本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纳米载药系统在制备治疗难治性甲状腺癌的药物中的应用。
背景技术：
甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，近几年甲状腺癌的发生率在全球范围内逐年上升。在美国，过去10年甲状腺癌的发病率以平均每年6.4％的增幅上升，而我国甲状腺癌患病率已上升至女性恶性肿瘤的第三位。分化型甲状腺癌患者术后无病生存期长，预后好，但仍无法避免部分患者术后出现复发或远处转移。据统计，甲状腺癌术后十年内有约20％的患者出现术后复发或颈淋巴结转移，或伴有远处转移。此外，一些难治性甲状腺癌，包括甲状腺髓样癌、未分化甲状腺癌和部分对碘抵抗的分化型甲状腺癌等，平均生存期仅为0.5～5年。因此，我们急需寻求一种更加有效的治疗方法来治疗难治性甲状腺癌，以提高患者的生存期。光动力疗法是一种光激发的化学疗法，光敏剂吸收光子的能量跃迁到激发态，受激发的光敏剂将能量传递给氧，产生单线态氧、超氧自由基等多种活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)成分。ros能与附近的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性进而杀伤肿瘤细胞，成为一种有巨大应用潜力的治疗晚期肿瘤的新手段。由于甲状腺位置表浅，便于进行激光照射，对光的吸收效果较好，使得pdt在甲状腺癌的治疗中具有一定应用的可行性。化疗药物具有较好的药理作用，能够有效杀伤肿瘤细胞，但多数化疗药物在体内无法富集在肿瘤组织，或者在肿瘤组织的药物浓度较低，因此就会提高药物用量，但随之而来的严重的不良反应也使其治疗效果受到限制。
环境响应性药物载体能够根据所处环境发生药物释放等特定响应，实现增强肿瘤组织药物递送的目的，成为目前研究的热点。利用光动力治疗过程中产生的ros促使纳米药物载体快速释放药物，可实现药物在肿瘤组织的靶向释放，提高药物治疗效果和安全性。光动力治疗过程中有效递送能消除肿瘤组织免疫抑制微环境的药物的载体材料和给药系统的构建，以及其发挥作用的机制是其中关键的科学问题。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有难治性甲状腺癌治疗方法预后差，花费大，副作用高等缺点，而提供一种纳米载药系统在制备治疗难治性甲状腺癌的药物中的应用。
本发明提供一种纳米载药系统在制备治疗难治性甲状腺癌的药物中的应用，该纳米载药系统包括ros响应性的超支化高分子、光敏剂和化疗药物，所述的光敏剂的包封率为60％以上，化疗药物的包封率为60％以上；
所述的超支化高分子的结构式如式ⅰ所示：
所述的光敏剂为二氢卟吩e6；
所述的化疗药物为索拉菲尼。
优选的是，所述的纳米药物系统的制备方法，该方法包括：
步骤一：制备ros响应性的超支化高分子；
步骤二：将步骤一得到的ros响应性的超支化高分子溶于溶剂中溶解，然后加入光敏剂和化疗药物，搅拌，混合均匀，得到混合溶液；
步骤三：在剧烈搅拌条件下，将步骤二的混合溶液滴入水相中，自组装为纳米颗粒，滴加结束后，调节转速，继续缓慢搅拌2h，得到纳米药物系统。
优选的是，所述的步骤一具体为：
1)将丙酮和半胱氨酸盐在常温条件下，通过羰基的加成反应合成二胺硫缩酮单体，；
2)取mpeg、三氯氧磷于室温反应，得到反应溶液，然后将二氨基硫羧酮单体和三乙醇胺加入上述反应溶液，常温反应，得到ros响应性的超支化结构。
