本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种用于治疗糖尿病慢性溃疡的药物制剂及其制备方法。
背景技术：
糖尿病难治性溃疡是导致糖尿病病人截肢致残的主要原因。随着全球性糖尿病患病人数的增加，糖尿病人均寿命的延长以及老龄化的趋势，因糖尿病溃疡而需要截肢的患者也在增加。预计到2025年，全球糖尿病患者将达到2.5亿以上，而大约15％的糖尿病患者将发生溃疡或坏疽。
其发病机制非常复杂，预后较差。研究表明，神经及外周血管病变造成的下肢末端供血不足、感觉缺失是导致糖尿病足溃疡形成和发展的危险诱因。此外，长期的病理性高糖环境增强了患者体内的氧化应激水平，使ros及炎症因子过量表达，对细胞造成了氧化损伤，从而阻碍了创伤的正常修复过程。目前，血管重塑是现代研究中用于治疗糖尿病足的常用手段之一，它能改善微循环，利于肉芽组织的新生与再上皮化。然而，使用单一药理作用的药物进行治疗往往不能达到理想的效果。随着对糖尿病溃疡发病机制研究的不断深入，多靶点联合用药的治疗策略为糖尿病溃疡的治疗提供了新的思路和方向。
在中国，红花是传统的活血化瘀中药，临床可用于防治心脑血管病以及食管癌、胃癌、肝癌等多种疾病。其中羟基红花黄色素a(hsya)是其主要活性成分。近年来人们对hsya的研究主要集中在减轻心脑缺血损伤的作用、降血压作用以及抗凝血、抑制血栓形成等作用上。
甲磺酸去铁胺(dfo)是一种铁螯合剂，和铁离子有高度特异的亲和力，能快速和游离或与蛋白结合的三价铁形成稳定、无毒的水溶性铁胺复合物(酸性条件下结合作用加强)，由尿排出。研究发现，它对缺氧缺血脑组织具有保护作用，这与其清除过量游离铁、抑制羟自由基形成和减轻过氧化损伤有关。
技术实现要素：
本发明提供了一种用于治疗糖尿病慢性溃疡的药物制剂，在保持中药提取物羟基红花黄色素a原有药理活性的基础上，联合使用化药小分子甲磺酸去铁胺来增强羟基红花黄色素a的血管新生作用，实现抗炎与重塑血管多靶点治疗的策略，提高联合用药的疗效。
本发明提供了如下技术方案：
一种用于治疗糖尿病慢性溃疡的药物制剂，包括羟基红花黄色素a(hsya)、甲磺酸去铁胺(dfo)和药用辅料，所述药物制剂中，羟基红花黄色素a的质量百分数为0.02～0.2％，甲磺酸去铁胺的质量百分数为0.02～0.2％。
hsya能通过抑制炎症反应，上调vegf和tgf-β1的表达量来加快血管的新生，从而加快溃疡的修复，缩短溃疡愈合时间，但是羟基红花黄色素a在血管新生上的药理作用欠佳；dfo能诱导缺氧诱导因子(hif-1α)的表达，从而上调vegf的表达，而vegf又是促进缺氧缺血性组织损伤中血管新生所必不可少的调控因子，但是dfo的毒性大，半衰期短。因此，二者单独使用均不能对糖尿病慢性溃疡起到很好的治疗效果。
本发明通过将hsya和dfo联用，可以很好地抑制dfo的毒性，并且二者可以协同作用，显著抑制糖尿病慢性溃疡面炎症的产生，并能更好地促进上皮细胞向伤口处的迁移和血管新生，加速溃疡伤口的愈合。
优选的，所述药物制剂中，羟基红花黄色素a的质量百分数为0.05～0.2％，甲磺酸去铁胺的质量百分数为0.02～0.1％。
药物制剂中hsya的含量较低时，该药物加速糖尿病组溃疡皮肤再生和创面愈合的效果不理想，而药物中hsya的含量过高时，反而会抑制血管的新生，不利于创面的愈合；当dfo含量过高时，会对细胞产生明显的毒性。两者联合使用时均没有产生毒性，且生物活性较高。
进一步优选的，所述药物制剂中，羟基红花黄色素a的质量百分数为0.1～0.2％，甲磺酸去铁胺的质量百分数为0.02～0.1％。
