一种具有抑菌性能的生物活性表面的制备方法与流程

本发明的技术方案涉及生物材料领域，具体的是一种钛基生物材料表面改性方法。
背景技术：
：随着社会经济的发展以及人们生活水平的提高，人类逐渐进入老龄化阶段，患有关节疾病和骨骼疾病的人数逐渐增多，这使得对硬组织修复或替换材料的需求逐渐增加。作为生物医用金属材料，钛及钛合金具有无毒、比强度高、生物相容性好等一系列优点，在医学临床上得到广泛的应用。钛及钛合金广泛应用于承重部位骨缺损的修复和重建。但是钛及钛合金属于生物惰性材料，缺少诱导骨细胞生长的能力，植入人体后与骨骼之间只能形成简单的机械嵌合，容易造成植入体的松动甚至脱落。因此，目前临床上广泛使用的是载有羟基磷灰石(hydroxyapatite,ha)涂层的ti植入体（zhongz,qinj,maj.electrophoreticdepositionofbiomimeticzincsubstitutedhydroxyapatitecoatingswithchitosanandcarbonnanotubesontitanium[j].ceramicsinternational,2015,41(7):8878-8884；sunl,berndtcc,grosska,etal.materialfundamentalsandclinicalperformanceofplasma-sprayedhydroxyapatitecoatings:areview[j].journalofbiomedicalmaterialsresearch,2001,58(5):570-92）。羟基磷灰石是人体骨组织的主要无机组成部分，具有良好的生物学性能。植入人体后能在短时间内与人体的软硬组织紧密结合，因而ha已被广泛应用为骨组织修复与替换材料。但是,ha的力学性能特别是冲击韧性差，还不具备作为理想骨替代材料的能力,因此必须通过与其它材料如钛材料结合来提高其使用性能，成为目前研究的热点（孟德营,刘金华,姜丽娜.羟基磷灰石/壳聚糖生物复合材料研究进展.齐鲁工业大学学报,2009,23(1):33-37）。若在钛基体表层先制备出二氧化钛（tio2）层，再在其表面上制备ha层，则tio2作为过渡层，可以在一定程度上提高ha层与钛基体之间的结合力（e.mohseni,e.zalnezhad,a.r.bushroa.comparativeinvestigationontheadhesionofhydroxyapatitecoatingonti–6al–4vimplant:areviewpaper.internationaljournalofadhesionandadhesives,2014,48:238-257），并且tio2使得基体的耐腐蚀性得到增强（李兆峰,廖志谦，匡蒙生,等.ti-6al-2zr-1mo-3nb合金微弧氧化陶瓷膜的结构与性能.稀有金属材料与工程,2011,40(1):40-44）。ha层的制备虽然在一定程度上改善了植入体的生物活性，但植入体不具备抗菌能力。植入人体后，植入体引发的术后感染也高达20%以上，感染严重时甚至会造成患者截肢、死亡的危险，大大增加了患者的痛苦和负担，所以，通过对ti植入体进行表面处理，使其兼具良好的生物活性和抗菌性能是目前对ti植入体进行表面改性的研究重点。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是：提供通过一步微弧氧化技术在钛表面制备tio2/ha复合层的方法，并通过浸提-干燥的方法在tio2/ha复合层上装载壳聚糖(cs)，制备出具有高cs装载量及低表面形貌遮盖度的tio2/ha/cs复合层，使其具有明显抑菌性的同时仍能保持优异的生物学性能。