqidno:61)

注意：这可以通过巯基化学(例如，二硫键)或胺反应性化学缀合到cca1(参见上文)。

(5c)fgf片段[25-47]-左边的半胱氨酸是天然的。

cknggfflrihpdgrvdgvreks(seqidno:43)

注意：这可以通过巯基化学(例如，二硫键)或胺反应性化学缀合到cca1(参见上文)。

(5d)fgf片段[26-47]-cys右

knggfflrihpdgrvdgvreksc(seqidno:44)

注意：这可以通过巯基化学(例如，二硫键)或胺反应性化学缀合到cca2(参见上文)。

(6a)毒蜥外泌肽(s11c)[1-39]

hgegtftsdlckqmeeeavrlfiewlknggpssgappps(seqidno:2)

注意：这可以通过巯基化学(例如，二硫键)或胺反应性化学缀合到cca1(参见上文)。

多价表面涂层

在一些情况下，表面涂层包括以下中的任何一种或多种(以任何所需组合)：(i)一种或多种上述聚合物，(ii)一种或多种靶向配体，一种或多种cpp和一种或多种七肽。例如，在一些情况下，表面涂层可包括一种或多种(例如，两种或更多种，三种或更多种)靶向配体，但也可包括一种或多种上述阳离子聚合物。在一些情况下，表面涂层可包括一种或多种(例如，两种或更多种，三种或更多种)靶向配体，但也可包括一种或多种cpp。

在一些情况下，表面涂层包含提供与cd34和硫酸肝素蛋白多糖的靶向结合的靶向配体的组合。例如，聚(l-精氨酸)可以用作表面涂层的一部分以提供与硫酸肝素蛋白多糖的靶向结合。因此，在一些情况下，在用阳离子聚合物(例如，聚(l-精氨酸))表面涂覆纳米颗粒之后，将有涂层的纳米颗粒与透明质酸一起温育，从而形成两性离子和多价表面。

在一些实施方案中，表面涂层是多价的。多价表面涂层是包含两种或更多种靶向配体(例如，包含不同配体的两种或更多种递送分子)的组合物。多聚体(在这种情况下为三聚体)表面涂层(外壳)的实例是包含靶向配体干细胞因子(scf)(其靶向c-kit受体，也称为cd117)、cd70(其靶向cd27)和含sh2结构域的蛋白1a(sh2d1a)(其靶向cd150)的表面涂层。例如，在一些情况下，对于靶向造血干细胞(hsc)[kls(c-kit⁺lin^-sca-1⁺)和cd27⁺/il-7ra^-/cd150⁺/cd34^-]，主题纳米颗粒包含表面涂层，所述表面涂层包含分别靶向c-kit、cd27和cd150的靶向配体scf、cd70和含sh2结构域蛋白1a(sh2d1a)的组合物(参见，例如，表1)。在一些情况下，此类表面涂层可以选择性地靶向其它淋巴和骨髓祖细胞上的hspc和长期hsc(c-kit+/lin-/sca-1+/cd27+/il-7ra-/cd150+/cd34-)。

在一些示例性实施方案中，所有三种靶向配体(scf、cd70和sh2d1a)通过与阳离子锚定结构域(例如，诸如6h的聚组氨酸，诸如9r的聚精氨酸，等等)融合而锚定至纳米颗粒。例如，(1)靶向多肽scf(其靶向c-kit受体)可以包含xmegicrnrvtnnvkdvtklvanlpkdymitlkyvpgmdvlpshcwisemvvqlsdsltdlldkfsniseglsnysiidklvnivddlvecvkensskdlkksfkspeprlftpeeffrifnrsidafkdfvvasetsdcvvsstlspekdsrvsvtkpfmlppvax(seqidno:194)，其中x是阳离子锚定结构域(例如，诸如6h的聚组氨酸、诸如9r的聚精氨酸等)，例如，x在某些情况下可以存在于n-末端和/或c-末端处或者可以嵌入多肽序列中；(2)靶向多肽cd70(其靶向cd27)可以包含xpeegsgcsvrrrpygcvlraalvplvaglviclvvciqrfaqaqqqlpleslgwdvaelqlnhtgpqqdprlywqggpalgrsflhgpeldkgqlrihrdgiymvhiqvtlaicssttasrhhpttlavgicspasrsisllrlsfhqgctiasqrltplargdtlctnltgtllpsrntdetffgvqwvrpx(seqidno:195)，其中x是阳离子锚定结构域(例如，诸如6h的聚组氨酸、诸如9r的聚精氨酸等)，例如，x在某些情况下可以存在于n-末端和/或c-末端处或者可以嵌入多肽序列中；以及(3)靶向多肽sh2d1a(其靶向cd150)可以包含xssglvprgshmdavavyhgkisretgeklllatgldgsyllrdsesvpgvyclcvlyhgyiytyrvsqtetgswsaetapgvhkryfrkiknlisafqkpdqgiviplqypvekkssarstqgttgiredpdvclkap(seqidno:196)，其中x是阳离子锚定结构域(例如，诸如6h的聚组氨酸、诸如9r的聚精氨酸等)，例如，x在某些情况下可以存在于n-末端和/或c-末端处或者可以嵌入多肽序列(例如，如mgssxssglvprgshmdavavyhgkisretgeklllatgldgsyllrdsesvpgvyclcvlyhgyiytyrvsqtetgswsaetapgvhkryfrkiknlisafqkpdqgiviplqypvekkssarstqgttgiredpdvclkap(seqidno:197))中。

如上所述，本公开的纳米颗粒可以包括多个靶向配体(作为表面涂层的一部分)，以便靶向所需细胞类型，或者靶向所需细胞类型的组合。在图17(图a-b)中描绘了小鼠和人造血细胞谱系中的目标细胞的实例，以及对于那些细胞已经鉴定的标志物。例如，目标细胞表面标志物的各种组合包括但不限于：[小鼠](i)cd150；(ii)sca1，ckit，cd150；(iii)cd150和cd49b；(iv)sca1、ckit、cd150和cd49b；(v)cd150和flt3；(vi)sca1、ckit、cd150和flt3；(vii)flt3和cd34；(viii)flt3、cd34、sca1和ckit；(ix)flt3和cd127；(x)sca1、ckit、flt3和cd127；(xi)cd34；(xii)ckit和cd34；(xiii)cd16/32和cd34；(xiv)ckit、cd16/32和cd34；和(xv)ckit；以及[人](i)cd90和cd49f；(ii)cd34，cd90和cd49f；(iii)cd34；(iv)cd45ra和cd10；(v)cd34，cd45ra和cd10；(vi)cd45ra和cd135；(vii)cd34、cd38、cd45ra和cd135；(viii)cd135；(ix)cd34、cd38和cd135；和(x)cd34和cd38。因此，在一些情况下，表面涂层包括提供与表面蛋白或表面蛋白的组合的靶向结合的一种或多种靶向配体，所述一种或多种靶向配体选自：[小鼠](i)cd150；(ii)sca1，ckit，cd150；(iii)cd150和cd49b；(iv)sca1、ckit、cd150和cd49b；(v)cd150和flt3；(vi)sca1、ckit、cd150和flt3；(vii)flt3和cd34；(viii)flt3、cd34、sca1和ckit；(ix)flt3和cd127；(x)sca1、ckit、flt3和cd127；(xi)cd34；(xii)ckit和cd34；(xiii)cd16/32和cd34；(xiv)ckit、cd16/32和cd34；和(xv)ckit；以及[人](i)cd90和cd49f；(ii)cd34，cd90和cd49f；(iii)cd34；(iv)cd45ra和cd10；(v)cd34，cd45ra和cd10；(vi)cd45ra和cd135；(vii)cd34、cd38、cd45ra和cd135；(viii)cd135；(ix)cd34、cd38和cd135；和(x)cd34和cd38。因为主题纳米颗粒可以包含多于一种靶向配体，并且因为一些细胞包含重叠标记，所以可以使用表面涂层的组合靶向多种不同的细胞类型，例如，在一些情况下，表面涂层可以靶向一种特定细胞而在其它情况下，表面涂层可以靶向多于一种特定细胞类型(例如，2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种细胞类型)。例如，可以靶向造血谱系内的任何细胞组合。作为说明性实例，靶向cd34(使用提供与cd34的靶向结合的靶向配体)可以导致纳米颗粒将有效负载递送到造血谱系内的若干不同细胞(参见，例如图17，图a和b)。

iv.递送

提供了将核酸、蛋白或核糖核蛋白有效负载递送到细胞的方法。如上所述，在一些情况下，有效负载包含基因编辑工具。因此，在一些情况下，使用主题方法来进行位点特异性基因组编辑，其在一些情况下，例如，当在供体dna模板的存在下进行时，导致同源定向修复。

此类方法包括使细胞与主题纳米颗粒(或主题病毒或非病毒递送载体)接触的步骤。主题纳米颗粒(或主题病毒或非病毒递送载体)可用于将有效负载递送至任何预期的真核靶细胞。在一些情况下，靶细胞是哺乳动物细胞(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、有蹄动物、牛、羊、猪、马、骆驼、兔子、犬(狗)、猫科动物(猫)、灵长类动物、非人类灵长类动物或人的细胞)。任何细胞类型都可以被靶向，并且在一些情况下，特定细胞的特异性靶向取决于靶向配体的存在，例如作为表面涂层的一部分，其中靶向配体提供与特定细胞类型的靶向结合。例如，可以靶向的细胞包含但不限于骨髓细胞、造血干细胞(hsc)、长期hsc、短期hsc、造血干细胞和祖细胞(hspc)、外周血单核细胞(pbmc)、骨髓祖细胞、淋巴祖细胞、t细胞、b细胞、nkt细胞、nk细胞、树突细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞、巨核细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、红系祖细胞(例如，hudep细胞)、巨核细胞-红系祖细胞(mep)、共同髓系祖细胞(cmp)、多能祖细胞(mpp)、造血干细胞(hsc)，短期hsc(st-hsc)、it-hsc、长期hsc(lt-hsc)、内皮细胞、神经细胞、星形胶质细胞、胰腺细胞、胰岛β细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞、脂肪细胞、肠细胞、结肠细胞和胃细胞。

各种应用的实例(例如，用于靶向神经元、胰腺细胞、造血干细胞和多能祖细胞等)在上文中，例如，在靶向配体的上下文进行了讨论。例如，可以靶向造血干细胞和多能祖细胞以进行体内基因编辑(例如，插入)。甚至在体内编辑1％的骨髓细胞(约150亿个细胞)将比离体治疗(约100亿个细胞)靶向更多的细胞。作为另一个实例，可以靶向胰腺细胞(例如，β胰岛细胞)，例如，以治疗胰腺癌、治疗糖尿病等。作为另一个实例，可以靶向如神经细胞等大脑中的体细胞，(例如，以治疗如亨廷顿病、帕金森病(例如，lrrk2突变)和als(例如，sod1突变)等适应症)。在一些情况下，这可以通过直接颅内注射来实现。

作为另一个实例，可以用主题纳米颗粒(或主题病毒或非病毒递送载体)靶向内皮细胞和造血系统的细胞(例如，巨核细胞和/或巨核细胞上游的任何祖细胞，如巨核细胞-红系祖细胞(mep)、共同髓系祖细胞(cmp)、多能祖细胞(mpp)、造血干细胞(hsc)、短期hsc(st-hsc)、it-hsc、长期hsc(lt-hsc)-参见，例如图17)以治疗冯·维勒布兰德氏病。例如，可以靶向在编码冯·维勒布兰德因子(vwf)的基因中具有突变的细胞(例如，内皮细胞；巨核细胞和/或巨核细胞上游的任何祖细胞，如mep、cmp、mpp、hsc(如st-hsc、it-hsc和/或lt-hsc))以引入活性蛋白(例如，通过递送功能性vwf蛋白和/或编码功能性vwf蛋白的核酸)和/或以编辑突变基因，例如，通过引入替代序列(例如，通过递送基因编辑工具并且递送dna供体模板)。在以上一些情况下(例如，在与治疗冯维勒布兰德氏病相关的情况下；在与靶向在编码vwf的基因中具有突变的细胞相关的情况下)，主题靶向配体提供与e-选择蛋白的靶向结合。

作为另一个实例，可以用主题纳米颗粒(或主题病毒或非病毒递送载体)靶向干细胞谱系的细胞(例如，造血谱系的干细胞和/或祖细胞，例如，gmp、mep、cmp、mlp、mpp和/或hsc)以增加细胞中干细胞因子(scf)的表达，其因此可以驱动靶细胞的增殖。例如，主题纳米颗粒(或主题病毒或非病毒递送载体)可用于将scf和/或编码scf的核酸(dna或mrna)递送至靶细胞。

本公开的方法和组合物可以用于治疗任何数量的疾病，包含与例如基因组中的突变等已知致病突变相关的任何疾病。例如，本公开的方法和组合物可以用于治疗镰状细胞病、β地中海贫血、hiv、骨髓增生异常综合征、jak2介导的真性红细胞增多症、jak2介导的原发性骨髓纤维化、jak2介导的白血病以及各种血液病。作为另外的非限制性实例，本公开的方法和组合物还可以用于b细胞抗体产生、免疫疗法(例如，递送检查点阻断试剂)以及干细胞分化应用。

如上文所提到的，在一些实施例中，靶向配体提供与klscd27+/il-7ra-/cd150+/cd34-造血干细胞和祖细胞(hspc)的靶向结合。例如，可以引入基因编辑工具(本文其它地方所描述的)以破坏bcl11a转录因子的表达并且因此产生胎儿血红蛋白。作为另一个实例，可以直接靶向β-珠蛋白(hbb)基因以用对应的同源定向修复供体模板校正改变的e7v取代。作为一个说明性实例crispr/casrna指导的多肽(例如，cas9、casx、casy、cpf1)可以与适当的指导rna一起递送，使得其将与hbb基因上的位点结合并且在基因组中产生双链或单链断裂，启动基因组修复。在一些情况下，引入dna供体模板(单链或双链)(作为有效负载的一部分)并释放14-30天，同时可以在1-7天的过程中释放指导rna/crispr/cas蛋白复合物(核糖核蛋白复合物)。在一些情况下，有效负载可以包含用于ku70或ku80的sirna，例如，所述sirna可以用于促进同源定向修复(hdr)并且限制插入缺失形成。在一些情况下，用于sirt6的mrna在14-30d内释放以在核酸酶介导的位点特异性切割之后促进hdr驱动的供体链的插入。

在一些实施方案中，靶向配体提供与cd4+或cd8+t细胞、造血干细胞和祖细胞(hspc)或外周血单核细胞(pbmc)的靶向结合，以修饰t细胞受体。例如，可以引入一个或多个基因编辑工具(本文其它地方所描述的)以修饰t细胞受体。可以直接靶向并且用对应的同源定向修复供体模板取代t细胞受体以形成新型t细胞受体。作为一个实例，crispr/casrna引导的多肽(例如，cas9，casx，casy，cpf1)可以与适当的引导rna一起递送，使得其将与tcr基因上的位点结合并且在基因组中产生双链或单链断裂，启动基因组修复。在一些情况下，引入用于hdr的dna供体模板(单链或双链)(作为有效负载的一部分)。对于技术人员而言将显而易见的是，可以根据本公开使用其它crispr引导rna和hdr供体序列、靶向β-珠蛋白、ccr5、t细胞受体或任何其它目的基因和/或其它表达载体。

在一些情况下，使细胞与主题纳米颗粒(或主题病毒或非病毒递送载体)接触时，接触是体外的(例如，细胞处于培养中)，例如，细胞可以是已建立的组织培养细胞系的细胞。在一些情况下，接触是离体的(例如，细胞是从个体(例如患者)分离的原代细胞(或近后代)。在一些情况下，细胞是体内的并且因此在生物体的(部分的)内部。作为体内接触的实例，在一些情况下，接触步骤包括向个体施用主题纳米颗粒(或主题病毒或非病毒递送载体)。

可以经由以下途径中的任何一种将主题纳米颗粒(或主题病毒或非病毒递送载体)引入到受试者体内(即，施用给个体)：全身的、局部的、肠胃外的、皮下的(s.c.)、静脉内的(i.v.)、颅内的(i.c.)、脊柱内的、眼内的、皮内的(i.d.)、肌肉内的(i.m.)、淋巴管内的(i.l.)或进入脊髓液。可以通过注射(例如，全身注射、直接局部注射、局部注射到或接近肿瘤和/或肿瘤切除部位等)导管等引入主题纳米颗粒(或主题病毒或非病毒递送载体)。用于局部递送(例如，递送到肿瘤和/或癌症部位)的方法的实例包含例如通过推注，例如，通过注射器，例如，注射到关节、肿瘤或器官中，或者在关节、肿瘤或器官附近；例如，通过连续输注，例如，通过插管，例如，用对流(参见，例如，美国申请第20070254842号，通过引用并入本文)。

对受试者的治疗施用次数可以变化。将主题纳米颗粒(或主题病毒或非病毒递送载体)引入个体可以是一次性事件；但在某些情况下，这种治疗可能会在一段有限的时间内引起改善并且需要进行一系列持续的重复治疗。在其它情况下，在观察到效果之前，可能需要多次施用主题纳米颗粒(或主题病毒或非病毒递送载体)。如本领域普通技术人员将容易理解的，确切的方案取决于疾病或病症、疾病的阶段和所治疗的个体的参数。

“治疗有效剂量”或“治疗剂量”是足以产生期望的临床结果(即，实现治疗效果)的量。治疗有效剂量可以以一次或多次施用进行施用。出于本公开的目的，主题纳米颗粒(或主题病毒或非病毒递送载体)的治疗有效剂量是当向个体施用时，足以减轻、改善、稳定、逆转、防止、减缓或延迟疾病状态/病痛的进展的量。

除了去除已经整合到宿主基因组中的任何逆转录病毒dna之外，示例治疗性干预是产生对hiv感染的抗性的干预。t细胞直接受hiv影响并且因此可以探索cd34+和cd45+细胞的混合血液靶向策略以递送双引导核酸酶。通过同时靶向hsc和t细胞并且通过多个引导核酸酶(例如，在单个颗粒内)向ccr5-δ32和gag/rev/pol基因递送消融，可以通过患者生命的持久性产生通用的hiv疗法。

v.共同递送(不一定是本公开的纳米颗粒)

如上所述，将多种有效负载作为相同包装的一部分递送的一个优点是每种有效负载的效率不被削弱。因此，在一些实施方案中，一种或多种基因编辑工具(例如，如上所述)与蛋白(和/或编码蛋白的dna或mrna)和/或提高基因组编辑效率的非编码rna组合(例如，作为相同包装/递送载体的一部分，其中递送载体不需要是本公开的纳米颗粒)递送。在一些实施方案中，一种或多种基因编辑工具与蛋白(和/或编码蛋白的dna或mrna)和/或控制细胞分裂和/或分化的非编码rna组合(例如，作为相同包装/递送载体的一部分，其中递送载体不需要是本公开的纳米颗粒)递送。例如，在一些情况下，一种或多种基因编辑工具与蛋白(和/或编码蛋白的dna或mrna)和/或控制细胞分裂的非编码rna组合(例如，作为相同包装/递送载体的一部分，其中递送载体不需要是本公开的纳米颗粒)递送。在一些情况下，一种或多种基因编辑工具与蛋白(和/或编码蛋白的dna或mrna)和/或控制分化的非编码rna组合(例如，作为相同包装/递送载体的一部分，其中递送载体不需要是本公开的纳米颗粒)递送。在一些情况下，一种或多种基因编辑工具与蛋白(和/或编码蛋白的dna或mrna)和/或使细胞dna修复机制偏向非同源末端连接(nhej)或同源定向修复(hdr)的非编码rna组合(例如，作为相同包装/递送载体的一部分，其中递送载体不需要是本公开的纳米颗粒)递送。

如上所述，在一些情况下，递送载体不需要是本公开的纳米颗粒。例如，在一些情况下，递送载体是病毒的，并且在一些情况下，递送载体是非病毒的。非病毒递送系统的实例包括可用于使多种核酸有效负载，或蛋白和核酸有效负载的组合共凝聚的材料。实例包括但不限于：(1)基于脂质的颗粒诸如两性或阳离子脂质，和外来体或外来体来源的囊泡；(2)无机/杂化复合颗粒，诸如包括与核酸和/或蛋白有效负载共凝聚的离子复合物，以及可以从ca、mg、si、fe的阳离子离子态和生理阴离子如o^2-、oh、po4^3-、so4^2-凝聚的复合物的那些；(3)碳水化合物递送载体如环糊精和/或藻酸盐；(4)聚合物和/或共聚物复合物，如基于聚(氨基酸)的静电复合物、聚(酰胺-胺)和阳离子聚(b-氨基酯)；(5)病毒样颗粒(例如，基于蛋白和核酸的)，诸如li2016人工病毒。病毒递送系统的实例包括但不限于：aav、腺病毒、逆转录病毒和慢病毒。

用于共同递送的有效负载的实例

在一些实施方案中，一种或多种基因编辑工具可以与以下一种或多种组合(例如，作为相同包装/递送载体的一部分，其中递送载体不需要是本公开的纳米颗粒)递送：scf(和/或编码scf的dna或mrna)、hoxb4(和/或编码hoxb4的dna或mrna)、bcl-xl(和/或编码bcl-xl的dna或mrna)、sirt6(和/或编码sirt6的dna或mrna)、抑制mir-155的核酸分子(例如，sirna和/或lna)、降低ku70表达的核酸分子(例如，sirna、shrna、微rna)和降低ku80表达的核酸分子(例如，sirna、shrna、微rna)。

对于可以一起递送的微rna(作为rna递送或作为编码rna的dna递送)的实例，参见图18a。例如，以下微rna可用于以下目的：用于阻断多能干细胞向外胚层谱系的分化：mir-430/427/302；用于阻断多能干细胞向内胚层谱系的分化：mir-109和/或mir-24；用于驱动多能干细胞向内胚层谱系的分化：mir-122和/或mir-192；用于驱动外胚层祖细胞向角化细胞命运的分化：mir-203；用于驱动神经嵴干细胞向平滑肌命运的分化：mir-145；用于驱动神经干细胞向神经胶质细胞命运和/或神经元命运的分化：mir-9和/或mir-124a；用于阻断中胚层祖细胞向软骨细胞命运的分化：mir-199a；用于驱动中胚层祖细胞向成骨细胞命运的分化：mir-296和/或mir-2861；用于驱动中胚层祖细胞向心肌命运的分化：mir-1；用于阻断中胚层祖细胞向心肌命运的分化：mir-133；用于驱动中胚层祖细胞向骨骼肌命运的分化：mir-214、mir-206、mir-1和/或mir-26a；用于阻断中胚层祖细胞向骨骼肌命运的分化：mir-133、mir-221和/或mir-222；用于驱动造血祖细胞向分化的分化：mir-223；用于阻断造血祖细胞向分化的分化：mir-128a和/或mir-181a；用于驱动造血祖细胞向淋巴祖细胞分化：mir-181；用于阻断造血祖细胞向淋巴祖细胞分化：mir-146；用于阻断造血祖细胞向骨髓祖细胞分化：mir-155、mir-24a和/或mir-17；用于驱动淋巴祖细胞向t细胞命运的分化：mir-150；用于阻断骨髓祖细胞向粒细胞命运的分化：mir-223；用于阻断骨髓祖细胞向单核细胞命运的分化：mir-17-5p、mir-20a和/或mir-106a；用于阻断骨髓祖细胞向红细胞命运的分化：mir-150、mir-155、mir-221和/或mir-222；和用于驱动骨髓祖细胞向红细胞命运的分化：mir-451和/或mir-16。

对于可以与一种或多种基因编辑工具(例如，如本文其他地方所述)一起递送的信号传导蛋白(例如，细胞外信号传导蛋白)的实例，参见图18b。例如，以下信号传导蛋白(例如，细胞外信号传导蛋白)(例如，作为担保或作为编码蛋白的核酸诸如dna或rna递送)可用于以下目的：用于驱动造血干细胞向共同淋巴祖细胞谱系分化：il-7；用于驱动造血干细胞向共同骨髓祖细胞谱系分化：il-3、gm-csf和/或m-csf；用于驱动共同淋巴祖细胞向b细胞命运的分化：il-3、il-4和/或il-7；用于驱动共同淋巴祖细胞向自然杀伤细胞命运的分化：il-15；用于驱动共同淋巴祖细胞向t细胞命运的分化：il-2、il-7和/或notch；用于驱动共同淋巴祖细胞向树突细胞命运的分化：flt-3配体；用于驱动共同骨髓祖细胞向树突细胞命运的分化：flt-3配体、gm-csf和/或tnf-α；用于驱动共同骨髓祖细胞向粒细胞-巨噬细胞祖细胞谱系分化：gm-csf；用于驱动共同骨髓祖细胞向巨核细胞-红细胞祖细胞谱系分化：il-3、scf和/或tpo；用于驱动巨核细胞-红细胞祖细胞向巨核细胞命运的分化：il-3、il-6、scf和/或tpo；用于驱动巨核细胞-红细胞祖细胞向红细胞命运的分化：促红细胞生成素；用于驱动巨核细胞向血小板命运的分化：il-11和/或tpo；用于驱动粒细胞-巨噬细胞祖细胞向单核细胞谱系分化：gm-csf和/或m-csf；用于驱动粒细胞-巨噬细胞祖细胞向成髓细胞谱系分化：gm-csf；用于驱动单核细胞向单核细胞衍生的树突细胞命运的分化：flt-3配体、gm-csf、ifn-α和/或il-4；用于驱动单核细胞向巨噬细胞命运的分化：ifn-γ、il-6、il-10和/或m-csf；用于驱动成髓细胞向中性粒细胞命运的分化：g-csf、gm-csf、il-6和/或scf；用于驱动成髓细胞向嗜酸性粒细胞命运的分化：gm-csf、il-3和/或il-5；并且用于驱动成髓细胞向嗜碱性粒细胞命运的分化：g-csf、gm-csf和/或il-3。