所述的药物制剂为外用剂型。例如乳剂、膏剂、水凝胶或贴剂等。
优选的，所述的药用辅料为由天然可降解高分子材料形成的互穿网络结构聚合物(ipn)水凝胶。
该种水凝胶无毒、易降解、生物相容性好，既有良好的力学性能，可塑性强，又有大溶胀比，透气性佳，并能达到药物顺序释放的要求。
进一步优选的，所述的天然可降解高分子材料为明胶和/或壳聚糖。
天然高分子多聚物壳聚糖是一种生物可降解的聚阳离子多糖，具有抗菌、止血、来源丰富等特点，有助于创伤愈合过程中的炎症细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等发挥相应的功能。但由于壳聚糖本身分子间具有较强的氢键作用，使得其凝胶脆性大、力学性能欠佳，不利于单独进行局部使用。
明胶是胶原断裂形成的天然性多肽，亲水性强，生物相容性与降解性好，将其与壳聚糖共混制备水凝胶敷料，可明显改善凝胶的力学性能和溶胀性能等，使该敷料具有良好的生物粘附性和孔隙率，利于细胞的粘附生长和呼吸作用，为细胞提供适宜生长基质的同时保护伤口免受细菌侵入。且该水凝胶敷料可塑性强，可设计成双层结构，实现两种药物的顺序释放。此外，该凝胶敷料还能在一定程度上延缓药物的释放，减少给药次数，从而增加患者的依从性。
优选的，所述的天然可降解高分子材料为明胶和壳聚糖，明胶与壳聚糖的质量比为0.1～9:1。
优选的，所述的药物制剂具有双层结构，内层为甲磺酸去铁胺水凝胶，外层为羟基红花黄色素a水凝胶。
具有双层结构的药物制剂中，羟基红花黄色素a与甲磺酸去铁胺按照先后顺序释放，外层的羟基红花黄色素a先释放出来，抑制炎症的产生，甲磺酸去铁胺后释放出来，与羟基红花黄色素a共同作用促进血管的新生。该具有双层结构的药物制剂能实现hsya和dfo的顺序释放，达到先抗炎后促进血管新生的治疗目标，提高其对糖尿病慢性溃疡的疗效。
本发明还公开了所述药物制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将天然可降解高分子材料溶解在水中，得到天然可降解高分子溶液；
(2)将羟基红花黄色素a、甲磺酸去铁胺和交联剂加入到天然可降解高分子溶液中，搅拌交联，得到所述的药物制剂；
所述的药物制剂中，羟基红花黄色素a的质量分数为0.02％～0.2％；甲磺酸去铁胺的质量分数为0.02％～0.2％。
优选的，步骤(1)包括：
(1-1)将明胶与水混合，在40～50℃下搅拌至明胶完全溶解，得到明胶溶液；
所述的明胶溶液中明胶的质量分数为1～5％；
(1-2)将壳聚糖与水混合，壳聚糖溶胀后搅拌至完全溶解，得到壳聚糖溶液；
所述的壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为1～5％；
(1-3)将明胶溶液与壳聚糖溶液混合，在40～50℃下搅拌均匀得到混合溶液；
明胶溶液与壳聚糖溶液的质量比为0.1～9:1。
优选的，步骤(2)包括：
(2-1)向混合溶液中加入交联剂和羟基红花黄色素a，在40～50℃下搅拌，交联得到羟基红花黄色素a凝胶；
(2-2)向混合溶液中加入交联剂和甲磺酸去铁胺，在40～50℃下搅拌，交联得到甲磺酸去铁胺凝胶；
(2-3)将甲磺酸去铁胺凝胶逐滴滴加到羟基红花黄色素a凝胶中，在40～50℃下搅拌，得到具有双层结构的药物制剂。
所述的交联剂为甲醛、戊二醛、双醛淀粉、环氧化合物或京尼平。
制备得到的具有双层结构的水凝胶药物制剂，能按照先后顺序释放羟基红花黄色素a和甲磺酸去铁胺。