优选的是，所述的丙酮和半胱胺酸盐的质量比为(1～1.5)：1。
优选的是，所述的mpeg、三氯氧磷、二氨基硫羧酮单体和三乙醇胺的质量比为0.5：0.45：(0.9-1.125)：1.26。
优选的是，所述的ros响应性的超支化高分子、光敏剂和化疗药物的质量比为10：(1-2)：(1-2)。
优选的是，所述步骤二的搅拌时间为30～60min。
优选的是，所述的步骤三的剧烈搅拌速率为1500rpm。
优选的是，所述步骤三的滴加速度为1～2ml/h。
优选的是，所述的步骤三调节转速后的速率为750rpm。
本发明的有益效果
本发明提供一种纳米载药系统在制备治疗难治性甲状腺癌的药物中的应用，该系统包括ros响应性的超支化高分子、光敏剂和化疗药物；一方面ros与化疗药物sfb协同增效抑制肿瘤生长，另一方面，化疗药物sfb可改变肿瘤组织内免疫抑制环境，增强机体对肿瘤的免疫反应，显著提高治疗效果。该纳米药物系统不仅可以富集在肿瘤组织，还可以在660nm激光照射下增加肿瘤组织内ros水平，使肿瘤组织内的纳米载体崩解，化疗药物快速释放，从而协同增效肿瘤的治疗，同时减少化疗药物的用量，减轻其毒副作用。
附图说明
图1为本发明实施例1制备得到的ros响应性的超支化结构的核磁氢谱图；
图2为本发明实施例1制备得到的纳米载药系统的表征图；
图3为本发明所述纳米药物系统在肿瘤细胞的分布情况；
图4为本发明所述纳米药物系统在荷瘤小鼠体内的分布情况；
图5为本发明所述纳米药物系统对肿瘤细胞的毒性作用图；
图6是本发明所述纳米药物系统对荷瘤小鼠肿瘤生长曲线的抑制作用图(a)及肿瘤大小(b)的影响。
具体实施方式
本发明提供一种纳米载药系统在制备治疗难治性甲状腺癌的药物中的应用，该纳米载药系统包括ros响应性的超支化高分子、光敏剂和化疗药物，所述的光敏剂的包封率为60％以上，优选为65％，化疗药物的包封率为60％以上，优选为65％；
所述的超支化高分子的结构式如式ⅰ所示：
所述的光敏剂为二氢卟吩e6；
所述的化疗药物为索拉菲尼。
按照本发明，所述的纳米药物系统的制备方法，该方法包括：
步骤一：制备ros响应性的超支化高分子；
步骤二：将步骤一得到的ros响应性的超支化高分子溶于溶剂中溶解，然后加入光敏剂和化疗药物，搅拌，混合均匀，得到混合溶液；
步骤三：在剧烈搅拌条件下，将步骤二的混合溶液滴入水相中，自组装为纳米颗粒，滴加结束后，调节转速，继续缓慢搅拌2h，得到纳米药物系统。
按照本发明，所述的步骤一具体为：
1)将丙酮和半胱氨酸盐在常温条件下，通过羰基的加成反应合成二胺硫缩酮单体；所述的反应时间优选为12h；所述的丙酮和半胱胺酸盐的质量比优选为(1～1.5)：1，更优选为0.37：1；
2)取mpeg、三氯氧磷于室温反应，优选反应时间为2h，反应溶剂优选为氯仿，得到反应溶液，然后将二氨基硫羧酮单体和三乙醇胺(tea)加入上述反应溶液，常温反应，所述的反应时间优选为12h，得到ros响应性的超支化结构；所述的mpeg、三氯氧磷、二氨基硫羧酮单体和三乙醇胺的质量比为0.5：0.45：(0.9-1.125)：1.26，更优选为0.5：0.45：1：1.26。
按照本发明，将上述得到的ros响应性的超支化高分子溶于溶剂中溶解，所述的溶剂优选为二甲基亚砜(dmso)，所述的ros响应性的超支化高分子的浓度优选为10mg/ml，然后加入光敏剂和化疗药物，搅拌，所述的搅拌时间优选为30～60min，混合均匀，得到混合溶液；所述的ros响应性的超支化高分子、光敏剂和化疗药物的质量比优选为10：(1-2)：(1-2)；更优选为10：2：2；混合溶液中ros响应性的超支化高分子浓度优选为1mg/ml。