可以与一种或多种基因编辑工具(例如，如本文其他地方所述)组合递送的蛋白的实例(例如，作为蛋白和/或核酸，诸如编码所述蛋白的dna或rna)包括但不限于：sox17、hex、oskm(oct4/sox2/klf4/c-myc)和/或bfgf(例如，以驱动向肝干细胞谱系的分化)；hnf4a(例如，以驱动向肝细胞命运的分化)；聚(i:c)、bmp-4、bfgf和/或8-br-camp(例如，以驱动向内皮干细胞/祖细胞谱系的分化)；vegf(例如，以驱动向动脉内皮命运的分化)；sox-2、brn4、myt1l、neurod2、ascl1(例如，以驱动向神经干细胞/祖细胞谱系的分化)；和bdnf、fcs、毛喉素(forskolin)和/或shh(例如，以驱动向神经元、星形胶质细胞和/或少突胶质细胞命运的分化)。

可以与一种或多种基因编辑工具(例如，如本文其他地方所述)组合递送(例如，作为蛋白和/或核酸，如编码所述蛋白的dna或rna)的信号传导蛋白(例如，细胞外信号传导蛋白)的实例包括但不限于：细胞因子(例如，il-2和/或il-15，例如，用于激活cd8+t细胞)；配体和/或调节notch、wnt和/或smad信号传导途径中的一种或多种的信号传导蛋白；scf；干细胞分化因子(例如sox2、oct3/4、nanog、klf4、c-myc等)；和用于后续分离/纯化/浓缩的临时表面标记“标签”和/或荧光报告因子。例如，成纤维细胞可以通过sox2的递送转化为神经干细胞，而在oct3/4和小分子“表观遗传重置因子”的存在下它将变成心肌细胞。在有亨廷顿氏病(huntington’sdisease)或cxcr4突变的患者中，这些成纤维细胞可分别编码与神经元和心肌细胞相关的患病表型性状。通过在单个包装中递送基因编辑校正和这些因子，可以显著降低由于引入的一种或多种但不是所有因子/有效负载而产生的有害影响的风险。

应用包括体内方法，其中细胞死亡提示可以以基因编辑不成功为条件，并且细胞分化/增殖/活化与组织/器官特异性启动子和/或外源因子相关。接受基因编辑的患病细胞可以活化和增殖，但由于存在另一个启动子驱动的表达盒(例如与肿瘤抑制因子如p21或p53不存在相关的表达盒)，随后这些细胞将被消除。另一方面，可以触发表达所需特征的细胞以进一步分化成所需的下游谱系。

vi.试剂盒

试剂盒也在本公开的范围内。例如，在一些情况下，主题试剂盒可包括以下中的一种或多种(以任何组合)：(i)靶向配体，(ii)接头，(iii)与接头缀合的靶向配体，(iv)与锚定结构域缀合的靶向配体(例如，有或无接头)，(v)用作可脱落层的药剂(例如，二氧化硅)，(vi)有效负载，例如sirna或sirna或shrna的转录模板；基因编辑工具等，(vii)可用作阳离子聚合物的聚合物，(viii)可用作阴离子聚合物的聚合物，(ix)可用作阳离子多肽的多肽，例如，一种或多种htp，和(x)主题病毒或非病毒递送载体。在一些情况下，主题试剂盒可以包含使用说明。试剂盒通常包含指示试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包含在试剂盒上或与试剂盒上一起提供的任何书写或记录材料，或者以其它方式随附于试剂盒的书写或记录材料。

本公开的示例性非限制性方面

上述本主题的各方面(包括实施例)可以单独或与一个或多个其它方面或实施例组合有益。在不限制前述描述的情况下，下面在组a(编号1-74)、组b(编号1-33)和组c(编号1-11)中提供了本公开的某些非限制性方面。对于本领域普通技术人员在阅读本公开时将显而易见的是，每个单独编号的方面可以与前面或后面的任何单独编号的方面一起使用或组合。这旨在为所有这些方面的组合提供支持，并且不限于以下明确提供的方面的组合：

方面(组a)

1.一种纳米颗粒，其包含核和包封所述核的可脱落层，其中所述核包含：

(i)阴离子聚合物组合物；

(ii)阳离子聚合物组合物；

(iii)阳离子多肽组合物；和

(iv)核酸和/或蛋白质有效负载，

其中(a)所述阴离子聚合物组合物包含阴离子氨基酸的d-异构体的聚合物和阴离子氨基酸的l-异构体的聚合物；和/或(b)所述阳离子聚合物组合物包含阳离子氨基酸的d-异构体的聚合物和阳离子氨基酸的l-异构体的聚合物。

2.根据1所述的纳米颗粒，其中所述阴离子聚合物组合物包含选自聚(d-谷氨酸)(pdea)和聚(d-天冬氨酸)(pdda)的第一阴离子聚合物；并且包含选自聚(l-谷氨酸)(plea)和聚(l-天冬氨酸)(plda)的第二阴离子聚合物。

3.根据1或2所述的纳米颗粒，其中所述阳离子聚合物组合物包含选自聚(d-精氨酸)、聚(d-赖氨酸)、聚(d-组氨酸)，聚(d-鸟氨酸)和聚(d-瓜氨酸)的第一阳离子聚合物；并且包含选自聚(l-精氨酸)、聚(l-赖氨酸)、聚(l-组氨酸)、聚(l-鸟氨酸)和聚(l-瓜氨酸)的第二阳离子聚合物。

4.根据1-3中任一项所述的纳米颗粒，其中所述阴离子氨基酸的d-异构体的聚合物相对于所述阴离子氨基酸的l-异构体的聚合物以10:1至1:10范围的比率存在。

5.根据1-4中任一项所述的纳米颗粒，其中所述阳离子氨基酸的d-异构体的聚合物相对于所述阳离子氨基酸的l-异构体的聚合物以10:1至1:10范围的比率存在。

6.一种纳米颗粒，其包含核和包封所述核的可脱落层，其中所述核包含：

(a)阴离子聚合物组合物；

(b)阳离子聚合物组合物；

(c)阳离子多肽组合物；和

(d)核酸和/或蛋白有效负载，

其中(a)和(b)之一包含氨基酸的d-异构体聚合物，(a)和(b)中的另一种包含氨基酸的l-异构体聚合物，并且其中d-异构体聚合物与l-异构体聚合物的比率在10:1至1.5:1，或1:1.5至1:10的范围内。

7.根据6所述的纳米颗粒，其中所述阴离子聚合物组合物包含选自聚(d-谷氨酸)(pdea)和聚(d-天冬氨酸)(pdda)的阴离子聚合物。

8.根据7所述的纳米颗粒，其中所述阳离子聚合物组合物包含选自聚(l-精氨酸)、聚(l-赖氨酸)、聚(l-组氨酸)、聚(l-鸟氨酸)和聚(l-瓜氨酸)的阳离子聚合物。

9.根据6所述的纳米颗粒，其中所述阳离子聚合物组合物包含选自聚(d-精氨酸)、聚(d-赖氨酸)、聚(d-组氨酸)，聚(d-鸟氨酸)和聚(d-瓜氨酸)的阳离子聚合物。

10.根据9所述的纳米颗粒，其中所述阴离子聚合物组合物包含选自聚(l-谷氨酸)(plea)和聚(l-天冬氨酸)(plda)的阴离子聚合物。

11.根据1-10中任一项所述的纳米颗粒，其中所述可脱落层是阴离子涂层。

12.根据1-11中任一项所述的纳米颗粒，其中所述可脱落层是ph和/或谷胱甘肽敏感的。

13.根据1-12中任一项所述的纳米颗粒，其中所述可脱落层包含以下中的一种或多种：二氧化硅、类肽、聚半胱氨酸、钙，磷酸钙、硫酸钙、锰、磷酸锰、硫酸锰、镁、磷酸镁、硫酸镁、铁、磷酸铁、硫酸铁、锂、磷酸锂和硫酸锂。

14.根据8所述的纳米颗粒，其中所述可脱落层是二氧化硅涂层。

15.根据1-14中任一项所述的纳米颗粒，其还包含包围所述可脱落层的表面涂层。

16.根据15所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层包含与所述可脱落层静电相互作用的阳离子组分。

17.根据15或16所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层包含以下中的一种或多种：阳离子氨基酸的聚合物、聚(精氨酸)、锚定结构域、阳离子锚定结构域、细胞穿透肽、病毒糖蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖和靶向配体。

18.根据15-17中任一项所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层是两性离子和多价的。

19.根据15-18中任一项所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层包含一种或多种靶向配体。

20.根据19所述的纳米颗粒，其中所述一种或多种靶向配体中的至少一种缀合至与所述可脱落层相互作用的锚定结构域。

21.根据21所述的纳米颗粒，其中所述锚定结构域是选自rrrrrrrrr(seqidno:15)和hhhhhh(seqidno:16)的阳离子锚定结构域。

22.根据21或21所述的纳米颗粒，其中所述锚定结构域通过接头缀合至所述一种或多种靶向配体中的至少一种。

23.根据22所述的纳米颗粒，其中所述接头不是多肽。

24.根据22所述的纳米颗粒，其中所述接头是多肽。

25.根据22-24中任一项所述的纳米颗粒，其中所述接头通过巯基或胺反应性化学与所述靶向配体缀合，和/或所述接头通过巯基或胺反应性化学与所述锚定结构域缀合。

26.根据22-25中任一项所述的纳米颗粒，其中所述一种或多种靶向配体中的至少一种包含半胱氨酸残基并通过所述半胱氨酸残基与所述接头缀合。

27.根据19-26中任一项所述的纳米颗粒，其中所述一种或多种靶向配体提供与b家族g蛋白偶联受体(gpcr)的靶向结合。

28.根据27所述的纳米颗粒，其中所述靶向配体相对于相应的野生型氨基酸序列在一个或多个内部氨基酸位置包含半胱氨酸取代。

29.根据27或28所述的纳米颗粒，其中所述靶向配体包含与氨基酸序列hgegtftsdlskqmeeeavrlfiewlknggpssgappps(seqidno:1)具有85％或更高同一性的氨基酸序列。

30.根据29所述的纳米颗粒，其中所述靶向配体在seqidno:1)所示的氨基酸序列的位置l10、s11和k12中的一处或多处包含半胱氨酸取代。

31.根据30所述的纳米颗粒，其中所述靶向配体包含氨基酸序列hgegtftsdlckqmeeeavrlfiewlknggpssgappps(seqidno:2)。

32.根据19-31中任一项所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层包含一种或多种靶向配体，所述靶向配体提供与选自c-kit、cd27和cd150的细胞表面蛋白的靶向结合。

33.根据19-32中任一项所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层包含一种或多种选自下组的靶向配体：狂犬病病毒糖蛋白(rvg)片段、apoe-转铁蛋白、乳铁蛋白、黑素铁蛋白、卵转铁蛋白、l-选择素、e-选择素、p-选择素、psgl-1、esl-1、cd44、死亡受体-3(dr3)、lamp1、lamp2、mac2-bp、干细胞因子(scf)、cd70、含sh2结构域的蛋白1a(sh2d1a)、、毒蜥外泌肽-4、glp-1、靶向α5β1的靶向配体、rgd、转铁蛋白配体、fgf片段、琥珀酸、二膦酸盐、cd90、cd45f、cd34、造血干细胞的趋化脂质、鞘氨醇、神经酰胺、鞘氨醇-1-磷酸、神经酰胺-1-磷酸和任何上述物质的活性靶向片段。

34.根据19-33中任一项所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层包含干细胞因子(scf)或其靶向片段，cd70或其靶向片段，及含有sh2结构域的蛋白1a(sh2d1a)或其靶向片段。

35.根据19-34中任一项所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层包含一种或多种靶向配体，所述靶向配体提供与选自以下的靶细胞的靶向结合：骨髓细胞、造血干细胞(hsc)、造血干细胞和祖细胞(hspc)、外周血单核细胞(pbmc)、骨髓祖细胞、淋巴祖细胞、t细胞、b细胞、nkt细胞、nk细胞、树突细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞、巨核细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、红系祖细胞、巨核细胞-红系祖细胞(mep)、共同髓系祖细胞(cmp)、多能祖细胞(mpp)、造血干细胞(hsc)、短期hsc(st-hsc)、it-hsc、长期hsc(lt-hsc)、内皮细胞、神经细胞、星形胶质细胞、胰腺细胞、胰岛β细胞、肝细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞、脂肪细胞、肠细胞、结肠细胞和胃细胞。

36.根据19-34中任一项所述的纳米颗粒，其中所述表面涂层包含两种或更多种靶向配体，所述靶向配体的组合提供与选自以下的细胞的靶向结合：骨髓细胞、造血干细胞(hsc)、造血干细胞和祖细胞(hspc)、外周血单核细胞(pbmc)、骨髓祖细胞、淋巴祖细胞、t细胞、b细胞、nkt细胞、nk细胞、树突细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞、巨核细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、红系祖细胞、巨核细胞-红系祖细胞(mep)、共同髓系祖细胞(cmp)、多能祖细胞(mpp)、造血干细胞(hsc)、短期hsc(st-hsc)、it-hsc、长期hsc(lt-hsc)、内皮细胞、神经细胞、星形胶质细胞、胰腺细胞、胰岛β细胞、肝细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞、脂肪细胞、肠细胞、结肠细胞和胃细胞。

37.根据1-36中任一项所述的纳米颗粒，其中所述阳离子多肽组合物包含含有核定位信号(nls)的多肽。

38.根据37所述的纳米颗粒，其中所述nls包含seqidno:151-157和201-264中任一个所示的氨基酸序列。

39.根据1-38中任一项所述的纳米颗粒，其中所述阳离子多肽组合物包含组蛋白尾肽(htp)。

40.根据39所述的纳米颗粒，其中所述htp与阳离子氨基酸聚合物缀合。

41.根据40的纳米颗粒，其中所述htp通过半胱氨酸残基与阳离子氨基酸聚合物缀合。

42.根据40或41所述的纳米颗粒，其中所述阳离子氨基酸聚合物包含聚(赖氨酸)。

43.根据38-42中任一项所述的纳米颗粒，其中所述阳离子多肽组合物包含具有支化结构的组蛋白肽。

44.根据1-43中任一项所述的纳米颗粒，其中所述有效负载包括以下中的一种或多种：(i)crispr/cas指导rna，(ii)编码crispr/cas指导rna的dna分子，

(iii)编码crispr/casrna指导的多肽的核酸分子，(iv)crispr/casrna指导的多肽，(v)与crispr/casrna指导的多肽复合的crispr/cas指导rna，(vi)编码锌指蛋白(zfp)的核酸分子，(vii)zfp，(viii)编码转录活化因子样效应(tale)蛋白的核酸分子，(ix)tale蛋白，和(x)dna供体模板。

45.根据1-44中任一项所述的纳米颗粒，其中所述有效负载包含(i)crispr/cas指导rna和/或编码所述crispr/cas指导rna的dna分子；(ii)crispr/casrna指导的多肽和/或编码所述crispr/casrna指导的多肽的核酸分子。

46.根据45所述的纳米颗粒，其中所述有效负载还包含dna供体模板。

47.根据1-46中任一项所述的纳米颗粒，其还包含以下的一种或多种：scf、编码scf的核酸、hoxb4、编码hoxb4的核酸、bcl-xl、编码bcl-xl的核酸、sirt6、编码sirt6的核酸、抑制mir-155的核酸分子(例如，sirna、lna)、降低ku70表达的核酸分子(例如，sirna、shrna、微rna)和降低ku80表达的核酸分子(例如，sirna、shrna、微rna)。

48.一种纳米颗粒制剂，其包含：

(a)根据1-47中任一项所述的第一纳米颗粒，其中所述有效负载包含以下中的一种或多种：(i)crispr/cas指导rna，(ii)编码crispr/cas指导rna的dna分子，(iii)编码crispr/casrna指导的多肽的核酸分子，(iv)crispr/casrna指导的多肽，(v)与crispr/casrna指导的多肽复合的crispr/cas指导rna，(vi)编码锌指蛋白(zfp)的核酸分子，(vii)zfp，(viii)编码转录活化因子样效应(tale)蛋白的核酸分子，和(ix)tale蛋白；和

(b)包含核酸有效负载的第二纳米颗粒，所述核酸有效负载包含dna供体模板。

49.一种多层纳米颗粒，其包含：

(a)内核，其包含含有dna供体模板的有效负载；

(b)包围所述内核的第一可脱落层；

(c)包围所述第一可脱落层的中间核，其中所述中间核包含以下中的一种或多种：(i)crispr/cas指导rna，(ii)编码crispr/cas指导rna的dna分子，(iii)编码crispr/casrna指导的多肽的核酸分子，(iv)crispr/casrna指导的多肽，(v)与crispr/casrna指导的多肽复合的crispr/cas指导rna，(vi)锌指蛋白(zfp)，(vii)编码zfp的dna分子，(viii)编码转录活化因子样效应(tale)蛋白，和(ix)编码tale蛋白的的核酸分子；及

(d)包围所述中间核的第二可脱落层。

50.根据49所述的多层纳米颗粒，其中所述第一和/或第二可脱落层包括以下中的一种或多种：二氧化硅、类肽、聚半胱氨酸、钙、磷酸钙、硫酸钙、锰、磷酸锰、硫酸锰、镁、磷酸镁、硫酸镁、铁、磷酸铁、硫酸铁、锂、磷酸锂和硫酸锂。

51.根据49或50所述的多层纳米颗粒，其包含包围所述第二可脱落层的表面涂层。

52.根据51所述的多层纳米颗粒，其中所述表面涂层包含与所述第二可脱落层静电相互作用的阳离子组分。

53.根据51或52所述的多层纳米颗粒，其中所述表面涂层包含以下中的一种或多种：阳离子氨基酸的聚合物、聚(精氨酸)、细胞穿透肽、病毒糖蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖和靶向配体。

54.根据49-53中任一项所述的多层纳米颗粒，其中所述表面涂层是两性离子和多价的。

55.根据49-54中任一项所述的多层纳米颗粒，其中所述表面涂层包含一种或多种靶向配体。

56.一种将核酸和/或蛋白质有效负载递送至靶细胞的方法，所述方法包括：使真核靶细胞与1-47中任一项所述的纳米颗粒、48所述的纳米颗粒制剂和/或49-55中任一项所述的多层纳米颗粒接触。

57.根据56所述的方法，其中所述有效负载包括基因编辑工具。

58.根据56或57所述的方法，其中所述有效负载包括以下中的一种或多种：crispr/cas指导rna，编码crispr/cas指导rna的dna分子，crispr/casrna指导的多肽，编码crispr/casrna指导的多肽的核酸分子，锌指核酸酶，编码锌指核酸酶的核酸分子，tale或talen，编码tale或talen的核酸分子，dna供体模板，编码位点特异性重组酶(例如，cre重组酶、dre重组酶、flp重组酶、kd重组酶、b2重组酶、b3重组酶、r重组酶、hin重组酶、tre重组酶、phic31整合酶、bxb1整合酶、r4整合酶、λ整合酶、hk022整合酶、hp1整合酶)的核酸分子，位点特异性重组酶，编码解离酶和/或转化酶(例如，gin、hin、γδ3、tn3、sin、beta)的核酸分子，解离酶和/或转化酶(例如，gin、hin、γδ3、tn3、sin、beta)，转座子和/或源自转座子的dna(例如，细菌转座子如tn3、tn5、tn7、tn9、tn10、tn903、tn1681；真核转座子，如tc1/mariner超家族转座子、piggybac超家族转座子、hat超家族转座子、piggybac、睡美人、青蛙王子、minos、himar1、mariner)和转座酶。

59.根据56-58中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是哺乳动物细胞。

60.根据56-59中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是人细胞。

61.根据56-60中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是体外培养的。

62.根据56-60中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是体内的。

63.根据62所述的方法，其中所述接触包括将所述纳米颗粒施用给个体的步骤。

64.根据63所述的方法，其中所述个体患有亨廷顿氏病、als、帕金森氏病、胰腺癌、糖尿病或冯维勒布兰德氏病。

65.根据56-64中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包括含有靶向配体的表面涂层。

66.根据65所述的方法，其中所述靶向配体提供与选自以下的细胞的靶向结合：骨髓细胞、造血干细胞(hsc)、造血干细胞和祖细胞(hspc)、外周血单核细胞(pbmc)、骨髓祖细胞、淋巴祖细胞、t细胞、b细胞、nkt细胞、nk细胞、树突细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞、巨核细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、红系祖细胞(例如，hudep细胞)、巨核细胞-红系祖细胞(mep)、共同髓系祖细胞(cmp)、多能祖细胞(mpp)、造血干细胞(hsc)、短期hsc(st-hsc)、it-hsc、长期hsc(lt-hsc)、内皮细胞、神经细胞、星形胶质细胞、胰腺细胞、胰岛β细胞、肝细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞、脂肪细胞、肠细胞、结肠细胞和胃细胞。

67.根据56-66中任一项所述的方法，其中所述靶细胞选自：骨髓细胞、造血干细胞(hsc)、造血干细胞和祖细胞(hspc)、外周血单核细胞(pbmc)、骨髓祖细胞、淋巴祖细胞、t细胞、b细胞、nkt细胞、nk细胞、树突细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞、巨核细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、红系祖细胞、巨核细胞-红系祖细胞(mep)、共同髓系祖细胞(cmp)、多能祖细胞(mpp)、造血干细胞(hsc)、短期hsc(st-hsc)、it-hsc、长期hsc(lt-hsc)、内皮细胞、神经细胞、星形胶质细胞、胰腺细胞、胰岛β细胞、肝细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞、脂肪细胞、肠细胞、结肠细胞和胃细胞。

68.根据56-67中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是干细胞和/或祖细胞，并且所述有效负载包含干细胞因子(scf)和/或编码scf的核酸。

69.根据56-67中任一项所述的方法，其中(i)靶细胞来自患有冯维勒布兰德氏病的个体和/或靶细胞包括编码vwf的基因中的基因组突变，使得细胞产生亚正常水平的功能性vwf；(ii)靶细胞是以下任何一种：巨核细胞、内皮细胞、mep、cmp、mpp、hsc、st-hsc和lt-hsc；(iii)有效负载包括功能性vwf蛋白和/或编码功能性vwf的核酸。

70.一种支化组蛋白分子，其包含：一个或多个与阳离子聚合物的侧链缀合的组蛋白尾肽(htp)。

71.根据70所述的支化组蛋白分子，其中所述阳离子聚合物包括聚(精氨酸)或聚(赖氨酸)。

72.根据70或71所述的支化组蛋白分子，其中所述阳离子聚合物高达40％的侧链与所述一个或多个htp缀合。

73.一种支化组蛋白分子，其包含：一个或多个彼此缀合的组蛋白尾肽(htp)，使得所述支化组蛋白分子形成选自以下的结构：刷状聚合物、网(例如蛛网结构)、接枝聚合物、星形聚合物、梳形聚合物、聚合物网络和树枝状大分子。

74.根据73所述的支化组蛋白分子，其中所述支化组蛋白分子形成网状结构。

方面(组b)

1.一种用于递送蛋白和/或核酸有效负载的脂质制剂，所述脂质制剂包含：脂质和核，其中所述核包含：

(i)阴离子聚合物组合物；

(ii)阳离子聚合物组合物；

(iii)阳离子多肽组合物；和

(iv)核酸和/或蛋白质有效负载，

其中(a)所述阴离子聚合物组合物包含阴离子氨基酸的d-异构体的聚合物和阴离子氨基酸的l-异构体的聚合物；和/或(b)所述阳离子聚合物组合物包含阳离子氨基酸的d-异构体的聚合物和阳离子氨基酸的l-异构体的聚合物。

2.根据1所述的脂质制剂，其中所述阴离子聚合物组合物包含选自聚(d-谷氨酸)(pdea)和聚(d-天冬氨酸)(pdda)的第一阴离子聚合物；并且包含选自聚(l-谷氨酸)(plea)和聚(l-天冬氨酸)(plda)的第二阴离子聚合物。

3.根据1或2所述的脂质制剂，其中所述阳离子聚合物组合物包含选自聚(d-精氨酸)、聚(d-赖氨酸)、聚(d-组氨酸)，聚(d-鸟氨酸)和聚(d-瓜氨酸)的第一阳离子聚合物；并且包含选自聚(l-精氨酸)、聚(l-赖氨酸)、聚(l-组氨酸)、聚(l-鸟氨酸)和聚(l-瓜氨酸)的第二阳离子聚合物。

4.根据1-3中任一项所述的脂质制剂，其中所述阴离子氨基酸的d-异构体的聚合物相对于所述阴离子氨基酸的l-异构体的聚合物以10:1至1:10范围的比率存在。

5.根据1-4中任一项所述的脂质制剂，其中所述阳离子氨基酸的d-异构体的聚合物相对于所述阳离子氨基酸的l-异构体的聚合物以10:1至1:10范围的比率存在。

6.一种用于递送蛋白和/或核酸有效负载的脂质制剂，所述脂质制剂包含：脂质和核，其中所述核包含：

(a)阴离子聚合物组合物；

(b)阳离子聚合物组合物；

(c)阳离子多肽组合物；和

(d)核酸和/或蛋白有效负载，

其中(a)和(b)之一包含氨基酸的d-异构体聚合物，(a)和(b)中的另一种包含氨基酸的l-异构体聚合物。

7.根据6所述的脂质制剂，其中d-异构体聚合物与l-异构体聚合物的比率为10:1至1.5:1，或1:1.5至1:10。

8.根据7所述的脂质制剂，其中所述阴离子聚合物组合物包含选自聚(d-谷氨酸)(pdea)和聚(d-天冬氨酸)(pdda)的阴离子聚合物。

9.根据8所述的脂质制剂，其中所述阳离子聚合物组合物包含选自聚(l-精氨酸)、聚(l-赖氨酸)、聚(l-组氨酸)、聚(l-鸟氨酸)和聚(l-瓜氨酸)的阳离子聚合物。