使用时，将所述的药物制剂涂抹在糖尿病慢性溃疡伤口上即可。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的药物制剂生物相容性好，易于涂抹，能防止药物的流失，减少用药次数，提高药效；
(2)本发明的药物制剂具有多孔性，有利于气体交换，可以防止细菌入侵，使伤口维持在湿润的环境下，加快血管内皮细胞与成纤维细胞的增殖、迁移，刺激其分泌更多的生长因子，从而加速溃疡的愈合并提升其愈合质量；
(3)本发明的药物制剂具有双层结构，能按照先后顺序释放羟基红花黄色素a和甲磺酸去铁胺，达到先抗炎后促进血管新生的治疗目标，提高溃疡愈合的速度与愈合质量。
附图说明
图1为hsya/dfo联合用药对hsf细胞活性的影响情况图，其中(a)为用药24h，(b)为用药48h；
图2为hsya/dfo联合用药对raw264.7细胞炎症抑制情况图；
图3为hsya/dfo联合用药对huvec细胞的血管新生情况，其中：
(a)为0.2mmhsya的显微镜，
(b)为0.4mmhsya的显微镜，
(c)为空白对照的显微镜，
(d)为0.0375mm的dfo与0.2mm的hsya联用的显微镜，
(e)为0.0375mm的dfo与0.4mm的hsya联用的显微镜，
(f)为各种用药情况下血管新生情况的柱状图；
图4为实施例5中hsya/dfo联合用药溶液对大鼠糖尿病溃疡的愈合率的结果，其中，(a)为溃疡愈合情况图，(b)为溃疡愈合率曲线图；
图5为实施例11中hsya/dfo联合用药水凝胶对大鼠糖尿病溃疡的愈合率的结果，其中，(a)为溃疡愈合情况图，(b)为溃疡愈合率曲线图。
具体实施方式
实施例1：细胞毒性实验(hsf)
1.将皮肤成纤维细胞培养在dmem高糖培养液(含10％灭活胎牛血清，1％双抗(青霉素+链霉素))中，待细胞铺满后，用胰酶消化细胞，轻轻拍打后加入培养液终止消化，小心收集细胞于离心管中，离心，去除上清液，重悬细胞后进行计数。调整细胞悬液浓度为2×104cell/ml，然后向96孔板的每孔加入200ul细胞悬液(边缘孔用无菌pbs填充)。5％co2，37℃孵育，贴壁过夜至细胞单层铺满孔底。去上清，加入浓度梯度的hsya(0.1、0.2、0.4mm)、dfo(0.01875、0.0375、0.075、0.15、0.3mm)及两者混合溶液，每孔200ul，每个浓度设5个复孔。同时设定空白对照组(每孔加200ul培养液)，5％co2，37℃孵育24小时。
之后取出96孔板，每孔加入10ulcck-8，孵育2h，酶标仪od490nm处测定各孔的吸光度值。
2.实验结果
如图1所示，dfo在联合hsya后并没有对皮肤成纤维细胞产生毒性，与单独使用dfo相比，出现了明显地协同作用(p<0.01)，而且可以看出高浓度的hsya与dfo联用的促增殖作用更明显。
然而，随着孵育时间的增加，单独使用去铁胺的细胞毒性增强，hsya对dfo的毒性缓和作用也降低，但是仍然没有呈现出细胞毒性(一般情况下，细胞活力在80％以下就说明了有一定毒性)，可见两种药物是可以合用的(两药合用较单独用药而言，能显著促进成纤维细胞的增殖，克服了dfo单独使用毒性较大的问题)。
注：图1中，与单独使用去铁胺相比，*：p<0.05；#：p<0.01。
实施例2：抗炎实验
