本发明属于生物医药技术领域，具体涉及adar1作为干预靶点在缓解认知功能障碍方面的应用。
背景技术：
认知功能是指脑对信息的加工、储存和提取的能力，包括学习、记忆、知觉、注意、思维和想象等能力。认知功能障碍即认知功能缺陷或异常，不能正常对信息进行加工、储存和提取，主要表现为感知障碍、思维障碍和记忆障碍。社会隔离应激刺激是认知功能下降的风险因素，可引起的认知功能障碍，其发病机制与海马和皮层的神经递质及其相关受体功能的紊乱、内分泌系统和免疫系统失衡等有关。
由于认知功能障碍的发病机制尚未完全阐明，目前治疗只能以对症和神经保护性治疗为主，包括应用不同的神经细胞保护剂，如脑循环改善剂、能量代谢激活剂、神经递质和神经生长因子保护剂、ca2+拮抗剂、谷氨酸盐受体拮抗剂、抗氧化剂、胶质细胞调节剂和非甾体类抗炎剂等；通过干预恢复和维持神经递质的正常水平，包括药物补充其前体l-多巴胺、各种细胞移植以替代多巴胺能神经元、基因治疗法植入促进多巴胺合成的酶基因，以促进纹状体内多巴胺的生成或植入神经营养因子基因，利用胆碱酯酶抑制剂提高神经系统乙酰胆碱的含量等；传统的手术疗法包括苍白球切除术、丘脑切除术以及立体定位埋植脑刺激器等。由于上述治疗均是针对认知功能发病的下游环节和对症治疗，治疗效果极不理想，具有药物依赖性、创伤性和易复发性。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明从表观遗传学角度，在转录后水平进行干预，进而发现认知功能障碍的上游环节的关键靶点。确定本发明的技术方案，在于保护adar1作为干预靶点在缓解认知功能障碍方面的应用。
本发明通过制备应激刺激引起的认知功能障碍小鼠模型，进一步采用新物体识别实验检测小鼠的认知功能改变，免疫组化和westernblot检测小鼠脑内的adar1表达的改变，给予已在细胞水平证实的adar1抑制剂或诱导剂干预，从而证实了adar1在社会隔离应激刺激引起的balb/c小鼠异常行为中的作用机制。
对于上文所述的技术方案而言，进一步的，所述的应用包括adar1作为干预靶点在制备治疗认知功能障碍药物方面的应用。
对于上文所述的技术方案而言，进一步的，所述的应用包括adar1在制备治疗认知功能障碍药物方面的应用。
对于上文所述的技术方案而言，进一步的，所述的应用包括adar1诱导剂或adar1抑制剂在制备治疗认知功能障碍药物方面的应用。
对于上文所述的技术方案而言，进一步的，所述的adar1诱导剂是ifn(interferon)-γ，γ-干扰素；所述的adar1抑制剂是ehna(erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine),pentostatin喷司他丁。
对于上文所述的技术方案而言，进一步的，所述的应用包括使用adar1诱导剂或adar1抑制剂促使患者脑内adar1恢复到人脑内正常水平。
对于上文所述的技术方案而言，进一步的，所述的应用包括利用所述的adar1诱导剂，促进脑内的adar1的mrna和蛋白的表达，或者促进adar1活性的增加。本发明的研究发现4周社会隔离应激刺激后，balb/c小鼠出现非空间认知功能显著减弱；4周社会隔离应激刺激后，balb/c小鼠前额叶皮层、海马区adar1蛋白表达均明显降低；adar1抑制剂增强社会隔离应激刺激balb/c小鼠出现的非空间认知功能障碍；adar1诱导剂减轻社会隔离应激刺激balb/c小鼠的非空间认知功能障碍；adar1诱导剂逆转社会隔离应激刺激balb/c小鼠前额叶皮层、海马区adar1的低表达。这对于揭示该类疾病的发病机制，发现针对该类疾病的药物靶点，进行有效防治，具有重要的理论意义和应用价值。
对于上文所述的技术方案而言，进一步的，所述的应用包括利用所述的adar1诱导剂，促进脑内前额叶皮层和海马区的adar1的mrna和蛋白的表达，或者促进adar1活性的增加。
对于上文所述的技术方案而言，进一步的，所述的应用包括利用所述的adar1抑制剂，抑制脑内的adar1的mrna和蛋白的表达，或者抑制adar1的活性。