具体步骤如下：第一步，配制电解液：将用量为0.2mol/l的ca(ch3coo)2·h2o和0.1mol/l的nah2po4·2h2o溶于去离子水中，40℃下搅拌20min，静置30min后，室温下搅拌20min后静置，而后重复升温搅拌和室温搅拌步骤至溶液浊度均匀。第二步，微弧氧化制备tio2/ha复合层：将钛件置于阳极，打开微弧氧化电源，缓慢升压，使微弧氧化电压升至360v~400v，然后反应3min，反应期间，进行实施透光检测，当溶液出现浊度分层时，启动搅拌，分层消失即停止搅拌，反应时间后，将电压缓慢降到零，关闭电源，用去离子水清洗试样表面，室温干燥；第三步，浸提-干燥法制备tio2/ha/cs复合层：将第二步制得的tio2/ha复合层浸泡在cs浓度为10g/l的2%的乙酸溶液中3min，然后提拉出来，再浸入去离子水中5s，在60℃烘箱中干燥24h，制备出tio2/ha/cs复合层。上述步骤二中，还不需要实时检测钛件附近区域的ph，并用0.01mol/l的氢氧化钠溶液调节，保证ph值不小于7。上述步骤三中，提拉速度为2~5cm/s。本发明的有益效果如下：（1）现有的通过微弧氧化法在纯钛表面生成的ha多为多孔状或不规则块状，这些方法生成的ha层比表面积小，粗糙度和亲水性也有待提高。本发明在原来钙磷电解液的基础上，通过提高电解液浓度使之达到50g/l以上，同时ca/p并未采用羟基磷灰石中钙磷的比例1.67，而是提高到了2，使ha在阳极钛的形成具有充足的钙磷离子、动力学和热力学条件，并最终形成了花瓣状ha，由于微弧氧化的电击穿作用，氧化层表面亦可保持多孔状形貌。（2）本发明制备出的花瓣状ha表面与多孔状表面相比具有更高的粗糙度，使cs的装载量提高。（3）本发明通过将不同形貌的ha浸入10g/l的壳聚糖2%乙酸溶液，再在60℃烘箱中干燥24小时，形成分布均匀的ha/cs复合层，克服了制备ha/cs复合层传统的溶液共混法、共沉淀法的ha颗粒易团聚与分散不均匀的问题，交替沉积法ha结晶性差的问题，以及模拟体液矿化法、原位沉析法和仿生法等的时间长、效率低的问题，通过微弧氧化法首先在钛基底上制备ha，可控性强且ha结晶性较好，再通过浸提-干燥的方法装载cs，形成的膜层分布均匀，操作简单。整个工艺流程简便易实施、可控性强，且所用时间短、效率高。（4）本发明采用的保持浊度的电解液，能够稳定电解液中钙磷离子浓度，减少因反应消耗造成的离子浓度的下降，使得反应制备的花瓣状ha更加完整。附图说明下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。图1为本发明实施例1、2、3制得的不同形貌的tio2/ha复合层及其负载cs后的sem图。图2为本发明实施例1、2、3制得的不同形貌的tio2/ha复合层及实施例1制得的tio2/ha复合层的xrd谱图。图3为本发明实施例1、2、3制得的不同形貌的tio2/ha复合层的三维轮廓图。图4为本发明实施例1、2、3制得的不同形貌的tio2/ha复合层的二维粗糙度图。图5为本发明实施例3制得的ha与ha/cs复合层，及纯cs的ft-ir谱图。图6为本发明实施例1、2、3制得的不同ha/cs复合层的比浊度曲线。图7为本发明实施例1、2、3制得的不同ha/cs复合层的菌落数柱状图。具体实施方式实施例1第一步，配制电解液：将0.02mol(ca(ch3coo)2·h2o)和0.01mol的(nah2po4·2h2o)溶于100ml去离子水中，40℃下搅拌20min，静置30min后，室温下搅拌20min后静置，而后重复升温搅拌和室温搅拌步骤至溶液浊度均匀。