10.根据7所述的脂质制剂，其中所述阳离子聚合物组合物包含选自聚(d-精氨酸)、聚(d-赖氨酸)、聚(d-组氨酸)，聚(d-鸟氨酸)和聚(d-瓜氨酸)的阳离子聚合物。

11.根据10所述的脂质制剂，其中所述阴离子聚合物组合物包含选自聚(l-谷氨酸)(plea)和聚(l-天冬氨酸)(plda)的阴离子聚合物。

12.根据1-11中任一项所述的脂质制剂，其中所述阳离子多肽组合物包含含有核定位信号(nls)的多肽。

13.根据12所述的脂质制剂，其中所述nls包含seqidno:151-157和201-264中任一个所示的氨基酸序列。

14.根据1-13中任一项所述的脂质制剂，其中所述阳离子多肽组合物包含组蛋白尾肽(htp)。

15.根据14所述的脂质制剂，其中所述htp与阳离子氨基酸聚合物缀合。

16.根据15的脂质制剂，其中所述htp通过半胱氨酸残基与阳离子氨基酸聚合物缀合。

17.根据14或15所述的脂质制剂，其中所述阳离子氨基酸聚合物包含聚(赖氨酸)。

18.根据1-17中任一项所述的脂质制剂，其中所述阳离子多肽组合物包含具有支化结构的组蛋白肽。

19.根据1-18中任一项所述的脂质制剂，其中所述有效负载包括以下中的一种或多种：(i)crispr/cas指导rna，(ii)编码crispr/cas指导rna的dna分子，(iii)编码crispr/casrna指导的多肽的核酸分子，(iv)crispr/casrna指导的多肽，(v)与crispr/casrna指导的多肽复合的crispr/cas指导rna，(vi)编码锌指蛋白(zfp)的核酸分子，(vii)zfp，(viii)编码转录活化因子样效应(tale)蛋白的核酸分子，(ix)tale蛋白，(x)dna供体模板，(xi)编码位点特异性重组酶(例如，cre重组酶、dre重组酶、flp重组酶、kd重组酶、b2重组酶、b3重组酶、r重组酶、hin重组酶、tre重组酶、phic31整合酶、bxb1整合酶、r4整合酶、λ整合酶、hk022整合酶、hp1整合酶)的核酸分子，(xii)位点特异性重组酶，(xiii)编码解离酶和/或转化酶(例如，gin、hin、γδ3、tn3、sin、beta)的核酸分子，(xiv)解离酶和/或转化酶(例如，gin、hin、γδ3、tn3、sin、beta)，(xv)转座子和/或源自转座子的dna(例如，细菌转座子如tn3、tn5、tn7、tn9、tn10、tn903、tn1681；真核转座子，如tc1/mariner超家族转座子、piggybac超家族转座子、hat超家族转座子、piggybac、睡美人、青蛙王子、minos、himar1、mariner)和(xvi)转座酶。

20.根据1-19中任一项所述的脂质制剂，其中所述有效负载包含(i)crispr/cas指导rna和/或编码所述crispr/cas指导rna的dna分子；(ii)crispr/casrna指导的多肽和/或编码所述crispr/casrna指导的多肽的核酸分子。

21.根据20所述的脂质制剂，其中所述有效负载还包含dna供体模板。

22.一种将核酸和/或蛋白有效负载递送至靶细胞的方法，所述方法包括：使真核靶细胞与1-21中任一项所述的脂质制剂接触。

23.根据22所述的方法，其中所述有效负载包括基因编辑工具。

24.根据22或23所述的方法，其中所述有效负载包括以下中的一种或多种：crispr/cas指导rna，编码crispr/cas指导rna的dna分子，crispr/casrna指导的多肽，编码crispr/casrna指导的多肽的核酸分子，锌指核酸酶，编码锌指核酸酶的核酸分子，tale或talen，编码tale或talen的核酸分子，dna供体模板，编码位点特异性重组酶(例如，cre重组酶、dre重组酶、flp重组酶、kd重组酶、b2重组酶、b3重组酶、r重组酶、hin重组酶、tre重组酶、phic31整合酶、bxb1整合酶、r4整合酶、λ整合酶、hk022整合酶、hp1整合酶)的核酸分子，位点特异性重组酶，编码解离酶和/或转化酶(例如，gin、hin、γδ3、tn3、sin、beta)的核酸分子，解离酶和/或转化酶(例如，gin、hin、γδ3、tn3、sin、beta)，转座子和/或源自转座子的dna(例如，细菌转座子如tn3、tn5、tn7、tn9、tn10、tn903、tn1681；真核转座子，如tc1/mariner超家族转座子、piggybac超家族转座子、hat超家族转座子、piggybac、睡美人、青蛙王子、minos、himar1、mariner)和转座酶。

25.根据22-24中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是哺乳动物细胞。

26.根据22-25中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是人细胞。

27.根据22-26中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是体外培养的。

28.根据22-26中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是体内的。

29.根据28所述的方法，其中所述接触包括将所述脂质制剂施用给个体的步骤。

30.根据29所述的方法，其中所述个体患有亨廷顿氏病、als、帕金森氏病、胰腺癌、糖尿病或冯维勒布兰德氏病。

31.根据22-30中任一项所述的方法，其中所述靶细胞选自：骨髓细胞、造血干细胞(hsc)、造血干细胞和祖细胞(hspc)、外周血单核细胞(pbmc)、骨髓祖细胞、淋巴祖细胞、t细胞、b细胞、nkt细胞、nk细胞、树突细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞、巨核细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、红系祖细胞、巨核细胞-红系祖细胞(mep)、共同髓系祖细胞(cmp)、多能祖细胞(mpp)、造血干细胞(hsc)、短期hsc(st-hsc)、it-hsc、长期hsc(lt-hsc)、内皮细胞、神经细胞、星形胶质细胞、胰腺细胞、胰岛β细胞、肝细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞、脂肪细胞、肠细胞、结肠细胞和胃细胞。

32.根据22-31中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是干细胞和/或祖细胞，并且所述有效负载包含干细胞因子(scf)和/或编码scf的核酸。

33.根据22-31中任一项所述的方法，其中(i)靶细胞是患有冯维勒布兰德氏病的个体的细胞和/或靶细胞包括编码vwf的基因中的基因组突变，使得细胞产生亚正常水平的功能性vwf；(ii)靶细胞是以下任何一种：巨核细胞、内皮细胞、mep、cmp、mpp、hsc、st-hsc和lt-hsc；(iii)有效负载包括功能性vwf蛋白和/或编码功能性vwf的核酸。

方面(组c)

1.一种将核酸和/或蛋白有效负载递送至靶细胞的方法，所述方法包括：使真核靶细胞与病毒或非病毒递送载体接触，所述递送载体包含：

(a)基因编辑工具；和

(b)诱导靶细胞增殖和/或使靶细胞分化偏向的核酸或蛋白药剂。

2.根据1所述的方法，其中(a)包括以下中的一种或多种：(i)crispr/cas指导rna，(ii)编码crispr/cas指导rna的dna分子，(iii)编码crispr/casrna指导的多肽的核酸分子，(iv)crispr/casrna指导的多肽，(v)与crispr/casrna指导的多肽复合的crispr/cas指导rna，(vi)编码锌指蛋白(zfp)的核酸分子，(vii)zfp，(viii)编码转录活化因子样效应(tale)蛋白的核酸分子，(ix)tale蛋白，(x)dna供体模板，(xi)编码位点特异性重组酶(例如，cre重组酶、dre重组酶、flp重组酶、kd重组酶、b2重组酶、b3重组酶、r重组酶、hin重组酶、tre重组酶、phic31整合酶、bxb1整合酶、r4整合酶、λ整合酶、hk022整合酶、hp1整合酶)的核酸分子，(xii)位点特异性重组酶，(xiii)编码解离酶和/或转化酶(例如，gin、hin、γδ3、tn3、sin、beta)的核酸分子，(xiv)解离酶和/或转化酶(例如，gin、hin、γδ3、tn3、sin、beta)，(xv)转座子和/或源自转座子的dna(例如，细菌转座子如tn3、tn5、tn7、tn9、tn10、tn903、tn1681；真核转座子，如tc1/mariner超家族转座子、piggybac超家族转座子、hat超家族转座子、piggybac、睡美人、青蛙王子、minos、himar1、mariner)和(xvi)转座酶。

3.根据1或2所述的方法，其中(b)包含诱导靶细胞增殖的核酸或蛋白药剂。

4.根据1-3中任一项所述的方法，其中(b)包含使靶细胞分化偏向的核酸或蛋白药剂。

5.根据1-4中任一项所述的方法，其中(b)包含以下的一种或多种：scf、编码scf的核酸、hoxb4、编码hoxb4的核酸、bcl-xl、编码bcl-xl的核酸、sirt6、编码sirt6的核酸、抑制mir-155的核酸分子(例如，sirna、lna)、降低ku70表达的核酸分子(例如，sirna、shrna、微rna)和降低ku80表达的核酸分子(例如，sirna、shrna、微rna)。

6.根据1-5中任一项所述的方法，其中(b)包含用于阻断或驱动靶细胞分化的微rna。

7.根据1-6中任一项所述的方法，其中(b)包含用于靶细胞分化的信号传导蛋白。

8.根据1-7中任一项所述的方法，其中递送载体是非病毒的。

9.根据1-7中任一项所述的方法，其中递送载体是病毒的。

10.根据1-9中任一项所述的方法，其中递送载体不是纳米颗粒。

11.根据1-9中任一项所述的方法，其中递送载体是纳米颗粒，例如，如本文所述的纳米颗粒。

本领域普通技术人员显而易见的是可在不脱离本发明的精神和范围的情况下作出各种改变和修改。

实验

提出以下实例以便向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制本发明的范围，它们也不旨在表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。虽然已努力确保关于使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应当对一些实验误差和偏差进行解释。除非另外指明，否则部分是重量部份，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，并且压力是处于大气压或接近大气压。

本说明书中所引用的所有公开案和专利申请均以引用的方式并入本文中，就如同各个别公开案或专利申请专门且单独地指出以引用的方式并入一般。

已经根据发现或提出的包含用于实践本发明的优选模式的特定实施例描述了本发明。本领域技术人员将理解的是，鉴于本公开，在不脱离本发明的预期范围的情况下，可以对例示的特定实施例进行多种修改和改变。例如，由于密码子冗余，可以在不影响蛋白质序列的情况下在底层dna序列中进行改变。此外，由于生物功能等效性的考虑，可以在不影响生物作用的种类或数量的情况下在蛋白质结构中进行改变。希望所有此类修改包括于所附权利要求书的范围内。

实施例1

为了确定核制剂参数，使用荧光光谱法监测核酸凝聚(对于双链dna有效负载而言)。在以增加的电荷比添加凝聚剂之后测量嵌入溴乙锭(etbr)的发射光谱。由聚合物诱导的核酸凝聚引起的溴乙锭脱嵌导致荧光信号的下降。这是因为溴乙锭在dna结合状态下显示出比未结合状态高得多的量子荧光产率。结果如图1所示。

图1描绘了测试核酸有效负载凝聚的各种参数(例如阳离子:阴离子电荷比)的荧光测定法的结果。结果显示，例如，为2的电荷比对于编码cas9和指导rna分子的质粒的凝聚很有效。向每个孔中添加100μl阴离子溶液：100ng/μldna、80ng/μl聚(d-谷氨酸)(pde)、0.5ng/μl溴乙锭。对于每个数据点，以12.5μl滴定凝聚物质。溶液中凝聚剂的总浓度(m/v)为0.4ug/μl，组蛋白尾肽(htp)[h3k4(me3)]和聚(l-精氨酸)(plr)的不同组成由括号中的质量分数表示。每次滴定后，在605nm下以250nm激发对板读数。对于每个测试的电荷比，对照包括：(i)“仅dna”，其是没有etbr的dna；(ii)“dna”，其为dna加etbr，不存在pde、plr或htp；以及(iii)“dna+pde”，其为dna加etbr加pde，不存在plr或htp。

实施例2：示例合成方法

程序是在无菌、无粉尘的环境(bsl-ii罩)内进行的。气密注射器用70％乙醇灭菌，之后用经过滤的不含核酸酶的水漂洗3次，并在使用前储存在4℃下。使用之前用rna酶抑制剂处理表面。

纳米颗粒核

通过组合适量的有效负载(在这种情况下为质粒dna(egfp-n1质粒))与聚((d-谷氨酸)和聚(l-谷氨酸)的含水混合物(‘阴离子聚合物组合物’)，制备第一溶液(阴离子溶液)。用ph8.5的10mmtris-hcl将该溶液稀释至适当体积。通过用ph5.5的60mmhepes将含有适量凝聚剂的浓缩溶液稀释至适当体积，制备第二溶液(阳离子溶液)，其为“阳离子聚合物组合物”和“阳离子多肽组合物”的组合。在这种情况下，“阳离子聚合物组合物”是聚(l-精氨酸)，“阳离子多肽组合物”是16μg的h3k4(me3)(组蛋白h3的尾部，在k4上三甲基化)。

通过将凝聚溶液滴加到玻璃小瓶或低蛋白结合离心管中的有效负载溶液中，然后在4℃下温育30分钟，可以进行小于200μl批次的纳米颗粒核沉淀。对于大于200μl的批次，可以使用标准混合芯片(例如dolomitemicromixer)或流体动力学流动聚焦芯片以微流体形式组合两种溶液。在每种情况下，可确定最佳输入流速，使得所得纳米颗粒核的悬浮液是单分散的，表现出低于100nm的平均粒度。

在这种情况下，制备上述两种等体积溶液(一种阳离子凝聚剂溶液和一种阴离子凝聚剂溶液)用于混合。对于阳离子凝聚剂溶液，将聚合物/肽溶液添加到一根蛋白低结合管(eppendorf)中，然后用60mmhepes(ph5.5)稀释至总体积为100μl(如上所述)。将该溶液保持在室温下，同时制备阴离子溶液。对于阴离子凝聚剂溶液，将阴离子溶液在冰上冷却，同时最小程度地曝光。用10mmtris-hcl(ph8.5)稀释10μg核酸水溶液(大致1μg/μl)和7μg聚(d-谷氨酸)[.1％]水溶液至总体积100μl(如上所述)。

使用.2微米注射器过滤器过滤两种溶液中的每一种，并转移至其自身的hamilton1ml气密注射器(玻璃，(插入产品编号))。将每个注射器放在harvardpump11elite双重注射泵上。用管形材料将注射器连接到dolomitemicromixer芯片的适当入口，并且注射泵以120μl/分钟运行，总体积为100μl。所得溶液包括核组合物(其现在包括核酸有效负载、阴离子组分和阳离子组分)。纳米颗粒尺寸(峰值)为128.8nm，ζ电位(峰值)为+10.5mv(100％)(例如，参见图2)。

核稳定(添加可脱落层)

为了用可脱落层涂覆所述核，然后将所得纳米颗粒核悬浮液与硅酸钠在10mmtrishcl(ph8.5，10-500mm)或氯化钙在10mmpbs(ph8.5，10-500mm)中的稀释溶液组合，并使其在室温下温育1-2小时。在这种情况下，将核组合物添加到稀释的硅酸钠溶液中以用聚合二氧化硅的酸不稳定性涂层(可脱落层的实例)涂覆所述核。为此，首先将10μl储备硅酸钠(sigma)溶解在1.99ml的tris缓冲液(10mmtrisph＝8.5，1:200稀释度)中并充分混合。使用无菌0.1微米注射器过滤器过滤硅酸盐溶液，并将其转移至安装在注射泵上的无菌hamilton气密注射器中。将上述核组合物也转移到也安装在注射泵上的无菌hamilton气密注射器中。用ptfe管形材料将注射器连接到dolomitemicromixer芯片的适当入口，并且注射泵以120μl/分钟运行。

可以使用标准离心过滤装置(100kdaamiconultra,millipore)或使用高分子量截留膜在30mmhepes(ph7.4)中透析来纯化稳定的(有涂层的)核。在这种情况下，使用离心过滤装置纯化稳定的(有涂层的)核。用稀释的pbs(1:800)或hepes洗涤收集的有涂层的纳米颗粒(纳米颗粒溶液)并再次过滤(可将溶液重新悬浮于500μl无菌分散缓冲液或无核酸酶的水中用于储存)。证明了有效的二氧化硅涂层。稳定化核的大小为110.6nm，ζ电位为-42.1mv(95％)(图3)。

表面涂层(外壳)

表面涂层(也称为外壳)的添加，有时称为“表面官能化”，通过将配体物质(在这种情况下，是与作为阳离子锚定结构域的9-arg肽序列融合的狂犬病病毒糖蛋白-‘rvg9r')静电接枝到稳定的(在这种情况下是有二氧化硅涂层的)纳米颗粒的带负电荷的表面来实现。从二氧化硅涂层纳米颗粒开始，将其过滤并重新悬浮在分散缓冲液或水中，测定每种纳米颗粒分散体的最终体积，以及使得质子化胺基团的最终浓度为至少75um所添加的聚合物或肽的所需量。添加所需的表面组成部分，将溶液超声处理20-30秒，然后温育1小时。在300kda下进行离心过滤(可以使用标准离心过滤装置，例如来自amiconultramillipore的300-500kda，或使用高分子量截留膜，例如在30mmhepes(ph7.4)中透析来纯化最终产物)，最终重新悬浮于细胞培养基或分散缓冲液中。在一些情况下，最佳外壳添加产生单分散的颗粒悬浮液，其平均粒度为50至150nm且ζ电位为0至-10mv。在这种情况下，具有外壳的纳米颗粒的大小为115.8nm，ζ电位为-3.1mv(100％)(图4)。

实施例3：纳米颗粒摄取

在这些研究中(例如，参见图5)，测试了具有各种表面化学和电荷比的纳米颗粒。配方是(电荷比是指纳米颗粒核)：

htt018b：电荷比(阳离子/阴离子)为2；表面涂层为聚(l-精氨酸)

htt019b：电荷比为5；表面涂层为聚(l-精氨酸)

htt020b：电荷比为2，表面涂层为n-乙酰基semax

htt021b：电荷比为5，表面涂层为n-乙酰基semax

htt022b：电荷比为2，表面涂层为n-乙酰selank

htt023b：电荷比为5，表面涂层为n-乙酰基selank

l3000gfp：编码gfp的核酸(编码gfp的质粒)的lipofectamine(非纳米颗粒)递送

l3000crispr：无gfp或荧光标签的crispr/cas组分的lipofectamine(非纳米颗粒)递送。

产生纳米颗粒。对于htt018b-023b，核组分包括核酸有效负载(crispr/cas编码核酸：编码cas9指导rna的一个质粒和编码cas9蛋白的第二质粒)和聚(l-精氨酸)(阳离子聚合物组合物)，其用荧光团(fitc)标记使得可以通过荧光显微镜评估摄取。对于l3000gfp(阳性对照)，不使用纳米颗粒，并且递送的核酸是编码gfp的质粒。对于l3000crispr(阴性对照)，不使用纳米颗粒，并且递送的核酸是编码crispr组分的质粒，但是没有使用的质粒编码gfp，并且没有用fitc标记。

以每孔10⁵个细胞(96孔板)的密度接种神经干细胞，并使其在补充有成纤维细胞生长因子(fgf)(1:1000)的neurobasal培养基中生长。在接种后24小时，将纳米颗粒和lipofectamine3000(0.75μl试剂/μgdna)引入细胞，每孔转染400ng的dna有效负载。将纳米颗粒样品施加至培养的神经干细胞中，并温育4-24小时，然后用pbs洗涤多达3次，以去除任何非内化颗粒。通过以适当的激光激发和滤光器选择成像来确定摄取。使用20x物镜用zeisslsm780对细胞成像。作为替代或补充，可以使用高含量成像和流式细胞术获得定量摄取数据。三行描绘了三种不同的重复。

如上所述，样品htt18b、htt20b和htt22b以2的电荷比制备，而样品htt19b、htt21b和htt23b以5的电荷比制备。数据显示，电荷比为2(对于核的凝聚而言)导致比电荷比为5更高的内化。此外，七肽适应原selank和semax的表面涂层(外壳)促进比包括细胞穿透肽聚(l-精氨酸)[9.7kda]的表面涂层更高程度的内化。

实施例4：表征纳米颗粒内化行为和亚细胞运输

使神经干细胞与包含crispr/cas9质粒作为核酸有效负载的纳米颗粒接触。纳米颗粒核包括用荧光团(fitc)标记的聚(l-精氨酸)(阳离子聚合物组合物)，使得可以通过荧光显微镜评估摄取。内体和细胞核分别用lysotracker(红色)和hoescht3342(蓝色)染色。在接种后16小时，将纳米颗粒和lipfectamine3000(0.75μl试剂/μgdna)引入细胞，每孔转染400ng的dna有效负载。在成像之前，将细胞与hoescht3342和lysotrackerred一起孵育。在转染后2.5小时和5小时用cellomicscx5，使用10x物镜对细胞成像(图6，图a-b)。定量测量纳米颗粒的荧光信号与染色内体和细胞核的荧光信号的共同定位，并且用所得皮尔逊积差系数表示共同定位程度(图6，图c-d)。

对于表2中列出的所有纳米颗粒(参见图6)，核包括(i)表中所示的阳离子多肽组合物，(ii)核酸有效负载，(iii)聚(l-精氨酸)[阳离子氨基酸]聚合物]和(iv)聚(l-谷氨酸)[阴离子氨基酸聚合物]。可脱落层是二氧化硅涂层，表面涂层如表2所示。

表2.

图6，图c描绘了纳米颗粒聚合物(fitc标记的核聚合物)和hoeschtdna染剂之间或纳米颗粒聚合物(fitc标记的核聚合物)和lyotracker之间的皮尔逊积矩相关系数。在图a和b中生成图像的同时计算相关系数。将所有值标准化为阴性对照(cas9lipofectamine3000)的值。在2.5小时和5小时时间点之间，hoescht和fitc之间的皮尔逊相关性降低表明纳米颗粒聚合物随时间推移而降解，释放或扩散到核以外的区室。图6，图d描绘了纳米颗粒聚合物和内体(lysotrackerred)之间的皮尔逊积矩相关系数。在图a和b中生成图像的同时计算相关系数。将所有值标准化为阴性对照(cas9lipofectamine3000)的值。2.5小时和5小时时间点的比较表明内体随时间逃逸。

实施例5：定时释放

图7描绘了用纳米颗粒转染的外周血单核细胞(pbmc)的显微镜图像，其中核酸有效负载是编码gfp的mrna。该图像证明，用包括核的纳米颗粒将mrna表达延长至16天，所述核具有限定比率的阴离子氨基酸的d-异构体的聚合物和阴离子氨基酸的l-异构体的聚合物。在这种情况下，使用具有2:1比率的聚(d-谷氨酸)与聚(l-谷氨酸)的纳米颗粒核在16天时产生最大表达(图a＝4天；图b＝16天)。纳米颗粒核包括(i)阴离子聚合物组合物：总共7μg聚(谷氨酸)(即，d-和l-异构体组合总计7μg)；(ii)阳离子聚合物组合物：聚(l-精氨酸)；(iii)阳离子多肽组合物：h3k4(me3)[即组蛋白h3的尾部，在k4上三甲基化]；和(iv)核酸有效负载：编码gfp的mrna。纳米颗粒核由二氧化硅涂层(可脱落层)包封，表面涂层为聚(l-精氨酸)(plr)。

实施例6：提供与家族bgpcr的靶向结合的靶向配体

图11提供了家族bgpcr的示意图，突出了在评估靶向配体时要考虑的单独结构域，例如，用于结合变构/亲和力n-末端结构域和正构内体-分选/信号传导结构域。(图改编自siu、faiyiu等人,《自然(nature)》499.7459(2013):444-449)。当在靶向配体毒蜥外泌肽-4内选择用于半胱氨酸取代的位点时，考虑这种结构域。

在图12中，半胱氨酸11取代(s11c)被鉴别为一种可能的氨基酸修饰，用于使毒蜥外泌肽-4与锚定结构域(例如，阳离子锚定结构域)缀合，其方式保持亲和力并且还接合促进核酸释放和限制核酸降解的长内体再循环途径。在模拟的毒蜥外泌肽-4(seqidno:1)与胰高血糖素-gcgr(4ers)以及glp1-glp1r-ecd复合物(pdb:3iol)的已知晶体结构的比对之后，pdb渲染在3维空间中旋转以预测交联的复合物必须面对的方向以免破坏两个结合裂缝。当分泌素-家族配体的交联位点与对应的分泌素-家族受体的两个结合裂缝充分正交时，于是确定高亲和力结合可以发生以及伴随着用于最佳的有效负载释放的长内体再循环途径螯合。使用该技术，毒蜥外泌肽-4的氨基酸位置10、11和12被鉴别为用于插入半胱氨酸残基或被半胱氨酸残基取代的位置。

实施例7：提供与rtk的靶向结合的靶向配体

图13示出了作为三元fgf2-fgfr1-肝素复合物(pdb上的1fq9)的一部分的tbfgf片段。确定cknggfflrihpdgrvdgvreks(突出显示的)(seqidno:14)对于fgfr1的亲和力是重要的。图14显示hfkdpk(seqidno:5)被确定是用于配体-受体正构活性和亲和力的肽。图15显示lesnnynt(seqidno:6)也被确定是用于配体-受体正构活性和亲和力的肽。