对于上文所述的技术方案而言，进一步的，所述的应用包括利用所述的adar1抑制剂，抑制脑内前额叶皮层和海马区的adar1的mrna和蛋白的表达，或者抑制adar1的活性。
本研究发现以adar1(rna编辑酶)作为干预的新靶点，从表观遗传学的角度，发现认知功能障碍发病上游环节的关键靶点，更好的诠释机体如何适应环境应激刺激引起的体内稳态的破坏。本发明采用行为学、形态学和分子生物学技术检测和分析adar1(adenosinedeaminaseactingonrna)诱导剂(ifn(interferon)-γ，γ-干扰素)和抑制剂[ehna(erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine),pentostatin喷司他丁]对社会隔离小鼠的认知功能的影响，发现adar1诱导剂或adar1抑制剂促使患者脑内adar1恢复到人脑内正常水平，可以有效的缓解社会隔离小鼠的异常认知功能。这对于揭示该类疾病的发病机制，发现针对该类疾病的药物靶点，进行有效防治，具有重要的理论意义和应用价值。
附图说明
图1为实验分组和社会隔离应激刺激模型的制备示意图；
图2为新物体识别实验示意图；新物体识别实验(ort)辨别指数；ehna和ifn-γ分别为adar1抑制剂和adar1诱导剂；数据以均数±标准差表示；*p<0.05,**p<0.01；(n＝10只/组)。
图3为adar1抑制剂和诱导剂干预社会隔离balb/c小鼠的新物体识别实验结果；
图4为药物干预的社会隔离balb/c小鼠前额叶皮层adar1表达的免疫组化结果；(a)前额叶皮层adar1表达的免疫组化结果；(b)前额叶皮层的脑区示意图；(c)前额叶皮层adar1表达阳性的神经元的光密度值统计结果。ehna和ifn-γ分别为adar1抑制剂和adar1诱导剂；数据以均数±标准差表示；**p<0.01；(n＝5只/组)。
图5为药物干预的社会隔离balb/c小鼠海马区adar1表达的免疫组化结果；(a)海马ca1区adar1表达的免疫组化结果；(b)海马hilus区adar1表达的免疫组化结果；(c)海马ca1和hilus区的脑区示意图；(d)海马ca1区adar1表达阳性的神经元的光密度值统计结果；(e)海马hilus区adar1表达阳性的神经元的光密度值统计结果。ehna和ifn-γ分别为adar1抑制剂和adar1诱导剂；数据以均数±标准差表示；**p<0.01；(n＝5只/组)。
图6为药物干预的社会隔离balb/c小鼠脑内adar1蛋白表达的westernblot结果。(a)前额叶皮层adar1蛋白的westernblot结果及灰度分析统计结果；(b)药物干预的社会隔离balb/c小鼠海马区adar1蛋白表达的westernblot结果及灰度分析统计结果。统计结果为目的蛋白与内参的灰度比值结果；ehna和ifn-γ分别为adar1抑制剂和adar1诱导剂；数据以均数±标准差表示；**p<0.01；(n＝5只/组)。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
本发明所使用的实验动物和实验试剂如下：
实验动物采用出生21天的健康balb/c小鼠60只，spf级，体重12～15g(大连医科大学重大疾病基因工程模式动物研究所提供)。
免疫组化试剂：
水合氯醛(扬州市奥鑫助剂厂)
多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司)
蔗糖(biosharp美国)
oct冷冻切片包埋液(sakura美国)
pbs磷酸盐缓冲液(粉剂)(北京索莱宝科技有限公司)
免疫组化染色试剂盒sp-9000(北京中杉金桥生物技术有限公司)
浓缩型dab显色试剂盒zli-9032(北京中杉金桥生物技术有限公司)
无水乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)