1.将单核巨噬细胞株raw264.7培养在dmem高糖培养液中(含10％灭活胎牛血清，1％双抗(青霉素+链霉素))，待细胞铺满后，用胰酶消化细胞，轻轻拍打后加入培养液终止消化，小心收集细胞于离心管中，离心，去除上清液，重悬细胞调整细胞密度为5×105cell/ml，以每孔加入0.2ml细胞悬液将raw264.7接种于96孔板中(边缘孔用无菌pbs填充)。培养后加入浓度梯度的hsya(0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2mm)、dfo(0.0375、0.075、0.15)及两者混合溶液预孵育4h，然后加入10ul浓度为1ug/ml的lps于96孔板中，5％co2，37℃培养24h后，收集上清液用于检测no含量，所有实验均采用四个复孔。
2.实验结果
脂多糖(lps)诱导的raw264.7小鼠巨噬细胞是常见研究炎症反应的模型。巨噬细胞在脂多糖lps刺激下，可促使炎症因子如一氧化氮(no)、il-6、pge2、肿瘤坏死因子等的分泌。因此可以以lps诱导raw264.7细胞释放的no含量为检测指标。
如图2所示，低浓度的hsya联合dfo给药与单独使用hsya相比，能更好地实现抗炎效果，然而随着dfo浓度的增加，抗炎效果并没有随之增强，其细胞毒性却是在增加，因此可选择低浓度的hsya与dfo进行联合使用。
注：图2中，与单独使用去铁胺相比，*：p<0.05；**：p<0.01。
实施例3：血管生成实验
1.将基质胶放在4℃冰箱解冻，待其成为流体状态后，取50ul基质胶加入96孔板的孔中，并在37℃孵箱中放置30min。用胰酶消化血管内皮细胞，轻轻拍打后加入培养液终止消化，小心收集细胞于离心管中，离心，去除上清液，重悬细胞后进行计数。调整细胞悬液浓度为1.5×105cell/ml，每孔加入100ul细胞悬液，然后加入浓度梯度的hsya溶液(0.2、0.4mm)、dfo(0.0375)及两者混合溶液，5％co2，37℃孵育。6h后取出96孔板，加入2.5um钙黄绿素继续孵育30min，然后在倒置荧光显微镜下观察血管形成情况，每个浓度均采用三个复孔。
2.实验结果
如图3所示，各组都有一定数量的新生血管生成，与空白对照组相比，各用药组的新生血管数量更多，表明dfo和hsya均能促进血管的新生。就hsya而言，低浓度的羟基红花黄色素a溶液(0.2mm)可以更显著地促进血管的生成(p<0.01)，且该浓度下的hsya再结合0.0375mmdfo共同作用时产生了明显的协同作用(p<0.01)，此时的新生血管最为密集。高浓度的hsya结合0.0375mmdfo共同作用时也产生了一定程度的协同作用，但与单独使用0.4mm的hsya用药组相比，没有显著性差异。可见hsya和dfo更适合于在低浓度下联合使用。
注：图3(f)中，与空白对照组相比，*：p<0.05；**：p<0.01；与单独使用hsya相比，#：p<0.01。
实施例4：糖尿病大鼠模型的建立
受试动物为spf级sd雄性大鼠15只，体重220～240g，自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1℃，明暗周期为12小时。待sd大鼠适应环境一周后，15只大鼠用链脲佐菌素(stz)75mg/kg腹腔注射(stz以ph4.2，0.1mmol/l的柠檬酸缓冲液溶解，配制成质量分数为2.5％溶液，以0.3ml/100g注射)，3天后尾静脉采血，用血糖仪检测随机血糖水平，一周检测两次血糖和体重，持续两周，若随机血糖水平都>16.7mmol/l，且伴随有多食、多饮、多尿和体重减轻的情况，则视为糖尿病大鼠造模成功。
实施例5：hsya/dfo联合用药对糖尿病溃疡的愈合的影响
1.糖尿病溃疡模型的建立
