本发明属于基因疫苗技术领域，具体涉及一种拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗及其制备方法和应用。
背景技术：
拟态弧菌(vibriomimicus)是一种严重危害水产养殖业健康发展的肠道病原菌。该菌主要经消化道黏膜感染鱼体，引起养殖鱼类腹水病。口服疫苗诱导的肠黏膜免疫应答在预防拟态弧菌引起的鱼类腹水病中发挥着至关重要的作用，也是水产养殖生产中最实用的疫苗剂型。表位基因疫苗是将保护性抗原表位基因克隆至真核表达元件下游构成的真核表达重组质粒。该疫苗进入体内后，通过宿主细胞的转录翻译系统持续表达抗原蛋白，诱导宿主产生全面且持久的免疫应答，从而达到防治传染病的目的。然而，“裸”表位基因疫苗以口服方式进入鱼体后，易受到消化道环境中核酸酶降解，同时由于基因疫苗表面带负电，也限制了其与肠黏膜局部抗原递呈细胞膜接触而内化，使其免疫原性下降，因此“裸”表位基因疫苗不能直接用于口服免疫。故亟须研发一种既能克服核酸酶降解，又能靶向局部抗原递呈细胞和促进抗原递呈的拟态弧菌靶向表位基因疫苗。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供一种拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗，既能克服核酸酶降解，又能靶向局部抗原递呈细胞和促进抗原递呈。
本发明提供了一种拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗，包括如下步骤，
s1、构建疫苗靶点ovepis基因；
s2、将s1中设计的疫苗靶点ovepis基因插入免疫载体草鱼cd74蛋白编码基因中ii类分子相关肽段区的第261～280bp之间，方向从序列5’端到3’端，形成一个大小为1020bp的cd74(1-261bp)-ovepis-cd74(280-711bp)嵌合基因，再用靶向递送载体大肠杆菌dh5α冻干菌蜕装载上述嵌合基因，即获得所述靶向表位基因疫苗；
所述嵌合基因的核苷酸序列如seqidno:20所示。
优选的，所述s1中，构建疫苗靶点ovepis基因的具体方法如下：使用具有接头肽“丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸”的核苷酸序列seqidno:8、具有接头肽“甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸”的核苷酸序列seqidno:9以及具有接头肽“甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸”的核苷酸序列seqidno:10，将拟态弧菌黏附素蛋白ompu的2个b细胞线性表位的核苷酸序列seqidno:1和seqidno:2，拟态弧菌溶血素蛋白vmh的3个b细胞线性表位的核苷酸序列seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5和拟态弧菌溶血素蛋白vmh的2个模拟表位的核苷酸序列seqidno:6、seqidno:7按照seqidno:1-seqidno:8-seqidno:2-seqidno:8-seqidno:3-seqidno:8-seqidno:4-seqidno:8-seqidno:5-seqidno:9-seqidno:6-seqidno:10-seqidno:7顺序串联起来，构建成一个大小为327bp的基因，该基因即为疫苗靶点ovepis基因，其核苷酸序列以及对应的氨基酸序列如seqidno:11和seqidno:12所示；
其中，核苷酸序列seqidno:1和seqidno:2编码的拟态弧菌黏附素蛋白ompu对应的2个b细胞线性表位的氨基酸序列如seqidno:13和seqidno:14所示；
核苷酸序列seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5编码的拟态弧菌溶血素蛋白vmh对应的3个b细胞线性表位的氨基酸序列如seqidno:15、seqidno:16和seqidno:17所示；
核苷酸序列seqidno:6和seqidno:7编码的拟态弧菌溶血素蛋白vmh对应的2个模拟表位的氨基酸序列如seqidno:18和seqidno:19所示。
优选的，所述s2具体包括如下步骤，