盐酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)
二甲苯(天津市科密欧化学试剂有限公司)
中性树胶(北京索莱宝科技有限公司)
westernblot试剂：
全蛋白提取试剂盒kgp250/kgp2100(江苏凯基生物技术股份有限公司)
bca蛋白含量检测试剂盒kgpbca(江苏凯基生物技术股份有限公司)
sds-page蛋白上样缓冲液(5x)(上海碧云天生物技术有限公司)
30％acr-bis(29:1)(上海碧云天生物技术有限公司)
下层胶缓冲液(4x)(上海碧云天生物技术有限公司)
上层胶缓冲液(4x)(上海碧云天生物技术有限公司)
过硫酸铵(上海碧云天生物技术有限公司)
temed(上海碧云天生物技术有限公司)
无水乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)
pagerulerprestproteinladder(thermoscientific美国)
sds-page电泳液(上海碧云天生物技术有限公司)
western转膜液(上海碧云天生物技术有限公司)
western洗涤液(10x)(上海碧云天生物技术有限公司)
甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)
脱脂奶粉(p1622普利莱基因技术有限公司)
牛血清白蛋白(bsa)(d009sigma美国)
特超敏ecl化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)
药物和抗体：
ehnahydrochloridee114(sigma美国)
重组鼠ifn-γ(peprotech美国)
adar1多克隆抗体(proteintech美国)
gapdh单克隆抗体(immunoway美国)
辣根酶标记山羊抗兔igg/hrp(arigobio美国)
辣根酶标记山羊抗小鼠igg/hrp(北京博奥森生物技术有限公司)
其他试剂：
2,4,6-三硝基苯酚(苦味酸)(台州市粤侨试剂塑料有限公司)
中性红(天津市科密欧化学试剂有限公司)
本发明下述实施例所述方法均采用graphpadprism5.0(sandiego,ca,usa)和spss21.0(aramonk,ny,usa)进行统计学分析。所有数据均用均数±标准差表示，使用t检验和单因素方差分析检测显著性。p<0.05为有显著性差异。
实施例1
1.免疫组化实验主要溶液配制：
(1)0.01mpbs
取一袋pbs粉末置于烧杯(规格：1l)中，加入三蒸水至1l充分溶解，随后在量筒中定容至2l。室温保存备用。
(2)4％水合氯醛
用电子天平称取水合氯醛结晶0.6g，加入三蒸水10ml溶解，在量筒中定容至15ml。室温避光保存备用。
(3)多聚甲醛
4％多聚甲醛：用电子天平称取40g多聚甲醛粉末置于烧杯(规格：1l)中，加入三蒸水，将烧杯置于磁力搅拌器上加热至55℃，注意通风，并持续搅拌至多聚甲醛完全溶解，在量筒中定容至1l。室温保存备用。
1％多聚甲醛：用量筒量取200ml4％多聚甲醛，加入三蒸水定容至800ml。室温保存备用。
(4)蔗糖
30％蔗糖溶液：用电子天平称取150g蔗糖，置于烧杯(规格：500ml)中，加入300ml三蒸水充分溶解，随后在量筒中定容至500ml。4℃保存备用。
20％蔗糖溶液：用量筒量取100ml30％蔗糖溶液，加入三蒸水定容至150ml。4℃保存备用。
10％蔗糖溶液：用量筒量取50ml30％蔗糖溶液，加入三蒸水定容至150ml。4℃保存备用。
2.westernblot实验主要溶液配制：
(1)10％过硫酸铵溶液(ammoniumpersulfate，aps)
取0.5g过硫酸铵，加三蒸水溶解并定容至5ml，分装到0.5ml离心管中，-20℃保存备用。
(2)sds-page电泳凝胶的配制(2板)