实施例8

表3-表5提供了以下实验中使用的组分的指南(例如，凝聚数据、生理化学数据以及流式细胞术和成像数据)。

表3.在以下实验中使用的递送分子的特征。靶向配体名称/命名格式：a_b_c_d_e_f其中a＝受体名称：受体配体的名称是靶向的；b＝靶向配体来源：靶向受体的配体名称(如果配体不是野生型，则修饰前缀为“m”或“rm”)；c＝接头名称；d＝带电多肽名称；e＝基于b的接头末端；以及f＝版本号(以区分来自相同wt但aa序列不同的两种修饰的靶向配体)；

表4.以下实验中使用的有效负载。

表5.用于以下实验中使用的组分的指南关键：关键：n＝“纳米颗粒”cat.＝“阳离子”；an.＝“阴离子”；spec.＝“种类”；c:p＝“羧基:磷酸盐”；

纳米颗粒调配物中使用的*亚细胞运输肽是与某些有效负载(例如，“nls_cas9......”)缀合的核定位信号肽纳米颗粒调配物中使用的*阳离子种类与靶向配体(tl)缀合为氨基酸长度为9(9r)的聚(精氨酸)链。无靶向配体的纳米颗粒包含长度为10的非缀合阳离子种类聚(精氨酸)aa链(plr10)或aa链长度为10的聚乙二醇化聚(赖氨酸)。表中所有阳离子种类的l:d异构体比率为1:0。*hsc＝造血干细胞；bm＝骨髓细胞；tcell＝t细胞；血＝全血；cynobm＝食蟹猴骨髓

材料和方法

配体合成

大多数靶向配体序列由内部设计并且由第3方提供商定制。肽配体衍生自天然多肽序列并且在一些情况下突变以提高结合亲和力。通过使用罗塞塔(rosetta)软件实现结合动力学的计算分析和最佳突变的确定。在其中在内部制造靶向配体的情况下，方法和材料如下：

使用标准的基于fmoc的固相肽合成(spps)合成肽。在rink-酰胺(amide)am树脂上合成肽。用o-(1h-6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(hctu)偶联剂和n-甲基吗啉(nmm)在二甲基甲酰胺(dmf)中进行氨基酸偶联。用三氟乙酸(tfa)、三异丙基硅烷(tips)和水进行肽的脱保护和切割。通过反相hplc(rp-hplc)纯化粗肽混合物。将纯肽段冷冻并冻干以得到纯化的肽。

纳米颗粒合成

纳米颗粒在室温37℃或37℃和室温的温差下在阳离子与阴离子组分之间合成。在阳离子与阴离子组分混合期间利用天然静电相互作用在水性缓冲液中制备溶液。开始时，将阴离子组分溶于tris缓冲液(30mm-60mm；ph＝7.4-9)或hepes缓冲液(30mm，ph＝5.5)中，同时将阳离子组分溶于hepes缓冲液(30mm-60mm，ph＝5-6.5)中。

具体地，有效负载(例如，遗传物质(rna或dna)，遗传物质-蛋白质-核定位信号多肽复合物(核糖核蛋白)或多肽)在碱性、中性或酸性缓冲液中重构。出于分析的目的，有效负载被制造成与荧光团共价标记或者遗传性地编码荧光团。利用pdna有效负载，对tatata串联重复具有特异性的cy5标记的肽核酸(pna)用于荧光标记荧光报告载体和荧光报告-治疗基因载体。也可以充当带负电荷的凝胶物质(例如聚(谷氨酸))的定时释放组分也在碱性、中性或酸性缓冲液中重构。具有与接头-锚序列缀合的野生型衍生或野生型突变靶向肽的靶向配体在酸性缓冲液中重构。在纳米颗粒中包含另外的凝聚物质或核定位信号肽的情况下，这些也在作为阳离子种类的0.03％w/v和阴离子种类的0.015％w/v的工作溶液的缓冲液中重构。还用用于阳离子物质的0.1％w/v和用于阴离子物质的0.1％w/v的工作溶液进行实验。除了与遗传物质复合的那些多肽外，对所有多肽进行十分钟的超声处理以提高溶解性。

然后将纳米颗粒的每个单独重构的组分以所研究的添加顺序混合。所研究的不同添加顺序包含：

1)有效负载<阳离子物质

2)有效负载<阳离子物质(锚)<阳离子物质(锚-接头-配体)

3)有效负载<阴离子物质<阳离子物质

4)有效负载<阳离子物质<阴离子物质

5)有效负载<阳离子物质(锚)<阳离子物质(锚-接头-配体)<阴离子物质

6)有效负载<阴离子物质<阳离子物质(锚)+阳离子物质(锚-接头-配体)

7)有效负载+阴离子物质<阳离子物质(锚)+阳离子物质(锚-接头-配体)

8)有效负载1(核糖核蛋白或其它遗传/蛋白质物质)<阳离子物质(组蛋白片段、nls或无接头-配体的带电多肽锚)<阴离子物质

9)有效负载1(核糖核蛋白或其它遗传/蛋白质物质)<阳离子物质(组蛋白片段、nls或无接头-配体的带电多肽锚)<阴离子物质<阳离子物质(组蛋白片段、nls或有或没有接头-配体的带电多肽锚)

10)有效负载1(核糖核蛋白或其它遗传/蛋白质物质)<阳离子物质(组蛋白片段、nls或无接头-配体的带电多肽锚)<有效负载2/3/4(一种或多种有效负载)<阳离子物质(组蛋白片段、nls或有或没有接头-配体的带电多肽锚)

11)有效负载1(核糖核蛋白或其它遗传/蛋白质物质)<阳离子物质(组蛋白片段、nls或无接头-配体的带电多肽锚)<有效负载2/3/4(一种或多种有效负载)+阴离子物质<阳离子物质(组蛋白片段、nls或有或没有接头-配体的带电多肽锚)

12)有效负载1/2/3/4(一种或多种核糖核蛋白、蛋白质或核酸有效负载)+阴离子物质<阳离子物质(组蛋白片段、nls或有或没有接头-配体的带电多肽锚)

13)有效负载1/2/3/4(一种或多种核糖核蛋白、蛋白质或核酸有效负载)<阳离子物质(组蛋白片段、nls或有或没有接头-配体的带电多肽锚)

细胞培养

t细胞

转染前24小时，将含有20m人原代pan-t细胞(干细胞#70024)的冷冻管解冻并且以200μl和75,000个细胞/孔(1.5e6细胞/ml)接种于4个96孔板的4x66孔中。细胞在补充有10％fbs和l-谷氨酰胺的无抗生素的rpmi1640培养基(赛默飞世尔#11875119)中培养，并且通过每2天更换培养基来维持。

造血干细胞(hsc)

转染前24小时，将含有500k人原代cd34+细胞(干细胞#70002)的冷冻管解冻并且以200μl和10-12k个细胞每孔接种于96孔板的48个孔中。培养基由补充有10％的fbs、25ng/ml的tpo、50ng/ml的flt-3配体和50ng/ml的scf的stemspansfemii(干细胞#09605)组成并且通过每2天更换培养基来维持细胞。食蟹猴骨髓(hsc)

转染前48小时，将含有1.25m食蟹猴骨髓细胞(iq生命科学#iqb-mnbm1)的冷冻管解冻并且以200μl和～30k个细胞/孔接种于圆底96孔板的48个孔中。细胞在补充有12％fbs的无抗生素的rpmi1640培养基中培养，并且通过每2天更换培养基来维持。

人全血

通过静脉穿刺抽取5ml全血。将1ml全血与14ml的pbs混合。将纳米颗粒直接转染到15ml管中，或者在纳米颗粒转染之前将100μl的血滴定到96孔板的每个孔中。

转染

在形成纳米颗粒的储备溶液后，在96孔板的每个孔中加入10μl纳米颗粒并且在不改变细胞培养条件或培养基的补充物的情况下进行孵育(参见表6)。在活细胞成像期间，在co2和温度控制的环境下，通过biotekcytation5来维持96孔板。

表6.

分析

凝聚和包合曲线

通过将含有0.0044ug/μl的血红蛋白β亚基(hbb)grna或具有pdna结合位点或mrna或sirna的冯维勒布兰德因子(vwf)-egfp-pdna的50μl溶液与悬浮于30mmtris缓冲液(ph＝7.4-8.5)中的1μl的sybr0.4x混合来产生凝聚曲线。hbbgrna在rnp中被复合而存在。在单独添加ple20、ple35、ple100或ple100:pde100(1:1的d:l比率)之前和之后监测来自嵌入的sybrgold的荧光发射，其中羧酸盐与磷酸盐(c:p)之比的范围在1与150之间。然后，加入阳离子种类以达到期望的胺与磷酸盐(n:p)或胺与磷酸盐+羧酸盐[n:(p+c)]的比率。代表性的阳离子种类包含plr10；plr50；plr150、锚-接头肽；与缀合到带电聚(精氨酸)链的ggggsggggs(seqidno:xx)接头缀合的各种突变靶向配体(即，内部名称：scf_mckit_(4gs)2_9r_c)；组蛋白_h3k4(me3)肽[1-22](mh3_k4me3_1)；组蛋白_h4k16(ac)肽[1-20](mh4_k16ac_1)；组蛋白_h2a肽[1-20](mh2a_1)，对应于不同的正负电荷比(cr)。在一些实验中，根据上述说明，在阴离子种类之前加入阳离子种类。

在将稀释于30mmtris缓冲液(ph＝7.4)中的sybrgold0.2x多次添加到悬浮于含有包封在不同的纳米颗粒调配物中的vwf-egfp-pdna、grnahbb、alexa555block-it-sirna的已知量(100至600ng)的60mmhepes(ph＝5.5)溶液中的纳米颗粒后获得包合曲线。

使用synergyneo2hybrid多模式读数器(伯腾仪器有限公司(biotek)，美国)或clariostar微孔板读数器(bmg，德国)在平底半区96孔板中记录来自gfp通道中的嵌入的sybrgold的荧光发射。

纳米颗粒跟踪分析(ζ)

使用zetaview仪器(particlemetrix，德国)，通过纳米颗粒跟踪分析研究纳米颗粒调配物的流体动力学直径和ζ电位。在注入仪器之前，将样品在pbs(1:12)中以1:100稀释。为了获得测量结果，在分析之前将相机设置调整到最佳的灵敏度和粒子/帧(～100-150)。

荧光显微镜-biotekcytation5

在通过流式细胞术评估之前，使用cytation5高含量筛选活细胞成像显微镜(伯腾仪器有限公司，美国)对转染效率进行成像。简而言之，在转染前对细胞进行成像，转染后4小时以15m的增量成像，并且然后在接下来的12小时内，利用gfp和/或cy5通道以及10x物镜下的明视场以2h的增量进行成像。随后收集图像作为连续动力学或离散的1-18、24、36或48小时时间点的代表。

流式细胞术

进行细胞标记实验，进行洗涤步骤以移除细胞培养基，然后在室温下用溶于pbs的zombienir活性试剂盒染色(zombienirviabilitykitstain)和/或celleventtm半胱天冬酶-3/7green(英杰(invitrogen)，usa)孵育细胞30分钟。活性标记混合物的总体积为每孔25μl。然后将一板荧光第一抗体添加到混合物中(每孔0.25μl每种抗体)并且保持孵育15分钟。使用ultracompebeads补偿珠粒和阴性珠粒或活细胞的cy5核染色产生阳性对照和阴性单通道对照。所有孵育步骤都在旋转振荡器上和黑暗中进行。在已应用不同通道之间的适当补偿后，使用attunenxt流式细胞仪(赛默飞世尔(thermofisher)，美国)对活细胞进行attune多参数流式细胞术测量。通过选择适当的正向和侧向散射强度门来选择代表性的细胞群。继续检测细胞荧光，直到收集至少10000个事件。

结果/数据

图19-图44：凝聚数据

图19.(a)sybrgold排斥测定示出荧光强度变化作为含有具有最初嵌入sybrgold的pna有效负载的vwf-egfppdna的纳米颗粒中的正负电荷比(cr)的函数。图例中显示的羧酸盐与磷酸盐(c:p)的比率基于在阴离子多肽种类(ple100)上的羧酸盐基团与在有效负载的遗传物质上的磷酸基团的纳米颗粒的比率。

通过逐步添加阳离子plr150来增加cr。观察到的荧光的减少示出了通过添加plr150来增加cr导致sybr在颗粒凝聚时从有效负载中移位。另外，在各种c:p比率下，凝聚保持一致。空白溶液在没有有效负载的情况下包含sybrgold。(b)荧光强度变化作为无ple100的纳米颗粒中的正负电荷比(cr)的函数。

图20.sybrgold排斥测定示出荧光强度变化作为含有最初嵌入sybrgold的nls-cas9-nlsrnp复合的w/hbbgrna有效负载的纳米颗粒中的正负电荷比(cr*)的函数。另外，cr*的确定不包含通过与cas9复合而屏蔽的grna的带负电荷的部分。图例中显示的羧酸盐与磷酸盐(c:p)的比率基于在阴离子多肽物质(ple100)上的羧酸盐基团与在有效负载的遗传物质上的磷酸基团的纳米颗粒的比率。

通过逐步添加阳离子plr150来增加cr。空白溶液在没有有效负载的情况下包含sybrgold。观察到的荧光的减少示出了通过添加plr150来增加cr导致sybr在颗粒凝聚时从有效负载中移位。另外，在各种c:p比率下，凝聚保持一致。

图21.sybrgold排斥测定示出荧光强度变化作为含有最初嵌入sybrgold的grnahbb有效负载的纳米颗粒中的正负电荷比(cr)的函数。图例中显示的羧酸盐与磷酸盐(c:p)的比率基于在阴离子多肽物质(ple100)上的羧酸盐基团与在有效负载的遗传物质上的磷酸基团的纳米颗粒的比率。

通过逐步添加plr150来增加cr。空白溶液在没有有效负载的情况下包含sybrgold。观察到的荧光的减少示出了通过添加plr150来增加cr导致sybr在颗粒凝聚时从有效负载中移位。另外，在各种c:p比率下，关于cr的凝聚保持一致。

表7：在凝聚端点处测量一些调配物的流体动力学直径和ζ电位并且在下表中进行了报告。

图22-图24：使用肽scf_rmac-ckit_(4gs)2_9r_c作为阳离子材料的凝聚曲线

图22.(a)(b)sybrgold排斥测定示出荧光强度变化作为含有最初嵌入sybrgold的hbbgrna有效负载的纳米颗粒中的正负电荷比(cr)的函数。图例中显示的羧酸盐与磷酸盐(c:p)的比率基于在阴离子多肽物质(ple100)上的羧酸盐基团与在有效负载的遗传物质上的磷酸基团的纳米颗粒的比率。通过逐步添加与缀合到带正电荷的聚(精氨酸)的(gggs)2接头缀合的阳离子突变ckit靶向配体(内部配体名称：scf_rmac-ckit_(4gs)2_9r_c)来增加cr。观察到的荧光的减少示出了通过添加scf_rmac-ckit_(4gs)2_9r_c来增加cr导致sybr在颗粒凝聚时从有效负载中移位。另外，在各种c:p比率下，凝聚保持一致。空白溶液在没有有效负载的情况下包含sybrgold。

图23.(a)(b)sybrgold排斥测定示出荧光强度变化作为含有最初嵌入sybrgold的nls-cas9-nlsrnp复合的w/hbbgrna有效负载的纳米颗粒中的正负电荷比(cr)的函数。图例中显示的羧酸盐与磷酸盐(c:p)的比率基于在阴离子多肽物质(ple100)上的羧酸盐基团与在有效负载的遗传物质上的磷酸基团的纳米颗粒的比率。

通过逐步添加与缀合到带正电荷的聚(精氨酸)的(gggs)2接头缀合的阳离子突变ckit靶向配体(内部配体名称：scf_rmac-ckit_(4gs)2_9r_c)来增加cr。观察到的荧光的减少示出了通过添加scf_rmac-ckit_(4gs)2_9r_c来增加cr导致sybr在颗粒凝聚时从有效负载中移位。另外，在各种c:p比率下，凝聚保持一致。空白溶液在没有有效负载的情况下包含sybrgold。

图24.(a)(b)sybrgold排斥测定示出荧光强度变化作为含有具有最初嵌入sybrgold的pna有效负载的vwf-egfppdna的纳米颗粒中的正负电荷比(cr)的函数。图例中显示的羧酸盐与磷酸盐(c:p)的比率基于在阴离子多肽物质(ple100)上的羧酸盐基团与在有效负载的遗传物质上的磷酸基团的纳米颗粒的比率。

通过逐步添加与缀合到带正电荷的聚(精氨酸)的(gggs)2接头缀合的阳离子突变ckit靶向配体(内部配体名称：scf_rmac-ckit_(4gs)2_9r_c)来增加cr。观察到的荧光的减少示出了通过添加scf_rmac-ckit_(4gs)2_9r_c来增加cr导致sybr在颗粒凝聚时从有效负载中移位。另外，在各种c:p比率下，凝聚保持一致。空白溶液在没有有效负载的情况下包含sybrgold。

图25-图26：组蛋白h3k4me作为阳离子材料的凝聚曲线

图25.sybrgold排斥测定示出荧光强度变化作为含有具有最初嵌入sybrgold的pna有效负载的vwf-egfppdna的纳米颗粒中的正负电荷比(cr)的函数。图例中显示的羧酸盐与磷酸盐(c:p)的比率基于在阴离子多肽物质(ple100)上的羧酸盐基团与在有效负载的遗传物质上的磷酸基团的纳米颗粒的比率。通过逐步添加阳离子突变组蛋白_h3k4(me3)肽[1-22](内部肽名称mh3_k4me3_1)来增加cr。观察到的荧光变化示出了在ple100存在下，通过添加mh3_k4me3_1来增加cr，不能充分地使sybr从有效负载中移位。空白溶液在没有有效负载的情况下包含sybrgold。

图26.(a)sybrgold排斥测定示出荧光强度变化作为含有最初嵌入sybrgold的nls-cas9-nlsrnp复合的w/hbbgrna有效负载的纳米颗粒中的正负电荷比(cr)的函数。图例中显示的羧酸盐与磷酸盐(c:p)的比率基于在阴离子多肽物质(ple100)上的羧酸盐基团与在有效负载的遗传物质上的磷酸基团的纳米颗粒的比率。通过逐步添加阳离子突变组蛋白_h3k4(me3)肽[1-22](内部肽名称mh3_k4me3_1)来增加cr。观察到的荧光变化示出了在ple100存在下，通过添加mh3_k4me3_1来增加cr，不能始终导致sybr从有效负载中移位。然而，在不存在阴离子多肽的情况下，当cr≤8:1时，组蛋白_h3k4(me3)被示出为有效凝聚剂。

图27-图30：使用肽cd45_asiglec_(4gs)2_9r_c作为阳离子材料的凝聚曲线

图27.sybrgold排斥测定示出荧光强度变化作为含有具有最初嵌入sybrgold的pna有效负载的vwf-egfppdna的纳米颗粒中的正负电荷比(cr)的函数。图例中显示的羧酸盐与磷酸盐(c:p)的比率基于在阴离子多肽物质(ple100)上的羧酸盐基团与在有效负载的遗传物质上的磷酸基团的纳米颗粒的比率。通过逐步添加与缀合到带正电荷的聚(精氨酸)的(gggs)2接头缀合的阳离子突变cd45受体靶向配体(内部配体名称：cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c)来增加cr。空符号代表在没有有效负载的情况下，空白溶液包含sybrgold。

观察到的荧光的减少示出了通过添加cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c来增加cr导致sybr在颗粒凝聚时从有效负载中移位。另外，在各种c:p比率下，凝聚保持一致。

图28.sybrgold排斥测定示出荧光强度变化作为含有最初嵌入sybrgold的cy5-egfpmrna有效负载的纳米颗粒中的正负电荷比(cr)的函数。图例中显示的羧酸盐与磷酸盐(c:p)的比率基于在阴离子多肽物质(ple100)上的羧酸盐基团与在有效负载的遗传物质上的磷酸基团的纳米颗粒的比率。

通过逐步添加与缀合到带正电荷的聚(精氨酸)的(gggs)2接头缀合的阳离子突变cd45受体靶向配体(内部配体名称：cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c)来增加cr。观察到的荧光的减少示出了通过添加cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c来增加cr导致sybr在颗粒凝聚时从有效负载中移位。另外，在各种c:p比率下，凝聚保持一致。

图29.sybrgold排斥测定示出荧光强度变化作为含有最初嵌入sybrgold的block-italexafluor555sirna有效负载的纳米颗粒中的正负电荷比(cr)的函数。图例中显示的羧酸盐与磷酸盐(c:p)的比率基于在阴离子多肽物质(ple100)上的羧酸盐基团与在有效负载的遗传物质上的磷酸基团的纳米颗粒的比率。通过逐步添加与缀合到带正电荷的聚(精氨酸)的(gggs)2接头缀合的阳离子突变cd45受体靶向配体(内部配体名称：cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c)来增加cr。观察到的荧光的减少示出了通过添加cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c来增加cr导致sybr在颗粒凝聚时从有效负载中移位。另外，在各种c:p比率下，凝聚保持一致。

图30.(a)sybrgold排斥测定示出荧光强度变化作为含有与最初嵌入sybrgold的hbbgrna有效负载复合的nls-cas9-egfprnp的纳米颗粒中的正负电荷比(cr)的函数。图例中显示的羧酸盐与磷酸盐(c:p)的比率基于在阴离子多肽物质(ple100)上的羧酸盐基团与在有效负载的遗传物质上的磷酸基团的纳米颗粒的比率。

通过逐步添加与缀合到带正电荷的聚(精氨酸)的(gggs)2接头缀合的阳离子突变cd45受体靶向配体(内部配体名称：cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c)来增加cr。填充符号代表在没有有效负载的情况下，空白溶液包含sybrgold。

观察到的荧光的减少示出了通过添加cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c来增加cr导致sybr在颗粒凝聚时从有效负载中移位。另外，在各种c:p比率下，凝聚保持一致。

(b)无ple并且电荷比＝22的纳米颗粒的流体动力学直径分布的代表性图像。平均直径<d>＝134nm±65。

表8：在凝聚端点处测量一些调配物的流体动力学直径和ζ电位并且在下表中进行了报告。

图31-图34：包合曲线

图31.sybrgold包合测定示出作为向所有含有150ngblock-italexafluor555sirna有效负载的不同纳米颗粒调配物中逐步添加sybr的函数的荧光强度变化。从0μl到50μl的sybr的荧光的δ变化指示纳米颗粒调配物的稳定性。调配物凝聚的越不稳定，sybrgold嵌入遗传有效负载的可能性越大。lipofectaminernaimax在此用作阳性对照。表2-4。

图32.sybrgold包合测定示出作为向所有含有300nghbbgrna有效负载的不同纳米颗粒调配物中逐步添加sybr的函数的荧光强度变化。从0μl到50μl的sybr的荧光的δ变化指示纳米颗粒调配物的稳定性。调配物凝聚的越不稳定，sybrgold嵌入遗传有效负载的可能性越大。lipofectaminecrisprmax在此用作阳性对照。表2-4。

图33.sybrgold包合测定示出作为向所有含有cy5egfpmrna有效负载的不同纳米颗粒调配物中逐步添加sybr的函数的荧光强度变化。从0μl到50μl的sybr的荧光的δ变化指示纳米颗粒调配物的稳定性。调配物凝聚的越不稳定，sybrgold嵌入遗传有效负载的可能性越大。lipofectamine信使max在此用作阳性对照。表2-4。

图34.sybrgold包合测定示出作为向所有含有600ng的具有cy5标记的肽核酸(pna)结合位点有效负载的vwf-egfppdna的不同纳米颗粒调配物中逐步添加sybr的函数的荧光强度变化。从0μl到50μl的sybr的荧光的δ变化指示纳米颗粒调配物的稳定性。调配物凝聚的越不稳定，sybrgold嵌入遗传有效负载的可能性越大。lipofectamine3000在此用作阳性对照。表2-4。

图35-图44：tc.001上的sybr包合/凝聚分析(参见表2-4)

这些数据显示，实验tc.001中使用的调配物是稳定的，而且所述数据显示，与h3不同，h2a和h4组蛋白尾肽本身就是用于所有列出的有效负载的有效凝聚剂。所述数据还显示，h2a和h4可以进一步与锚-接头-配体结合。最后，证据表明，随后添加阴离子聚合物(在该实施例中为ple100)不影响颗粒稳定性，或者如通过在添加到阴离子聚合物之前在与核酸或核糖核蛋白缀合的各种锚-接头-配体肽上测量的大小和ζ电位所证明的增强稳定性。

图35.sybrgold排斥测定示出了通过加入阳离子多肽cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c，然后加入ple100并且通过进一步向rnp中加入阳离子多肽来降低荧光强度。由于来自rnp的gfp荧光引起的荧光背景信号id。

图36.sybrgold排斥测定示出了通过加入阳离子多肽cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c，然后加入ple100并且通过进一步向sirna中加入阳离子多肽并且进一步加入sybrgold引起的荧光强度变化。

图37.sybrgold排斥测定示出了通过加入阳离子多肽组蛋白肽h2a，然后加入cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c，并且通过进一步向具有hbbgrna和sybrgold的nls-cas9-egfp的rnp中加入ple100而引起的荧光强度变化。

图38.sybrgold排斥测定示出了通过一起加入阳离子多肽组蛋白肽h4和cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c，并且通过进一步向具有hbbgrna和sybrgold的nls-cas9-egfp的rnp中加入ple100而引起的荧光强度变化。

图39.sybrgold排斥测定示出了通过加入阳离子多肽cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c并且通过进一步向mrna中加入ple100而引起的荧光强度变化。

图40.sybrgold排斥测定示出了通过加入组蛋白h4并且通过进一步向mrna中加入cd45-msiglec-(4gs)2_9r_c和ple100而引起的荧光强度变化。

