本发明涉及一种α-低聚半乳糖提取物缓释体及其制备和护肤应用，特别是从绿豆中提取的α-低聚半乳糖提取物缓释体及其制备和护肤应用。
背景技术：
：α-低聚半乳糖(α-galactooligosaccharides，α-gos)是一类含有α-半乳糖苷键的低分子量可溶性低聚糖，广泛分布于豆科植物中，尤其多见于种子、根、芽等组织内，具有重要的生理保护功能。有研究表明α-低聚半乳糖是双歧杆菌的有效增殖因子，具有抑制病原菌、防止便秘、腹泻、保护肝功能、降低血清胆固醇、降低血压、降低血脂、增强免疫功能、促进营养和钙离子的吸收、预防和治疗乳糖消化不良、改善脂肪代谢、防癌抗癌等功能。目前，α-低聚半乳糖的来源大致分为四种：①从天然原料提取；②天然多糖酸水解；③化学合成；④酶法合成。每一种方法都有其优点及缺点，例如，从天然原料中提取，主要是从豆科植物的种子中提取，现阶段国内外报道的有关提取原料主要有大豆、羽扇豆、红豆，豌豆等，获得的产物种类较多，难以分离纯化，同时制备纯化方法通常都会涉及醇沉纯化的步骤，清除和回收溶剂困难；天然多糖水解转化产品得率低，产物复杂，不易获得纯品；化学合成法使用大量化学试剂，毒性大，易残留，生产成本高，并且需要繁琐的羟基保护和去保护步骤，在实际生产中不可行；酶法合成主要以半乳糖为底物，通过半乳糖苷酶催化合成，由于逆反应即水解反应的存在，反应产物的产量往往不高，同时反应产物中含有多种聚合度的糖，而且同一聚合度的糖存在多种异构体，对应用存在很大的干扰。绿豆属豆科蝶形花亚科菜豆族豇豆属，又名青豆、交豆、青小豆。原产于亚洲东南部，中国也是起源中心，在温带、亚热带地区广泛种植。在我国绿豆已有千余年的栽培史，其产量和出口量均居世界首位。绿豆具有药食两用功能。富含淀粉、蛋白质、膳食纤维、维生素e、β-胡萝卜素、钙、铁、钾、锌、镁、硒等营养素和功能性低聚糖、黄酮类化合物等功能成分，有较高的营养与保健价值，有“济世粮谷”、“食中要物”的美誉。本草纲目记载：绿豆有补气元神，安精神，调和五脏，行十二经脉，润皮肤，去浮风，利肿胀，止消渴，解一切牛马、草药、金石诸毒等功效。绿豆具有多种保健功能，清热解毒、润肠通便、降血糖、降血压、降血脂、抗肿瘤、抗过敏、提高免疫力、解暑去烦、清胆养胃、明目、排铅、保护肝脏和心血管等功效。传统绿豆的利用仍较为粗放，以食用为主。绿豆源低聚糖，目前已有较多文献涉及提取或应用，但主要是水溶性低聚糖如甘露糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖等，且产物通常是粗多糖，纯度较低。绿豆来源的α-低聚半乳糖，研究较少，主要集中在毛蕊花糖，且主要应用在食品、保健品等领域，尚未见其在化妆品领域中应用。复乳是将简单的w/o或o/w乳液(即初乳或一级乳)进一步乳化在另外一种连续相中得到的复合型乳剂，其结构特点是在其分散相的液滴中又包含另一种分散相微滴，每个分散相液滴都形成内含一个或多个分散隔室的小囊泡结构。通常，w/o型乳剂进一步乳化分散在水中，则形成w/o/w型复乳；o/w乳剂进一步乳化分散在油中，则形成o/w/o型复乳。由于复乳的特殊结构特点可以实现包埋、保护、隔离、掩藏、缓释、控释等多种功能。技术实现要素：本发明提供了一种绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体及其制备和护肤应用，该缓释体不仅能够实现对绿豆α-低聚半乳糖提取物的缓释，而且能够提高其活性。根据本发明的一个方面，本发明涉及一种绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体，其特征在于，其为w/o/w复乳，在内水相中含有绿豆α-低聚半乳糖提取物。优选地，内水相中绿豆α-低聚半乳糖提取物和水的质量比为1:(2～10)，更优选为1:(5～8)。优选地，油相中含有溶剂和乳化剂i。所述溶剂选自氢化聚异丁烯、辛酸/癸酸三甘油酯、棕榈酸异丙酯、c12-15烷基苯甲酸酯、异壬酸异壬酯、鲸蜡醇(乙基己基)酯、三羟甲基丙烷三异硬脂酸酯中的一种或其任意混合物；所述乳化剂i为聚甘油酯类乳化剂，优选地，所述乳化剂i为聚甘油-2油酸酯、聚甘油-2倍半油酸酯、聚甘油-10三油酸酯、聚甘油-2二聚羟基硬脂酸酯、聚甘油-3二硬脂酸酯、聚甘油-3二异硬脂酸酯、聚甘油-3油酸酯、聚甘油-4异硬脂酸酯、聚甘油-10三硬脂酸酯、聚甘油-10五硬脂酸酯中任意两种乳化剂的任意质量比混合物，更优选地，所述乳化剂i中两种乳化剂的质量比为(1～2):(2～1)，更优选为1:1。优选地，油相中乳化剂i和溶剂的质量比为1:(10～50)，更优选为1:(20～40)。优选地，外水相中含有乳化剂ii。所述乳化剂ii为椰油基葡糖苷、鲸蜡硬脂基葡糖苷、蔗糖硬脂酸酯、蔗糖多油酸酯、硬脂酰乳酰乳酸钠、c20-22烷基磷酸酯中任意两种乳化剂的任意质量比混合物，更优选地，所述乳化剂ii中两种乳化剂的质量比为(1～2):(2～1)，更优选为1:1。优选地，外水相中乳化剂ii和水的质量比为1:(10～50)，更优选为1:(20～40)。优选地，内水相、油相、外水相的质量比为(6～22):(11～51):(11～51)，更优选为(12～18):(21～41):(21～41)。优选地，本发明w/o/w复乳的粒径为6-15μm，更优选为9～11μm。