5％的浓缩胶配制(4ml)：三蒸水2.33ml、30％arc-bis(29:1)0.67ml、上层胶缓冲液(4x)(ph6.8)1ml、10％aps0.04ml、temed0.004ml。
10％的分离胶配制(15ml)：三蒸水6.1ml、30％arc-bis(29:1)5ml、下层胶缓冲液(4x)(ph8.8)3.75ml、10％aps0.15ml、temed0.006ml。
(3)sds-page电泳液
取一瓶可以配制1lsds-page电泳液的粉剂，倒入到洁净的烧杯(规格1l)中，加入三蒸水到约900ml，充分溶解。在量筒中定容到1l，混匀后即可使用。可室温保存。
(4)western转膜液
取一瓶可以配制1lwestern转膜液的粉剂，倒入到洁净的烧杯(规格1l)中，加入三蒸水到约700ml，充分溶解。随后加入200ml无水乙醇或210ml95％乙醇，混匀。在量筒中用三蒸水定容至1l，混匀即可使用。可室温保存。
(5)western洗涤液(tbst)
取一瓶western洗涤液(5x)，倒入到洁净的烧杯(规格1l)中，加入三蒸水并定容到1l，混匀即为western洗涤液(1x)，可以用于western的洗涤。可室温保存。
(6)5％bsa(封闭液)
称取2.5gbsa粉末，置于50ml离心管中，用量筒量取30mltbst加入其中，充分溶解，定容至50ml。-20℃保存。
(7)5％脱脂奶粉(封闭液)
称取2.5g奶粉置于50ml离心管中，用量筒量取30mltbst加入其中，充分溶解，定容至50ml。现用现配。
3.药物的配制：
(1)ehnahydrochloride(0.5mg/ml)
用半微量天平称取60.0mgehna粉末置于烧杯(100ml)中，加入生理盐水100ml充分溶解，在量筒中定容至120ml，混匀分装至10ml离心管中。-20℃保存，避免反复冻融。
(2)重组鼠ifn-γ(0.5ug/ml)
称取0.1gbsa，配成100ml0.1％的bsa缓冲液。将重组鼠ifn-γ用手掌离心机离心后打开，用生理盐水稀释成1.0mg/ml，随后用0.1％的bsa缓冲液进一步稀释成0.5ug/ml，混匀分装至10ml离心管中。-80℃保存，避免反复冻融。
实施例2
1实验分组
选取出生21天的健康雄性balb/c小鼠，单笼饲养4周，建立社会隔离应激刺激模型，相同周龄健康雄性balb/c小鼠群居饲养作为对照组。按照随机分组原则，分为隔离组(si)、群居对照组(gh)、药物干预组[adar1抑制剂隔离组(si+ehna)和adar1诱导剂隔离组(si+ifn-γ)]和药物干预对照组(adar1抑制剂群居组和adar1诱导剂群居组)。每组10只。如图1实验分组和社会隔离应激刺激模型的制备示意图。
2社会隔离应激刺激模型的制备
隔离组：出生21天(断奶)的健康雄性balb/c小鼠，适应一天后，单笼(29cm×17.8cm×16cm)饲养4周。饲养环境适宜，温度：22±1℃，湿度：60％～70％，饮水和食物充足，用灯光调节昼夜节律(12h：12h)。群居对照组：出生21天(断奶)的健康雄性balb/c小鼠，适应一天后，群居饲养4周，5只每笼(29cm×17.8cm×16cm)。饲养环境适宜，温度：22±1℃，湿度：60％～70％，饮水和食物充足，用灯光调节昼夜节律(12h：12h)。
3药物干预
模型建立成功后，adar1抑制剂隔离组和adar1抑制剂群居组给予adar1抑制剂ehna(10mg/kg,20ml/kg,ip)进行干预，而adar1诱导剂隔离组和adar1诱导剂群居组给予adar1诱导剂ifn-γ(5.0×104u/kg,20ml/kg,ip)进行干预，药物干预的剂量和给药途径依据课题组前期预实验结果。隔离组和群居对照组则给予生理盐水(20ml/kg)作为药物干预对照处理，总共进行8次药物干预。第4次给予药物干预后，进行行为学检测，检测时间为药物干预30min后。
4行为学检测
新物体识别实验(objectrecognitiontest,ort)