按照本发明，优选在速率为1500rpm剧烈搅拌条件下，将上述的混合溶液滴入水相(灭菌去离子水)中，自组装为纳米颗粒，滴加结束后，调节转速，优选速率为750rpm，继续缓慢搅拌2h，得到纳米药物系统；所述滴加速度优选为1～2ml/h。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，实施例中涉及到的原料均为商购获得。
实施例1
将15.6g丙酮和11.36g半胱氨酸盐在常温条件下，反应12h，所得的粗产物提纯后得到二氨基硫羧酮单体；
取0.5gmpeg、0.45g三氯氧磷于室温反应2h，溶剂为氯仿，将1g二氨基硫羧酮单体和1.26gtea加入上述溶液，常温反应过夜，得到ros响应性的超支化结构。核磁氢谱图如图1所示，图1中，a,b,c,d表示不同的化学键，氢谱的峰面积表示化学键的数量多少，从图中我们可以得出检测物与ros响应性的超支化结构一致。
用电子天平称取10mgros响应性超支化聚合材料于无菌5mlep管中，加入1mldmso，涡旋至完全溶解；取一个10ml圆底烧瓶，加入磁子，将上述溶液转移至圆底烧瓶，分别加入2mgsfb和2mgce6(100μl20mg/ml的sfb和100μl20mg/mlce6dmso溶液)，搅拌30min，混合均匀；
混合结束后，取50ml圆底烧瓶，加入磁子和10ml去离子水；在搅拌速率为1500rpm剧烈搅拌下，用注射器泵将上述混合液缓慢滴入水相中(1ml/h)，自组装成纳米颗粒；滴加结束后，调节转速，速率为750rpm，继续缓慢搅拌2h；得到纳米药物系统。
将实施例1制备得到的纳米药物系统转移至mwco10000透析袋中透析，透析水相体积约500ml；透析过程中，要注意勤换水，透析过夜除dmso(注：刚开始透析时，每隔30min换一次，加快透析速度)；用微量移液器吸取10μl纳米颗粒混悬液加入1.5mlep管中，加入990μlddh2o稀释，将纳米颗粒稀释液转移入粒径测量专用比色杯中，用粒度仪测量纳米颗粒粒径。
将比色杯中的纳米颗粒稀释液转移入电势测量样品池中，用粒度仪测量纳米颗粒表面电位。分别测量3次。使用后，比色杯与电势测量样品池用ddh2o清洗干净。在表面含有碳膜400目的铜网上滴加20μl稀释10倍的纳米颗粒混悬液，避光静置，待混悬液风干后用透射电镜进行观察。
图2为本发明实施例1制备得到的纳米载药系统的表征图，图a为粒径大小图，图b为表面电势图，图c为电镜照片，其中所述的纳米载药系统主要分为(1)不载药纳米颗粒的为blanknps；(2)包载有ce6的纳米颗粒npsce6；(3)包载有sfb的纳米颗粒sfbnps；(4)同时包装有sfb和ce6的纳米颗粒sfbnpsce6。从图2可以看出，包载sfb和ce6的纳米颗粒的粒径大于不载药的纳米颗粒，其电势也因包载药物的不同而变化，同时包装有sfb和ce6的sfbnpsce6纳米颗粒的粒径最大为151.8±11.4nm，电势为-14.9±2.8mv，电镜下呈球形结构，载药纳米颗粒粒径大小，分散度较好，具有很好的稳定。
实施例2含荧光染料dii和/或did的载药纳米系统的制备