优选地，缓释体中进一步含有高分子聚合物，高分子聚合物能够提高缓释体的稳定性。所述高分子聚合物选自羟乙基纤维、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、聚丙烯酸酯交联共聚物-11、丙烯酸钠/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/vp共聚物、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/羟乙基丙烯酸酯交联共聚物、山嵛醇聚醚-25甲基丙烯酸酯交联聚合物中的一种或其任意混合物。所述高分子聚合物的含量为缓释体质量的0.1～0.2％。优选地，所述绿豆α-低聚半乳糖提取物提取自绿豆，其提取方法包括如下步骤：(1)对绿豆进行除杂、粉碎、用脱脂剂脱脂，去除脱脂剂得脱脂绿豆粉；(2)将脱脂绿豆粉分散于萃取液中萃取α-低聚半乳糖，得萃取混合物；(3)将萃取混合物进行固液分离，取液体部分静置，收集含有α-低聚半乳糖的下相液体；和(4)从含有α-低聚半乳糖的下相液体中纯化得到α-低聚半乳糖提取物；其中，所述萃取液含有离子液体、无机盐、表面活性剂和水。优选地，绿豆为明绿豆，更优选地，明绿豆为非转基因明绿豆。本领域技术人员可以理解，步骤(1)中，粉碎可采用本领域已知的各种粉碎方法，包括但不限于机械粉碎、气流粉碎、球磨等。优选地，粉碎后的绿豆粉粒径为10～80μm，更优选地，粒径为30～50μm。优选地，步骤(1)中，在用脱脂剂脱脂之前对粉碎后的绿豆粉进行干燥。本领域技术人员可以理解，干燥可采用本领域已知的各种干燥方法，包括但不限于晒干、烘干、鼓风干燥、真空干燥等。优选地，干燥后的绿豆粉含水量≤0.5％(以重量百分比计)，更优选地，含水量≤0.3％。本领域技术人员可以理解，步骤(1)中，脱脂剂可采用本领域常用的各种有机溶剂，包括但不限于，卤代烃类、芳香烃类、醇类、醚类、酮类、酯类等或其任意混合物，例如：二氯甲烷、甲苯、甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇、乙醚、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、n,n-二甲基甲酰胺等或其任意混合物。优选地，脱脂剂是无毒或无害的，例如：乙醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、n,n-二甲基甲酰胺或其任意混合物。例如，在本发明的一个实施方式中，脱脂剂为石油醚和乙酸乙酯的混合物，优选地，石油醚沸程为60～90℃，更优选地，该混合物中石油醚和乙酸乙酯的质量比为(0.5～2):1，最优选地，该混合物中石油醚和乙酸乙酯的质量比为1:1。本领域技术人员可根据脱脂剂的种类调整脱脂剂的用量。例如，在本发明的一个实施方式中，脱脂剂的质量为绿豆粉质量的2～8倍，优选地，脱脂剂的质量为绿豆粉质量的4～6倍。本领域技术人员可根据脱脂剂的种类、用量调整脱脂的温度和时间。例如，在本发明的一个实施方式中，温度为4～35℃，优选地，温度为20～30℃；时间为1～8h，优选地，时间为2～4h。优选地，步骤(1)中，脱脂在振荡器中进行，频率为50～300次/min，更优选为100～200次/min。本领域技术人员可以理解，步骤(1)中，脱脂后可采用本领域已知的各种分离方法去除脱脂剂，包括但不限于离心、过滤、蒸馏等。根据本发明，步骤(1)中，去除脱脂剂后，所得脱脂绿豆粉可直接用于后续步骤，或者于0～8℃，优选4～5℃储存，然后再用于后续步骤。优选在储存前用本领域已知的各种干燥方法干燥，所述干燥方法包括但不限于鼓风干燥、冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥等。例如，在本发明的一个实施方式中，采用冷冻干燥，优选在-1.5～-0.5mpa下干燥1～3h。优选地，步骤(2)中，脱脂绿豆粉与萃取液的质量比为1:(2～10)，更优选为1:(5～8)；萃取温度为4～35℃，更优选为15～20℃；萃取时间为10-60min，更优选为30～45min；萃取在振荡器中进行，频率为50～300次/min，更优选为100～200次/min。优选地，所述萃取液由离子液体、无机盐、表面活性剂和水组成。优选地，所述萃取液中离子液体、无机盐、表面活性剂和水的质量比为1:(0.2～0.4):(0.05～0.1):(6～8)。优选地，离子液体为[bmim]x，其中，x为br-、i-、no3-、hso4-、[ch3coo]-、[bf3]-、[bf6]-中的至少一种，bmim为1-丁基-3-甲基咪唑阳离子。在本发明中，离子液体可市售获得，或通过本领域已知的方法合成。优选地，无机盐为磷酸钠、焦磷酸钠、六偏磷酸钠、三聚磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾或其任意混合物；优选地，表面活性剂为季铵盐型阳离子表面活性剂，例如：peg-2油酸脂基甲基氯化铵、椰油基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、硬脂基三甲基氯化铵、山嵛基三甲基氯化铵、双硬脂基二甲基氯化铵、聚季铵盐-2、聚季铵盐-22、聚季铵盐-39、聚季铵盐-47或其任意混合物；或者是含有eo、po或eo/po共聚结构的非离子表面活性剂，例如：c11-15链烷醇聚醚-7、c11-15链烷醇聚醚-9、c11-15仲链烷醇聚醚-12、c12-13链烷醇聚醚-3、c12-13链烷醇聚醚-6、c12-13链烷醇聚醚-9、ppg-1十三醇聚醚-6、ppg-10甘油醚、ppg-10鲸蜡基醚、peg/ppg-10/30共聚物、peg/ppg-17/6共聚物、peg/ppg-18/4共聚物或其任意混合物；更优选为季铵盐型阳离子表面活性剂。