新物体识别实验是用来检测实验动物的非空间认知能力，如图2新物体识别实验示意图。测试工具为透明的开口塑料箱(40cm×40cm×40cm)，箱体用帘与周围环境隔开，放置在隔音的测试房间内，保持光照强度约为40lx，避免产生阴影。识别的物体有a，b，c三个大小相同(5cm×5cm×5cm)的特制立方体，立方体的重量均不能被实验小鼠推动，其中a，b物体(白色)完全一样，c物体(黑白相间)与a，b物体完全不同。新物体识别实验包括两部分：样本实验和测试实验。在进行探索和测试前3天，每天抚摸实验小鼠1min，避免刺激小鼠，使其消除与测试者的陌生感，在进行探索或测试前24小时，将动物放在测试的房间内，适应测试环境。如图2所示，将a，b两个物体放在塑料箱两相对侧壁的中间(物体与侧壁相距8厘米，两个物体之间相距14厘米)。在样本实验中，实验小鼠背朝两物体放入场地内，并且小鼠鼻尖距离两物的长度要一致。小鼠放入10min，放入后立即开启录像设备，实验者立即离开测试房间，记录小鼠与这两个物体接触的情况，包括鼻子或嘴巴触及物体的次数和距离物体2cm范围内探究的时间(前爪搭在物体上、鼻子嗅物体、舔物体等均属探究物体，摆架势或爬到物体上不动不能算是对新物体的探究)。10min结束后，立即将小鼠放回原来饲养的鼠笼内，待其休息1小时后再进行测试(此期间小鼠仍呆在测试房间内)。在测试实验中，将场地内的b物体换作c物体，仍将小鼠背向两物体放入实验场地，鼻尖据两物体距离相同，如图1所示，观察5min时间，同样用录像设备录像，观察者离开测试房间，观察指标同探索实验。实验中为了避免实验小鼠气味或排泄物相互干扰，每次探索实验或测试实验后都用75％的酒精擦拭消毒。待全部实验结束将小鼠送回原来的饲养房中。
实验采用辨别指数(discriminationindex，di)来评估实验动物的非空间认知能力，计算公式为di＝(tn-tf)/(tn+tf)，tn和tf分别代表探索新的和熟悉的事物的探索时间。
行为学结果
药物干预对社会隔离balb/c小鼠认知功能的影响
图3为adar1抑制剂和诱导剂干预社会隔离balb/c小鼠的新物体识别实验结果；新物体识别实验(ort)辨别指数；ehna和ifn-γ分别为adar1抑制剂和adar1诱导剂；数据以均数±标准差表示；*p<0.05,**p<0.01；(n＝10只/组)。在新物体识别实验中(图3,a和b)，与群居对照组相比，隔离组小鼠的辨别指数(gh:0.41±0.17；si:-0.16±0.09,p<0.01)明显降低；与隔离组相比，adar1诱导剂隔离组小鼠的辨别指数(si:-0.16±0.09；si+ifn-γ:0.20±0.09,p<0.01)明显增强，而adar1抑制剂隔离组与隔离组相比辨别指数(si:-0.16±0.09；si+ehna:-0.29±0.12,p<0.05)明显降低。这些结果提示社会隔离应激刺激能导致balb/c小鼠非空间认知功能障碍，adar1诱导剂对社会隔离应激刺激balb/c小鼠的认知功能障碍有一定的缓解，而adar1抑制剂可加重认知功能障碍。实施例3形态学检测
1灌流
(1)麻醉：4％的水合氯醛，0.01ml/g，腹腔注射。腹股沟附近进针，向腹中线方向走行。若麻醉效果不佳，可适当增加剂量；
(2)固定：用注射器针头将小鼠四肢固定在泡沫板上；将泡沫板至于托盘内，其中一边搭在托盘边缘，使泡沫板倾斜，方便灌流液流出；
(3)灌流液体准备：分别抽取30ml1％多聚甲醛、30ml4％多聚甲醛，1％多聚甲醛前接头皮针，4％多聚甲醛前接普通针头，排净空气，确保针头通畅，备用；
(4)灌流：首先剪开腹腔，再剪开膈肌，少量剪开胸廓，暴露心脏。用皮钳或止血钳固定皮肤及胸廓等，剪开心包。由心尖进头皮针，注意：进针不宜过深，否则会刺破心脏。进针后发现有血液回流至头皮针，通常表示位置准确，此时剪开右心耳，固定好头皮针。缓慢推注射器，若心脏内有暗红色液体流出，则进针准确。30ml/10min左右的速度为宜。先注入1％多聚甲醛，再注入4％多聚甲醛，两管液体均灌流完成后，将小鼠室温放置30min，使其脑组织充分固定；