图41.sybrgold排斥测定示出了通过加入组蛋白h2a并且通过进一步向mrna中加入cd45-msiglec-(4gs)2_9r_c和ple100而引起的荧光强度变化。

图42.来自嵌入vwf_egfppdna的sybrgold排斥测定示出了通过加入阳离子多肽cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c，然后加入ple100而引起的荧光强度变化。

图43.来自嵌入vwf_egfppdna的sybrgold排斥测定示出了通过加入组蛋白h4，然后加入阳离子多肽cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c，然后加入ple100而引起的荧光强度变化。

图44.来自嵌入vwf_egfppdna的sybrgold排斥测定示出了通过加入组蛋白h4，然后加入阳离子多肽cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c，然后加入ple100而引起的荧光强度变化。

图45-图83：物理化学数据

颗粒大小和ζ电位是用于表征胶体纳米材料的常规测量。这些测量主要通过如dls(动态光散射)等光散射技术获得。纳米颗粒跟踪分析(nta)利用激光散射显微镜和图像分析来获得具有高分辨率的颗粒大小和ζ电位的测量结果。

分析

分散度是样品异质性的量度并且由分布确定分散度，其中低标准差和单峰指示颗粒均匀性。

通过固相肽合成来合成由具有配体的多肽组成的靶向配体、(ggggs)2接头和静电锚结构域并且用于使携带pegfp-n1质粒dna有效负载的颗粒的二氧化硅表面(可脱落层)官能化。使用zetaview仪器(particlemetrix，德国)，通过纳米颗粒跟踪分析获得所产生的颗粒大小和ζ电位分布。

图45.(a)核心复合物大小分布，由与h3k4(me3)和聚(l-精氨酸)(29kd，n＝150)复合的pegfp-n1质粒组成。(b)图45a的具有二氧化硅可脱落层的复合物表现出特性负ζ电位和124nm的平均颗粒大小。(c)具有n末端锚和甘氨酸-丝氨酸接头((ggggs)2)的e选择蛋白配体涂覆在图45b中所示的颗粒上。

图46.支化组蛋白肽缀合物先导颗粒。具有c-末端半胱氨酸的组蛋白h3肽与具有10％侧链硫醇取代的48kd聚(l-赖氨酸)缀合。通过离心过滤和分子量排斥而纯化的最终产物用于复合质粒dna(pegfp-n1)。图46描绘的所产生的测量结果显示了较窄的大小分布。与质粒dna(pegfp-n1)复合的h3-聚(l-赖氨酸)缀合物的大小分布

对于图47-图83，数据由实验编号(项目代码)索引。在多种情况下，这可以与表5的项目代码交叉参考(hsc＝造血干细胞；bm＝骨髓细胞；tcell＝t细胞；blood＝全血；cynobm＝食蟹猴骨髓)。

图47提供了与项目hsc.001.001相关的数据。

图48提供了与项目hsc.001.002相关的数据，其使用与pna标记的pdna和e-选择蛋白靶向肽(esellg_mesel_(4gs)2_9r_n)复合的的h3-聚(l-赖氨酸)缀合物。

图49-图52提供了实验数据，其中将各种靶向配体或隐形分子涂覆于二氧化硅涂覆的颗粒和二氧化硅涂覆的纳米钻石上(用于诊断的增强型荧光应用)。大小和ζ电位分布与相关统计一起呈现。靶向配体分别是esellg_mesel_(4gs)2_9r_n、esellg_mesel_(4gs)2_9r_c、cd45_msiglec_(4gs)2_9r_c和cy5mrna-sio2-peg。

在随后的所有数据中，纳米调配物和靶向配体的性能显著改善-通过各种有效负载和配体-靶向方法，消除了二氧化硅层并且用带电阴离子可脱落多肽基质替代显著提高了纳米颗粒在所有调配物中的转染效率。然而，以上数据中使用的多层技术，以及与支化组蛋白复合物的增强型凝聚和随后的肽基质工程化(工作实例在tcell.001、hsc.004、cynobm.002和blood.002中呈现)证明了技术(例如，多层化)和核心生物材料的灵活性(例如，参见本公开整体和随后的实验)。本文描述的所有技术可以应用于任何颗粒核心，无论是诊断的还是治疗的，以及自组装的材料。例如，支化组蛋白可以与接头-配体结构域缀合或与多个实施例及其用途共凝聚。

图53-图57描绘了携带cy5-egfpmrna有效负载的颗粒，所述颗粒与可脱落聚(谷氨酸)表面基质以及cd45配体复合。使用该调配物生产的纳米颗粒的颗粒大小和ζ电位是高度均匀的。在siglec衍生的肽与mrna缔合(blood.002.88)后加入具有聚(谷氨酸)的颗粒比在siglec衍生的肽与mrna和聚(谷氨酸)缔合之前加入具有聚(谷氨酸)的颗粒更稳定和单分散化，指示特定的加入顺序可以有助于形成更稳定的颗粒。另外，由不含含磷酸核酸的siglec衍生肽与聚(谷氨酸)复合形成的颗粒是高度阴离子单分散的(blood.002.92)。在plr与mrna缔合后加入的plr50与ple100形成的颗粒是高度稳定的、单分散的、阳离子化的(blood.002.91)。相反，在ple100添加之前plk-peg与mrna的缔合导致具有异质电荷分布的非常小的颗粒。通过流式细胞术数据证明了这些添加顺序和siglec衍生肽的功效，其中配体靶向的siglec衍生颗粒导致全血细胞中的cy5强度增加了近两个数量级，尽管与聚乙二醇化对照的转染效率相似。

图53提供了来自blood.002.88的数据。纳米颗粒的ζ电位为-3.32+/-0.29mv，其中90％的直径小于180nm。根据流式细胞术数据，这些纳米颗粒在全血中产生58.6％的有效cy5_egfp_mrna摄取。窄而均匀的峰是极好的电荷分布的示例性典范并且在tcell.001.18中形成净阴离子颗粒时是可再现的。这证明了siglec衍生靶向肽对于全身递送的广泛适用性(例如，参见以下的流式细胞术和成像数据)。

图54提供了来自blood.002.89的数据。纳米颗粒的ζ电位为-0.25+/-0.12mv，其中90％的直径小于176nm。根据流式细胞术数据，这些纳米颗粒分别在全血中产生58.6％的有效cy5_egfp_mrna摄取。这证明了siglec衍生靶向肽对于全身递送的广泛适用性(例如，参见以下的流式细胞术和成像数据)。

图55提供了来自blood.002.90的数据。纳米颗粒的ζ电位为2.54+/-0.03mv，其中90％的直径小于99nm。根据流式细胞术数据，这些纳米颗粒分别在全血中产生79.9％的有效cy5_egfp_mrna摄取(例如，参见以下的流式细胞术和成像数据)。

图56提供了来自blood.002.91的数据。纳米颗粒的ζ电位为27.10fwhm18.40mv，其中90％的直径小于130nm。根据流式细胞术数据，这些纳米颗粒分别在全血中产生96.7％的有效cy5_egfp_mrna摄取(例如，参见以下的流式细胞术和成像数据)。强正电荷的ζ电位导致全血细胞上cy5+信号的高效率和强度。简而言之，在该实施例中，将较大剂量的plr50(15μlplr500.1％w/v溶液)加入到具有2.5ugcy5mrna的100μl、ph5.5、30mm的hepes中(trilink)。在37℃下5分钟后，向溶液中加入1.5μl的0.1％ple100。相比之下，其它实验涉及将相对较大体积(总溶液体积的5-20％)的ple100加入到预形成的阳离子聚合物+阴离子材料核心。

图57提供了来自blood.002.92的数据。纳米颗粒的ζ电位为-22.16fwhm18.40mv，其中90％的直径小于130nm。根据流式细胞术数据，这些纳米颗粒不会导致全血中可检测到的cy5_egfp_mrna摄取，因为它们未用荧光团标记(例如，参见以下的流式细胞术和成像数据)。没有有效负载(载体)的这些纳米颗粒的有效凝聚也对非遗传物质有效负载的递送，如带电聚合物与小分子或化学治疗剂的缀合有影响。

图58-图73描绘了用于表征含有crispr核糖核蛋白(rnp)(tcell.001.01-tcell.001.15)、mrna(tcell.001.16-tcell.001.30)、质粒dna(tcell.001.31-tcell.001.45)和sirna(tcell.001.46-tcell.001.60)的代表性颗粒的实验结果并且在对应的组中用相同的配体图案化。

图58提供了来自tcell.001.1的数据。纳米颗粒的ζ电位为-3.24+/-0.32mv，其中90％的直径小于77nm。根据流式细胞术数据，这些纳米颗粒分别在活的cd4+和cd8a+pant细胞中产生99.16％和98.47％的有效crispr-gfp-rnp摄取(例如，参见以下的流式细胞术和成像数据)。这些调配物还反映了所有cynobm.002.75的物理化学性质，以及充当用于cynobm.002.82-cynobm.002.85中后续分层的基质的核心，其中plr10涂覆的颗粒与一个或多个阴离子多肽的可脱落阴离子涂层、核酸和/或一系列d:l比率、分子量和组合物的带电大分子复合。随后在cynobm.002.82-cynobm.002.85中加入带电聚合物或带电锚-接头-配体之前，将ple100+mrna涂覆于tcell.001.1。

图59提供了来自tcell.001.3的数据。纳米颗粒的ζ电位为-0.98+/-0.08mv，其中90％的直径小于65nm。尽管大小范围是理想的，但是根据流式细胞术数据，与tcell.001.1中在相同细胞群中达到约99％的效率的强阴离子相似大小的颗粒相比，这些纳米颗粒分别在活的cd4+和cd8a+pant细胞中产生11.6％和13.2％的有效crispr-gfp-rnp摄取。通过本文描述的实验显示，粒子大小与稳定的负ζ电位的关系及其方法和用途是可预测的约束条件。理想的纳米颗粒具有大部分<70nm、ζ电位<-5mv的粒子，并且本文所描述的可脱落阴离子涂层方法以及cynobm.002中描述的用于共同递送的多级分层可脱落基质实现了来自人和食蟹猴血液、骨髓和上文所提及的具体细胞的敏感原代细胞的稳定且极其高效的转染。tcell.001.3的降低的效率与tcell.01.27的结果形成鲜明对比，其中相比用于该特定crispr调配物的配体，相同的配体在改变的胺与磷酸盐与羧酸盐的比率下实现了mrna的稳定凝聚，而不是用于该mrna(例如，参见下文的流式细胞术和成像数据)。

图60提供了来自tcell.001.13的数据。纳米颗粒的ζ电位为2.19+/-0.08mv，其中90％的直径小于101nm。参见以下的流式细胞术/成像数据以获得活cd4+和cd8a+pant细胞中crispr-gfp-rnp摄取的效率。

图61提供了来自tcell.001.14的数据。纳米颗粒的ζ电位为-9.37+/-0.16mv，其中90％的直径小于111nm。根据流式细胞术数据，这些纳米颗粒分别在活的cd4+和cd8a+pant细胞中产生25.7％和28.6％的有效crispr-gfp-rnp摄取。(例如，参见以下的流式细胞术和成像数据)。

图62提供了来自tcell.001.16的数据。

图63提供了来自tcell.001.18的数据。这些颗粒的大小和ζ电位显示了平均颗粒大小为80.9nm、ζ电位为-20.26+/-0.15mv并且90％的颗粒的直径为39.2-129.8nm，指示在1.35的羧酸盐比磷酸盐(c:p)以及0.85的胺比磷酸盐的比率下的颗粒具有强稳定性，其中在包合阳离子锚-接头-配体后加入聚(谷氨酸)。请参考tcell.001.2、tcell.001.18和cynobm.002的所有ζ电位、大小、流式细胞数和显微镜数据，以获得与获得高效原代细胞转染相关的其它一般模式、工程约束、观察结果和经验测量(例如，参见表5和以下的流式细胞术和成像数据)。

图64提供了来自tcell.001.28的数据。图65提供了来自tcell.001.29的数据。图66提供了来自tcell.001.31的数据。图67提供了来自tcell.001.33的数据。图68提供了来自tcell.001.43的数据。图69提供了来自tcell.001.44的数据。图70提供了来自tcell.001.46的数据。图71提供了来自tcell.001.48的数据。图72提供了来自tcell.001.58的数据。图73提供了来自tcell.001.59的数据。

图74-图83描绘了表征食蟹猴骨髓细胞中使用的调配物的结果。

图74提供了cynobm.002.82的数据。如通过3％的活细胞中的胎儿血红蛋白表达所证明的，颗粒成功地删除了在整个骨髓红系祖细胞中的bcl11a红系增强子。cynobm.002.82纳米颗粒的ζ电位为2.96+/-0.14mv，其中90％的直径小于132nm并且50％的颗粒的直径小于30nm。根据流式细胞术数据，这些纳米颗粒分别在活的cd3+、cd45+和cd34+骨髓亚群中产生～48％、～53％和～97％的crisprrnp和cy5mrna的有效rispr-gfp-rnp+cy5_egfp_mrna的共同定位摄取，尽管仅有11.4％的总体骨髓活亚群靶向。

相比之下，具有由plr10、ple100、pde100和cas9rnp组成的相同核心模板但没有mrna共同递送组分或plr50的附加层的cynobm.002.75，根据流式细胞术数据，分别在活cd3+、cd45+和cd34+骨髓亚群中展示出约20％、～14％和～100％的有效crispr-gfp-rnp摄取，以及18.0％的总体骨髓活亚群靶向。

利用这些数据，可以推断出即使在看到混合骨髓原代群内的总体转染效率有微小增强的情况下，较大的颗粒可能也不太经得起选择性靶向的检验。颗粒的双模分布对原代细胞培养转染的影响仍有待确定。在先前的工作中，发现成骨细胞高效地内吞150-200nm的颗粒。显著地，大多数具有cynobm.002.82的颗粒群处于85nm的峰值以下，与tcell.001.1类似，但是在底层的ple、pde、mrna和cas9rnp的多肽-核糖核蛋白-mrna-蛋白质基质周围围绕着plr50的带正电荷的基质。

另外，3.0％的总活细胞对胎儿血红蛋白呈阳性，这些细胞中没有一个是cd34+，表现了cd34-红系祖细胞内的bcl11a红系祖细胞敲除群的成功的克隆扩增。(例如，参见以下的流式细胞术和成像数据)。结果还可能表示在内皮细胞、成骨细胞、破骨细胞和骨髓的其它细胞中的成功的靶向。

图75提供了来自cynobm.002.83的数据。如通过1.9％的活细胞(这些细胞中没有一个是cd34+)中的胎儿血红蛋白表达所证明的，颗粒成功地删除了在整个骨髓红系祖细胞中的bcl11a红系增强子。纳米颗粒具有-2.47+/-0.33mv的ζ电位，其中90％具有小于206nm的直径，导致相对于具有相同的il2-模拟肽涂层的cynobm.002.03，转染效率提高。尾部大约-50mv和+25mv的大电荷分布指示多分散颗粒群具有颗粒稳定性的变化，与cynobm.002.83类似，并且与具有-18mv的稳定阴离子单峰ζ电位的cynobm.002.84形成对比并且与其它crispr+mrna共同递送颗粒组(cynobm.002.82-cynobm.002.85)相比，细胞活力对应增加。就整体食蟹猴骨髓共同递送而言，次佳纳米颗粒组是cynobm.002.86，其表现出相似的-20mv的高净负电荷ζ电位和对应的高效转染、cd34克隆扩增和来自bcl11a红系增强子敲除的胎儿血红蛋白生成。根据流式细胞术数据，这些纳米颗粒在混合细胞群以及8.1％的全骨髓活亚群内的活cd34+骨髓细胞中产生～100％的有效crispr-gfp-rnp+cy5_egfp_mrna摄取。流式细胞术数据指示在食蟹猴骨髓细胞中诱导选择性cd34+增殖，指示cd34-红系祖细胞内bcl11a红系祖细胞敲除群的成功的克隆扩增。(例如，参见以下的流式细胞术和成像数据)。结果还表示在内皮细胞、成骨细胞、破骨细胞和/或骨髓的其它细胞中的成功的靶向。

图76提供了来自cynobm.002.84的数据。如在9.5％的活的全骨髓细胞中的胎儿血红蛋白蛋白质表达所证明的，颗粒成功地删除了全骨髓红系祖细胞中的bcl11a红系增强子，并且如通过每个选择性亚群中的cy5-mrna+和crispr-gfp-rnp+门所测量的，尽管转染效率中等，但cd34+、cd45或cd3+亚群中没有阳性的胎儿血红蛋白测量结果。cynobm.002.84纳米颗粒的ζ电位为-18.07+/-0.71mv，其中90％的直径小于205nm。高净负电荷指示稳定的颗粒形成。根据流式细胞术数据，这些纳米颗粒在活的cd3+、cd45+和cd34+骨髓细胞中分别产生76.5％、71％和～100％的有效crispr-gfp-rnp+cy5_egfp_mrna摄取，以及25.5％的全骨髓活亚群。另外，9.5％的总活细胞对胎儿血红蛋白呈阳性，这些细胞中没有一个是cd34+，这表现了cd34-红系祖细胞内的bcl11a红系祖细胞敲除群的成功的克隆扩增。(例如，参见以下的流式细胞术和成像数据)。结果还表示在内皮细胞、成骨细胞、破骨细胞和/或骨髓的其它细胞中的成功的靶向。

图77提供了来自cynobm.002.85的数据。纳米颗粒的ζ电位为-12.54+/-0.25mv，其中90％的直径小于186nm。根据流式细胞术数据，这些纳米颗粒分别在活的cd3+、cd45+和cd34+骨髓细胞中产生～33％、～23％和～100％的有效crispr-gfp-rnp+cy5_egfp_mrna摄取。(例如，参见以下的流式细胞术和成像数据)。结果可能表示在内皮细胞、成骨细胞、破骨细胞和骨髓的其它细胞中的成功的靶向。颗粒大小和电荷分布与随后的cynobm.002组及其在食蟹猴骨髓crispr和/或mrna递送中的预期的生物学性能一致。

图78提供了来自cynobm.002.86的数据。纳米颗粒的ζ电位为-20.02+/-0.10mv，其中90％的直径小于120nm。根据流式细胞术数据，这些纳米颗粒在活的食蟹猴骨髓中产生20.1％的crispr-gfp-rnp+cy5_egfp_mrna的有效共同递送，具有～68％、70％和～97％的有效cd3+、cd45+和cd34+分别的靶向。(例如，参见以下的流式细胞术和成像数据)。结果可能表示在内皮细胞、成骨细胞、破骨细胞和骨髓的其它细胞中的成功的靶向。高负电荷的ζ电位和90％的颗粒计数<200nm预测了高效率。

图79提供了来自cynobm.002.76的数据。纳米颗粒的ζ电位为-12.02+/-0.59mv，其中90％的直径小于135nm。根据流式细胞术数据，这些纳米颗粒分别在活的cd3+、cd45+和cd34+骨髓细胞中中产生18.4％、10.3％和100％的有效crispr-gfp-rnp摄取(例如，参见以下的流式细胞术和成像数据)。另外，如组蛋白模拟颗粒(如在cynobm.002.78中所见的，具有高负ζ电位、第10-第50百分位的颗粒大小为25.8-80.6nm、无大的聚合物)所期望的，颗粒展现出有限的毒性，在～500m处加入大体积峰的情况下，其展现出类似的ζ电位分布和大小。

图80提供了来自cynobm.002.77的数据。90％的纳米颗粒的直径低于254nm，其中大部分在171-254nm范围内。(例如，参见以下的流式细胞术和成像数据)。另外，按数量计算的第10-到第50百分位的颗粒为70-172nm，指示该群内的颗粒大小分布合理。与其中溶液中存在大量>200nm和/或具有大的、分布的ζ电位和/或非阴离子ζ电位的颗粒的其它研究一致，这些颗粒导致显著的细胞死亡。这些纳米颗粒总体上导致高摄取百分比，但是大量细胞(>90％)已经死亡。最终，根据流式细胞术数据，颗粒在活的cd3+、cd45+和cd34+骨髓细胞中、在crispr-gfp-rnp的检测限度下产生可忽略的摄取，并且在全骨髓活亚群中产生3.8％的crispr摄取。相反，具有相同表面涂层的90％的cynobm.002.83(crispr和mrna共同递送变体)颗粒低于200nm，平均数为121nm。通过与tcell.001.01-tcell.001.15中具有相似调配物的颗粒不同的方法生产的cynobm.002.75-cynobm.002.81中的其它颗粒具有更有利的大小和ζ电位分布并且在活的人cd4+和cd8a+t细胞中产生高转染效率(高达99％)。

图81提供了来自cynobm.002.78的数据。纳米颗粒的ζ电位为-11.72+/-0.79mv，其中90％的直径小于223nm。(例如，参见以下的流式细胞术和成像数据)。类似地，90％的具有相同表面涂层的cynobm.002.84(crispr和mrna共同递送变体)颗粒低于200nm，其中平均数为125nm，尽管cynobm.002.84的ζ电位显著更负(-18.07mv对-11.72mv)，指示利用阴离子可脱落层间台阶中间体增强稳定性，使初始cas9rnp电荷与plr10均匀化并且随后用配体或另外任选的分子量交错聚合物或多肽涂覆增强稳定性。这些单递送对共同递送(或间层对配体与rnp的直接缀合)纳米颗粒的不同物理化学性质及其各自的大小范围与转染效率和毒性强相关。

图82提供了来自cynobm.002.79的数据。纳米颗粒的直径小于200nm。这些纳米粒子导致骨髓中gfp-rnp的整体摄取非常低(3.7％)，但培养基中的细胞保留了极高的活力(70.0％对阴性对照的71.6％)。尽管总体摄取非常低，但是根据流式细胞仪数据，颗粒显示对活的cd3+细胞的选择性摄取为～9.0％、活的cd45+细胞为约4.4％、活的cd34+细胞为约100％，这是cd34+亚群中用于细胞计数的检测极限。(例如，参见以下的流式细胞术和成像数据)。结果表示混合细胞群内的cd34+造血干细胞的特异性靶向。

图83提供了来自cynobm.002.80的数据。纳米粒子的ζ电位为1.36+/-1.69mv。根据流式细胞术数据，这些纳米颗粒在活的cd34+骨髓细胞中产生8％的转染效率和～100％的有效crispr-gfp-rnp摄取，这是用于细胞计数的检测极限。(例如，参见以下的流式细胞术和成像数据)。结果可能表示在内皮细胞、成骨细胞、破骨细胞和骨髓的其它细胞中的成功的靶向。具有宽表面的～0mv处的均匀峰指示两性离子颗粒表面。高度的细胞活力指示该大小的颗粒具有良好的耐受性并且c-kit-受体-衍生的颗粒表面可能在细胞-细胞相互作用期间模拟骨髓内天然干细胞群表面标志物的呈递。

图84-图120：流式细胞术和成像数据

图84.在食蟹猴骨髓中的cynobm.002样品的未转染对照。显微镜图像-上图：数字相位对比；中图：gfp；下图：合并。流式细胞术数据-具有活力；cd34、cd3和cd45染色。

图85.nls-cas9-egfpbcl11agrnarnp的lipofectaminecrisprmax递送在活细胞中获得2.5％的转染效率并且造成显著的毒性，与食蟹猴骨髓中的阴性对照相比，cd45和cd3相对亚群的百分比显著降低。如通过剩余的cd3+细胞和可忽略不计的剩余的cd45+和cd34+的群的7.4％的有效靶向所例示的，lipofectaminecrisprmax没有表现出细胞选择性。显微镜图像-上图：数字相位对比；中图：gfp；下图：合并。

图86.cynobm.002rnp-仅对照示出了nls-cas9-egfpbcl11agrnarnp在没有递送载体但在转染前预先组合了两种有效负载的情况下在食蟹猴骨髓中获得可忽略的转染效率。尽管没有递送载体和最小事件，但是高度的共同定位指示核糖核蛋白复合物与mrna的缔合，以及crisprrnp的阴离子官能化的示例。(在该实例下，mrna充当rnp的松散缔合的可脱落涂层并且可以进一步用阳离子材料分层)。计算共同定位系数。x：活细胞中crispr摄取的％：

y：活细胞中mrna摄取的％

c：具有crispr和mrna的细胞的％

z：x或y的值，哪个较大

共同定位系数＝c/zcas9-mrna共同定位系数：92.2％

图87.cynobm.002.82显示，非特异性靶向的nls-cas9-egfp实现了将11.3％的有效mrna和11.4％的有效crispr递送到食蟹猴骨髓，其中共同定位系数为98.9％。亚细胞定位显示，非特异性靶向的nls-cas9-egfpbcl11agrnarnp与cy5mrna共同定位并且获得高转染效率。高度的共同定位确定离散颗粒装有两种有效负载。另外，可以看到cas9整齐地定位于与mrna分离的区室中，其中mrna在核相关cas9周围形成环状结构。这指示了两种有效负载的细胞溶质(mrna)对核(crispr)定位。显微镜图像-上图：数字相位对比；中图：cy5mrna；下图：合并以及上图：cas9-gfprnp；下图：与cas9-gfprnp共同定位的cy5mrna。

物理化学参数和附加观察结果参见以上数据。cynobm.002.82的ζ电位为2.96+/-0.14mv，其中90％的直径小于132nm并且50％的颗粒的直径小于30nm。这些纳米颗粒在活的cd3+、cd45+和cd34+骨髓亚群中分别产生45.5％、56.0％和97.3％的有效crispr-gfp-rnp+cy5_egfp_mrna摄取，尽管仅有11.4％的全骨髓活亚群靶向。cas9-mrna共同定位系数：94.8％。活的cd34+和crispr+：97.2％的活的cd34+。胎儿血红蛋白阳性：3.022％的活细胞