本领域技术人员可以理解，步骤(3)中，固液分离可采用本领域已知的各种固液分离方法，包括但不限于离心、过滤等。优选地，步骤(3)中，静置温度为0-35℃，更优选为0～5℃；本领域技术人员可以理解，静置直至上下两相界面稳定，在本发明的一个实施方式中，静置时间为1～8h，优选为2～4h。上相液体中含有离子液体，为了降低成本，可以通过例如溶剂萃取、减压蒸馏等方法分离、提纯离子液体，重复利用。优选地，在步骤(4)中，在步骤(3)中得到的含有α-低聚半乳糖的下相液体中加入乙醇，振荡，固液分离，收集沉淀物并用洗涤液洗涤，然后将沉淀物溶于水中，用大孔吸附树脂进行柱层析，收集水苏糖、毛蕊花糖、棉籽糖流出液，干燥后得到α-低聚半乳糖提取物。优选地，在步骤(4)中，乙醇为无水乙醇；乙醇加入量为下相液体质量的2～8，更优选为4～6倍。优选地，在步骤(4)中，振荡时间为2～20min，更优选为5～15min；振荡温度为0-35℃，更优选为0～5℃；振荡在振荡器中进行，频率为50～300次/min，更优选为100～200次/min。本领域技术人员可以理解，在步骤(4)中，固液分离可采用本领域已知的各种固液分离方法，包括但不限于离心、过滤等。优选地，在步骤(4)中，洗涤液为甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃或其任意混合物；洗涤次数为1～5次，更优选为2～3次。优选地，水量为沉淀物质量的2～10倍，更优选为5～8倍。本领域技术人员可以理解，大孔吸附树脂可以使用本领域常用的各种大孔吸附树脂，包括但不限于非极性的d101、lx-20、lx-60，弱极性的ab-8、lx-21、xda-6、极性的lx-17/lx-38，优选弱极性的ab-8大孔吸附树脂。洗脱液可以是乙醇-水体系、甲醇-水体系、乙腈-水体系，优选乙醇-水体系，更优选乙醇浓度0～45％梯度洗脱。本领域技术人员可以理解，可以通过hplc跟踪监测确定何时对水苏糖、毛蕊花糖、棉籽糖流出液进行收集。本领域技术人员可以理解，干燥可采用本领域已知的各种干燥方法，包括但不限于鼓风干燥、喷雾干燥、真空干燥、冷冻干燥等。例如，在本发明的一个实施方式中，采用冷冻干燥，优选在-1.5～-0.5mpa下干燥4～8h。在本发明中，步骤(iv)中固液分离洗涤后的沉淀物，即在柱层析精制之前，α-低聚半乳糖的含量一般约为62～70％，其中除水苏糖、毛蕊花糖、棉籽糖外，还含有葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖。柱层析时，葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖会被先洗脱出来，从而达到精制的目的。根据本发明的另一个方面，本发明涉及绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体的制备方法，包括如下步骤：(1)将绿豆α-低聚半乳糖提取物溶于水中，得到内水相；将乳化剂i溶于溶剂中，得到油相；在油相中缓慢加入内水相，超高压均质得到w/o乳液；(2)将乳化剂ii溶于水中，得到外水相；在外水相中缓慢加入w/o乳液，超高压均质得到w/o/w复乳。优选地，在w/o/w复乳中进一步加入高分子聚合物。优选地，超高压均质的压力为1200～1500bar；时间为15～30min；温度≤25℃。更优选地，超高压均质在超高压均质器进行，更优选在连续进样型超高压均质器中进行。优选地，步骤(1)得到的w/o乳液的粒径为0.8～1.2μm。根据本发明的另一个方面，本发明涉及通过如上方法制备得到的绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体。根据本发明的提取方法制备得到的绿豆α-低聚半乳糖提取物具有较强的抗氧化能力，能够清除羟基自由基和dpph自由基，从而具有抗氧化、抗过敏、降低刺激性、抗衰老、祛皱、保湿、增强皮肤弹性等活性，可以用在化妆品中，而将其制成复乳不仅能够实现绿豆α-低聚半乳糖提取物的缓释，而且能够提高其活性。根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种组合物，含有本发明的绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体。优选，所述组合物为化妆品组合物。根据本发明的另一个方面，本发明涉及绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体在制备化妆品中的应用。在本发明中，化妆品包括但不限于香皂、洗面奶、卸妆液、爽肤水、乳液、精华液、精华霜、精华油、润肤油、按摩油、面霜、眼霜、面膜、浴液等。