用电子天平称取实施例1制备得到的10mgros响应性超支化聚合材料于无菌5mlep管中，加入1mldmso，涡旋至完全溶解；取一个10ml圆底烧瓶，加入磁子，将上述溶液转移至圆底烧瓶，分三组分别加入，第一组加入2mgsfb、2mgce6和5μgdid染料(100μl20mg/ml的sfb、100μl20mg/mlce6dmso溶液、1μl5mg/ml的diddmso溶液)；第二组加入2mgsfb、2mgce6和5μgdii染料(100μl20mg/ml的sfb、100μl20mg/mlce6dmso溶液、1μl5mg/ml的diidmso溶液)；第三组加入2mgsfb、2mgce6、5μgdid染料和5μgdii染料(100μl20mg/ml的sfb、100μl20mg/mlce6dmso溶液、1μl5mg/ml的diddmso溶液、1μl5mg/ml的diidsmo溶液)；三组分别搅拌30min，混合均匀；
混合结束后，取50ml圆底烧瓶，加入磁子和10ml去离子水；在搅拌速率为1500rpm剧烈搅拌下，用注射器泵将上述混合液缓慢滴入水相中(1ml/h)，自组装成纳米颗粒；滴加结束后，调节转速，速率为750rpm，继续缓慢搅拌2h；得到单独包载did的纳米颗粒didnps、单独包载dii的纳米颗粒npsdii、同时包载did和dii的纳米颗粒didnpsdii。
实施例3体外用流式细胞术检测载药纳米系统在肿瘤细胞中的分布情况；
荷瘤小鼠为balb/cnude小鼠，雌性，6～8周，右股皮下接种人甲状腺癌乳头状细胞k1,数量为8×106，用dmem完全培养基于37℃、饱和湿度、co2的恒温培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长。取对数生长期的人甲状腺乳头状癌细胞k1，消化至6孔板内，每孔1×106个细胞，1.5ml完全培养基过夜。细胞贴壁后，加入实施例2分别得到的50μl分布含荧光染料did、dii的超支化载药纳米颗粒以及同时含有did/dii的超支化载药纳米颗粒于1.5ml完全培养基中，孵育箱中孵育3h，加入50μlpbs进行培养的孔作为阴性对照。用pbs洗3遍，消化于流式管内。以上操作均在避光条件下进行。dii用pe通道检测，did用apc通道检测。
图3是本发明所述纳米药物系统在肿瘤细胞的分布情况。从图3可以看出，相对于pbs对照组，didnpsdii纳米颗粒组apc与pe通道双阳性率达到99.2％，单独包载did的didnps纳米颗粒组，apc通道阳性率达到98.6％，单独包载dii的diinps纳米颗粒组，pe通道阳性率达到98.8％。可见，肿瘤细胞对纳米颗粒的吞噬作用很强，含荧光的载药纳米颗粒可进入肿瘤细胞内，并且同时携载两种疏水药物进入肿瘤细胞内，其所携载药物可更集中地作用于肿瘤细胞。
实施例4体内用小动物活体成像仪检测载药纳米系统在荷瘤小鼠体内的分布情况
荷瘤小鼠为balb/cnude小鼠，雌性，6～8周，右股皮下接种人甲状腺癌乳头状细胞k1,数量为8×106。取对数生长期人甲状腺乳头状癌细胞k1，饥饿6h后，弃去培养基，用pbs洗2遍，消化离心后，用10倍的pbs重悬，于ep管中，浓度为5.3×107个/ml，置于冰盒上。将小鼠用2％戊巴比妥钠麻醉，根据体重按2μl/g进行给药麻醉。铺上已消毒过的无菌术中单，待老鼠麻醉后，取150μl细胞混悬液于1ml胰岛素注射器内，左手用无菌眼科镊夹起右侧股部皮肤，右手将注射器垂直进针打一皮丘后缓慢拔出，将老鼠放回笼内。隔天观察老鼠状态良好。接种15天左右成实体瘤。肿瘤体积长至200mm3左右，尾静脉注射200μl实施例2制备得到的含荧光染料did的纳米颗粒溶液，注射等量pbs作为阴性对照。注射后的0.5h,2h,4h,6h,8h,12h,24h,用小动物活体成像仪观察肿瘤部位的荧光情况，分析纳米颗粒在肿瘤部位的聚集情况。