(5)剥离脑组织：用止血钳小心剥离脑组织，避免造成损伤；
(6)固定：将脑组织放置于含有4％多聚甲醛的离心管中，固定3天；
(7)梯度脱水：将装有脑组织的离心管中的多聚甲醛弃去，注入配制好的蔗糖溶液，按照10％、20％和30％(两次)三个浓度进行梯度脱水。每个浓度蔗糖脱水1天，待脑组织彻底沉底为脱水完全，即可更换高浓度的蔗糖继续脱水，直至脱水完全。
2脑组织冰冻切片
切片前3小时调试冰冻切片机温度至-22℃提前预冷。取脱水完全的小鼠脑组织，弃去蔗糖溶液，用刀修平脑组织底部。把脑组织置于样品托上并保证其呈竖直状态，在表面加适量otc包埋液，放入预冷的冰冻切片机中约90min，待脑组织全部冰冻后(或液氮速冻)，进行切片。本实验采用的切片厚度为16μm。各组切片做好标记，-20℃保存备用。
3免疫组化实验
(1)从-20℃取出冰冻切片，放入湿盒内备用。待切片干燥后置于摇床上，用pbs洗3次，每次5min；
(2)取出切片放入湿盒内，用滤纸吸干表面的液体(保持组织呈湿润状态)。用移液器滴加过氧化氢(3％h2o2去离子水)封闭内源性过氧化物酶，盖上湿盒盖，避光，室温5-10min，不宜过长，以免烂片；
(3)置于摇床上，用pbs洗3次，每次5min；
(4)取出切片放入湿盒内，吸干表面的液体(保持组织呈湿润状态)。滴加试剂a(山羊血清工作液)，盖上湿盒盖，37℃孵育30min，回收试剂a，勿洗；
(5)滴加稀释的一抗[adar1(1：100)]，一定要保证组织表面及周边被一抗完全覆盖，4℃过夜；
(6)倾斜玻片，回收一抗。置于摇床上，用pbs洗3次，每次5min；
(7)取出切片放入湿盒内，吸干表面的液体(保持组织呈湿润状态)。滴加试剂b(生物素化二抗工作液)，37℃孵育40min，倾去；
(8)置于摇床上，用pbs洗3次，每次5min；
(9)取出切片放入湿盒内，吸干表面的液体(保持组织呈湿润状态)。滴加试剂c(辣根酶标记链霉素卵白工作液)，盖上湿盒盖，37℃孵育40min；
(10)置于摇床上，用pbs洗3次，每次5min；
(11)进行dab显色，dab现配现用，30min内使用，避光保存。滴加dab显色液，镜下观察，适时终止(pbs缓冲液蘸一蘸)，一般8min-15min内终止；
(12)进行乙醇梯度脱水，分别将显色好的切片浸于梯度为70％、80％、90％、95％、100％、100％的乙醇中，每次3min。取出，二甲苯透明两次，每次5min；
(13)封片，切片从二甲苯中取出后迅速滴加中性树胶封片(防止干后组织干裂；若封片效果不佳，可放回二甲苯中溶解后重新封片)。封片时注意不要有气泡，树胶使用适量。自然晾干，室温保存；
(14)使用正置光学电子显微镜观察染色情况并拍照，用image-proplus6.0对免疫组化图片脑区进行光密度分析。
免疫组化实验结果
药物干预对社会隔离balb/c小鼠前额叶皮层adar1表达的影响
图4为药物干预的社会隔离balb/c小鼠前额叶皮层adar1表达的免疫组化结果(a)前额叶皮层adar1表达的免疫组化结果；(b)前额叶皮层的脑区示意图；(c)前额叶皮层adar1表达阳性的神经元的光密度值统计结果。ehna和ifn-γ分别为adar1抑制剂和adar1诱导剂；数据以均数±标准差表示；**p<0.01；(n＝5只/组)。
在前额叶皮层adar1表达的免疫组化实验中(如图4),与群居对照组相比，隔离组小鼠的前额叶皮层adar1表达阳性的神经元光密度值(gh:0.023±0.003,si:0.008±0.001；p<0.01)明显降低；与隔离组相比，诱导剂隔离组小鼠的前额叶皮层adar1表达阳性的神经元光密度值(si:0.008±0.001,si+ifn-γ:0.015±0.003；p<0.01)明显增高，而抑制剂隔离组无明显差异。光密度值统计结果如(图4,c)。