图88.cynobm.002.83实现了将8.1％的有效mrna和8.1％的有效crispr递送到食蟹猴骨髓，其中共同定位系数为93.0％。亚细胞定位显示，与nls-cas9-egfpbcl11agrnarnp缔合的il2衍生肽与cy5mrna共同定位并且获得高转染效率。高度的共同定位确定离散颗粒装有两种有效负载。另外，可以看到cas9整齐地定位于与mrna分离的区室中，其中mrna在核相关cas9周围形成环状结构。这指示了两种有效负载的细胞溶质(mrna)对核(crispr)定位。显微镜图像-上图：数字相位对比；中图：cy5mrna；下图：合并以及上图：cas9-gfprnp；下图：与cas9-gfprnp共同定位的cy5mrna。

物理化学参数和附加观察结果参见以上数据。这些纳米颗粒分别在活的cd3+、cd45+和cd34+骨髓细胞中产生～27％、41％和～100％的有效crispr-gfp-rnp+cy5_egfp_mrna摄取。cas9-mrna共同定位系数：93.0％。胎儿血红蛋白阳性：1.9％的活细胞

图89.如在9.5％的活的全骨髓细胞中的胎儿血红蛋白蛋白质表达所证明的，cynobm.002.84颗粒成功地删除了全骨髓红系祖细胞中的bcl11a红系增强子，并且如通过每个选择性亚群中的cy5-mrna+和crispr-gfp-rnp+门所测量的，尽管转染效率中等，但cd34+、cd45或cd3+亚群中没有阳性的胎儿血红蛋白测量结果。亚细胞定位显示，与nls-cas9-egfpbcl11agrnarnp缔合的e-选择蛋白衍生肽与cy5mrna共同定位并且获得高转染效率。高度的共同定位确定离散颗粒装有两种有效负载。另外，可以看到cas9整齐地定位于与mrna分离的区室中，其中mrna在核相关cas9周围形成环状结构。这指示了两种有效负载的细胞溶质(mrna)对核(crispr)定位。显微镜图像-上图：数字相位对比；中图：cy5mrna；下图：合并以及上图：cas9-gfprnp；下图：与cas9-gfprnp共同定位的cy5mrna。

物理化学参数和附加观察结果参见以上数据。根据流式细胞术数据，这些纳米颗粒在活的cd3+、cd45+和cd34+骨髓细胞中分别产生76.5％、71％和～100％的有效crispr-gfp-rnp+cy5_egfp_mrna共同定位摄取，以及～25.5％的全骨髓活亚群。另外，9.5％的总活细胞对胎儿血红蛋白呈阳性，这些细胞中没有一个是cd34+、cd3+或cd45+，表现了cd34-红系祖细胞内的bcl11a红系祖细胞敲除群的成功的克隆扩增。cas9-mrna共同定位系数：97.1％。胎儿血红蛋白(hbf)阳性：9.5％的活细胞14％的cd34+细胞；cd34+和hbf+的0％的共同定位

图90.cynobm.002.85实现了将5.2％的有效mrna和5.3％的有效crispr递送到食蟹猴骨髓，其中共同定位系数为87.2％。尽管将5.3％的有效crispr递送到活细胞，但cynobm.002.85并未如在其它共同递送实施例中所见的导致伴随而来的胎儿血红蛋白阳性细胞的增加。亚细胞定位显示，与nls-cas9-egfpbcl11agrnarnp缔合的scf衍生肽与cy5mrna共同定位并且获得高转染效率。高度的共同定位确定离散颗粒装有两种有效负载。另外，可以看到cas9整齐地定位于与mrna分离的区室中，其中mrna在核相关cas9周围形成环状结构。这指示了两种有效负载的细胞溶质(mrna)对核(crispr)定位。显微镜图像-上图：数字相位对比；中图：cy5mrna；下图：合并以及上图：cas9-gfprnp；下图：与cas9-gfprnp共同定位的cy5mrna。

附加物理化学特性参见以上数据。这些纳米颗粒分别在活的cd3+、cd45+和cd34+骨髓细胞中产生～33％、～23％和～100％的有效crispr-gfp-rnp+cy5_egfp_mrna摄取。cas9-mrna共同定位系数：87.2％。胎儿血红蛋白阳性：0.9％的活细胞

图91.cynobm.002.86实现了将20.1％的有效mrna和21.8％的有效crispr递送到食蟹猴骨髓，其中共同定位系数为98.6％。亚细胞定位显示，异质三价靶向的il2-、e-选择蛋白和scf-衍生的nls-cas9-egfpbcl11agrnarnp与cy5mrna共同定位并且获得高转染效率。高度的共同定位确定离散颗粒装有两种有效负载。另外，可以看到cas9整齐地定位于与mrna分离的区室中，其中mrna在核相关cas9周围形成环状结构。这指示了两种有效负载的细胞溶质(mrna)对核(crispr)定位。显微镜图像-上图：数字相位对比；中图：cy5mrna；下图：合并以及上图：cas9-gfprnp；下图：与cas9-gfprnp共同定位的cy5mrna；

附加物理化学特性参见以上数据。cas9-mrna共同定位系数：91.3％。胎儿血红蛋白阳性：7.6％的活细胞

图92.cynobm.002.75显示，具有可脱落阴离子多肽涂层的非特异性靶向的nls-cas9-egfpbcl11agrnarnp在活的食蟹猴骨髓中获得了18.0％的转染效率。总体而言，20％的活的cd3+t细胞在本文的混合群食蟹猴骨髓培养模型中是crispr+，而在人原代pant细胞中97-99％的活的cd4和cd8at细胞是tcell.001中的crispr+。相同调配物的颗粒大小在tcell1中更小且更均匀，所述制剂通过流体处理机器人而不是通过手工合成。附加的定性和定量注释以及数据比较参见以上数据。上图：数字相位对比；中图：gfp；下图：合并。

图93.cynobm.002.76显示，与食蟹猴骨髓中的阴性对照相比，双组蛋白片段缔合的和非特异性靶向的nls-cas9-egfpbcl11agrnarnp获得13.1％的转染效率和有限毒性。18％、10％和0％的cd3+、cd45+和cd34+活亚群是crispr+。附加物理化学特性和观察结果参见以上数据。上图：数字相位对比；中图：gfp；下图：合并。

图94.cynobm.002.77显示，与食蟹猴骨髓中的阴性对照相比，与nls-cas9-egfpbcl11agrnarnp缔合的同质价态靶向的il2衍生肽获得3.8％的转染效率和增强的活力。～90％的转染细胞死亡。最终，颗粒在活的cd3+、cd45+和cd34+骨髓细胞中、在crispr-gfp-rnp的检测限度下产生可忽略的摄取，指示剩余的3.8％的活的crispr+细胞并非来自这些亚群。大小数据支持在大颗粒多分散性和～999nm的第90体积百分位颗粒大小中的毒性的致病作用。附加的物理化学性质参见以上数据。上图：数字相位对比；中图：gfp；下图：合并。

图95.cynobm.002.78显示，与nls-cas9-egfpbcl11agrnarnp缔合的同质价态靶向的e-选择蛋白衍生肽获得～71％的总体转染效率(包含死细胞)，仅有4.5％的活细胞仍在食蟹猴骨髓中转染。这指示了颗粒毒性并且可能与大尺寸分布相关，尽管以数量计，50％的颗粒为33.1-113.1nm。包括溶液中大部分颗粒质量和容量的>250nm的颗粒可能导致该实验的活力降低。在该实施例中，cd45+和cd3+亚群密度也是多方面减少的。更详细的比较来自相同转染的纳米颗粒组的物理化学特性和定性观察结果参见以上数据。上图：数字相位对比；中图：gfp；下图：合并。

图96.cynobm.002.79显示，与食蟹猴骨髓中的阴性对照相比，与nls-cas9-egfpbcl11agrnarnp缔合的同质价态靶向的scf衍生肽获得3.7％的转染效率和极好的活力。

这些纳米粒子导致骨髓中gfp-rnp的整体摄取非常低(3.7％)，但培养基中的细胞保留了极高的活力(69.0％对阴性对照的71.6％)。尽管总体摄取非常低，但是颗粒显示对活的cd3+细胞的选择性摄取为～5％、活的cd45+细胞为约～4％并且活的cd34+细胞为约100％(后者在数值上处于检测极限)。高度的细胞活力加上呈强负性的ζ电位以及显著多于其它组的cd45+细胞，显示了了scf模拟颗粒表面在建立干细胞龛靶向和增殖和/或存活技术中的多因素作用。附加的物理化学参数参见以上数据。

上图：数字相位对比；中图：gfp；下图：合并。.

图97.cynobm.002.80显示，与nls-cas9-egfpbcl11agrnarnp缀合的同源价态靶向的c-kit-(cd117)衍生肽获得了8.097％的转染效率。转染效率分别为3.3％、2.4％，并且分别处于cd3+、cd45+和cd34+活亚群的检测极限，指示对cd3+和cd45+细胞的低选择性。更多的定量和定性数据参见以上数据。上图：数字相位对比；中图：gfp；下图：合并。(续)：流式细胞术数据。

图98.cynobm.002.81显示，异质三价靶向的il2-、e-选择蛋白-和scf衍生的nls-cas9-egfpbcl11agrnarnp在食蟹猴骨髓中获得5％的转染效率，尽管仅有0.48％的细胞是cd34+，但是～10％的转染细胞是活的cd34+细胞。这指示cd34+细胞的有效的选择性转染接近100％。上图：数字相位对比；中图：gfp；下图：合并。.

图99.cynobm.002rnp-仅对照的定性图像示出了nls-cas9-egfpbcl11agrnarnp在没有递送载体的情况下在食蟹猴骨髓中获得轻度的阳性信号。上图：数字相位对比；中图：gfp；下图：合并。

图100.hsc.004(纳米颗粒69-74，参见表5)高含量筛选。在原代人cd34+造血干细胞中转染后12-15小时的hsc.004cy5mrna递送的荧光显微图像(cy5mrna)。利用mrna调配物的这种特定实施例，用scf肽和e-选择蛋白进行异质双价靶向，以及用e-选择蛋白而不用scf肽进行同质价态靶向，实现比lipofectamine信使max更高的转染效率。hsc.001.69：a1–a6；hsc.001.70：b1–b6；hsc.001.71：c1–c6；hsc.001.72：d1–d6；hsc.001.73：e1–e6；hsc.001.74：f1–f6；hsc.004lipofectamine信使max剂量1：g1–g2和g4–g5；tc.001lipofectamine信使max剂量2：h1–h2和h4–h5；tc.001阴性：g3、g6、h3、h6

图101.tcell.001(纳米颗粒1-15，参见表5)高含量筛选。对tc.001.1-tc.001.60实行机器人调配物，代表4个有效负载(crisprrnp、mrna、sirna和pdna)中的15个配体。示出了t细胞crispr递送和定性转染效率的实施例-复合显微镜下转染后12-15小时的tcell.001crispr-egfprnp递送到原代人pant细胞的缩略图。板布局：tc.001.1：a1–c1；tc.001.3：d1–f1；tc.001.4：a2–c2；tc.001.5：d2–f2；tc.001.6：a3–c3；tc.001.7：d3–f3；tc.001.8：a4–c4；tc.001.9：d4–f4；tc.001.10：a5–c5tc.001.11：d5–f5；tc.001.12：a6–c6；tc.001.13：d6–f6；tc.001.14：a7–a9；tc.001.15：b7–b9；tc.001.2：a10–a12；tc.001lipofectaminecrisprmax剂量1：b10–b12；tc.001lipofectaminecrisprmax剂量2：c7–c9；仅tc.001rnp：c10–c12；tc.001阴性：d7–e12。

图102.tcell.001lipofectaminecrisprmax。在转染后24小时，lipofectaminecrisprmax在人原代pant细胞的活的cd4+和cd8a+亚群中分别获得4.7％和4.8％的nls-cas9-egfprnp的有效递送。总体而言，12.5％的crispr+细胞和65.9％的整体细胞是活的。

图103：在转染后24小时，tcell.001.1在人原代pant细胞的活的cd4+和cd8a+亚群中分别表现出99.163％和98.447％的有效的非特异性靶向的crispr-gfp核糖核蛋白摄取。总体而言，60.2％的crispr+细胞和57.2％的整体细胞是有活力的。

图104.在转染后24小时，tcell.001.2，非特异性靶向的聚乙二醇化对照，在人原代pant细胞的活的cd4+和cd8a+亚群中分别表现出5.5％和6.9％的有效的crispr-gfp核糖核蛋白摄取。总体而言，5.6％的crispr+细胞和40.5％的整体细胞是有活力的。

图105.tcell.001.3显示，在转染后24小时，与crispr-gfp核糖核蛋白缀合的同质价态靶向的唾液酸粘附素衍生肽在人原代pant细胞的活的cd4+和cd8a+亚群中分别产生11.6％和13.2％的有效摄取。总体而言，40.0％的crispr+细胞和79.2％的整体细胞是活的。

图106.tcell.001.4显示，在转染后24小时，与crispr-gfp核糖核蛋白缀合的同质价态靶向的cd80衍生肽在人原代pant细胞的活的cd4+和cd8a+亚群中分别产生6.8％和8.8％的有效摄取。总体而言，12.9％的crispr+细胞和60.2％的整体细胞是活的。

图107.tcell.001.5显示，在转染后24小时，与crispr-gfp核糖核蛋白缀合的同质价态靶向的cd80衍生肽在人原代pant细胞的活的cd4+和cd8a+亚群中分别产生10.3％和10.9％的有效的crispr-gfp核糖核蛋白摄取。总体而言，48.3％的crispr+细胞和85.1％的整体细胞是活的。注意，在阴性对照的9个孔中(对于tcell.001流式细胞术，n＝3阴性)，活力分别为81.4％、84.7％和82.5％，这表明c末端锚定的、cd80衍生的cd28靶向肽可能对培养液中未转染的细胞有轻微的生存促进作用。相反，tcell.001.4，相同的n末端锚定肽，显示出明显的毒性，tc.001.6和tc.001.7也是如此，它们也是cd80衍生片段，具有针对cd28跨膜受体的不同变构。

图108.tcell.001.6显示，在转染后24小时，与crispr-gfp核糖核蛋白缀合的同质价态靶向的cd86衍生肽在人原代pant细胞的活的cd4+和cd8a+亚群中分别产生1.7％和2.9％的有效摄取。总体而言，6.8％的crispr+细胞和69.1％的整体细胞是活的。

图109.tcell.001.7显示，在转染后24小时，与crispr-gfp核糖核蛋白缀合的同质价态靶向的cd86衍生肽在人原代pant细胞的活的cd4+和cd8a+亚群中分别产生1.6％和2.1％的有效摄取。总体而言，10.3％的crispr+细胞和76.4％的整体细胞是活的。

图110.tcell.001.8显示，在转染后24小时，与crispr-gfp核糖核蛋白缀合的同质价态靶向的cd86衍生肽在人原代pant细胞的活的cd4+和cd8a+亚群中分别产生14.5％和16.0％的有效摄取。总体而言，39.1％的crispr+细胞和76.3％的整体细胞是活的。

图111.tcell.001.9显示，在转染后24小时，与crispr-gfp核糖核蛋白缀合的同质价态靶向的4-1bb衍生肽在人原代pant细胞的活的cd4+和cd8a+亚群中分别产生3.6％和3.2％的有效摄取。总体而言，27.5％的crispr+细胞和87.8％的整体细胞是活的。注意，在阴性对照的9个孔中(对于tcell.001流式细胞术，n＝3阴性)，活力分别为81.4％、84.7％和82.5％，这表明具有先天的t细胞生存信号的c末端锚定的、4-1bb衍生的cd137靶向肽可能对培养液中未转染的细胞有轻微的生存促进作用。

图112.tcell.001.10显示，在转染后24小时，与crispr-gfp核糖核蛋白缀合的同质价态靶向的4-1bb衍生肽在人原代pant细胞的活的cd4+和cd8a+亚群中分别产生5.8％和5.4％的有效摄取。总体而言，30.8％的crispr+细胞和84.2％的整体细胞是活的。注意，在阴性对照的9个孔中(对于tcell.001流式细胞术，n＝3阴性)，活力分别为81.4％、84.7％和82.5％，这表明具有先天的t细胞生存信号的c末端锚定的、4-1bb衍生的cd137靶向肽在培养液中没有表现出总体毒性。

图113.tcell.001.11显示，在转染后24小时，与crispr-gfp核糖核蛋白缀合的同质价态靶向的cd3-ab衍生肽在人原代pant细胞的活的cd4+和cd8a+亚群中分别产生12.9％和12.4％的有效摄取。总体而言，50.0％的crispr+细胞和77.6％的整体细胞是活的。

图114.tcell.001.12显示，在转染后24小时，与crispr-gfp核糖核蛋白缀合的同质价态靶向的cd3-ab衍生肽在人原代pant细胞的活的cd4+和cd8a+亚群中分别产生9.0％和9.5％的有效摄取。总体而言，38.9％的crispr+细胞和80.7％的整体细胞是有活力的。

图115.tcell.001.13显示，在转染后24小时，与crispr-gfp核糖核蛋白缀合的同质价态靶向的il2衍生肽在人原代pant细胞的活的cd4+和cd8a+亚群中分别产生25.7％和28.6％的有效摄取。总体而言，40.3％的crispr+细胞和68.1％的整体细胞是有活力的。

图116.tcell.001.14显示，在转染后24小时，与crispr-gfp核糖核蛋白缀合的同质价态靶向的il2衍生肽在人原代pant细胞的活的cd4+和cd8a+亚群中分别产生24.9％和25.8％的有效摄取。总体而言，45.9％的crispr+细胞和70.1％的整体细胞是活的。

图117.tcell.001.15，十二价态靶向的12配体变体，不会导致内吞摄取或crispr递送。总体而言，59.8％的整体细胞是活的。

图118.tcell.001阴性对照。来自阴性(未转染)对照的9个孔中的一个孔的代表性结果。总体而言，细胞接种后52小时(转染后24小时)，81.4％、84.7％和82.5％的整体细胞是活的。

图119.通过利用siglec衍生物进行糖基化细胞表面标记物靶向，blood.002在人全血的淋巴细胞门中获得60％-97％的mrna递送效率；示出了通过attunenxt流式细胞仪测定的cy5标记的egfpmrna。与聚乙二醇化对照相比，配体靶向是细胞信号的显著增强子。预测纳米颗粒行为的附加的物理化学性质参见以上数据。blood.002对照：未转染。blood.002.88：cd45-和neu5ac靶向的siglec衍生物(在阴离子聚合物之前加入阳离子锚-接头-配体肽)。blood.002.89：cd45-和neu5ac靶向的siglec衍生物(在阴离子聚合物之后加入阳离子锚-接头-配体肽)。blood.002.90：聚乙二醇化对照(在阴离子聚合物之前加入阳离子锚-peg)。blood.002.91：非特异性靶向变体。blood.002.92：无有效负载的cd45-和neu5ac-靶向的siglec衍生物(锚-接头-配体直接与阴离子聚合物缀合，阴性荧光对照)。

图120.tcell.001.27显示，如通过流式细胞术所测量的，在转染后5小时，同质价态靶向的siglec衍生肽在人原代pant细胞的活的cd8a+和cd4+亚群中指导45％的有效cy5mrna摄取。这些颗粒的大小和ζ电位显示了平均颗粒大小为171nm、ζ电位为-25.5+/-0.15mv，指示在1.35的羧酸盐比磷酸盐(c:p)以及0.85的胺比磷酸盐的比率下的颗粒具有强稳定性，其中在包合阳离子锚-接头-配体后加入聚(谷氨酸)。tcell.001.2和tcell.001.18的ζ电位和大小数据参见以上数据。附加的定量细节参见以上数据。右上：明视场；右中：cy5mrna；右下：合并上图：阴性对照的明视场；下图：阴性对照的cy5通道。

实施例9

图121.用于核糖核蛋白和蛋白质递送的基本原理。crisprrnp的电荷密度图允许确定是否应添加阴离子或阳离子肽/材料以在蛋白质表面上形成稳定的带电层。在一个实施例中，暴露的核酸(阴离子)和阴离子电荷袋在加入带电阴离子之前充当带电阳离子的强静电锚定位点，或者充当它们自己的配体-接头阴离子锚。比例尺：电荷。

图122.用于核糖核蛋白和蛋白质递送的基本原理。睡美人转座子的电荷密度图允许确定是否应添加阴离子或阳离子肽/材料以在蛋白质表面上形成稳定的带电层。在另一个实施例中，阳离子电荷袋在加入带电阳离子之前充当带电阴离子的强静电锚定位点，或者作为它们自己的配体-接头-阴离子锚定结构域。比例尺：电荷。

图123.在(2)加入阳离子锚作为(2a)锚-接头-配体或独立的阳离子锚，添加或不添加(2b)后续多层化学、多种核酸或带电治疗剂的共同递送或通过交联进行层稳定之前的(1)锚定到crisprrnp表面上的阳离子位点的示例性阴离子肽(9-10个氨基酸长，大约按比率缩放到10nm直径的crisprrnp)。

手绘图从左到右转换为文本：‘阳离子锚’。‘间隔区’。‘配体’。‘和/或’。‘2d’。‘阳离子聚合物和/或多肽’。‘2b然后是层间化学’。

图124.用于有效负载与带电蛋白质核心模板的共同递送的基本原理。基于可以包含cas9rnp或任何均匀或两性离子带电表面的核心模板的添加顺序和静电基质组合物的实例。示出了用于使用各种聚合物均化两性离子表面电荷的方法。由与grna结合的crispr-cas9rnp组成的～10nm核心颗粒与两性离子结构域一起示出。简而言之，在加入带相反电荷的聚合物之前，可以加入阳离子聚合物或阴离子聚合物以使表面电荷均匀化。阴离子成分的交错分子量被证明可以提高具有rnp核心和mrna-ple层间的颗粒的转染效率和基因编辑效率，其中cynobm.002.82-cynobm.002-86中的多个表面涂层对cynobm.002.75-cynobm.002.81中的单个有效负载递送变体。带电核心模板实施例包括任何带电表面，所述带电表面包含带电树枝状大分子或寡糖-树枝状大分子、重组或合成组蛋白二聚体/三聚体/四聚体/八聚体、纳米钻石、金纳米颗粒、量子点、mri造影剂或其与以上的组合。

手绘图从左到右转换为文本：‘带负电荷的涂层可以用阳离子聚合物或锚-接头-配体层压，其中锚是阳离子的。’‘氨基糖’。‘带电糖胺聚糖’。‘pdna’。‘共同递送’。‘暴露的grna’。‘净负可脱落聚合物涂层’。‘聚糖’。‘cas9上的阳离子蛋白质结构域’。‘～10nmcas9rnp’。‘cas9上的阳离子蛋白质结构域’。‘plr’。‘pde(5-100)’。‘ple(5-100)’。‘cas9上的阴离子蛋白质结构域’。‘mrna’。‘糖肽上的支化阳离子聚合物’。“组蛋白”。‘sirna’。‘带负电荷的涂层也可以是阴离子锚-接头-配体或独立的阴离子基质组合物的结构域。一致聚合物的交错mw提高了胶体稳定性和基因编辑效率’。

实施例10

图125.肽工程-用于il2r靶向的新型il2模拟片段。白细胞介素-2(左)与白细胞介素-2受体(右)结合(pdb：1z92)选自il2(pdb1z92)的序列asn(33)-pro(34)-lys(35)-leu(36)-thr(37)-arg(38)-met(39)-leu(40)-thr(41)-phe(42)-lys(43)-phe(44)-tyr(45)与il2受体α链的活性结合区域相关。通过选择il2r与il2的相互作用基序来工程化互补的结合：此处，为来自il2受体的两个结合基序选择序列cys(3)-asp(4)-asp(5)-asp(6)-met(25)-leu(26)-asn(27)-cys(28)-glu(29)。

图126：肽工程-cd3概念下的新型抗体衍生的“活性结合袋”工程验证。选自cd3抗体(pdb1xiw)的序列thr(30)-gly(31)-asn(52)-pro(53)-tyr(54)-lys(55)-gly(56)-val(57)-ser(58)-thr(59)-tyr(101)-tyr(102)-gly(103)-asp(104)与cd3ε和δ链的活性结合区域相关。氨基酸的顺序被重布置成反映结合袋中肽的2维平面的结合动力学，所述肽不再具有由较大蛋白质维持的三级结构。这种数据降维导致：thr(59)-ser(58)-val(57)-gly(56)-lys(55)-tyr(54)-pro(53)-asn(52)-thr(30)-gly(31)-tyr(101)-tyr(102)-gly(103)-asp(104).