含有本发明的绿豆α-低聚半乳糖提取物复乳的化妆品能够抗氧化、抗过敏、降低刺激性、抗衰老、祛皱、保湿、增强皮肤弹性。通过本发明的提取方法获得的提取物中α-低聚半乳糖纯度高，主要组分是水苏糖、毛蕊花糖、棉籽糖，以sugar-d色谱柱和rid检测器分析，总α-低聚半乳糖的纯度≥99.0％，其余基本上是含量≤1.0％的蛋白质(其含量通过folin-酚法测定)，该蛋白质以sevag除蛋白法并不能脱除，说明该蛋白质是以与α-低聚半乳糖结合形式存在的糖蛋白。本发明提取方法的整个工艺在常温或常温以下进行，保持了α-低聚半乳糖和糖蛋白的天然构象，从而最大程度的保留了α-低聚半乳糖和糖蛋白的生物活性。由于采用改进的离子液体双水相体系，在体系中加入了表面活性剂，提高了α-低聚半乳糖的萃取得率。综上，本发明相对于现有技术取得了如下的优点及有益效果：(1)将绿豆α-低聚半乳糖提取物制备成w/o/w复乳，不仅实现了缓释，而且能够提高其活性；(2)采用离子液体、无机盐、表面活性剂和水构成的新型萃取分离体系，结合了离子液体和双水相萃取的优点。与传统的水提醇沉、双水相萃取等方法相比，萃取效率高，条件温和；(3)表面活性剂的加入降低了α-低聚半乳糖与绿豆细胞组织的结合力，加速α-低聚半乳糖从固相进入溶剂的过程，具有省时、节能、提取效率高等优点；(4)提取得到的提取物中α-低聚半乳糖纯度达到99.0％，杂多糖等杂质含量低，主要成分是水苏糖、毛蕊花糖及棉籽糖以及少量的糖蛋白；(5)提取工艺在常温或常温以下进行，无高温对α-低聚半乳糖或糖蛋白构象的破坏，保持了绿豆α-低聚半乳糖提取物的高生物活性；(6)本发明的绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体具有良好的抗氧化能力，优于水苏糖、毛蕊花糖和棉子糖，能够抗衰老、祛皱、保湿、增强皮肤弹性，且能够降低表面活性剂等的刺激性，并具有较好的舒敏作用，特别适用于制备化妆品。附图说明图1为绿豆α-低聚半乳糖提取物降低sds刺激能力测试；图2为绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体对皮肤水分含量的影响；图3为绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体对皮肤经皮水分流失的影响；图4为绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体对皮肤弹性的影响。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。以下实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为可商购获得的常规常用试剂。以下实施例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规的操作方法。干燥植物的水含量测定方法参照《gb5009.3-2010食品中水分的测定第一法直接干燥法》总糖含量的测定采用苯酚-硫酸比色法测定(张青,张天民.苯酚-硫酸比色法测定多糖含量[j].中国药学会全国生化新药研究与临床应用学术会议,2004:56-56.)蛋白质的含量采用folin-酚试剂法测定。釆用高效液相色谱外标法测定样品中的低聚糖含量：(1)糖标准曲线的制备。准确称取果糖、蔗糖、棉籽糖、水苏糖、毛蕊花糖的标准样品，用水溶解后，加入等量的乙腈，配制成一系列不同浓度梯度的标准溶液，经0.45μm针头式有机系滤膜过滤后，按浓度从低到高的顺序进行检测，得到各个糖的保留时间，并记录各个浓度对应的峰面积，以峰面积对浓度作图，得到各个糖的标准曲线。(2)对提取的绿豆低聚糖及进行分析，通过糖的标准曲线计算糖的含量，并得到纯化后的纯度。(3)色谱条件。色谱柱：sugar-d；检测器：rid；柱温：40℃；流动相：乙腈：水＝75:25(v/v)；流速：1.0ml/min；进样量：20μl。实施例11.制备绿豆α-低聚半乳糖提取物(i)绿豆的前处理将100质量份市售明绿豆剔除杂质、杂豆、缺陷豆，球磨至粒径为30μm，烘干至含水量0.2％，加入由200质量份石油醚(沸程60～90℃)和200质量份乙酸乙酯，以振荡的方式进行脱脂，振荡频率100次/min，脱脂温度为20℃，时间为2h。脱脂完毕后，离心，将滤饼在-1.5mpa下冷冻干燥1h，得到约96质量份的脱脂绿豆粉，保存于5℃冰箱中。(ii)绿豆α-低聚半乳糖的萃取1质量份的离子液体[bmim]bf3中，加入0.2质量份的磷酸二氢钾、0.05质量份的十六烷基三甲基溴化铵、6质量份的去离子水，搅拌溶解，得到萃取液；将100质量份的脱脂绿豆粉分散于500质量份的萃取液中，以频率为100次/min的振荡器，在15℃恒温条件下，振荡30min。(iii)绿豆α-低聚半乳糖的分离将步骤(ii)得到混合萃取体系，离心，液体部分在0℃条件下静置2h，分离上下相，收集得到约400质量份的下相液体。(iv)绿豆α-低聚半乳糖的纯化将步骤(iii)得到的下相液体，加入1600质量份的无水乙醇，以频率为100次/min的振荡器在0℃振荡5min，离心固液分离，收集沉淀物并用四氢呋喃洗涤2次，得到约4质量份的沉淀物。