s21、通过基因工程方法构建携带免疫载体草鱼cd74蛋白编码基因和拟态弧菌疫苗靶点ovepis基因的嵌合基因的真核表达重组质粒pcdna3.1(+)-cd74(1-261bp)-ovepis-cd74(280-711bp)；
s22、制备大肠杆菌dh5α菌蜕冻干粉；
s23、将s22中获得的菌蜕冻干粉用hbs缓冲液溶解后装载真核表达重组质粒pcdna3.1(+)-cd74(1-261bp)-ovepis-cd74(280-711bp)，且上述菌蜕冻干粉与重组质粒的质量比为5:2，获得拟态弧菌靶向表位基因疫苗；
s24、将s23中获得的疫苗放于-20℃冻存或冻干成粉剂室温保存、备用。
优选的，所述s21具体包括如下步骤：
s211、根据genbank中收录的草鱼cd74的mrna序列，设计一对特异性引物，其中，
上游引物为5'-ctagctacgatggacgagcatc-3'，如seqidno:21所示，下划线部分为nhei酶切位点，
下游引物为5'-ccgctcgagttactctgagccacactggg-3'，如seqidno:22所示，下划线部分为xhoi酶切位点，
以草鱼头肾cdna为模板，pcr扩增cd74蛋白编码基因，长度为711bp，回收pcr产物；用nhei/xhoi双酶切pcr产物和真核表达质粒pcdna3.1(+)，再用t4dna连接酶连接回收后的cd74蛋白编码基因和质粒pcdna3.1(+)的消化片段，获得真核表达重组质粒pcdna3.1(+)-cd74；
s212、合成s21中所述嵌合基因的前806bp基因片段，方向从序列5’端到3’端，并在其5’端添加nhei酶切位点，克隆至puc57质粒中，获得重组克隆质粒puc57-cd74(1-261bp)-ovepis-cd74(280-497bp)；
s213、用nhei/saci双酶切重组克隆质粒puc57-cd74(1-261bp)-ovepis-cd74(280-497bp)，回收其中cd74(1-261bp)-ovepis-cd74(280-496bp)消化片段；同时，用nhei/saci双酶切pcdna3.1(+)-cd74，回收其中pcdna3.1(+)-cd74(497-711bp)消化片段，再用t4dna连接酶连接上述2个消化片段，获得嵌合基因的真核表达重组质粒pcdna3.1(+)-cd74(1-261bp)-ovepis-cd74(280-711bp)。
优选的，所述s22具体包括如下步骤：
将自行构建的含有温控裂解质粒pbv220-lysise的重组大肠杆菌e.colidh5α接种含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的lb培养液，28℃、180rpm振荡培养过夜；按体积比为1:100比例将经培养过夜后的菌液转接至含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的lb培养液，28℃振荡培养至od600nm至0.4时，转至42℃诱导培养2.5h后，8000rpm离心10min，收集沉淀并用无菌磷酸盐缓冲液离心洗涤2次，获得新鲜的大肠杆菌dh5α菌蜕，将新鲜菌蜕转移至安培瓶，经不加保护剂的真空冷冻干燥处理后，获得无活菌残留的大肠杆菌dh5α菌蜕冻干粉。
优选的，所述s23具体包括如下步骤：
用hbs缓冲液重悬大肠杆菌dh5α菌蜕冻干粉，每升上述hbs缓冲液包含氯化钠100mmol、乙酸钠10mmol和hepes10mmol，保持上述hbs缓冲液的ph为7.0，在200μl装载体系中dh5α菌蜕冻干粉和嵌合基因的真核表达重组质粒pcdna3.1(+)-cd74(1-261bp)-ovepis-cd74(280-711bp)按5:2质量比混匀，28℃水浴1h，再加入66.7μl浓度为0.1mmol/l的cacl2溶液、混匀，37℃孵育过夜，取出装载混合液，在4℃，8000rpm离心10min，沉淀即为拟态弧菌靶向表位基因疫苗。
本发明还提供一种拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗。
本发明还提供一种拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗在防治拟态弧菌感染鱼类所致腹水病中的应用。
该靶向表位基因疫苗的使用方法为口灌免疫或者拌料口服免疫。