图127：肽工程-用于cd45糖基化靶向的新型siglec衍生物。与n-乙酰神经氨酸(neu5ac)复合的唾液酸粘附素n-末端的pdb渲染(rcspdb1oda)。在渲染中位于唾液酸粘附素近侧的唾液酸粘附素片段用于靶向糖基化的cd45和其它复合的细胞表面糖蛋白。它在tcell.001.3中成功靶向具有crisprrnp的t细胞以及在blood.002.1-blood.002.2中成功靶向全血淋巴细胞门中的mrna。配体序列为snrwldvk(seqidno:xx)。

图128：肽工程-用于c-kit靶向的新型scf片段。虚线圆圈-干细胞因子(rcspdb1scf)的信号肽结构域代表c-kit活性所必需的二聚体结构域。可以在在cynobm.002.79(～5％的效率)和cynobm.002.85(～56％的效率)之间比较和对比配体呈现对由于特定纳米颗粒表面大小+scf涂层密度引起的细胞摄取的影响。另外，人cd34+造血干细胞转染的定性图像显示了对比，其中e-选择蛋白+scf片段(hsc.004.73)实现了高效率，但scf片段本身未实现高效率(hsc.004.74)。行为的显着差异表明二聚体肽在产生内吞线索和随后核靶向核酸和/或核糖核蛋白材料中的特定作用。配体序列为ekfilkvrpafkav(seqidno:xx)(mscf)；和ekfilkvrpafkav(seqidno:xx)(rmscf)。

图129：肽工程-用于膜结合scf靶向的新型ckit受体片段。干细胞因子靶向肽的合理设计衍生自c-kit，以模拟内皮细胞和骨髓细胞上的造血干细胞滚动行为的行为并且提高系统转染效率(参见cynobm.002.80)。评估折叠的序列：名称scfn，序列：rrrrrrrrrggggsggggsegicrnrvtnnvkdvtklvanlpk(seqidno:xx)。用rosetta和namd模拟包评估序列-rosetta结果：将缩短的序列放置于rosetta中用于从头折叠(ggsegicrnrvtnnvkdvtklvanlpk)(seqidno:xx)。

图130：肽工程-ckit受体片段(续)。用分子动力学模拟的锚定-接头-配体的锚片段保持在适当位置以允许模拟如将在纳米颗粒表面上呈现的熵有利的构象。每个结果含有相同的评分因子，这意味着很难确定这些结构中的任何结构是否是优选的。rosetta也不进行折叠动力学，因此很可能这些序列不会折叠成螺旋状结构。

namd结果：因为rosetta不进行折叠动力学，所以检查完整序列是否会快速折叠成二级结构。在namd中使用副本交换分子动力学(remd)在介于300-500k之间的16或32个副本上进行模拟并且在每个复制品上模拟10ns。锚部分(聚-r)被固定成线性以模拟蛋白质与颗粒的结合。示出了最低能量快照。

对衍生自kit的序列的进一步分析显示，它可能不具有大量固有顺序。橙色卡通部分属于最初从kit中选择的序列。

图131：肽工程-ckit受体片段(续)。通过用氨基异丁酸修饰关键疏水性结构域，将具有强配体-接头的稳定化随机卷曲肽自折叠成稳定的螺旋肽，用于有效的配体呈现。

蓝色链代表kit中存在的更有序的螺旋，范围从残基71到94：snysiidklvnivddlvecvkens。具有锚和接头的kit残基71到94的namd模拟：rrrrrrrrrggggsggggssnysiidklvnivddlvecvkens

聚合成其中链与接头残基在很大程度上相互作用的结构。对于残基71到94，存在通过与klt中的其它两个螺旋相互作用来稳定螺旋的疏水性残基。疏水性残基以红色示出(下划线)：snysiidklvnivddlvecvkens。改变序列以移除疏水性残基并且用氨基异丁酸(aib)取代，帮助诱导螺旋折叠，以得到以下序列：kit7194_aib1：snysaibadkaibanaibaddaibaeaibakens.含有aib的序列在rink树脂上合成并且在游离胺和酰化胺(ac)上分离。通过圆二色性检查二级结构。

图132：肽工程-ckit受体片段(续)scf_mckit_(4gs)2_9r_n和scf_mckit(ac)_(4gs)2_9r_n的圆二色性。配体末端的乙酰化可以用于中和带电多肽末端的电荷。上图：kit7194_aib1的cd在222附近略有下降并且在208附近大幅下跌，与包含aib单元的α-螺旋和螺旋的二级结构一致。下图：kit7194_aib1_ac示出了与kit7194_aib1相似的cd。有时酰化可以帮助折叠，但似乎没有必要。乙酰化也可以帮助配体相互作用，因为终端胺需要是中性的而不是带电荷的。完整锚-接头-kit7194_aib1构建体：rrrrrrrrr-ggggsggggs-snysaibadkaibanaibaddaibaeaibakens.

图133：肽工程-ckit受体片段。在用氨基异丁酸修饰关键疏水残基后，scf_mckit(ac)_(4gs)2_9r_n的稳定构象。

序列表

<110>a·r·沃森

c·福斯特

<120>用于核酸和/或蛋白有效负载递送的组合物和方法

<130>lgdl-004

<150>us62/443,522

<151>2017-01-06

<150>us62/434,344

<151>2016-12-14

<150>us62/443,567

<151>2017-01-06

<150>us62/517,346

<151>2017-06-09

<160>277

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>39

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>1

hisglygluglythrphethrseraspleuserlysglnmetgluglu

151015

glualavalargleupheileglutrpleulysasnglyglyproser

202530

serglyalaproproproser

35

<210>2

<211>39

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>2

hisglygluglythrphethrseraspleucyslysglnmetgluglu

151015

glualavalargleupheileglutrpleulysasnglyglyproser

202530

serglyalaproproproser

35

<210>3

<211>86

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>3

lysargleutyrcyslysasnglyglyphepheleuargilehispro

151015

aspglyargvalaspglyvalargglulysseraspprohisilelys

202530

leuglnleuglnalaglugluargglyvalvalserilelysglyval

354045

cysalaasnargtyrleualametlysgluaspglyargleuleuala

505560

serlyscysvalthraspglucysphephephegluargleugluser

65707580

asnasntyrasnthrtyr

85

<210>4

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>4

lysasnglyglyphepheleuargilehisproaspglyargvalasp

151015

glyvalargglulysser

20

<210>5

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>5

hisphelysaspprolys

15

<210>6

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>6

leugluserasnasntyrasnthr

15

<210>7

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>7

metilealaserglnpheleuseralaleuthrleuvalleuleuile

151015

lysgluserglyala

20

<210>8

<211>38

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>8

metvalpheprotrpargcysgluglythrtyrtrpglyserargasn

151015

ileleulysleutrpvaltrpthrleuleucyscysasppheleuile

202530

hishisglythrhiscys

35

<210>9

<211>38

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>9

metilepheprotrplyscysglnserthrglnargaspleutrpasn

151015

ilephelysleutrpglytrpthrmetleucyscysasppheleuala

202530

hishisglythraspcys

35

<210>10

<211>28

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>10

metilepheprotrplyscysglnserthrglnargaspleutrpasn

151015

ilephelysleutrpglytrpthrmetleucyscys

2025

<210>11

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>11

thrhisargpropromettrpserprovaltrppro

1510

<210>12

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>12

argarggluthralatrpala

15

<210>13

<211>86

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>13

lysargleutyrcyslysasnglyglyphepheleuargilehispro

151015

aspglyargvalaspglyvalargglulysseraspprohisilelys

202530

leuglnleuglnalaglugluargglyvalvalserilelysglyval

354045

cysalaasnargtyrleualametlysgluaspglyargleuleuala

505560

serlyscysvalthraspglucysphephephegluargleugluser

65707580

asnasntyrasnthrtyr

85

<210>14

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>14

cyslysasnglyglyphepheleuargilehisproaspglyargval

151015

aspglyvalargglulysser

20

<210>15

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>15

argargargargargargargargarg

15

<210>16

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>16

hishishishishishis

15

<210>17

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>17

glyalaproglyalaprocysalapro

15

<210>18

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>18

glyalaproglyalaprocysalaprocys

1510

<210>19

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>19

cysglyalaproglyalaproglyalapro

1510

<210>20

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>20

glyserglyglyser

15

<210>21

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>21

glyglyserglyglyser

15

<210>22

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>22

glyglyglyser

1

<210>23

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>23

glyglysergly

1

<210>24

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>24

glyglyserglygly

15

<210>25

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>25

glyserglysergly

15

<210>26

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>26

glyserglyglygly

15

<210>27

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>27

glyglyglysergly

15

<210>28

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>28

glysersersergly

15

<210>29

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>29

glyglyglyglyglyserglyglyglyglygly

1510

<210>30

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>30

glyglyglyglyglyserglyglyglyglyser

1510

<210>31

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>31

glyglyglyglyglyserglyglyglyglyglycys

1510

<210>32

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>32

cysglyglyglyglyglyserglyglyglyglygly

1510

<210>33

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>33

glyglyglyglyglyserglyglyglyglysercys

1510

<210>34

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>34

cysglyglyglyglyglyserglyglyglyglyser

1510

<210>35

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>35

lysalaleuala

1

<210>36

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>36

glyalaleuala

1

<210>37

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>37

cyslysalaleuala

15

<210>38

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>38

lysalaleualacys

15

<210>39

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>39

cysglyalaleuala

15

<210>40

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>40

glyalaleualacys

15

<210>41

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>41

argargargargargargargargargglyalaproglyalaprogly

151015

alaprocys

<210>42

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>42

cysglyalaproglyalaproglyalaproargargargargargarg

151015

argargarg

<210>43

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>43

cyslysasnglyglyphepheleuargilehisproaspglyargval

151015

aspglyvalargglulysser

20

<210>44

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>44

lysasnglyglyphepheleuargilehisproaspglyargvalasp

151015

glyvalargglulyssercys

20

<210>45

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>45

argargargargargargargargargglyalaproglyalaprogly

151015

alaproargarggluthralatrpala

2025

<210>46

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>46

argarggluthralatrpalaglyalaproglyalaproglyalapro

151015

argargargargargargargargarg

2025

<210>47

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>47

argargargargargargargargargglyalaproglyalaprogly

151015

alaproargglyasp

20

<210>48

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>48

argglyaspglyalaproglyalaproglyalaproargargargarg

151015

argargargargarg

20

<210>49

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>49

cysargglyasp

1

<210>50

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>50

argglyaspcys

1

<210>51

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>51

argargargargargargargargargglyalaproglyalaprogly

151015

alaprothrhisargpropromettrpserprovaltrppro

202530

<210>52

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>52

thrhisargpropromettrpserprovaltrpproglyalaprogly

151015

alaproglyalaproargargargargargargargargarg

202530

<210>53

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>53

cysthrhisargpropromettrpserprovaltrppro

1510

<210>54

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>54

cysprothrhisargpropromettrpserprovaltrppro

1510

<210>55

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>55

thrhisargpropromettrpserprovaltrpprocys

1510

<210>56

<211>39

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>56

argargargargargargargargargglyalaproglyalaprogly

151015

alaprometilealaserglnpheleuseralaleuthrleuvalleu

202530

leuilelysgluserglyala

35

<210>57

<211>39

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>57

metilealaserglnpheleuseralaleuthrleuvalleuleuile

151015

lysgluserglyalaglyalaproglyalaproglyalaproargarg

202530

argargargargargargarg

35

<210>58

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>58

cysmetilealaserglnpheleuseralaleuthrleuvalleuleu

151015

ilelysgluserglyala

20

<210>59

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>59

metilealaserglnpheleuseralaleuthrleuvalleuleuile

151015

lysgluserglyalacys

20

<210>60

<211>40

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>60

argargargargargargargargargglyalaproglyalaprogly

151015

alaprolysasnglyglyphepheleuargilehisproaspglyarg

202530

valaspglyvalargglulysser

3540

<210>61

<211>40

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>61

lysasnglyglyphepheleuargilehisproaspglyargvalasp

151015

glyvalargglulysserglyalaproglyalaproglyalaproarg

202530

argargargargargargargarg

3540

<210>62

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>62

serglyargglylysglnglyglylysalaargalalysalalysthr

151015

argserserarg

20

<210>63

<211>39

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>63

serglyargglylysglnglyglylysalaargalalysalalysthr

151015

argserserargalaglyleuglnpheprovalglyargvalhisarg

202530

leuleuarglysglyglygly

35

<210>64

<211>130

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>64

metserglyargglylysglnglyglylysalaargalalysalalys

151015

thrargserserargalaglyleuglnpheprovalglyargvalhis

202530

argleuleuarglysglyasntyralagluargvalglyalaglyala

354045

provaltyrleualaalavalleuglutyrleuthralagluileleu

505560

gluleualaglyasnalaalaargaspasnlyslysthrargileile

65707580

proarghisleuglnleualaileargasnaspglugluleuasnlys

859095

leuleuglylysvalthrilealaglnglyglyvalleuproasnile

100105110

glnalavalleuleuprolyslysthrgluserhishislysalalys

115120125

glylys

130

<210>65

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>65

cyslysalathrglnalaserglnglutyr

1510

<210>66

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>66

lyslysthrseralathrvalglyprolysalaproserglyglylys

151015

lysalathrglnalaserglnglutyr

2025

<210>67

<211>143

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>67

metserglyargglylysthrglyglylysalaargalalysalalys

151015

serargserserargalaglyleuglnpheprovalglyargvalhis

202530

argleuleuarglysglyhistyralagluargvalglyalaglyala

354045

provaltyrleualaalavalleuglutyrleuthralagluileleu

505560

gluleualaglyasnalaalaargaspasnlyslysthrargileile

65707580

proarghisleuglnleualaileargasnaspglugluleuasnlys

859095

leuleuglyglyvalthrilealaglnglyglyvalleuproasnile

100105110

glnalavalleuleuprolyslysthrseralathrvalglyprolys

115120125

alaproserglyglylyslysalathrglnalaserglnglutyr

130135140

<210>68

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>68

progluproalalysseralaproalaprolys

1510

<210>69

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>69

progluproalalysseralaproalaprolys

1510

<210>70

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>70

alaglnlyslysaspglylyslysarglysargserarglysglu

151015

<210>71

<211>126

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>71

metprogluproalalysseralaproalaprolyslysglyserlys

151015

lysalavalthrlysalaglnlyslysaspglylyslysarglysarg

202530

serarglysglusertyrseriletyrvaltyrlysvalleulysgln

354045

valhisproaspthrglyileserserlysalametglyilemetasn

505560

serphevalasnaspilephegluargilealaglyglualaserarg

65707580

leualahistyrasnlysargserthrilethrserarggluilegln

859095

thralavalargleuleuleuproglygluleualalyshisalaval

100105110

sergluglythrlysalavalthrlystyrthrserserlys

115120125

<210>72

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>72

alaargthrlysglnthralaarg

15

<210>73

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>73

alaargthrlysglnthralaarglysser

1510

<210>74

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>74

alaargthrlysglnthralaarglysser

1510

<210>75

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>75

alaargthrlysglnthralaarglysser

1510

<210>76

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>76

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysala

151015

<210>77

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>77

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglystrpcys

20

<210>78

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>78

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysgln

<210>79

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>79

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleu

20

<210>80

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>80

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleu

20

<210>81

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>81

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleuala

20

<210>82

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>82

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleuala

20

<210>83

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>83

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleuala

20

<210>84

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>84

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleuala

20

<210>85

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>85

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleuala

20

<210>86

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>86

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleuala

20

<210>87

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>87

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleuala

20

<210>88

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>88

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleuala

20

<210>89

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>89

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleuala

20

<210>90

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>90

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleuala

20

<210>91

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>91

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleualacys

20

<210>92

<211>24

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>92

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleualathrlysala

20

<210>93

<211>24

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>93

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleualathrlysala

20

<210>94

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>94

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleualathrlysalaala

2025

<210>95

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>95

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleualathrlysalaala

2025

<210>96

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>96

thrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalaproarg

151015

<210>97

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>97

thrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalaproarg

151015

<210>98

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>98

thrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalaproarg

151015

<210>99

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>99

lysserthrglyglylysalaproarglysgln

1510

<210>100

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>100

glnthralaarglysserthrglyglylysalaproarglysglnleu

151015

alaserlys

<210>101

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>101

alaproarglysglnleualathrlysalaalaarglysseralapro

151015

alathrglyglyvallyslysprohis

2025

<210>102

<211>24

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>102

alathrlysalaalaarglysseralaproalathrglyglyvallys

151015

lysprohisargtyrargprogly

20

<210>103

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>103

lysalaalaarglysseralaproala

15

<210>104

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>104

lysalaalaarglysseralaproalathrglygly

1510

<210>105

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>105

lysalaalaarglysseralaproalathrglyglycys

1510

<210>106

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>106

lysalaalaarglysseralaproalathrglygly

1510

<210>107

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>107

lysalaalaarglysseralaproalathrglygly

1510

<210>108

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>108

lysalaalaarglysseralaproalathrglygly

1510

<210>109

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>109

lysalaalaarglysseralaproalathrglygly

1510

<210>110

<211>24

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>110

alathrlysalaalaarglysseralaproserthrglyglyvallys

151015

lysprohisargtyrargprogly

20

<210>111

<211>24

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>111

alathrlysalaalaarglysseralaproserthrglyglyvallys

151015

lysprohisargtyrargprogly

20

<210>112

<211>35

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>112

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleualathrlysalaalaarglysseralaproalathr

202530

glyglyval

35

<210>113

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>113

serthrglyglyvallyslysprohisargtyr

1510

<210>114

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>114

serthrglyglyvallyslysprohisargtyr

1510

<210>115

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>115

serthrglyglyvallyslysprohisargtyr

1510

<210>116

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>116

glythrvalalaleuarggluileargargtyrglnlysserthrglu

151015

leuleuilearg

20

<210>117

<211>50

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>117

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleualathrlysalaalaarglysseralaproalathr

