一种能提高轴突再生有序性的神经导管及其制备方法与流程

本发明涉及神经导管领域，具体而言，涉及一种能提高轴突再生有序性的神经导管及其制备方法。

背景技术：

制约周围神经缺损修复的主要障碍是缺乏合适的修复材料，运用组织工程原理构建仿生性周围神经移植物是当今的研究热点，其中结构仿生和内环境仿生是该领域的两大课题。

生物相容性材料制备的神经套管，神经导管，以及去细胞神经移植物在一定程度上模拟了天然神经的支架结构，能够对神经再生起到一定的促进作用但距离理想的功能修复依然相差甚远已有不少研究证实，某些神经营养因子、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)、药物以及干细胞可促进周围神经再生，在移植物内引入这些物质可促进轴突生长，提升神经修复效果。

现有的技术，无论是通过在移植物例如神经导管内负载促神经再生物质和/或清除对轴突生长有抑制作用的物质，均可促进轴突生长，增加轴突再生数量，但形态学上轴突数量的增加并没有带来对应程度的功能恢复。本发明的发明人发现，其主要原因在于，在增加轴突数量的同时也增加了再生神经纤维无序、错长的机会。由于错长的神经纤维无法支配正确的靶器官，因此部分抵消了再生神经纤维数量增加带来的优势。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能提高轴突再生有序性的神经导管，该神经导管可减少神经移植物中轴突无序生长的情况，有利于降低轴突与靶器官的错配率。

本发明的另一目的在于提供一种制备上述神经导管的方法。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供了一种能提高轴突再生有序性的神经导管，其包括管体和分布在管体内的对轴突再生具有抑制作用的轴突抑制性分子；

所述管体内具有沿所述管体长度方向延伸的神经再生通道，轴突抑制性分子均匀分布于管体的基质材料内及神经再生通道的内壁。

当再生轴突长入多通道导管后，而存在于神经再生通道内壁的轴突抑制性分子将作为排斥性信号，防止轴突接触管壁，利用轴突抑制性分子在神经再生通道的周围组成化学护栏，减少轴突的错长机率，对于周围神经再生轴突有序、快速生长起到协同作用。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述轴突生长抑制分子为硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)或髓磷脂相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述神经再生通道内填充有用于促进神经纤维再生的神经纤维再生促进剂。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述神经纤维再生促进剂为负载神经营养因子的水凝胶。

神经营养因子(neurotrophin,NT)是一类由神经所支配的组织(如肌肉)和星形胶质细胞产生的且为神经元生长与存活所必需的蛋白质分子。神经营养因子通常在神经末梢以受体介导式入胞的方式进入神经末梢，再经逆向轴浆运输抵达胞体，促进胞体合成有关的蛋白质，从而发挥其支持神经元生长、发育和功能完整性的作用。

水凝胶(Hydrogel)是以水为分散介质的凝胶，是具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水残基遇水膨胀的交联聚合物。水凝胶可以对神经纤维的生长起到支持和促进的作用并能很好的负载和缓释水溶性神经营养因子。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述神经营养因子选自神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)，脑源神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)，胶质细胞源神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)中的一种或几种的混合。

NGF，BDNF，GDNF被证明有利于促进神经纤维的生长，提高神经纤维的生长速度，使其快速通过神经再生通道。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述神经再生通道的数量为多个。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述所述神经再生通道的直径为100-300μm。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述导管的直径为2-5mm。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述导管由可降解生物材料制成；

优选的，所述可降解生物材料选自明胶和壳聚糖中的任意一种或两种的组合。

当管体由可降解生物材料制成，使得当轴突穿越神经再生通道后，管体自然降解吸收完成神经修复过程。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述神经再生通道的内壁具有微孔。

微孔是由制备管体的材料例如可降解生物材料在制备过程中自然形成的，其孔径维持在0.5-1μm左右。

微孔可使环境中的营养物质进入到神经再生通道内，为轴突和神经纤维的生长提供支持；同时，由于管体内分布有轴突抑制性分子，可阻止轴突通过微孔穿越神经再生通道的内壁。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，微孔的孔径约0.5-1μm。

另一方面，本发明提供了能提高轴突再生有序性的神经导管的制备方法，其包括：将对轴突再生具有抑制作用的轴突抑制性分子与制备管体的原料混合。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，轴突抑制性分子为硫酸软骨素蛋白多糖或髓磷脂相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)。

本发明提供的神经导管的制备方法通过在原料中加入轴突抑制性分子，使制成的神经导管中，轴突抑制性分子均匀分布于神经再生通道的内壁及管体的基质材料内，进而得到能提高轴突再生有序性的神经导管。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中的神经导管的结构示意图；

图2为本发明实施例1中的神经导管的沿圆周方向的剖面结构视图；

图3为本发明实施例1中的神经导管未填充水凝胶状态下的的沿圆周方向的剖面结构视图；

图4为本发明实施例1中的神经导管的沿长度方向的剖面结构视图；

图5为本发明实验例1中的坐骨神经钳夹损伤造模后免疫荧光染色结果图；图中：(A)正常坐骨神经横截面CSPGs呈环形分布在轴突(星标)周围，(B)钳夹损伤2天后，CSPGs呈弥散状分布。(C)纵切面显示，损伤修复7天后轴突再生效果与CSPGs分布有关。在CSPGs分布规律处，轴突走形顺畅(箭头)，而在CSPGs分布混乱处，轴突再生紊乱(箭标)；