图5为药物干预的社会隔离balb/c小鼠海马区adar1表达的免疫组化结果；海马ca1区adar1表达的免疫组化结果；(b)海马hilus区adar1表达的免疫组化结果；(c)海马ca1和hilus区的脑区示意图；(d)海马ca1区adar1表达阳性的神经元的光密度值统计结果；(e)海马hilus区adar1表达阳性的神经元的光密度值统计结果。ehna和ifn-γ分别为adar1抑制剂和adar1诱导剂；数据以均数±标准差表示；**p<0.01；(n＝5只/组)。
药物干预对社会隔离balb/c小鼠海马区adar1表达的影响
在海马区adar1表达的免疫组化实验中(如图5),与群居对照组相比，隔离组小鼠的海马ca1和hilus区adar1表达阳性的神经元光密度值(ca1,gh:0.047±0.004,si:0.021±0.005；p<0.01；hilus,gh:0.021±0.002,si:0.013±0.003；p<0.01)明显降低；与隔离组相比，诱导剂隔离组小鼠的海马ca1和hilus区adar1表达阳性的神经元光密度值(ca1,si:0.021±0.005,si+ifn-γ:0.040±0.005；p<0.01；hilus,si:0.013±0.003,si+ifn-γ:0.023±0.004；p<0.01)明显增高，而抑制剂隔离组无明显差异。光密度值统计结果如(图5,d和e)。
实施例4westernblot检测
1小鼠脑分区组织全蛋白的提取
(1)使用全蛋白提取试剂盒，每1ml冷lysisbuffer中加入10μl磷酸酶抑制剂，1μl蛋白酶抑制剂和10μl100mmpmsf，混匀。冰上保存数分钟备用；
(2)将取好的脑分区组织，置于预冷离心管中，按照每100mg固体组织加入0.5ml冷lysisbuffer的标准，加入冷lysisbuffer。用高速匀浆机手动上下匀浆30～50次，注意低温操作；
(3)打开离心机，调节温度至4℃预冷。将组织匀浆液转移到1.5ml预冷的离心管中，按照12000g离心，4℃离心5min；
(4)取上清转移至新的预冷的离心管中，即为全蛋白提取物；
(5)样品分装保存于-80℃冰箱中(注意标记蛋白样品的体积，便于后期加上样缓冲液)，避免反复冻融。
2蛋白浓度的测定
(1)配制bca工作液：根据样品数量，按50体积bca试剂a加1体积bca试剂b(50:1)配置适量的bca试剂，充分混匀后置于冰盒内待用；
(2)将蛋白质标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl的顺序依次加到96孔板的标准品孔中，加去离子水补足到20μl，再加200μlbca工作液；
(3)取待测蛋白样品，稀释至合适的浓度；
(4)各孔加入20μl稀释好的蛋白样品，再加入配制好的bca工作液200μl。把酶标版放在震荡仪器震动30sec，充分混匀，放置在37℃温箱中30min；
(5)在562nm波长下比色测定。以蛋白含量(ug)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；
(6)根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可算得相应的蛋白含量(ug)，除以样品稀释液总体积(20ul)，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单位：ug/ul)。
3sds-聚丙烯酰氨凝胶电泳
(1)根据被检测蛋白分子量确定分离胶浓度为8％，浓缩胶浓度为5％；
(2)清洗玻璃板：玻璃板用自来水冲洗，再用三蒸水冲洗干净后，放在胶架上晾干；
(3)灌胶：首先用三蒸水灌入等待10min，确定是否漏水。按照配胶浓度先配制分离胶，灌入至插入梳子后至梳子底端1cm左右，缓慢加入无水乙醇直至玻璃板上方，赶走气泡。室温放置40min，待胶凝固后，将无水乙醇倒出。配制浓缩胶，混匀，注入玻璃板，至玻璃板顶端，迅速小心插入梳子，避免产生气泡，室温放置40min，使分离胶和浓缩胶充分聚合；
(4)准备蛋白样品：将已经测定浓度的蛋白取出，根据蛋白样品体积，加入6×sds上样缓冲液至终浓度为1×，放入水浴锅中，96℃～98℃加热5min使蛋白变性，注意防止爆管；