最后沉淀物溶于20质量份的水中，加入到预处理后的大孔吸附树脂ab-8层析柱，洗脱液为0～45％的乙醇溶液，进行梯度洗脱，hplc跟踪监测下收集水苏糖、毛蕊花糖、棉籽糖流出液，在-1.5mpa下冷冻干燥4h，得到约2.78质量份粉末状绿豆α-低聚半乳糖提取物，折合成未脱脂的明绿豆，其得率为：2.67％。以高效液相色谱外标法检测绿豆α-低聚半乳糖提取物的组成如下：表1绿豆α-低聚半乳糖提取物的组成水苏糖毛蕊花糖棉籽糖α-低聚半乳糖含量蛋白质含量32.42％51.12％16.04％99.58％0.42％2.制备绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体将2质量份绿豆α-低聚半乳糖提取物溶于10质量份的水中，得内水相；将0.5质量份的聚甘油-2油酸酯和0.5质量份的聚甘油-10三油酸酯溶于20质量份的辛酸/癸酸三甘油酯中，得油相；在油相中缓慢加入内水相，以1200bar，温度20℃，均质15min，得到w/o乳液。将0.5质量份的椰油基葡糖苷、0.5质量份的硬脂酰乳酰乳酸钠溶于20质量份水中，得外水相；在外水相中缓慢加入w/o乳液，以1200bar，温度20℃，均质15min，再加入0.055质量份的聚丙烯酸钠，得到w/o/w复乳。绿豆α-低聚半乳糖提取物的含量为3.70％。以激光粒度仪器测试绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体的粒径，为10.8μm。实施例21.制备绿豆α-低聚半乳糖提取物(i)绿豆的前处理将100质量份市售明绿豆剔除杂质、杂豆、缺陷豆，球磨至粒径为35μm，烘干至含水量0.15％，加入由200质量份石油醚(沸程60～90℃)和200质量份乙酸乙酯，以振荡的方式进行脱脂，振荡频率150次/min，脱脂温度为25℃，时间为3h。脱脂完毕后，离心，将滤饼在-1.0mpa下冷冻干燥2h，得到约96质量份的脱脂绿豆粉，保存于5℃冰箱中。(ii)绿豆α-低聚半乳糖的萃取1质量份的离子液体[bmim]bf3中，加入0.3质量份的磷酸二氢钾、0.06质量份的硬脂基三甲基氯化铵、7质量份的去离子水，搅拌溶解，得到萃取液；将100质量份的脱脂绿豆粉分散于500质量份的萃取液中，以频率为150次/min的振荡器，在16℃恒温条件下，振荡35min。(iii)绿豆α-低聚半乳糖的分离将步骤(ii)得到混合萃取体系，离心，液体部分在2℃条件下静置2.5h，分离上下相，收集得到约400质量份的下相液体。(iv)绿豆α-低聚半乳糖的纯化将步骤(iii)得到的下相液体，加入2000质量份的无水乙醇，以频率为150次/min的振荡器在2℃振荡8min，离心固液分离，收集沉淀物并用四氢呋喃洗涤3次，得到约4.8质量份的沉淀物。最后沉淀物溶于28.8质量份的水中，加入到预处理后的大孔吸附树脂ab-8层析柱，洗脱液为0～45％的乙醇溶液，进行梯度洗脱，hplc跟踪监测下收集水苏糖、毛蕊花糖、棉籽糖流出液，在-1.0mpa下冷冻干燥5h，得到3.02质量份粉末状绿豆α-低聚半乳糖提取物，折合成未脱脂的明绿豆，其得率为：2.90％。以高效液相色谱外标法检测绿豆α-低聚半乳糖提取物的组成如下：表2绿豆α-低聚半乳糖提取物的组成水苏糖毛蕊花糖棉籽糖α-低聚半乳糖含量蛋白质含量31.57％52.57％15.33％99.47％0.53％2.制备绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体将2质量份绿豆α-低聚半乳糖提取物溶于12质量份的水中，得内水相；将0.5质量份的聚甘油-2油酸酯和0.5质量份的聚甘油-10三油酸酯溶于30质量份的辛酸/癸酸三甘油酯中，得油相；在油相中缓慢加入内水相，以1300bar，温度18℃，均质20min，得到w/o乳液。将0.5质量份的蔗糖硬脂酸酯、0.5质量份的硬脂酰乳酰乳酸钠溶于30质量份水中，得外水相；在外水相中缓慢加入w/o乳液，以1300bar，温度18℃，均质20min，再加入0.077质量份的聚丙烯酸钠，得到w/o/w复乳。绿豆α-低聚半乳糖提取物的含量为2.63％。以激光粒度仪器测试绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体的粒径，为9.5μm。实施例31.制备绿豆α-低聚半乳糖提取物(i)绿豆的前处理将100质量份市售明绿豆剔除杂质、杂豆、缺陷豆，球磨至粒径为45μm，烘干至含水量0.3％，加入由200质量份石油醚(沸程60～90℃)和200质量份乙酸乙酯，以振荡的方式进行脱脂，振荡频率180次/min，脱脂温度为28℃，时间为2.5h。脱脂完毕后，离心，将滤饼在-1.0mpa下冷冻干燥1.5h，得到约95质量份的脱脂绿豆粉，保存于5℃冰箱中。(ii)绿豆α-低聚半乳糖的萃取1质量份的离子液体[bmim]hso4中，加入0.25质量份的碳酸氢钾、0.08质量份的十六烷基三甲基溴化铵、7.5质量份的去离子水，搅拌溶解，得到萃取液；将100质量份的脱脂绿豆粉分散于500质量份的萃取液中，以频率为180次/min的振荡器，在18℃恒温条件下，振荡40min。(iii)绿豆α-低聚半乳糖的分离将步骤(ii)得到混合萃取体系，离心，液体部分在3℃条件下静置3h，分离上下相，收集得到约400质量份的下相液体。