所述口灌免疫的具体步骤如下，将与1ml无菌注射器连接的软管经鱼口腔伸到咽齿下，注入经无菌磷酸盐缓冲液适当稀释的靶向表位基因疫苗，使免疫剂量达到20ug/尾，其中，鱼体质量为100g左右，免疫后第14天用相同方法和相同剂量加强免疫一次。
所述拌料口服的具体步骤如下，将上述靶向表位基因疫苗用无菌磷酸盐缓冲液适当稀释后，与商品化鱼颗粒饲料均匀混合、吸附，再加入鱼肝油拌匀、37℃烘干，其中，靶向表位基因疫苗按2ug/g饲料的剂量添加，鱼肝油加入量以防止疫苗向水中扩散的最小量为宜；免疫程序为按鱼体重的2％投喂含有疫苗的饲料，连续投喂7天，间隔一周后再进行加强免疫一次，免疫方法与投喂量同第一次免疫。
本发明的有益效果是：
1)细菌菌蜕(bacterialghost，bg)是通过诱导噬菌体phix174的裂解基因e(lysise)在革兰氏阴性细菌中表达，引起细菌内外膜融合形成跨膜孔道，细胞内容物外流，获得的细菌空壳。研究发现，细菌内、外膜在跨膜孔道处融合、形成一个完整的周质腔，该空腔具有很大的装载容量，可装载3000-6000copies质粒dna/bg。而且，菌蜕完好地保留了菌体表面结构和各种抗原成分，能有效地被抗原呈递细胞吞噬和加工处理。因此，菌蜕是一种理想的基因疫苗的靶向递送载体。
用菌蜕装载表位基因疫苗可保护疫苗不被降解，并将其靶向黏膜局部抗原递呈细胞进行表达。在此基础上若能通过免疫载体将表达的抗原肽直接导入mhcⅱ分子的抗原结合槽，促进抗原递呈，则可进一步提高基因疫苗的免疫原性。草鱼cd74基因的开放阅读框长711bp，编码由237个氨基酸组成的ⅱ型跨膜糖蛋白(cd74蛋白)，又称恒定链类似蛋白(invariantchainlikeprotein，iclp)。该蛋白结构由氨基端胞浆区、跨膜区和羧基端内质网腔区组成，其中内质网腔区又包括ii类分子相关肽段区(classii-associatedinvariantchainpeptide,clip)和三聚体区。ii类分子相关肽段区(位于cd74蛋白氨基端起第82位至98位氨基酸之间，对应的基因位于草鱼cd74蛋白编码基因的244-294bp之间)能与mhc-ⅱ类分子的抗原肽结合槽结合。用疫苗抗原肽替换ii类分子相关肽段区，则可将疫苗抗原肽直接导入mhcⅱ分子的抗原结合槽，提高抗原递呈效率。因此，草鱼cd74蛋白是一种免疫载体。
2)疫苗靶点的选择与改造是影响疫苗免疫效果的重要因素。通常情况下病原微生物单一抗原成分难以刺激机体产生良好的免疫应答和免疫保护效应，需选择在不同环节发挥致病作用且具有免疫保护性的毒力因子作为疫苗靶点。黏附素蛋白ompu和溶血素蛋白vmh是拟态弧菌的重要毒力因子和保护性抗原，本发明对ompu蛋白和vmh蛋白的优势表位进行有效整合，创造出最佳表位基因疫苗靶点。该疫苗靶点不仅剔除了天然抗原蛋白中的免疫抑制成分、提高了疫苗的特异性，而且能诱导机体产生更加广泛的免疫应答，在阻止拟态弧菌黏附和中和溶血素两大环节发挥免疫保护效应。
3)本发明的核心技术方案是先将优化设计的表位基因疫苗靶点ovepis基因插入草鱼cd74蛋白编码基因中ii类分子相关肽段区的第261～280bp之间，方向从序列5’端到3’端，形成嵌合基因cd74(1-261bp)-ovepis-cd74(280-711bp)并构建其真核表达重组质粒；然后用大肠杆菌dh5α冻干菌蜕装载嵌合基因的真核表达重组质粒，获得靶向表位基因疫苗。这种靶向表位基因疫苗不仅能防止体内核酸酶的降解、增加疫苗dna编码基因在黏膜局部抗原呈递细胞内的表达，又可将表达和加工处理后的抗原肽高效呈递给t、b细胞，从而大大提高所述疫苗的免疫效果。
4)本发明是用无活菌残留的大肠杆菌dh5α冻干菌蜕装载表位基因疫苗，并且以5倍免疫剂量口灌或腹腔注射本发明所述疫苗后的草鱼无任何不良反应，表明本发明所述疫苗是安全无毒的。本发明所述疫苗还可制成冻干粉剂，便于保存和运输。
5)本发明中所使用的表位基因疫苗的递送载体是大肠杆菌dh5α冻干菌蜕，该菌蜕除具有防止疫苗降解和靶向递送疫苗的作用外，还具有很好的肠黏膜黏附特性，因此本发明所述疫苗能够在鱼体肠道内良好定植，可用于鱼类口服免疫，以解决注射型疫苗在水产养殖生产中难以操作的问题，具有大规模推广应用前景。
6)用本发明制备的拟态弧菌靶向表位基因疫苗免疫草鱼，可诱导鱼体产生良好的系统免疫应答和肠黏膜免疫应答，能保护90％免疫草鱼抵抗10ld50(半数致死量)拟态弧菌的攻击，证实本发明疫苗较拟态弧菌的灭活疫苗、菌蜕疫苗、“裸”基因疫苗等疫苗具有更好的免疫效果。