按照实施例8所描述的方法进行分组并建立糖尿病模型。5周后，将糖尿病大鼠麻醉，然后用剃毛刀剃除大鼠背部的毛发，再用碘伏进行消毒。消毒后在每只大鼠背部制造2个1.5cm×1.5cm的全层皮肤创面，深至皮下筋膜处，止血后自然暴露。
2.大鼠的分组给药情况
造好创面后，进行分组，一共分为4组，每组6个创面，按照表1进行给药，剩下的则为对照组(只给pbs)。给药频率为一天一次，每天观察伤口变化情况。3天拍照一次，并临摹伤口。糖尿病大鼠实验期间自由进食和饮水，每周监测体重和血糖。
按照下列公式计算创伤的愈合率：
于最后一天处死大鼠，将实验开始时圈定部位的皮肤(1.5cm×1.5cm的面积)剪下，以备之后的考察。
表1.糖尿病大鼠给药分组情况
3.实验结果
大鼠的糖尿病溃疡修复情况见图4。如图所示，与空白对照组相比，在整个溃疡愈合过程中，dfo与hsya联合用药后能明显在早期促进糖尿病溃疡的快速愈合(p<0.01)。与单独使用hsya或dfo相比，联合用药组在溃疡愈合前6天优势比较明显(p<0.05)；第6天后其愈合率与单独使用dfo相比无明显优势，但与单独使用hsya相比，仍然保持其优势。可见联合用药中主要是dfo发挥了较大的作用，其促进血管新生的特性有助于进一步地提升了创伤的愈合速度。
注：图4中，与糖尿病空白对照组相比，*：p<0.05；**：p<0.01。
实施例6：hsya/dfo顺序释放水凝胶的制备
(1)将明胶与双蒸水混合，在50℃下搅拌至完全溶解，得到明胶溶液；明胶溶液中明胶的质量分数为2.5％；
(2)将壳聚糖加入到双蒸水中，待其溶胀后搅拌至完全溶解，得到壳聚糖溶液；壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为3％；
(3)将明胶溶液与壳聚糖溶液混合，在50℃下搅拌均匀得到混合溶液；明胶溶液与壳聚糖溶液的质量比为5：5；
(4)向混合溶液中加入京尼平和hsya，在40℃下搅拌1天进行交联得到hsya交联体系；
(5)向混合溶液中加入京尼平和dfo，在40℃下搅拌1天进行交联得到dfo交联体系；
(6)把含dfo的交联体系逐滴滴加到含hsya的交联体系中，在40～50℃下搅拌8h得到能顺序释放两种药物的双层结构水凝胶敷料，其中里层为dfo，外层为hsya；
药物中羟基红花黄色素a的质量分数为0.2％，去铁胺的质量分数为0.1％。
实施例7：hsya/dfo顺序释放水凝胶的制备
(1)将明胶与双蒸水混合，在50℃下搅拌至完全溶解，得到明胶溶液；明胶溶液中明胶的质量分数为3％；
(2)将壳聚糖加入双蒸水中，待其溶胀后搅拌至完全溶解，得到壳聚糖溶液；壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为3％；
(3)将明胶溶液与壳聚糖溶液混合，在50℃下搅拌均匀得到混合溶液；明胶溶液与壳聚糖溶液的质量比为2:8；
(4)向混合溶液中加入京尼平和hsya，在40℃下搅拌1天进行交联得到hsya交联体系；
(5)向混合溶液中加入京尼平和dfo，在40℃下搅拌1天进行交联得到dfo交联体系；
(6)把含dfo的交联体系逐滴滴加到含hsya的交联体系中，在40～50℃下搅拌12h得到能顺序释放两种药物的双层结构水凝胶敷料，其中里层为dfo，外层为hsya；
药物中羟基红花黄色素a的质量分数为0.05％，去铁胺的质量分数为0.2％。
实施例8：hsya/dfo顺序释放水凝胶的制备
(1)将明胶与双蒸水混合，在50℃下搅拌至完全溶解，得到明胶溶液；明胶溶液中明胶的质量分数为3％；