(iv)绿豆α-低聚半乳糖的纯化将步骤(iii)得到的下相液体，加入2000质量份的无水乙醇，以频率为180次/min的振荡器在4℃振荡12min，离心固液分离，收集沉淀物并用四氢呋喃洗涤2次，得到约4.2质量份的沉淀物。最后沉淀物溶于29.4质量份的水中，加入到预处理后的大孔吸附树脂ab-8层析柱，洗脱液为0～45％的乙醇溶液，进行梯度洗脱，hplc跟踪监测下收集水苏糖、毛蕊花糖、棉籽糖流出液，在-1.2mpa下冷冻干燥7h，得到2.85质量份的粉末状绿豆α-低聚半乳糖提取物，折合成未脱脂的明绿豆，其得率为：2.71％。以高效液相色谱外标法检测绿豆α-低聚半乳糖提取物的组成如下：表3绿豆α-低聚半乳糖提取物的组成水苏糖毛蕊花糖棉籽糖α-低聚半乳糖含量蛋白质含量33.37％50.67％15.14％99.18％0.82％2.制备绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体将2质量份绿豆α-低聚半乳糖提取物溶于14质量份的水中，得内水相；将0.5质量份的聚甘油-2油酸酯和0.5质量份的聚甘油-2二聚羟基硬脂酸酯溶于40质量份的c12-15烷基苯甲酸酯中，得油相；在油相中缓慢加入内水相，以1500bar，温度15℃，均质15min，得到w/o乳液。将0.5质量份的椰油基葡糖苷、0.5质量份的蔗糖硬脂酸酯溶于40质量份水中，得外水相；在外水相中缓慢加入w/o乳液，以1500bar，温度15℃，均质15min，再加入0.196质量份的丙烯酸钠/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物，得到w/o/w复乳。绿豆α-低聚半乳糖提取物的含量为2.04％。以激光粒度仪器测试绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体的粒径，为9.2μm。实施例41.制备绿豆α-低聚半乳糖提取物(i)绿豆的前处理将100质量份市售明绿豆剔除杂质、杂豆、缺陷豆，球磨至粒径为50μm，烘干至含水量0.1％，加入由200质量份石油醚(沸程60～90℃)和200质量份乙酸乙酯，以振荡的方式进行脱脂，振荡频率200次/min，脱脂温度为30℃，时间为4h。脱脂完毕后，离心，将滤饼在-0.5mpa下冷冻干燥3h，得到约95质量份的脱脂绿豆粉，保存于5℃冰箱中。(ii)绿豆α-低聚半乳糖的萃取1质量份的离子液体[bmim]hso4中，加入0.4质量份的碳酸氢钾、0.1质量份的聚季铵盐-22、8质量份的去离子水，搅拌溶解，得到萃取液；将100质量份的脱脂绿豆粉分散于500质量份的萃取液中，以频率为200次/min的振荡器，在20℃恒温条件下，振荡45min。(iii)绿豆α-低聚半乳糖的分离将步骤(ii)得到混合萃取体系，离心，液体部分在5℃条件下静置4h，分离上下相，收集得到约400质量份的下相液体。(iv)绿豆α-低聚半乳糖的纯化将步骤(iii)得到的下相液体，加入2400质量份的无水乙醇，以频率为200次/min的振荡器在5℃振荡15min，离心固液分离，收集沉淀物并用四氢呋喃洗涤3次，得到约4.5质量份的沉淀物。最后沉淀物溶于36质量份的水中，加入到预处理后的大孔吸附树脂ab-8层析柱，洗脱液为0～45％的乙醇溶液，进行梯度洗脱，hplc跟踪监测下收集水苏糖、毛蕊花糖、棉籽糖流出液，在-0.5mpa下冷冻干燥8h，得到3.13质量份的粉末状绿豆α-低聚半乳糖提取物，折合成未脱脂的明绿豆，其得率为：2.97％。以高效液相色谱外标法检测绿豆α-低聚半乳糖提取物的组成如下：表4绿豆α-低聚半乳糖提取物的组成水苏糖毛蕊花糖棉籽糖α-低聚半乳糖含量蛋白质含量33.16％51.55％14.66％99.37％0.63％2.制备绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体将2质量份绿豆α-低聚半乳糖提取物溶于16质量份的水中，得内水相；将0.5质量份的聚甘油-2油酸酯和0.5质量份的聚甘油-2二聚羟基硬脂酸酯溶于40质量份的c12-15烷基苯甲酸酯中，得油相；在油相中缓慢加入内水相，以1200bar，温度15℃，均质30min，得到w/o乳液。将0.5质量份的蔗糖多油酸酯、0.5质量份的硬脂酰乳酰乳酸钠溶于40质量份水中，得外水相；在外水相中缓慢加入w/o乳液，以1200bar，温度15℃，均质30min，再加入0.2质量份的丙烯酸钠/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物，得到w/o/w复乳。绿豆α-低聚半乳糖提取物的含量为2.00％。以激光粒度仪器测试绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体的粒径，为10.3μm。