附图说明
图1为本发明拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗的设计与制备流程图。
图2为真核表达重组质粒pcdna3.1(+)-cd74的双酶切鉴定电泳图，其中m为dnamarker，1为重组质粒pcdna3.1(+)-cd74的dna条带，2为重组质粒pcdna3.1(+)-cd74经nhei/xhoi双酶切后的的dna条带。
图3为嵌合基因的真核表达重组质粒的构建策略图。
图4为嵌合基因的真核表达重组质粒的双酶切鉴定电泳图，其中m为dnamarker；1为重组质粒pcdna3.1(+)-cd74(1-261bp)-ovepis-cd74(280-711bp)经nhei/xhoi双酶切后的的dna条带；2为重组质粒pcdna3.1(+)-cd74(1-261bp)-ovepis-cd74(280-711bp)的dna条带。
图5为大肠杆菌dh5α及其菌蜕在扫描电镜下的形态结构图(30000×)，其中a为大肠杆菌dh5α；b为大肠杆菌dh5α菌蜕，箭头所示为跨膜溶菌孔道。
图6为嵌合基因的真核表达重组质粒的荧光定量pcr的标准曲线、扩增曲线和熔解曲线，其中a为标准曲线；b为扩增曲线；c为熔解曲线。
图7为免疫后不同时间草鱼血清及肠黏液中抗体水平的动态变化图。
图8为免疫后第23d草鱼外周血及肠组织中淋巴细胞增殖活性图，其中a为外周血中淋巴细胞增殖活性；b为肠组织中淋巴细胞增殖活性。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本技术领域的普通技术人员应该理解的是,在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
下述说明中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实验方法中所使用的试验材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述说明中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
下述说明中的比例，如无特别说明，均为体积比例。
实施例一拟态弧菌表位基因疫苗靶点ovepis基因的设计
使用具有接头肽“丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸”的核苷酸序列seqidno:8、具有接头肽“甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸”的核苷酸序列seqidno:9以及具有接头肽“甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸”的核苷酸序列seqidno:9，将拟态弧菌黏附素蛋白ompu的2个b细胞线性表位的核苷酸序列seqidno:1和seqidno:2，拟态弧菌溶血素蛋白vmh的3个b细胞线性表位的核苷酸序列seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5和拟态弧菌溶血素蛋白vmh的2个模拟表位的核苷酸序列seqidno:6、seqidno:7按照seqidno:1-seqidno:8-seqidno:2-seqidno:8-seqidno:3-seqidno:8-seqidno:4-seqidno:8-seqidno:5-seqidno:9-seqidno:6-seqidno:10-seqidno:7顺序串联起来，构建成一个大小为327bp的基因，该基因即为疫苗靶点ovepis基因，其核苷酸序列以及对应的氨基酸序列如seqidno:11和seqidno:12所示；
其中，核苷酸序列seqidno:1和seqidno:2编码的拟态弧菌黏附素蛋白ompu对应的2个b细胞线性表位的氨基酸序列如seqidno:13和seqidno:14所示；
核苷酸序列seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5编码的拟态弧菌溶血素蛋白vmh对应的3个b细胞线性表位的氨基酸序列如seqidno:15、seqidno:16和seqidno:17所示；