(2)将壳聚糖加入到双蒸水中，待其溶胀后搅拌至完全溶解，得到壳聚糖溶液；壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为5％；
(3)将明胶溶液与壳聚糖溶液混合，在50℃下搅拌均匀得到混合溶液；明胶溶液与壳聚糖溶液的质量比为8:2；
(4)向混合溶液中加入京尼平和hsya，在40℃下搅拌1天进行交联得到hsya交联体系；
(5)向混合溶液中加入京尼平和dfo，在40℃下搅拌1天进行交联得到dfo交联体系；
(6)把含dfo的交联体系逐滴滴加到含hsya的交联体系中，在40～50℃下搅拌24h得到能顺序释放两种药物的双层结构水凝胶敷料，其中里层为dfo，外层为hsya；
药物中羟基红花黄色素a的质量分数为0.1％，去铁胺的质量分数为0.05％。
实施例9：hsya/dfo水凝胶的制备
(1)将明胶与双蒸水混合，在50℃下搅拌至完全溶解，得到明胶溶液；明胶溶液中明胶的质量分数为3％；
(2)将壳聚糖加入到双蒸水中，待其溶胀后搅拌至完全溶解，得到壳聚糖溶液；壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为5％；
(3)将明胶溶液与壳聚糖溶液混合，在50℃下搅拌均匀得到混合溶液；明胶溶液与壳聚糖溶液的质量比为8:2；
(4)向混合溶液中加入京尼平，在50℃下搅拌1天进行交联得到凝胶体系；
(5)向交联体系中加入羟基红花黄色素a和去铁胺，在40℃下搅拌12h，使药物均匀地分散于凝胶体系中得到治疗糖尿病足溃疡的药物；
药物中羟基红花黄色素a的质量分数为0.1％，去铁胺的质量分数为0.05％。
实施例10：hsya/dfo水凝胶联合用药对糖尿病溃疡的愈合的影响
1.糖尿病溃疡模型的建立
按照实施例8所描述的方法进行分组并建立糖尿病模型。5周后，将糖尿病大鼠麻醉，然后用剃毛刀剃除大鼠背部的毛发，再用碘伏进行消毒。消毒后在每只大鼠背部制造2个直径为1.5cm的全层皮肤创面，深至皮下筋膜处，止血后自然暴露。将1mm厚的硅胶夹板固定在伤口周围。
2.大鼠的分组给药情况
造好创面后，进行分组，一共分为4组，每组6个创面，按照表2进行给药，剩下的则为对照组(只给pbs)。缓冲液和水溶液给药频率为一天一次，其他组两天一次，每天观察伤口变化情况。3天拍照一次，并临摹伤口。糖尿病大鼠实验期间自由进食和饮水，每周监测体重和血糖。并按照下列公式计算创伤的愈合率：
于最后一天处死大鼠，将实验开始时圈定部位的皮肤(1.5cm×1.5cm的面积)剪下，以备之后的考察。
表2.糖尿病大鼠给药分组情况
3.实验结果
大鼠的糖尿病溃疡修复情况见图5。如图所示，与空白对照组相比，在溃疡的愈合过程中，hsya/dfo共载药的壳聚糖-明胶水凝胶能明显促进糖尿病溃疡的快速愈合，整个愈合时期中效果都很显著(p<0.01)。与hsya/dfo溶液用药组相比，凝胶组的创伤愈合率也显示了一定的优势，在减少给药次数的情况下仍然能达到高于溶液的愈合率。可见该水凝胶是适合用于hsya/dfo的载体来进行局部给药的。
对比实施例9和10制备的水凝胶的实验数据可知，实施例9制备的按先后顺序释放hsya和dfo的水凝胶对糖尿病慢性溃疡的治疗效果优于同时释放hsya和dfo的水凝胶。
注：图5中，与糖尿病空白对照组相比，*：p<0.05；**：p<0.01。
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。