应用实施例1按照下表5所列配方用本发明的绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体制备乳化型面膜液表5制备工艺：1、预配d相：d相混合，充分搅拌至溶解透明，备用；2、预配g相：g相混合，充分搅拌至溶解均匀，备用；3、边弱均质(速度为3000～4000rpm)，边将a相中的粉料依次缓慢地洒入冷的去离子水中，再边搅拌边加热，期间可进行多次短时间的弱均质(速度为3000～4000rpm)，至60-65℃，弱均质(速度为3000～4000rpm)5-8分钟至完全分散均匀，加入浸润完全的b相、c相，继续加热至82-85℃，再弱均质(速度为3000～4000rpm)2-5分钟至完全分散均匀，乳化前加入预配好的d相，充分搅拌均匀后，保温至少15-20分钟消毒，消泡，备用；4、e相，加热至85-88℃，保温搅拌至完全熔成液体后，再降温至80-82℃，依次加入f相，保温搅拌至完全熔成液体，备用；5、真空下，中速搅拌，弱-中速均质(速度为3500～6000rpm)，e+f相缓慢加入a+b+c+d相中，加完后，提速至中-强速(速度为6000～10000rpm)均质5-8分钟至完全乳化均匀，保温15分钟，消泡后降温；6、降温至45℃以下，加入预配好的g相，充分搅拌至均匀；7、加入预先混合均匀的h相，充分搅拌至均匀，再依次加入i相物料，充分搅拌均匀；8、取样，检测合格后，过滤出料。应用实施例2按照下表6所列配方用本发明的绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体制备透明型面膜液表6制备工艺：1、预配b相：将b相预混合，加热至75-80℃，充分搅拌至完全溶解，保温，备用；2、预配c相：c相混合，充分搅拌至溶解透明，备用；3、预配d相：将d相中的香精和peg-40氢化蓖麻油、丙二醇预混合均匀后，搅拌均匀，再加入去离子水，充分搅拌至完全溶解透明后，备用；4、预配e相：e相混合，充分搅拌至溶解均匀，备用；5、边弱均质(速度为3000～4000rpm)，边将卡波姆缓慢地洒入a相中的其余组分，再边搅拌边加热，期间可进行多次短时间的弱均质(速度为3000～4000rpm)，至82-85℃，弱均质(速度为3000～4000rpm)5-8分钟至完全分散均匀，加入预配好的b相，搅拌至完全溶解均匀后，至少15-20分钟消毒，消泡后，降温；6、降温至60-65℃，加入预配好的c相，充分搅拌至完全溶解透明；7、降温至45℃以下，加入预配好的d相，充分搅拌至完全溶解透明；8、加入预配好的e相，充分搅拌至完全溶解透明；9、依次加入f相，分别充分搅拌至完全溶解透明；10、取样，检测合格后，过滤出料。对比例1应用实施1中，用水替代实施例1制备的绿豆α-低聚半乳糖提取物w/o/w复乳，其余组分相同。对比例2应用实施2中，用水替代实施例3制备的绿豆α-低聚半乳糖提取物w/o/w复乳，其余组分相同。对比例3应用实施1中，用0.185％实施例1制备的绿豆α-低聚半乳糖提取物和4.815％的水替代5％的绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体，其余组分相同。对比例4应用实施2中，用0.102％实施例3制备的绿豆α-低聚半乳糖提取物和4.898％的水替代5％的绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体，其余组分相同。实施例5稳定性测试感官测试：肉眼观察产品的性状，看是否有异常；耐热试验：将样品放入(40±1)℃的电热恒温培养箱中24h，恢复室温后观察是否有变稀、变色、分层及硬度变化等现象，以判断样品的耐热性能；耐寒试验：将样品放入(-5～-10)℃的电冰箱中24h，恢复室温后观察是否有变稀、变色、分层及硬度变化等现象，以判断样品的耐寒性能；离心试验：将样品置于离心机中，以3000r/min的转速试验30min，观察样品的分离、分层状况。稳定性测试结果见下表7：表7稳定性测试结果稳定性测试结果表明：本发明制备的绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体稳定性良好，同时在化妆品中的稳定性亦良好。实施例6绿豆α-低聚半乳糖提取物抗氧化能力测试以羟基自由基、dpph自由基为受试物质，将实施例1～4制备的绿豆α-低聚半乳糖提取物制成相应的水溶液，考察其对自由基的清除能力。(1)羟基自由基实验利用h2o2和fe2+混合发生fenton反应，生成具有很高反应活性的羟基自由基，羟基自由基能被水杨酸有效地捕捉，并生成有色物质，若加入具有清除自由基的物质，便会和水杨酸竞争而减少有色物生成。常温下，取3支试管，在第一支试管中依次加入0.5ml水杨酸-乙醇溶液(浓度为9.1mmol/l)，3.5ml水，0.5ml样品溶液，0.5mlfe2+溶液(浓度为9.0mmol/l)，摇匀静置5min，加入h2o2(浓度为88mmol/l)溶液启动fenton反应，摇匀后，避光静置10min，在510nm波长下测定吸光度，记为a1；第二支试管，取0.5ml水替代fe2+溶液，其他与第一支试管相同，测得吸光度a2；第三支试管，取0.5ml水代替样品溶液，其他与第一支试管相同，测得吸光度a3。羟基自由基的清除率为：表8绿豆α-低聚半乳糖提取物对羟基自由基的清除率羟基自由基实验表明，绿豆α-低聚半乳糖提取物在极低的浓度下对羟基自由基就具有良好的清除效果，浓度越高，清除率越好。以实施例1为例，绿豆α-低聚半乳糖提取物对羟基自由基清除能力的ic50值为0.85mg/ml。(2)dpph自由基实验dpph在有机溶剂中是一种稳定自由基，在517nm处有吸收峰，呈紫色，当有自由基清除剂存在时，dpph会被配对，颜色变浅。