核苷酸序列seqidno:6和seqidno:7编码的拟态弧菌溶血素蛋白vmh对应的2个模拟表位的氨基酸序列如seqidno:18和seqidno:19所示；
接头肽“丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸”对应的编码核苷酸序列如seqidno:8所示、接头肽“甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸”对应的编码核苷酸序列如seqidno:9所示，以及接头肽“甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸”对应的编码核苷酸序列如seqidno:10所示。
实施例二携带草鱼cd74和拟态弧菌表位基因疫苗靶点ovepis基因的嵌合基因的真核表达重组质粒构建
1.真核表达重组质粒pcdna3.1(+)-cd74的构建
1.1pcr扩增草鱼cd74蛋白编码基因
采用trizol试剂提取草鱼头肾组织总rna，并使用fastquantcdna第一链合成试剂盒合成cdna。根据genbank中收录的草鱼cd74的mrna序列(收录号：km369885.1)设计一对特异性引物，其中上游引物为5'-ctagctacgatggacgagcatc-3'(seqidno:21)，下划线部分为nhei酶切位点；下游引物为5'-ccgctcgagttactctgagccacactggg-3'(seqidno:22)，下划线部分为xhoi酶切位点。以草鱼头肾cdna为模板，pcr扩增大小为711bp的cd74蛋白编码基因。pcr反应体系含：模板2.0μl，10μmol/l上下游引物各1μl，去离子水8.5μl，2×taqpcrmastermix12.5μl；循环条件为：95℃预变性5min、95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸90s，32个循环后72℃延伸10min。
1.2cd74蛋白编码基因和真核表达质粒pcdna3.1(+)的双酶切
50μl酶切反应体系含：cd74蛋白编码基因的pcr回收产物或pcdna3.125μl，nhei/xhoi各1μl，10×lbuffer5μl，去离子水18μl。各组成分依次加入ep管混匀后，37℃水浴酶切3h。然后，向酶切体系中加入3倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸铵(7.5mol/l)溶液混匀，-80℃静置15min，4℃、12000rpm离心10min，用20μl蒸馏水重悬沉淀，得到浓缩的酶切产物。
1.3酶切产物的连接与转化
将浓缩后的cd74蛋白编码基因和真核表达质粒pcdna3.1(+)的酶切产物按1:3摩尔比混合，再加入t4dna连接酶室温作用30min。取10μl连接产物与100μldh5a感受态细胞混匀，依次进行冰水浴30min、42℃水浴热激45s、冰水浴2min。取100μl菌液涂布含终浓度为100μg/ml氨苄青霉素的lb平板，37℃过夜培养。
1.4阳性重组质粒的筛选与鉴定
从培养板上挑取单个菌落接种5ml含终浓度为100μg/ml氨苄青霉素的lb培养液中，37℃、150rpm过夜培养后，从dh5a中提取质粒。对重组质粒进行双酶切鉴定和测序鉴定，双酶切鉴定反应条件同前。结果如图2所示，在5400bp和711bp附近各有一条特异性的dna条带，分别与pcdna3.1(+)和cd74蛋白编码基因的大小一致；测序结果也显示cd74蛋白编码基因无任何突变，表明真核表达重组质粒pcdna3.1(+)-cd74构建成功。
2.嵌合基因的真核表达重组质粒的构建
2.1嵌合基因的设计
如图3所示，用大小为327bp的拟态弧菌疫苗靶点ovepis基因替换cd74蛋白编码基因中261～280bp区域，形成一个大小为1020bp的嵌合基因cd74(1-261bp)-ovepis-cd74(280-711bp)。
2.2嵌合基因的真核表达重组质粒的构建