202530

glyglyvallyslysprohisargtyrargproglythrvalalaleu

354045

argglu

50

<210>118

<211>32

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>118

thrgluleuleuilearglysleupropheglnargleuvalargglu

151015

ilealaglnaspphelysthraspleuargpheglnseralaalaile

202530

<210>119

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>119

gluilealaglnaspphelysthraspleuarg

1510

<210>120

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>120

gluilealaglnaspphelysthraspleuarg

1510

<210>121

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>121

gluilealaglnaspphelysthraspleuarg

1510

<210>122

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>122

argleuvalarggluilealaglnaspphelysthraspleuargphe

151015

glnserseralaval

20

<210>123

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>123

argleuvalarggluilealaglnaspphelysthraspleuargphe

151015

glnserseralaval

20

<210>124

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>124

argleuvalarggluilealaglnaspphelysthraspleuargphe

151015

glnserseralaval

20

<210>125

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>125

argleuvalarggluilealaglnaspphelysthraspleuargphe

151015

glnserseralaval

20

<210>126

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>126

lysargvalthrilemetprolysaspileglnleualaargargile

151015

argglygluargala

20

<210>127

<211>136

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>127

metalaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysala

151015

proarglysglnleualathrlysvalalaarglysseralaproala

202530

thrglyglyvallyslysprohisargtyrargproglythrvalala

354045

leuarggluileargargtyrglnlysserthrgluleuleuilearg

505560

lysleupropheglnargleumetarggluilealaglnaspphelys

65707580

thraspleuargpheglnserseralavalmetalaleuglngluala

859095

cysglusertyrleuvalglyleuphegluaspthrasnleucysval

100105110

ilehisalalysargvalthrilemetprolysaspileglnleuala

115120125

argargileargglygluargala

130135

<210>128

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>128

serglyargglylysglygly

15

<210>129

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>129

argglylysglyglylysglyleuglylysglyala

1510

<210>130

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>130

serglyargglylysglyglylysglyleuglylysglyglyalalys

151015

arghisarglysval

20

<210>131

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>131

lysglyleuglylysglyglyalalysarghisarglysvalleuarg

151015

aspasntrpcys

20

<210>132

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>132

serglyargglylysglyglylysglyleuglylysglyglyalalys

151015

arghisarglysvalleuargaspasnglyserglyserlys

202530

<210>133

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>133

serglyargglylysglyglylysglyleuglylysglyglyalalys

151015

arghisarglys

20

<210>134

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>134

serglyargglylysglyglylysglyleuglylysglyglyalalys

151015

arghisarglys

20

<210>135

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>135

serglyargglylysglyglylysglyleuglylysglyglyalalys

151015

arghisarglys

20

<210>136

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>136

serglyargglylysglyglylysglyleuglylysglyglyalalys

151015

arghisarglys

20

<210>137

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>137

serglyargglylysglyglylysglyleuglylysglyglyalalys

151015

arghisarglys

20

<210>138

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>138

lysglyleuglylysglyglyalalysarghisarglysvalleuarg

151015

aspasntrpcys

20

<210>139

<211>103

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>139

metserglyargglylysglyglylysglyleuglylysglyglyala

151015

lysarghisarglysvalleuargaspasnileglnglyilethrlys

202530

proalaileargargleualaargargglyglyvallysargileser

354045

glyleuiletyrglugluthrargglyvalleulysvalpheleuglu

505560

asnvalileargaspalavalthrtyrthrgluhisalalysarglys

65707580

thrvalthralametaspvalvaltyralaleulysargglnglyarg

859095

thrleutyrglypheglygly

100

<210>140

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>140

cyslysalathrglnalaserglnglutyr

1510

<210>141

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>141

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglysglnleualacys

20

<210>142

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>142

alaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysalapro

151015

arglystrpcys

20

<210>143

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>143

lysalaalaarglysseralaproalathrglyglycys

1510

<210>144

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>144

lysglyleuglylysglyglyalalysarghisarglysvalleuarg

151015

aspasntrpcys

20

<210>145

<211>136

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>145

metalaargthrlysglnthralaarglysserthrglyglylysala

151015

proarglysglnleualathrlysvalalaarglysseralaproala

202530

thrglyglyvallyslysprohisargtyrargproglythrvalala

354045

leuarggluileargargtyrglnlysserthrgluleuleuilearg

505560

lysleupropheglnargleumetarggluilealaglnaspphelys

65707580

thraspleuargpheglnserseralavalmetalaleuglngluala

859095

cysglusertyrleuvalglyleuphegluaspthrasnleucysval

100105110

ilehisalalysargvalthrilemetprolysaspileglnleuala

115120125

argargileargglygluargala

130135

<210>146

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>146

alaalaalaala

1

<210>147

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>147

thrlysproargproglypro

15

<210>148

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>148

metgluhispheproglypro

15

<210>149

<211>28

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>149

progluaspgluiletrpleuprogluprogluservalaspvalpro

151015

alalysproileserthrsersermetmetmetpro

2025

<210>150

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>150

alaalaalaala

1

<210>151

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>151

prolyslyslysarglysval

15

<210>152

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>152

prolyslyslysarglysvalgluaspprotyrcys

1510

<210>153

<211>33

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>153

prolyslyslysarglysvalglyprolyslyslysarglysvalgly

151015

prolyslyslysarglysvalglyprolyslyslysarglysvalgly

202530

cys

<210>154

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>154

cystyrglyarglyslysargargglnargargarg

1510

<210>155

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>155

cysserileproprogluvallyspheasnlysprophevaltyrleu

151015

ile

<210>156

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>156

aspargglnilelysiletrppheglnasnargargmetlystrplys

151015

lys

<210>157

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>157

prolyslyslysarglysvalgluaspprotyrcys

1510

<210>158

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>158

proalaalalysargvallysleuasp

15

<210>159

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>159

alaalaalaala

1

<210>160

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>160

tyrglyarglyslysargargglnargargarg

1510

<210>161

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>161

argargglnargargthrserlysleumetlysarg

1510

<210>162

<211>27

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>162

glytrpthrleuasnseralaglytyrleuleuglylysileasnleu

151015

lysalaleualaalaleualalyslysileleu

2025

<210>163

<211>33

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>163

lysalaleualatrpglualalysleualalysalaleualalysala

151015

leualalyshisleualalysalaleualalysalaleulyscysglu

202530

ala

<210>164

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>164

argglnilelysiletrppheglnasnargargmetlystrplyslys

151015

<210>165

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>165

arglyslysargargglnargargarg

15

<210>166

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>166

arglyslysargargglnargarg

15

<210>167

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>167

tyralaargalaalaalaargglnalaargala

1510

<210>168

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>168

thrhisargleuproargargargargargarg

1510

<210>169

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>169

glyglyargargalaargargargargargarg

1510

<210>170

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>170

glnglnglnglnglnglnglnglnglngln

1510

<210>171

<211>186

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>171

argargargargargargargargargargargargargargargarg

151015

argargargargargargargargargargargargargargargarg

202530

argargargargargargargargargargargargargargargarg

354045

argargargargargargargargargargargargargargargarg

505560

argargargargargargargargargargargargargargargarg

65707580

argargargargargargargargargargargargargargargarg

859095

argargargargargargargargargargargargargargargarg

100105110

argargargargargargargargargargargargargargargarg

115120125

argargargargargargargargargargargargargargargarg

130135140

argargargargargargargargargargargargargargargarg

145150155160

argargargargargargargargargargargargargargargarg

165170175

argargargargargargargargargarg

180185

<210>172

<211>64

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>172

argargargargargargargargargargargargargargargarg

151015

argargargargargargargargargargargargargargargarg

202530

argargargargargargargargargargargargargargargarg

354045

argargargargargargargargargargargargargargargarg

505560

<210>173

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>173

alaalaalaala

1

<210>174

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>174

alaalaalaala

1

<210>175

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>175

gluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglu

151015

gluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglu

202530

gluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglu

354045

gluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglu

505560

gluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglu

65707580

gluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglu

859095

gluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglugluglu

100105110

gluglugluglu

115

<210>176

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>176

alaalaalaala

1

<210>177

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>177

alaalaalaala

1

<210>178

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>178

alaalaalaala

1

<210>179

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>179

alaalaalaala

1

<210>180

<211>41

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>180

tyrthriletrpmetprogluasnproargproglythrprocysasp

151015

ilephethrasnserargglylysargalaserasnglyglyglygly

202530

argargargargargargargargarg

3540

<210>181

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>181

argglyaspglytrp

15

<210>182

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>182

glycysglytyrglyargglyaspserprogly

1510

<210>183

<211>32

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>183

tyrthriletrpmetprogluasnproargproglythrprocysasp

151015

ilephethrasnserargglylysargalaserasnglyglyglygly

202530

<210>184

<211>164

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>184

gluglyilecysargasnargvalthrasnasnvallysaspvalthr

151015

lysleuvalalaasnleuprolysasptyrmetilethrleulystyr

202530

valproglymetaspvalleuproserhiscystrpileserglumet

354045

valvalglnleuseraspserleuthraspleuleuasplyspheser

505560

asnilesergluglyleuserasntyrserileileasplysleuval

65707580

asnilevalaspaspleuvalglucysvallysgluasnserserlys

859095

aspleulyslysserphelysserprogluproargleuphethrpro

100105110

glugluphepheargilepheasnargserileaspalaphelysasp

115120125

phevalvalalasergluthrseraspcysvalvalserserthrleu

130135140

serproglulysaspserargvalservalthrlysprophemetleu

145150155160

proprovalala

<210>185

<211>192

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>185

proglugluglyserglycysservalargargargprotyrglycys

151015

valleuargalaalaleuvalproleuvalalaglyleuvalilecys

202530

leuvalvalcysileglnargphealaglnalaglnglnglnleupro

354045

leugluserleuglytrpaspvalalagluleuglnleuasnhisthr

505560

glyproglnglnaspproargleutyrtrpglnglyglyproalaleu

65707580

glyargserpheleuhisglyprogluleuasplysglyglnleuarg

859095

ilehisargaspglyiletyrmetvalhisileglnvalthrleuala

100105110

ilecysserserthrthralaserarghishisprothrthrleuala

115120125

valglyilecysserproalaserargserileserleuleuargleu

130135140

serphehisglnglycysthrilealaserglnargleuthrproleu

145150155160

alaargglyaspthrleucysthrasnleuthrglythrleuleupro

165170175

serargasnthraspgluthrphepheglyvalglntrpvalargpro

180185190

<210>186

<211>138

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>186

serserglyleuvalproargglyserhismetaspalavalalaval

151015

tyrhisglylysileserarggluthrglyglulysleuleuleuala

202530

thrglyleuaspglysertyrleuleuargaspsergluservalpro

354045

glyvaltyrcysleucysvalleutyrhisglytyriletyrthrtyr

505560

argvalserglnthrgluthrglysertrpseralagluthralapro

65707580

glyvalhislysargtyrphearglysilelysasnleuileserala

859095

pheglnlysproaspglnglyilevalileproleuglntyrproval

100105110

glulyslysserseralaargserthrglnglythrthrglyilearg

115120125

gluaspproaspvalcysleulysalapro

130135

<210>187

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>187

aspglyalaargtyrcysargglyaspcyspheaspgly

1510

<210>188

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>188

glycysglytyrglyargglyaspserprogly

1510

<210>189

<211>174

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>189

argargargargargargargargargmetgluglyilecysargasn

151015

argvalthrasnasnvallysaspvalthrlysleuvalalaasnleu

202530

prolysasptyrmetilethrleulystyrvalproglymetaspval

354045

leuproserhiscystrpileserglumetvalvalglnleuserasp

505560

serleuthraspleuleuasplyspheserasnilesergluglyleu

65707580

serasntyrserileileasplysleuvalasnilevalaspaspleu

859095

valglucysvallysgluasnserserlysaspleulyslysserphe

100105110

lysserprogluproargleuphethrproglugluphepheargile

115120125

pheasnargserileaspalaphelysaspphevalvalalaserglu

130135140

thrseraspcysvalvalserserthrleuserproglulysaspser

145150155160

argvalservalthrlysprophemetleuproprovalala

165170

<210>190

<211>201

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>190

argargargargargargargargargproglugluglyserglycys

151015

servalargargargprotyrglycysvalleuargalaalaleuval

202530

proleuvalalaglyleuvalilecysleuvalvalcysileglnarg

354045

phealaglnalaglnglnglnleuproleugluserleuglytrpasp

505560

valalagluleuglnleuasnhisthrglyproglnglnaspproarg

65707580

leutyrtrpglnglyglyproalaleuglyargserpheleuhisgly

859095

progluleuasplysglyglnleuargilehisargaspglyiletyr

100105110

metvalhisileglnvalthrleualailecysserserthrthrala

115120125

serarghishisprothrthrleualavalglyilecysserproala

130135140

serargserileserleuleuargleuserphehisglnglycysthr

145150155160

ilealaserglnargleuthrproleualaargglyaspthrleucys

165170175

thrasnleuthrglythrleuleuproserargasnthraspgluthr

180185190

phepheglyvalglntrpvalargpro

195200

<210>191

<211>201

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>191

proglugluglyserglycysservalargargargprotyrglycys

151015

valleuargalaalaleuvalproleuvalalaglyleuvalilecys

202530

leuvalvalcysileglnargphealaglnalaglnglnglnleupro

354045

leugluserleuglytrpaspvalalagluleuglnleuasnhisthr

505560

glyproglnglnaspproargleutyrtrpglnglyglyproalaleu

65707580

glyargserpheleuhisglyprogluleuasplysglyglnleuarg

859095

ilehisargaspglyiletyrmetvalhisileglnvalthrleuala

100105110

ilecysserserthrthralaserarghishisprothrthrleuala

115120125

valglyilecysserproalaserargserileserleuleuargleu

130135140

serphehisglnglycysthrilealaserglnargleuthrproleu

145150155160

alaargglyaspthrleucysthrasnleuthrglythrleuleupro

165170175

serargasnthraspgluthrphepheglyvalglntrpvalargpro

180185190

argargargargargargargargarg

195200

<210>192

<211>148

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>192

metglyserserhishishishishishisserserglyleuvalpro

151015

argglyserhismetaspalavalalavaltyrhisglylysileser

202530

arggluthrglyglulysleuleuleualathrglyleuaspglyser

354045

tyrleuleuargaspsergluservalproglyvaltyrcysleucys

505560

valleutyrhisglytyriletyrthrtyrargvalserglnthrglu

65707580

thrglysertrpseralagluthralaproglyvalhislysargtyr

859095

phearglysilelysasnleuileseralapheglnlysproaspgln

100105110

glyilevalileproleuglntyrprovalglulyslysserserala

115120125

argserthrglnglythrthrglyilearggluaspproaspvalcys

130135140

leulysalapro

145

<210>193

<211>147

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>193

argargargargargargargargargserserglyleuvalproarg

151015

glyserhismetaspalavalalavaltyrhisglylysileserarg

202530

gluthrglyglulysleuleuleualathrglyleuaspglysertyr

354045

leuleuargaspsergluservalproglyvaltyrcysleucysval

505560

leutyrhisglytyriletyrthrtyrargvalserglnthrgluthr

65707580

glysertrpseralagluthralaproglyvalhislysargtyrphe

859095

arglysilelysasnleuileseralapheglnlysproaspglngly

100105110

ilevalileproleuglntyrprovalglulyslysserseralaarg

115120125

serthrglnglythrthrglyilearggluaspproaspvalcysleu

130135140

lysalapro

145

<210>194

<211>167

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(167)..(167)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>194

xaametgluglyilecysargasnargvalthrasnasnvallysasp

151015

valthrlysleuvalalaasnleuprolysasptyrmetilethrleu

202530

lystyrvalproglymetaspvalleuproserhiscystrpileser

354045

glumetvalvalglnleuseraspserleuthraspleuleuasplys

505560

pheserasnilesergluglyleuserasntyrserileileasplys

65707580

leuvalasnilevalaspaspleuvalglucysvallysgluasnser

859095

serlysaspleulyslysserphelysserprogluproargleuphe

100105110

thrproglugluphepheargilepheasnargserileaspalaphe

115120125

lysaspphevalvalalasergluthrseraspcysvalvalserser

130135140

thrleuserproglulysaspserargvalservalthrlysprophe

145150155160

metleuproprovalalaxaa

165

<210>195

<211>194

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(194)..(194)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>195

xaaproglugluglyserglycysservalargargargprotyrgly

151015

cysvalleuargalaalaleuvalproleuvalalaglyleuvalile

202530

cysleuvalvalcysileglnargphealaglnalaglnglnglnleu

354045

proleugluserleuglytrpaspvalalagluleuglnleuasnhis

505560

thrglyproglnglnaspproargleutyrtrpglnglyglyproala

65707580

leuglyargserpheleuhisglyprogluleuasplysglyglnleu

859095

argilehisargaspglyiletyrmetvalhisileglnvalthrleu

100105110

alailecysserserthrthralaserarghishisprothrthrleu

115120125

alavalglyilecysserproalaserargserileserleuleuarg

130135140

leuserphehisglnglycysthrilealaserglnargleuthrpro

145150155160

leualaargglyaspthrleucysthrasnleuthrglythrleuleu

165170175

proserargasnthraspgluthrphepheglyvalglntrpvalarg

180185190

proxaa

<210>196

<211>139

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>196

xaaserserglyleuvalproargglyserhismetaspalavalala

151015

valtyrhisglylysileserarggluthrglyglulysleuleuleu

202530

alathrglyleuaspglysertyrleuleuargaspsergluserval

354045

proglyvaltyrcysleucysvalleutyrhisglytyriletyrthr

505560

tyrargvalserglnthrgluthrglysertrpseralagluthrala

65707580

proglyvalhislysargtyrphearglysilelysasnleuileser

859095

alapheglnlysproaspglnglyilevalileproleuglntyrpro

100105110

valglulyslysserseralaargserthrglnglythrthrglyile

115120125

arggluaspproaspvalcysleulysalapro

130135

<210>197

<211>143

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>197

metglyserserxaaserserglyleuvalproargglyserhismet

151015

aspalavalalavaltyrhisglylysileserarggluthrglyglu

202530

lysleuleuleualathrglyleuaspglysertyrleuleuargasp

354045

sergluservalproglyvaltyrcysleucysvalleutyrhisgly

505560

tyriletyrthrtyrargvalserglnthrgluthrglysertrpser

65707580

alagluthralaproglyvalhislysargtyrphearglysilelys

859095

asnleuileseralapheglnlysproaspglnglyilevalilepro

100105110

leuglntyrprovalglulyslysserseralaargserthrglngly

115120125

thrthrglyilearggluaspproaspvalcysleulysalapro

130135140

<210>198

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>198

alaalaalaala

1

<210>199

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>199

alaalaalaala

1

<210>200

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>200

alaalaalaala

1

<210>201

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>201

leuprolyslysarglysphesergluileserser

1510

<210>202

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>202

lysarglysargtrpgluasnaspilepro

1510

<210>203

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>203

lysarglysargtrpgluasnasnilepro

1510

<210>204

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>204

thrglyglyvalmetlysarglysargglyserval

1510

<210>205

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>205

proileleuproleuilecysargargargglyserpro

1510

<210>206

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>206

thrtyrserglyvallysarglysargasnvalval

1510

<210>207

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>207

thrhisileglytyrlysarglysargaspserval

1510

<210>208

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>208

leuserglythrlysarglysargalatyrpheile

1510

<210>209

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>209

glnargargleuleulysarglysargglyserleu

1510

<210>210

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>210

glnileglylyslysarglysargasptyrleuasp

1510

<210>211

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>211

lysargglylysarglysargleuvalargprotrp

1510

<210>212

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>212

lyslysglylysarglysargleuvalargprotrp

1510

<210>213

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>213

proserarglysarglysarggluserasphisile

1510

<210>214

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>214

proserarglysarglysargasphistyralaval

1510

<210>215

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>215

ileserarglysarglysargaspleuglupheval

1510

<210>216

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>216

ilethrarglysarglysargaspleuvalphethr

1510

<210>217

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>217

gluproasnproarglysarglysargsergluleu

1510

<210>218

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>218

thrserproserarglysarglystrpaspglnval

1510

<210>219

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>219

thrleugluarglysarglysleualavalleutyr

1510

<210>220

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>220

argargarglysargargargglutrpgluaspphe

1510

<210>221

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>221

hisargtyrcysglylysargargargargthrarg

1510

<210>222

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>222

servalleuglylysargserargthrtrpglu

1510

<210>223

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>223

tyrglyargvalserlysargproargtyrglnphe

1510

<210>224

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>224

arglysargglyarglysargpheargserval

1510

<210>225

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>225

lysarglystyralavalpheleugluserglnasn

1510

<210>226

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>226

lysarglystyrseriletyrleuglyserglnser

1510

<210>227

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>227

lysarglystrpmetalaphevalmetglyasppro

1510

<210>228

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>228

lysarglyscysalavalpheleugluglyglnasn

1510

<210>229

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>229

ileproarglysargserphealagluleutyrasp

1510

<210>230

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>230

argleuthrproarglysargalaphesergluval

1510

<210>231

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>231

lysargsertrpsermetalaphecys

15

<210>232

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>232

lysargthrasnalaglnalaphethrglu

1510

<210>233

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>233

lysargprotyrserilealapheproleuglygln

1510

<210>234

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>234

argargargservalleulysargsertrpservalalaphe

1510

<210>235

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>235

lysargargtyrseraspalapheargleuproval

1510

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<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>236

lysarglystyrseraspalapheglyleuproval

1510

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<211>12

<212>prt

<213>人工序列

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<223>合成序列

<400>237

ileglyarglysargglytyrservalalaphegly

1510

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<211>12

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<223>合成序列

<400>238

ileglyarglysargvalasnalavalalaphetyr

1510

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<211>12

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<220>

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trpalaglyarglysargthrtrpargaspalaphe

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serserhisarglysarglyspheseraspalaphe

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<211>12

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proserhisarglysarglyspheseraspalaphe

1510

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<211>12

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thralahisarglysarglyspheseraspalaphe

1510

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<211>12

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<223>合成序列

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argvalglnarglysarglystrpserglualaphe

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<211>12

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<400>244

argleuthrarglysarglystyraspcysalaphe

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leuvalasnarglysargargtyrtrpglualaphe

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<211>12

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<223>合成序列

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leuglylysargtyraspargasptrpasptyrlys

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<211>12

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argserserglyileleuglylysarglyspheglu

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<211>12

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valhislysthrvalleuglylysarglystyrtrp

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<211>12

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serileleuglylysarglysasnargaspproser

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<211>12

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glnservalleuglylysarglysserargprophe

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<211>12

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<223>合成序列

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thrvalhisleuglylysargargleuargprotrp

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<223>合成序列

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argvalleuglylysarglysthrglyargserpro

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<223>合成序列

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valleuglylysarglysargaspaspcystrp

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hisglyargglnvalleuglylysarglysarg

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provalleuglylysarglysargserleuserser

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argvalleuglylysarglysarggluaspargpro

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<223>合成序列

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ileleuglylysarglysargserhishisprotyr

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<211>12

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proileleuglylysarglysarghisleupheleu

1510

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<211>12

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leuleuglylysarglysargproserilegluhis

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sermetleuglylysarglysargcysileileser

1510

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alaalaalaala

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alaalaalaala

1

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alaalaalaala

1

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<211>4

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alaalaalaala

1

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<212>prt

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alaalaalaala

1

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<211>4

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alaalaalaala

1

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<212>prt

<213>人工序列

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<223>合成序列

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metalavalglyalaserglyleugluglyasplysmetalaglyala

151015

metproleuglnleuleuleuleuleuileleuleuglyproglyasn

202530

serleuglnleutrpaspthrtrpalaaspglualaglulysalaleu

354045

glyproleuleualaargaspargargglnalathrglutyrglutyr

505560

leuasptyrasppheleuprogluthrgluproproglumetleuarg

65707580

asnserthraspthrthrproleuthrglyproglythrprogluser

859095

thrthrvalgluproalaalaargargserthrglyleuaspalagly

100105110

glyalavalthrgluleuthrthrgluleualaasnmetglyasnleu

115120125

serthraspseralaalametgluileglnthrthrglnproalaala

130135140

thrglualaglnthrthrglnprovalprothrglualaglnthrthr

145150155160

proleualaalathrglualaglnthrthrargleuthralathrglu

165170175

alaglnthrthrproleualaalathrglualaglnthrthrpropro

180185190

alaalathrglualaglnthrthrglnprothrglyleuglualagln

195200205

thrthralaproalaalametglualaglnthrthralaproalaala

210215220

metglualaglnthrthrproproalaalametglualaglnthrthr

225230235240

glnthrthralametglualaglnthrthralaproglualathrglu

245250255

alaglnthrthrglnprothralathrglualaglnthrthrproleu

260265270

alaalametglualaleuserthrgluproseralathrglualaleu

275280285

sermetgluprothrthrlysargglyleupheilepropheserval

290295300

serservalthrhislysglyileprometalaalaserasnleuser

305310315320

valasntyrprovalglyalaproasphisileservallysglncys

325330335

leuleualaileleuileleualaleuvalalathrilephepheval

340345350

cysthrvalvalleualavalargleuserarglysglyhismettyr

355360365

provalargasntyrserprothrglumetvalcysileserserleu

370375380

leuproaspglyglygluglyproseralathralaasnglyglyleu

385390395400

serlysalalysserproglyleuthrprogluproarggluasparg

405410415

gluglyaspaspleuthrleuhisserpheleupro

420425

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<211>1203

<212>prt

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<220>

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<400>272

metalaalacysglyargvalargargmetpheargleuseralaala

151015

leuhisleuleuleuleuphealaalaglyalaglulysleuprogly

202530

glnglyvalhisserglnglyglnglyproglyalaasnphevalser

354045

phevalglyglnalaglyglyglyglyproalaglyglnglnleupro

505560

glnleuproglnserserglnleuglnglnglnglnglnglnglngln

65707580

glnglnglnglnproglnproproglnpropropheproalaglygly

859095

proproalaargargglyglyalaglyalaglyglyglytrplysleu

100105110

alaglugluglusercysarggluaspvalthrargvalcysprolys

115120125

histhrtrpserasnasnleualavalleuglucysleuglnaspval

130135140

arggluprogluasngluileserseraspcysasnhisleuleutrp

145150155160

asntyrlysleuasnleuthrthraspprolysphegluservalala

165170175

arggluvalcyslysserthrilethrgluilelysglucysalaasp

180185190

gluprovalglylysglytyrmetvalsercysleuvalasphisarg

195200205

glyasnilethrglutyrglncyshisglntyrilethrlysmetthr

210215220

alaileilepheserasptyrargleuilecysglyphemetaspasp

225230235240

cyslysasnaspileasnileleulyscysglyserileargleugly

245250255

glulysaspalahisserglnglygluvalvalsercysleuglulys

260265270

glyleuvallysglualaglugluarggluprolysileglnvalser

275280285

gluleucyslyslysalaileleuargvalalagluleuserserasp

290295300

aspphehisleuasparghisleutyrphealacysargaspasparg

305310315320

gluargphecysgluasnthrglnalaglygluglyargvaltyrlys

325330335

cysleupheasnhislysphegluglusermetserglulyscysarg

340345350

glualaleuthrthrargglnlysleuilealaglnasptyrlysval

355360365

sertyrserleualalyssercyslysseraspleulyslystyrarg

370375380

cysasnvalgluasnleuproargserargglualaargleusertyr

385390395400

leuleumetcysleugluseralavalhisargglyargglnvalser

405410415

serglucysglnglyglumetleuasptyrargargmetleumetglu

420425430

asppheserleuserprogluileileleusercysargglygluile

435440445

gluhishiscysserglyleuhisarglysglyargthrleuhiscys

450455460

leumetlysvalvalargglyglulysglyasnleuglymetasncys

465470475480

glnglnalaleuglnthrleuileglngluthraspproglyalaasp

485490495

tyrargileaspargalaleuasnglualacysgluservalilegln

500505510

thralacyslyshisileargserglyaspprometileleusercys

515520525

leumetgluhisleutyrthrglulysmetvalgluaspcysgluhis

530535540

argleuleugluleuglntyrpheileserargasptrplysleuasp

545550555560

provalleutyrarglyscysglnglyaspalaserargleucyshis

565570575

thrhisglytrpasngluthrsergluphemetproglnglyalaval

580585590

phesercysleutyrarghisalatyrargthrglugluglnglyarg

595600605

argleuserargglucysargalagluvalglnargileleuhisgln

610615620

argalametaspvallysleuaspproalaleuglnasplyscysleu

625630635640

ileaspleuglylystrpcysserglulysthrgluthrglyglnglu

645650655

leuglucysleuglnasphisleuaspaspleuvalvalglucysarg

660665670

aspilevalglyasnleuthrgluleuglusergluaspileglnile

675680685

glualaleuleumetargalacysgluproileileglnasnphecys

690695700

hisaspvalalaaspasnglnileaspserglyaspleumetglucys

705710715720

leuileglnasnlyshisglnlysaspmetasnglulyscysalaile

725730735

glyvalthrhispheglnleuvalglnmetlysasppheargpheser

740745750

tyrlysphelysmetalacyslysgluaspvalleulysleucyspro

755760765

asnilelyslyslysvalaspvalvalilecysleuserthrthrval

770775780

argasnaspthrleuglnglualalysgluhisargvalserleulys

785790795800

cysargargglnleuargvalglugluleuglumetthrgluaspile

805810815

argleugluproaspleutyrglualacyslysseraspilelysasn

820825830

phecysseralavalglntyrglyasnalaglnileileglucysleu

835840845

lysgluasnlyslysglnleuserthrargcyshisglnlysvalphe

850855860

lysleuglngluthrglumetmetaspprogluleuasptyrthrleu

865870875880

metargvalcyslysglnmetilelysargphecysproglualaasp

885890895

serlysthrmetleuglncysleulysglnasnlysasnsergluleu

900905910

metaspprolyscyslysglnmetilethrlysargglnilethrgln

915920925

asnthrasptyrargleuasnprometleuarglysalacyslysala

930935940

aspileprolysphecyshisglyileleuthrlysalalysaspasp

945950955960

sergluleugluglyglnvalilesercysleulysleuargtyrala

965970975

aspglnargleuserseraspcysgluaspglnileargileileile

980985990

glngluseralaleuasptyrargleuaspproglnleuglnleuhis

99510001005

cysseraspgluileserserleucysalagluglualaalaala

101010151020

glngluglnthrglyglnvalgluglucysleulysvalasnleu

102510301035

leulysilelysthrgluleucyslyslysgluvalleuasnmet

104010451050

leulysgluserlysalaaspilephevalaspprovalleuhis

105510601065

thralacysalaleuaspilelyshishiscysalaalailethr

107010751080

proglyargglyargglnmetsercysleumetglualaleuglu

108510901095

asplysargvalargleuglnproglucyslyslysargleuasn

110011051110

aspargileglumettrpsertyralaalalysvalalaproala

111511201125

aspglypheseraspleualametglnvalmetthrserproser

113011351140

lysasntyrileleuservalileserglyserilecysileleu

114511501155

pheleuileglyleumetcysglyargilethrlysargvalthr

116011651170

arggluleulysaspargleuglntyrargsergluthrmetala

117511801185

tyrlysglyleuvaltrpserglnaspvalthrglyserproala

119011951200

<210>273

<211>742

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>273

metasplysphetrptrphisalaalatrpglyleucysleuvalpro

151015

leuserleualaglnileaspleuasnilethrcysargphealagly

202530

valphehisvalglulysasnglyargtyrserileserargthrglu

354045

alaalaaspleucyslysalapheasnserthrleuprothrmetala

505560

glnmetglulysalaleuserileglyphegluthrcysargtyrgly

65707580

pheilegluglyhisvalvalileproargilehisproasnserile

859095

cysalaalaasnasnthrglyvaltyrileleuthrserasnthrser

100105110

glntyraspthrtyrcyspheasnalaseralaproproglugluasp

115120125

cysthrservalthraspleuproasnalapheaspglyproilethr

130135140

ilethrilevalasnargaspglythrargtyrvalglnlysglyglu

145150155160

tyrargthrasnprogluaspiletyrproserasnprothraspasp

165170175

aspvalserserglysersersergluargserserthrserglygly

180185190

tyrilephetyrthrpheserthrvalhisproileproaspgluasp

195200205

serprotrpilethraspserthraspargileproalathrthrleu

210215220

metserthrseralathralathrgluthralathrlysargglnglu

225230235240

thrtrpasptrpphesertrpleupheleuprosergluserlysasn

245250255

hisleuhisthrthrthrglnmetalaglythrserserasnthrile

260265270

seralaglytrpgluproasnglugluasngluaspgluargasparg

275280285

hisleuserpheserglyserglyileaspaspaspgluasppheile

290295300

serserthrileserthrthrproargalapheasphisthrlysgln

305310315320

asnglnasptrpthrglntrpasnproserhisserasnprogluval

325330335

leuleuglnthrthrthrargmetthraspvalaspargasnglythr

340345350

thralatyrgluglyasntrpasnproglualahisproproleuile

355360365

hishisgluhishisglugluglugluthrprohisserthrserthr

370375380

ileglnalathrproserserthrthrglugluthralathrglnlys

385390395400

gluglntrppheglyasnargtrphisgluglytyrargglnthrpro

405410415

lysgluaspserhisserthrthrglythralaalaalaseralahis

420425430

thrserhisprometglnglyargthrthrproserprogluaspser

435440445

sertrpthraspphepheasnproileserhisprometglyarggly

450455460

hisglnalaglyargargmetaspmetaspserserhisserilethr

465470475480

leuglnprothralaasnproasnthrglyleuvalgluaspleuasp

485490495

argthrglyproleusermetthrthrglnglnserasnserglnser

500505510

pheserthrserhisgluglyleuglugluasplysasphisprothr

515520525

thrserthrleuthrserserasnargasnaspvalthrglyglyarg

530535540

argaspproasnhissergluglyserthrthrleuleugluglytyr

545550555560

thrserhistyrprohisthrlysgluserargthrpheileproval

565570575

thrseralalysthrglyserpheglyvalthralavalthrvalgly

580585590

aspserasnserasnvalasnargserleuserglyaspglnaspthr

595600605

phehisproserglyglyserhisthrthrhisglysergluserasp

610615620

glyhisserhisglyserglngluglyglyalaasnthrthrsergly

625630635640

proileargthrproglnileproglutrpleuileileleualaser

645650655

leuleualaleualaleuileleualavalcysilealavalasnser

660665670

argargargcysglyglnlyslyslysleuvalileasnserglyasn

675680685

glyalavalgluasparglysproserglyleuasnglyglualaser

690695700

lysserglnglumetvalhisleuvalasnlysglusersergluthr

705710715720

proaspglnphemetthralaaspgluthrargasnleuglnasnval

725730735

aspmetlysileglyval

740

<210>274

<211>426

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>274

metgluglnargproargglycysalaalavalalaalaalaleuleu

151015

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202530

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