(5)电泳：将配制好的胶放置于电泳槽中，胶内部注入充足的电泳液至没过加样孔，外周也加入电泳液没过底部的导电线，保证通电。竖直拔出梳子，除去上样孔中的气泡并用钝针头扶正。用微量移液器贴壁加入蛋白样品，蛋白上样量为30μg。插入电泳仪电源，调制电压为恒定80v，15min后将电压调整为恒定120v，至溴酚蓝移至分离胶底部，关闭电源，取出凝胶；
(6)转膜：用切胶器将凝胶切下放入盛有转膜液的容器内，并且按照所切凝胶的大小剪出相应大小的pvdf膜，放置在无水甲醇中浸泡30sec活化，再放入转膜液中洗涤待用。在加有转膜液的盘中放入转膜夹、海绵、滤纸。将转膜夹黑色的部分朝下，依次放置海棉、3层滤纸、凝胶、pvdf膜、3层滤纸、海棉，每步都用切胶器在上面轻轻压过，赶走气泡。将转膜夹放入转膜槽中，使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。使用恒定电流300ma转膜90min。转膜时需将电泳槽置于放有充足冰水混合物的盆中，避免产热破坏转膜，使条带变形；
(7)封闭：待转膜结束后将pvdf膜迅速从夹子中取出，正面朝上放入装有tbst的容器内洗涤，然后转移至配制好的5％脱脂奶粉(或5％bsa)的孵育盒中，置于摇床上，室温封闭2h。注意脱脂奶粉现配现用，bsa可回收利用2-3次，-20℃保存；
(8)一抗孵育：倒掉脱脂奶粉(回收bsa)，用tbst洗膜3次，每次10min。分别加入按比例配制好的一抗[adar1(1:1000)和gapdh(1:5000)]，4℃摇床过夜；
(9)二抗孵育：回收一抗。tbst洗膜3次，每次10min。孵育配制好的二抗[山羊抗兔igg/hrp(1:5000)、山羊抗小鼠igg/hrp(1:5000)]，在摇床上孵育20min后，移至37℃恒温箱中孵育30min，之后再在摇床上孵育10min；
(10)化学发光与显影：回收二抗。tbst洗膜3次，每次10min。按照1:1的比例配制显影液，用移液器滴加到pvdf膜上进行显影(避光)，使用凝胶成像仪进行成像；
(11)用imagelab3.0进行灰度分析。
westernblot结果
药物干预对社会隔离balb/c小鼠脑内adar1蛋白表达的影响
在药物干预的社会隔离balb/c小鼠前额叶皮层adar1蛋白表达的westernblot结果中(如图6,a)，与群居对照组相比，隔离组小鼠前额叶皮层adar1蛋白的表达(adar1,gh:1.00±0.00；si:0.44±0.08,p<0.01)均明显降低；与隔离组相比，诱导剂隔离组小鼠前额叶皮层adar1蛋白的表达(adar1,si:0.44±0.08；si+ifn-γ:0.84±0.05,p<0.01)均明显增加，而抑制剂隔离组则无明显差异。灰度值统计结果见(图6，a)。
图6为药物干预的社会隔离balb/c小鼠脑内adar1蛋白表达的westernblot结果；前额叶皮层adar1蛋白的westernblot结果及灰度分析统计结果；(b)药物干预的社会隔离balb/c小鼠海马区adar1蛋白表达的westernblot结果及灰度分析统计结果。统计结果为目的蛋白与内参的灰度比值结果；ehna和ifn-γ分别为adar1抑制剂和adar1诱导剂；数据以均数±标准差表示；**p<0.01；(n＝5只/组)。
在药物干预的社会隔离balb/c小鼠马海区adar1蛋白表达的westernblot结果中(如图6,b)，与群居对照组相比，隔离组小鼠马海区adar1蛋白的表达(adar1,gh:1.00±0.00；si:0.48±0.07,p<0.01)均显著降低；与隔离组相比，诱导剂隔离组小鼠马海区adar1蛋白的表达(adar1,si:0.48±0.07；si+ifn-γ:0.82±0.04,p<0.01)均明显增加。灰度值统计结果见(图6,b)。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。