第二步，微弧氧化制备tio2/ha复合层：将钛件置于阳极，打开微弧氧化电源，缓慢升压，使微弧氧化电压升至360v，然后反应3min，反应期间，进行实施透光检测，当溶液出现浊度分层时，启动搅拌，分层消失即停止搅拌，反应时间后，将电压缓慢降到零，关闭电源，用去离子水清洗试样表面，室温干燥；第三步，浸提-干燥法制备tio2/ha/cs复合层：将第二步制得的tio2/ha复合层浸泡在cs浓度为10g/l的2%的乙酸溶液中3min，然后提拉出来，提拉速度为5cm/s，再浸入去离子水中5s，在60℃烘箱中干燥24h，制备出tio2/ha/cs复合层。用扫描电镜(sem,s-4800,hitachi)、能谱仪(eds)、x-射线衍射仪(xrd,rigakud/max2500)、原子力显微镜（afm，agilent5500)和红外光谱仪（ftir，brookerv80）分别表征负载壳聚糖前后复合层的形貌、成分、物相、粗糙度和官能团变化。用电子天平（cp224c）称量装载壳聚糖前后试样的质量，各质量数据为三次测量结果平均值，再除试样的有效面积得到单位面积cs装载量，比较不同形貌和粗糙度样品单位面积装载壳聚糖量的大小；采用比浊度实验进行tio2/ha/cs复合层的抗菌性能检测：①配制液体培养基：在量程500ml锥形瓶中配制液体培养基（去离子水400ml、酵母粉2g、胰蛋白胨2g、葡萄糖4g），用纱布和细绳封好瓶口。②灭菌：将配好的液体培养基、1个100ml小锥形瓶、包装好的移液枪枪头、包装好的若干10ml离心管及在玻璃培养皿中放置的用锡箔纸包装好的待测样品放入灭菌锅，灭菌20min。③液体培养基中植入大肠杆菌:紫外消过毒的超净台打开通风并点燃酒精灯，将灭菌锅内样品和培养基等转移到超净台中，待培养基冷却到37℃左右，将其倒80ml到小锥形瓶中，铁丝在酒精灯前烧红以去除细菌，在超净台无污染空气中冷却2秒，从试管中挑出适量的大肠杆菌在小锥形瓶的液体培养基中冲刷掉，然后用纱布和细绳将小锥形瓶瓶口封好，放进37℃摇床中振荡培养24小时左右使其od值大于1即可使用。④比浊度检测:将培养好的液体培养基分别倒8ml到5个离心管中，然后将待测试样放入离心管并做好标记，用纱布和细绳将5个离心管口封好放入摇床中振荡培养24小时，用移液枪吸200微升培养液到96孔板中，测出每个试样的培养液的od值即可。实施例2微弧氧化电压为380v，提拉速度为4cm/s，其他工艺参数同实施例1。实施例3微弧氧化电压为400v，提拉速度为5cm/s，其他工艺参数同实施例1。图1中a、b、c分别为实施例1、2、3制得的不同氧化层的表面形貌的sem图，图1中d、e、f分别为实施例1、2、3装载完cs后的表面形貌的sem图。图1a表面为错落有致、高低起伏的花瓣形貌。图1b为图1a表面装载壳聚后的表面形貌可见原来氧化层被大面积遮盖，壳聚糖在整个氧化层表面相连成膜，并且存在局域性团聚现象。图1c为微弧氧化电压升高后，围绕孔洞形成规则的螺旋状梯度形貌，氧化层在孔洞处呈凹陷状，孔洞之间为错落的花瓣状物质，整个氧化层较图1a更为起伏。图1d为图1c表面装载壳聚糖后的形貌，孔洞几乎没有被遮盖，围绕孔洞形成一个个似“小包”一样的形貌，这与氧化层区域性凹凸不平形貌和壳聚糖本身具有弹性有关。这些壳聚糖“小包”互相之间紧密相连构成一体，在整个氧化层表面相聚成膜。图1e中微弧氧化电流增加，形成的花瓣变得密集和卷曲，孔径增加。表面装载cs后，微弧氧化层表面形貌除部分孔洞外被完全遮盖，cs成膜的完全性受膜层本身厚度与孔洞处的粗糙度影响，因此在整个涂层上会有少量不连续部分存在（图1f）。