合成上述嵌合基因的前806bp基因片段，并在其5’端添加nhei酶切位点，克隆至puc57质粒形成重组克隆质粒puc57-cd74(1-261bp)-ovepis-cd74(280-497bp)。鉴于草鱼cd74蛋白编码基因序列中492-497bp区域为saci酶切位点,用nhei/saci分别酶切puc57-cd74(1-261bp)-ovepis-cd74(280-497bp)和pcdna3.1(+)-cd74，分别回收2个消化片段cd74(1-261bp)-ovepis-cd74(280-496bp)和pcdna3.1(+)-cd74(497-711bp)，酶切反应与连接反应的方法同1.3。然后按1.4方法依次将连接产物进行转化、培养、抽提质粒和鉴定。结果如图4所示，在5400bp和1020bp附近各有一条特异性的dna条带，分别与pcdna3.1(+)和嵌合基因的大小一致；测序结果也显示嵌合基因无任何突变，表明嵌合基因的真核表达重组质粒构建成功。
实施例三拟态弧菌靶向表位基因疫苗的制备与安全性检测
1.大肠杆菌dh5α菌蜕冻干粉的制备
1.1大肠杆菌dh5α新鲜菌蜕的制备
将自行构建(构建方法属于本领域的常规操作，可参照蔡昆，包士中，史晶等，大肠杆菌细菌菌蜕的制备及初步研究，军事医学科学院院刊，2008，32(5)：436-438)的含有温控裂解质粒pbv220-lysise的重组大肠杆菌dh5α接种至3ml含终浓度为100μg/ml氨苄青霉素的lb培养液，28℃、180rpm振荡培养12h。按1:100接种量取1ml上述培养后的菌液加入到100ml含终浓度为100μg/ml氨苄青霉素的lb培养液中，28℃、220rpm振荡培养至od600nm值为0.4时，转至42℃诱导培养2.5h，8000rpm离心10min，收集沉淀并用无菌磷酸盐缓冲液离心洗涤3次，再用1/10原体积的磷酸盐缓冲液重悬沉淀，获得新鲜的大肠杆菌dh5α菌蜕。采用平板倾注法测得诱导前后的重组大肠杆菌dh5α的活菌数分别为5.67×107cfu/ml与9.86×103cfu/ml，裂解效率为99.98％。如图5所示，扫描电镜下可见大肠杆菌dh5α菌蜕细胞的形态与表面结构无明显变化，但在细胞表面出现较多直径介于150-200nm的跨膜溶菌孔道，导致细胞内容物外漏而使细胞发生皱缩。
1.2大肠杆菌dh5α菌蜕冻干粉的制备
将新鲜的大肠杆菌dh5α菌蜕分装至中性硼硅管制西林瓶，加丁基橡胶塞，-80℃预冻4h，然后置fd8-3冷冻干燥机中真空冷冻干燥24h，压铝塑盖、贴标签，室温保存备用。用适量的无菌pbs重悬菌蜕冻干粉，采用平板倾注法进行活菌计数，结果未检测到任何活菌残留，说明冻干后的大肠杆菌dh5α菌蜕是安全的。
2.dh5α冻干菌蜕装载嵌合基因的真核表达重组质粒
2.1含有嵌合基因的真核表达重组质粒的装载
用hbs缓冲液(100mmol/l氯化钠,10mmol/l乙酸钠,10mmol/lhepes,ph7.0)重悬大肠杆菌dh5α菌蜕冻干粉。按菌蜕冻干粉与质粒的质量比为5:2向菌蜕冻干粉中加入嵌合基因的真核表达重组质粒pcdna3.1(+)-cd74(1-261bp)-ovepis-cd74(280-711bp)，接着hbs缓冲液定容至200μl，轻轻混匀，28℃水浴1h。然后，加入66.7μl浓度为0.1mmol/l的cacl2溶液、混匀，37℃孵育过夜。次日，4℃、8000rpm离心10min，收集沉淀，即为靶向表位基因疫苗。
2.2装载量的检测
以嵌合基因的真核表达重组质粒pcdna3.1(+)-cd74(1-261bp)-ovepis-cd74(280-711bp)作为阳性标准品。用双蒸水10倍梯度稀释阳性标准品，从1:103至1:108copies/μl6个梯度作为模板，每一梯度重复3次，进行荧光定量pcr，建立标准曲线。25μl荧光定量pcr反应体系为：superrealpremixplus12.5μl，模板2μl，上下游引物各1μl，其中上游引物：5′－agttgtccgctgccctct－3′,seqidno:23；下游引物：5′－gtcttgtgccgcgtgatt－3′,seqidno:24，ddh2o8.5μl。循环条件为：95℃预变性30s，95℃5s，45℃30s，共40个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，根据荧光值的变化规律获得标准曲线、扩增曲线和融解曲线，如图6所示。由扩增曲线(图6a)和标准曲线(图6b)可见，在103-108拷贝数之间的ct相差比较均匀，线性回归方程为y＝-3.192x+35.888，相关系数r2为0.992，扩增效率为105.719％，符合定量pcr的ct值与其拷贝数之间的线性关系。如图6c所示，熔解曲线表现为单一的峰值，产物的tm值均一，说明引物特异性好。以上结果表明所建立的标准曲线能够准确反映目的基因的扩增，可用于目的基因的定量分析。