加入5mldpph溶液(1mgdpph溶于20ml95％乙醇，超声5min，于517nm处测吸光度，吸光度为1.2-1.3间最佳)，0.2ml样品摇匀，于517nm处测定吸光度a1。a2为取5ml95％乙醇溶液替代dpph溶液所得吸光度，a3为取0.2ml水替代样品所得的吸光度。dpph自由基的清除率为：表9绿豆α-低聚半乳糖提取物对dpph自由基的清除率dpph自由基实验表明，绿豆α-低聚半乳糖提取物在极低的浓度下对dpph自由基就具有良好的清除效果，浓度越高，清除率越好。以实施例1为例，绿豆α-低聚半乳糖提取物对dpph自由基清除能力的ic50值为0.11mg/ml。特别是，绿豆α-低聚半乳糖提取物与维生素c等强还原剂相比稳定性更好，加之其对羟基自由基和dpph自由基良好的清除能力，从而特别适合在化妆品中应用。(3)以水苏糖、毛蕊花糖、棉籽糖单个组分来进行抗氧化能力测试，结果如下：表10单个低聚糖对羟基自由基的清除率从单个低聚糖对羟基自由基的清除率来看，实施例1-4所制备的绿豆α-低聚半乳糖提取物对羟基自由基的清除率更好。表11单个低聚糖对dpph自由基的清除率从单个低聚糖对dpph自由基的清除率来看，实施例1-4所制备的绿豆α-低聚半乳糖提取物对dpph自由基的清除率更好。实施例7绿豆α-低聚半乳糖提取物降低刺激性能力测试采用redbloodcorpuscletest(rbctest，血红细胞溶血值)来测试实施例1制备的绿豆α-低聚半乳糖提取物的降低刺激性能力。选择牛的新鲜血液，用sds(十二烷基硫酸钠)水溶液刺激其中的红细胞，测定530nm吸光度间接判断从红细胞中漏出的血红蛋白的量，基于从红细胞中漏出的血红蛋白的量来评价细胞膜的损伤程度，血红蛋白漏出量越多，损伤越大。实验方法参考：王海涛等，化妆品用抗敏抗刺激活性物质的筛选、提取及作机理研究，北京工商大学，2010。实验选取新鲜牛血红细胞进行，样品a为0.1mol/l的sds，样品b、c、d、e、f除含有0.1mol/l的sds外，还分别含有0.5％的水苏糖、毛蕊花糖、棉籽糖、实施例1制备的绿豆α-低聚半乳糖提取物和1.0％的实施例1制备的绿豆α-低聚半乳糖提取物。结果见图1，纵坐标为溶血率，其值越高表明对应样品刺激越高。从图1可以看出，水苏糖、毛蕊花糖、棉籽糖和实施例1制备的绿豆α-低聚半乳糖提取物都有降低sds刺激性的作用，相较而言，实施例1制备的绿豆α-低聚半乳糖提取物的活性更好。同时，样品e和f表明，绿豆α-低聚半乳糖提取物降低刺激性的能力与其加入量成正相关。因此，绿豆α-低聚半乳糖提取物添加到化妆品中，具有降低表面活性剂等的刺激性的作用。实施例8绿豆α-低聚半乳糖提取物舒缓过敏的测试以2.0％的sds水溶液刺激两侧前臂内侧，出现红肿、灼热、瘙痒等症状，用1.0％实施例1制备的绿豆α-低聚半乳糖提取物水溶液涂抹5min后进行感官评价，以0.25％的甘草酸二钾水溶液做为参照，测试人员18人。结果如下表：表12绿豆α-低聚半乳糖提取物舒缓过敏从测试结果可以看出，绿豆α-低聚半乳糖提取物具有一定的舒缓过敏的作用。本测试为感官性测试，即使考虑个体差异影响因素，仍可认为具有较好的舒敏作用，适于在化妆品中使用。实施例9绿豆α-低聚半乳糖提取物及绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体改善保湿性及弹性测试1)仪器：德国courage+khazaka(ck)公司生产的mpa10多探头测试系统、mpa580皮肤弹性测试仪。2)样品：空白(去离子水)、实施例1制备的绿豆α-低聚半乳糖提取物和绿豆α-低聚半乳糖提取物复乳，其中绿豆α-低聚半乳糖提取物为3.70％含量的水溶液。测试方法：依据mpa10多探头测试系统、mpa580皮肤弹性测试仪测试要求，测试人数9人，测试部位为受试者前臂内侧，每人每组(空白组、绿豆α-低聚半乳糖提取物组和绿豆α-低聚半乳糖提取物复乳组)均设置3个测试部位，按照(2.0±0.1)mg样品/cm2用量涂抹，早晚各一次。检测初始、4周、8周数据，以spss20.0数据统计系统对数据进行分析。3)试验结果见图2-4，初始时各测试部位水分含量、经皮水分流失和皮肤弹性基本相同，无显著性差异，4周和8周时绿豆α-低聚半乳糖提取物和绿豆α-低聚半乳糖提取物复乳与空白组相比水分含量、经皮水分流失和皮肤弹性数据均存在显著性差异，p＜0.01，这表明二者皆具有保湿和提高皮肤弹性的作用。相对而言，绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体的效果更为显著。实施例10绿豆α-低聚半乳糖提取物缓释体在化妆品中的应用1)试验方法：志愿者54人(年龄30-50岁)，按平行对照的原则随机分为6组，分别使用应用实施例1～2和对比例1-4的面膜，试验志愿者早晚洁面后各取一片敷于面部，使用周期为8周。2)试验结果：使用8周后，各组自评皮肤弹性改善程度，结果见下表13表13志愿者功效测试评价结果实验结果表明，含有绿豆α-低聚半乳糖提取物的面膜，较之于不添加的面膜，对皮肤的弹性具有显著的改善效果。对比例3和4尽管也加入了绿豆α-低聚半乳糖提取物，但是效果不如加入了绿豆α-低聚半乳糖提取物w/o/w复乳的面膜。以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12