图4是本发明所述纳米药物系统在荷瘤小鼠体内的分布情况，从图4可以看出，在体内，注射后1h即可见含荧光的纳米颗粒聚集在小鼠肿瘤部位，并随着体内循环时间的延长，其肿瘤部位荧光强度越来越高，证明载药纳米颗粒能够在肿瘤部位实现富集。
实施例5体外用酶标仪检测载药纳米系统对肿瘤细胞的杀伤作用
将细胞给予不同的药物处理，分三组，每组设置三个复孔：sfbnps，npsce6，sfbnpsce6，均以660nm的近红外光照射(50mw/cm2,3min)。同时不同组间又设置不同药物浓度，分别为ros浓度1.25,2.5,5,10,和15μg/ml。取20000个对数生长期的k1细胞铺于96孔板中，加200μl完全培养基培养过夜，待细胞贴壁。将完全培养基弃掉，加入dmem200μl，加入不同的药物浓度，孵育3h。将dmem弃掉，加入200μlpbs洗3遍。用660nm的近红外光照射后，孵育18h后用酶标仪检测，检测波长为490nm。
图5是本发明所述纳米药物系统对肿瘤细胞的毒性作用图，从图5可以看出，同一浓度下，sfbnps+laser组对细胞杀伤作用极微弱，没有光敏剂，不能产生ros，无法诱导纳米颗粒崩解释放药物，通过载药纳米颗粒的缓释作用，对细胞的毒性较小，可能是因为sfb的药量较低，npsce6+laser组对细胞有杀伤作用，因为光照下ce6产生ros，使纳米颗粒迅速崩解，释放大量ros，迅速作用于细胞，产生毒性。sfbnpsce6+laser组对细胞的杀伤作用最强，ros和sfb协同作用效果大大增强。特别在纳米颗粒浓度为2.5μg/ml的时候，sfbnpsce6+laser组对细胞的杀伤作用强于sfbnps+laser组和npsce6+laser组之和。
实施例6构建小鼠肿瘤模型，检测光动力疗法和化学疗法协同增效肿瘤治疗，检测治疗后小鼠肿瘤内免疫细胞的分布情况
将荷瘤小鼠给予不同药物处理，分五组，每组4只：分别为pbs对照组，sfbnps组，sfbnpsce6组，及以660nm的近红外光照射(50mw/cm2,2h)的npsce6组，sfbnpsce6组。当肿瘤长至100mm3时，将合成纳米颗粒浓缩4倍，尾静脉药ce6的浓度2.5mg/kg，pbs对照组给200μlpbs，8h后，光照组进行光照处理：660nm的近红外光照射2h。隔天给药，共7次。每天用游标卡尺测量小鼠肿瘤大小，并用电子秤称量小鼠体重。观察小鼠的饮食情况及精神状态。当肿瘤长至2000mm3，将实验中各组小鼠进行脱颈椎处死，实验室统一进行尸体处理。
图6是本发明所述纳米药物系统对荷瘤小鼠肿瘤生长曲线的抑制作用图(a)及肿瘤大小(b)的影响。从图6可以看出，与pbs对照组相比，单独使用sfbnpsce6或sfbnps治疗对肿瘤生长没有影响，因为sfbnps组sfb释放缓慢，而sfbnpsce6纳米颗粒在没有光照刺激下，无法产生足量的ros促使其快速释放sfb，药效发挥较慢，对肿瘤生长的抑制作用较弱。而npsce6+laser处理对肿瘤生长有一定抑制作用，主要是因为在660nm的激光照射下，ce6产生一定量的ros，促使颗粒崩解的同时，也引起了肿瘤细胞坏死。但sfbnpsce6+laser处理组中ce6产生的ros不仅引起的颗粒快速崩解，快速释放药物，也引起肿瘤坏死，二者协同，显著抑制肿瘤生长。与其他组相比，sfbnpsce6+laser治疗组肿瘤的重量也最小，有明显的统计学差异。