将2.1中装载离心后的上清液作为荧光定量pcr检测样品，经1:10000倍稀释后同重组质粒标准品同时进行荧光定量，测得检样的ct值分别为11.304、11.402、11.517，带入标准曲线的线性回归方程，得出检样中嵌合基因的平均拷贝数为4.68×1014copies/ml，经换算得到每毫克菌蜕可装载上述重组质粒(表位基因疫苗)214微克。
3.拟态弧菌靶向表位基因疫苗的安全性检测
健康实验草鱼(100g左右/尾)饲养于仿生态式循环水系统，水温控制在25±1℃，每天早晚各投喂饲料1次，投喂量为草鱼体重的2％-3％，适应性饲养10天，确认草鱼健康后开始试验。实验草鱼分为2组，10尾/组，分别以口灌和腹腔注射方式接种5倍免疫剂量的本发明所述疫苗，接种连续14d观察实验草鱼状态，发现草鱼均正常进食，游动良好，未见发病症状，鱼剖检后内脏组织器官无任何病变，说明所述疫苗对实验草鱼是安全的。
实施例四拟态弧菌靶向表位基因疫苗的免疫效果评价
1.实验草鱼分组与口灌免疫
健康实验草鱼(100g左右/尾)暂养于仿生态式循环水系统2周，观察摄食和活动状态，确认健康后随机分成2组，80尾/组。第一组为疫苗口灌免疫组，将与1ml无菌注射器连接的软管经鱼口腔伸到咽齿下,注入0.5ml经无菌pbs适当稀释的本发明所述疫苗，使得免疫剂量达到20ug/尾，免疫后第14天用相同方法和相同剂量加强免疫一次；第二组为pbs对照组，口灌0.5ml无菌pbs。实验期间水温控制在25±1℃。
2.血清与肠黏液中非特异性免疫因子含量或活力检测
2.1样品的采集与处理
分别于免疫前与免疫后3d、7d、14d和21d从各组随机挑取3尾草鱼，尾动脉采血、离心分离血清和采集肠段、制备肠黏膜匀浆液。肠黏膜匀浆液的制备方法为:用预冷的0.01mol/l、ph7.4pbs冲洗肠道内容物后，使用洁净镊子刮取黏膜，放入5mlep管，冰水浴中用高速组织匀浆机均质1min,再用预冷0.01mol/l、ph7.4pbs做4倍稀释，4℃10000rpm离心20min，取上清即为肠黏膜匀浆液。
2.2非特异性免疫因子含量或活力检测
使用免疫因子检测试剂盒(南京建成生物工程研究所产品)检测血清及肠黏液样品中补体(c3)含量、溶菌酶(lzm)和超氧化物歧化酶(sod)的活力，具体操作按试剂盒说明书进行。结果显示：
(1)pbs对照组免疫前后各检测点血清及肠黏液中c3含量未有明显变化(p﹤0.05)，而本发明所述疫苗免疫组免疫后各检测点血清及肠黏液中c3含量均显著或极显著高于免疫前和pbs对照组(p﹥0.05或0.01)(表1)；
(2)pbs对照组免疫前后各检测点血清及肠黏液中lzm活力未有明显变化(p﹤0.05)，而本发明所述疫苗免疫组免疫后各检测点血清及肠黏液中lzm活力均显著或极显著高于免疫前和pbs对照组(p﹥0.05或0.01)(表2)；
(3)pbs对照组免疫前后各检测点血清及肠黏液中sod活力无明显差异(p﹤0.05)，而本发明所述疫苗免疫组各检测点血清sod活力有所增加，但与免疫前与pbs对照组无显著差异，而肠黏液中sod活力显著高于免疫前与pbs对照组(表3)。
结果表明本发明所述疫苗诱导机体产生了较强的非特异性免疫应答。
表1免疫前后不同时间草鱼血清及肠黏液中c3含量
表2免疫前后不同时间草鱼血清及肠黏液中lzm活力
表3免疫前后不同时间草鱼血清及肠黏液中sod活力
3.血清与肠黏液中抗体水平的检测
3.1样品的采集与处理
分别于免疫前及免疫后的第7d、14d、21d、28d和35d从各组随机挑取3尾草鱼采集血液和后肠段，血清与肠黏液的制备方法同2.1。
3.2草鱼抗疫苗靶点抗体水平检测
(1)用浓度为20μg/ml的重组蛋白ovepis(疫苗靶点)包被酶标孔，100μl/孔，振荡1min，放入湿盒，4℃包被过夜；
(2)弃去包被液、拍干，用ph7.4pbst洗涤3次，再用含5％脱脂奶粉的pbs液37℃封闭2h；
(3)弃封闭液，pbst洗涤3次,加入不同稀释度的待检血清和待检肠黏液，100μl/孔，振荡1min，放入湿盒，37℃孵育2h。试验中同时做草鱼阴性血清和阴性肠黏液对照；
(4)弃血清或肠黏液，pbst洗涤5次，加入1:500倍稀释的兔抗草鱼igm纯化抗体，每孔100μl，37℃孵育2h；
(5)弃抗体，pbst洗涤5次，加入1:5000倍稀释的hrp标记的山羊抗兔igg，每孔100μl，37℃孵育1h；