图2为实施例1、2、3制得的不同氧化层的xrd谱图，可见在26°、32°、34°和50°处均检测出ha的特征峰，53°处为锐钛矿的特征峰，但峰的强度较小，这是tio2被形成的ha层覆盖的结果，xrd谱图的结果表明通过一步微弧氧化技术成功在ti表面制备出不同形貌的tio2/ha复合层。ha1+cs谱图中在23°处检测出壳聚糖的特征峰，说明通过浸泡-提拉的方法在ha层表面成功装载上了壳聚糖。但壳聚糖峰的强度较弱，由峰的形状可知壳聚糖的结晶度不高，这与壳聚糖本身为半结晶性物质有关。图3为实施例1、2、3制得的不同氧化层的三维轮廓图，粗糙度分别为0.467µm、0.552µm、0.788µm，可见粗糙度逐渐变大，这是由表面螺旋状凹陷孔洞形貌造成的表面凹凸不平和花瓣状ha的致密性不同造成的（图1a、c、e）。图4为实施例1、2、3制得的不同氧化层的二维粗糙度图，由图可见单位面积内垂直表面方向波峰波谷起伏越大或波峰波谷的数量越多，表面粗糙度则越大。图5为实施例3制得的ha与ha/cs复合层，及纯cs的ft-ir谱图，ha红外谱图中874、1430处为ha中特有的co32-。壳聚糖谱图中1085处为c-o峰，1370处为c-h峰，1424和1590处的肩峰为氨基-nh2的振动吸收峰。ha/cs复合层中，1037处为p-o-c-o键的吸收峰，为ha中的p-o与cs分子中的c-o键合而成的新峰，峰形尖锐，说明形成的p-o-c-o结构结晶度比较高，说明cs并不只是机械的覆盖在ha表面，二者易于发生化学交联，可有效提高界面间结合力。1430和1650处为-co-nh-，为ha和cs中均不具有的新的官能团，由cs在ha表面干燥的过程中co32-和-nh2化合交联而成，说明ha对cs的吸附为化学吸附，有很强的吸附作用，且峰向高波数方向偏移，说明键的力常数变大（刘芳,胡国海.红外吸收光谱基团频率影响因素的验证[j].景德镇高专学报,2010,25(4):28-30）。cs和ha之间的这种兼具物理和化学作用的结合，有效地增加了二者之间的结合力。图6为实施例1、2、3制得的不同ha/cs复合层的比浊度曲线，可见装载了壳聚糖的三个样品的比浊度在24h内均显著低于没有装载壳聚糖的ha和纯培养基，且随着培养时间延长这种变化趋势很稳定，说明壳聚糖本身具有一定的抗菌性。cs装载量少的样品比浊度较cs装载量大的样品大，说明cs装载量的增加有利于样品的抑菌。图7为本发明实施例1、2、3制得的不同ha/cs复合层的菌落数柱状图，为大肠杆菌在液体培养基中培养24小时后，再加入不同样品培养12小时，将一定量菌液涂覆到固体培养基平板上37℃培养8小时所得。由各式样菌落数可知，装载cs后的式样较没有装载cs的式样具有显著的抑菌性。cs装载量大的较装载量小的菌落数少，与比浊度实验结果吻合，证明了cs的装载量与对大肠杆菌的抑制程度直接相关。表1.不同形貌ha表面单位面积cs装载量试样ti(g)ti/tio2/ha(g)ti/tio2/ha/cs(g)单位面积cs装载量(g/cm2)6h降解量（g）ha1+cs0.55730.57990.60280.03050.0004ha2+cs0.56020.58480.61260.03710.0009ha3+cs0.55360.58080.61070.03990.0017表1为不同形貌ha表面单位面积cs装载量，可见随粗糙度的增加，ha表面装载的cs增多。式样有效面积为7.5×10=75mm2，结果显示，粗糙度较小的ha表面可装载壳聚糖的浓度为0.0305g/cm2,具有较大粗糙度的表面壳聚糖装载量分别为0.0376g/cm2、0.0399g/cm2，较前者分别提高了21.6%、30.8%。说明表面粗糙度对浸泡-提拉法壳聚糖的装载量影响很大。当前第1页12