图6为本发明实验例2中的CSPGs界面引导轴突的生长方向；图中：(A)在多聚赖氨酸(PDL)包被的培养皿中涂抹混有荧光染料的CSPGs形成清晰的界面。(B1)DRG神经元在对照组培养板中向各个方向长出轴突。(B2)DRG神经元在涂抹CSPGs的培养板中生长形成明显的轴突界线(箭头)。(C)NF200免疫荧光染色显示轴突在靠近CSPGs界面出发生转向，矩形方框放大图(对应1，2，3，4)显示轴突转向的角度。(D)柱状图显示受CSPGs界面影响而发生转向的轴突比例(0.88±0.09)远远高于生长停止的轴突比例(0.12±0.09，n＝40，P<0.01)。(E)转角分布图显示发生小角度转向的轴突数量要高于发生大角度转向的轴突数量。

图中标记：100-神经导管；101-管体；102-硫酸软骨素蛋白多糖；103-神经再生通道；104-水凝胶。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

请参考图1-图4，本实施例提供的能提高轴突再生有序性的神经导管100，其包括：

由明胶制成的管体101和分布在管体101内的对轴突再生具有抑制作用的轴突抑制性分子，本实施例中为硫酸软骨素蛋白多糖102(CSPGs)。

其中，管体101的内壁具有多个沿管体101长度方向延伸的神经再生通道103；硫酸软骨素蛋白多糖102均匀分布于管体101的基质材料内及神经再生通道103内壁并且以沿神经再生通道103的长度方向分布的方式分布于管体101内部。

此外，神经再生通道103填充有对神经纤维生长起支撑和促进作用的水凝胶104。

另外，该神经导管100的外直径约2-5mm；神经再生通道103的直径约100-300μm。当然，在其他的实施例中，神经导管100的外直径和神经再生通道103的直径均可以根据实际需求进行设计。

再有，本实施例中的神经再生通道103的内壁上具有多个用于供营养物质的输送但大多数轴突无法通过的微孔(图未示)，微孔的孔径为0.5-1μm。

本实施例提供的神经导管的制备方法如下：

1.用去离子水溶解明胶，配置浓度为4％(w/v,g/mL)的明胶水溶液。

2.待溶液均一透明后，加入对轴突再生具有抑制作用的轴突抑制性分子-CSPGs，浓度为20微克/毫升，再缓慢加入浓度为10mg/mL的甲醛水溶液，在37℃水浴下搅拌交联6h。

3.把步骤2得到的溶液注入直径为2mm，通道直径为0.2mm的模具中。

4.已注入明胶水溶液的模具经过超声处理后，放入-40℃冰箱冷冻1小时。

5.用98％乙醇洗涤模具和支架，置于-40℃冰箱内浸泡2h，该步骤重复三次。

6.用去离子水置换98％乙醇，置于-40℃冰箱内浸泡2h，洗涤三遍。

7.配置浓度为5mg/mL ECM消化液，先调pH至8使酶失活，再调pH至7.4，然后把已调pH的ECM注入上述模具的液槽中，缓慢抽出铁丝，使ECM注入明胶支架中，支架连同模具放入37℃恒温箱中20min，使ECM成胶后，拆除模具，得到管体长约20mm、直径2mm，神经再生通道直径为0.30mm，神经再生通道内填充有负载神经营养因子的水凝胶的多通道的能提高轴突再生有序性的神经导管。

当然，需要说明的是，在其他的实施例中，步骤2中的交联剂可换成2mg/mL的京尼平(Genipin)。

用Geinipin交联的话，步骤2和3为：加Genipin到溶液中，终浓度为2mg/mL，注入模具后，37摄氏度恒温24小时。

实验例1

CSPGs分布对轴突再生的影响

方法：(对成年SD大鼠行坐骨神经钳夹损伤造模，损伤后7天对SD大鼠实施安乐死，取材损伤段坐骨神经，多聚甲醛固定后行冰冻切片，取纵切视野，随后以免疫荧光染色的方法特异性标记出轴突(NF200)和硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)，结果如图5所示。

从图5可以看出，损伤修复7天后轴突再生效果与CSPGs分布有关。在CSPGs分布规律处，轴突走形顺畅(箭头)，而在CSPGs分布混乱处，轴突再生紊乱(如图中箭标所示)。

实验例2

平整的CSPGs界面能够引导轴突转向

方法：通过将CSPGs涂抹在多聚赖氨酸预处理的培养皿底面形成CSPGs边界，然后将DRG神经元种植在培养皿中，经过一段时间的培养后以多聚甲醛固定细胞，行免疫荧光染色标记轴突，显微镜下观察轴突在CSPGs边界处的生长情况，结果如图6所示。

图6-B1显示了DRG神经元在涂抹CSPGs的培养板中生长形成明显的轴突界线(图6-B1箭头所示)；图6-C显示了NF200免疫荧光染色显示轴突在靠近CSPGs界面出发生转向，矩形方框放大图(对应1，2，3，4)显示轴突转向的角度；图6-D显示了受CSPGs界面影响而发生转向的轴突比例(0.88±0.09)远远高于生长停止的轴突比例(0.12±0.09，n＝40，P<0.01)；图6-E的转角分布图显示了发生小角度转向的轴突数量要高于发生大角度转向的轴突数量；

以上结果表明CSPGs边界能够有效引导轴突沿着CSPGs分布方向进行方向调整并继续生长。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。