(6)弃抗体，pbst洗涤5次，每孔加入100μltmb显色液，避光反应10-30min左右，待空白对照孔稍微出现颜色时加终止液，每孔50μl，轻振后测定od450值。
(7)计算同一稀释度下待检血清或待检肠黏液与阴性血清或阴性肠黏液的od450比值，比值大于2.1的待检血清或待检肠黏液的最高稀释度为其抗体效价，并以log10形式表示。
3.3试验结果
结果如图7所示，草鱼免疫后7天，即可从其血清及肠黏液中检测到抗ovepis特异性抗体，并随免疫时间的延长，抗体水平逐渐升高，至第21d达到峰值，平均抗体滴度分别为4.19log10(血清抗体)和3.61log10(肠黏液抗体)，之后抗体滴度略有降低。结果表明本发明所述疫苗诱导机体产生了较强的体液免疫应答和肠黏膜免疫应答。
4.外周血与肠组织中淋巴细胞增殖活性检测
4.1草鱼外周血淋巴细胞的分离
分别于免疫前及免疫后的第23d从各组随机挑取3尾草鱼,用自来水冲洗体表，ms-222麻醉后从尾动脉无菌操作采集肝素钠抗凝血3ml，使用鱼(淡水)全血淋巴细胞分离试剂盒(天津灏洋生物科技有限公司产品)分离草鱼外周血淋巴细胞，具体操作按试剂盒说明书进行。
4.2草鱼肠组织中淋巴细胞的分离
分别于免疫前及免疫后的第23d从各组随机挑取3尾草鱼,用自来水冲洗体表，ms-222麻醉和75％酒精棉球消毒体表后，沿草鱼背部剪开腹腔外侧肌肉，无菌取出后肠段置于含有预冷的无菌pbs缓冲液(0.01mol/l，ph7.4)的培养皿中，用无菌弯头镊子去除肠道外脂肪与肠系膜，纵向剖开肠管并清洗粪便。然后，用无菌眼科剪将组织剪成小块，放入组织研磨器内，加入2ml组织匀浆液(鱼组织淋巴细胞分离试剂盒中配备的)，缓慢转动研棒、研磨至匀浆。用5ml组织匀浆液冲洗研磨器，收集细胞悬液，经200目不锈钢滤网过滤到15ml离心管内。使用鱼组织淋巴细胞分离试剂盒(天津灏洋生物科技有限公司产品)分离草鱼肠组织中淋巴细胞，具体操作按试剂盒说明书进行。
4.3淋巴细胞增殖活性检测
取96孔细胞培养板，每孔加入100μl浓度为5×106个/ml的淋巴细胞悬液和终浓度为100μg/ml的植物血凝素(pha-m)，重复3孔，试验中同时设置空白孔(只加淋巴细胞悬液，不加pha-m)和细胞培养液对照孔(用1640培养液替代淋巴细胞，加pha-m)。细胞培养板放置28℃、5％co2培养箱培养，每24h吹打1次，70h后加入噻唑蓝(mtt)，100μl/孔，继续培养4h，每孔加入100μl二甲基亚砜(dmso)轻微振荡后，测定od570值。用刺激指数(si)表示淋巴细胞的增殖活性，si＝样品孔平均od570值-培养液对照od570值/空白孔od570值-培养液对照od570值。结果如图8所示，发明所述疫苗免疫组草鱼外周血及肠组织样品的平均si值分别为2.16±0.02和2.29±0.17，pbs对照组草鱼外周血及肠组织样品的平均si值分别为1.26±0.06和1.52±0.20，疫苗免疫组外周血及肠组织的淋巴细胞增殖活性均极显著高于pbs对照组(p<0.01)。结果表明本发明所述疫苗诱导机体产生了较强的细胞免疫应答和肠黏膜免疫应答。
5.免疫保护率检测
免疫后第28天，从靶向表位基因疫苗免疫组和pbs对照组分别随机挑取30尾草鱼转入2个实验鱼缸中适应环境，并缓慢将水温升高至28±1℃。用10ld50拟态弧菌菌液(浓度为4.26×109cfu/ml/尾)腹腔注射攻击各组实验鱼，连续观察14d，记录各组草鱼发病及死亡情况，根据公式计算相对免疫保护率(rps)，rps＝(1-免疫组死亡数/对照组死亡数)×100％，同时对死亡草鱼及时剖检和病原分离鉴定，以确定死亡原因。结果发现pbs对照组草鱼全部死亡；靶向表位基因疫苗免疫组草鱼存活27尾，相对免疫保护率为90％。剖检死亡草鱼，眼观呈典型腹水病病变，并从肝脏中分离到大量细菌，其菌落特征与形态染色特性均与拟态弧菌一致。
结论：本发明所述拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗可刺激鱼体产生良好的系统免疫应答和黏膜免疫应答以及免疫保护效应，从而抵抗拟态弧菌的感染。
序列表
<120>一种拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗及其制备方法和应用
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