本发明属于纳米材料制备和生物医学领域，具体涉及一种具aβ蛋白抑制活性的egcg-fe/pvp纳米球及其制备方法与其在抑制淀粉样蛋白聚集中的应用。
背景技术：
阿尔茨海默病（alzheimerdisease，ad），又叫老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型，主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。ad的病因及发病机制尚未阐明，特征性病理改变为：β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。
大量研究表明aβ在ad发病中起着主导作用。目前针对aβ的神经毒作用的防治措施主要有以下几方面：减少aβ的前体即β淀粉样前体蛋白的量，调节app的裂解，减少aβ的产生；促进aβ的降解和清除；防止aβ的聚集和沉积；阻断aβ作用机制的关键环节等。
表没食子儿茶素没食子酸酯（egcg）具有抗氧化性、清除体内自由基、抗辐射和紫外线、预防心脑血管疾病、调整脂糖代谢、治疗糖尿病、降血脂、抗癌、抗炎、抗突变、抗衰老及改善肝功能等生物活性。此外，egcg还常被用来防止神经退行性疾病，如ad、pd、hd以及肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis，als)等。
虽然egcg具有抗氧化、抗衰老、预防神经退行性疾病等特性，但是自由的egcg分子易被氧化、热稳定性差，导致其生物利用度很低。本发明利用egcg易与金属离子配位的特性，对其进行修饰，发展出一种粒径小、易被体内清除、热稳定性高且对aβ蛋白的抑制治疗效果显著的egcg-fe/pvp纳米球，该项目获福建省自然基金（2017j01040）、国家自然基金（21271044）资助支持。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具aβ蛋白抑制活性的egcg-fe/pvp纳米球及其制备方法和应用，该egcg-fe-pvp纳米球在低浓度时对淀粉样蛋白aβ的抑制率高达百分之三十，且其具有粒径小、易被体内清除、热稳定性高等优点，可作为一种治疗阿尔兹海默病的潜在药物。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种具aβ蛋白抑制活性的egcg-fe/pvp纳米球，其是由表没食子儿茶素没食子酸酯（egcg）、fe3+及表面活性剂pvp自组装而成，其制备方法包括以下步骤：
1）将fecl3分散至水中，然后加入pvp，在室温、450rpm条件下混合搅拌1小时；
2）将egcg溶解在乙醇中，再将其加入到步骤1）所得混合溶液中，搅拌反应过夜，产物经透析处理，得到egcg-fe/pvp纳米球。
所用pvp的分子量为10kd。
所用fecl3与pvp的投料质量比为1:3.3~1:6，优选为1:5。
所用fecl3与egcg的投料质量比为1:0.13~1:0.2，优选为1:0.17。
所得具aβ蛋白抑制活性的egcg-fe/pvp纳米球的粒径为2-6nm，在最优质量比条件下，其粒径为3.2±1.2nm，电位为-10mv，其可作为淀粉样蛋白抑制剂，用于抑制淀粉样蛋白aβ的聚集。
egcg存在较多的酚羟基，可以与金属离子fe3+通过强配位作用得到金属-多酚纳米球egcg-fe/pvp。
本发明的显著优点在于：
（1）本发明所得egcg-fe/pvp纳米球粒径小、稳定性高、生物相容性好，并易被体内清除；
（2）本发明首次将多酚与金属离子组装形成egcg-fe/pvp纳米球，并将其应用于淀粉样蛋白聚集的抑制。本发明所得egcg-fe/pvp纳米球在低浓度（2μg/ml）时，对aβ蛋白的抑制率高达30%，可有效降低因淀粉样蛋白聚集所引起的毒性。
附图说明
图1为实施例1所制备egcg-fe/pvp纳米球的zeta电位仪粒径图。
图2为实施例1所制备egcg-fe/pvp纳米球的tem图（a）及粒径分布图（b）。
图3为实施例1所制备egcg-fe/pvp纳米球放置不同时间的光学照片。
图4为实施例1所制备egcg-fe/pvp纳米球在不同浓度下的生物相亲性情况图。
图5为淀粉样蛋白aβ与不同浓度egcg-fe/pvp纳米球一起孵育不同时间所测得的荧光结果图。
图6为淀粉样蛋白aβ与不同浓度egcg-fe/pvp一起孵育48h后的tem图，其中a为aβ（20μm）+0μg/mlegcg-fe/pvp，b为aβ（20μm）+2μg/mlegcg-fe/pvp，c为aβ（20μm）+50μg/mlegcg-fe/pvp；
图7为淀粉样蛋白aβ与不同浓度egcg-fe/pvp一起孵育48h后的afm图，其中a为aβ（20μm）+0μg/mlegcg-fe/pvp，b为aβ（20μm）+2μg/mlegcg-fe/pvp，c为aβ（20μm）+10μg/mlegcg-fe/pvp，d为aβ（20μm）+50μg/mlegcg-fe/pvp。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
1）将fecl3分散到去离子水中，配成浓度为100mg/ml的fecl3溶液，将pvp（mw=10kd）分散在去离子水中，配成浓度为10mg/ml的pvp溶液；
2）在搅拌条件下，在200μlfecl3溶液中加入10mlpvp溶液，然后将此混合液在室温、450rpm转速条件下搅拌1小时；
3）向上述混合液中逐滴加入1ml含3.36mgegcg的乙醇溶液，搅拌反应过夜，经过24h透析，即得egcg-fe/pvp纳米球。
1.将所得egcg-fe/pvp纳米球加入到去离子中，配制成浓度为1mg/ml的溶液，测其粒径，结果如图1所示。由图1可见，egcg-fe/pvp纳米球的光学粒径约为10nm。
2.将所得egcg-fe/pvp纳米球加入到去离子中，配制成浓度为1mg/ml的溶液，然后滴加到铜网上，待其干燥后，进行电镜扫描，结果如图2所示。由图2可见，透射电镜下egcg-fe/pvp纳米球的粒径为3.2±1.2nm。
3.将所得egcg-fe/pvp加入到去离子中，配制成浓度为1mg/ml的溶液，混匀，然后分别加入到7个1.5ml的ep管中，分别放置1天、3天、5天、7天、15天、20天、30天，观察egcg-fe/pvp的稳定性，结果如图3所示。由图3可见，所得egcg-fe/pvp纳米球的稳定性良好，30天内没发生团聚现象；
4.为了考察egcg-fe/pvp纳米球的生物相亲性情况，以egcg-fe/pvp纳米球对hela细胞的毒性实验为根据。
待hela细胞生长至90%左右进行细胞传代与接种操作，其步骤如下：先将旧培养基去掉，然后加入2mlpbs溶液轻柔清洗，之后加入1ml胰蛋白酶消化细胞1min左右，去除胰酶，加入2mlrpmi-1640培养基停止消化；轻轻吹打细胞制备成细胞原液，取1/4的细胞原液分装入新的培养瓶中，置于37℃培养箱中继续培养。
将hela细胞原液用培养液稀释并分散成hela细胞悬液，其密度为105个/ml，并以每孔104个细胞接种至96孔板中，置于37℃，5%co2的培养箱中培养24h后，移去培养液，加入浓度依次为0、2、10、50、100、200μg/ml的egcg-fe/pvp纳米球培养液，每个浓度设置4个重复孔。培养6h后，清洗2次，加入100μl新鲜培养液继续培养19h后，每孔加入10μl浓度为5mg/ml的mtt，孵育4~6h，小心移去培养液，加入150μldmso，37℃培养15min；测490nm处的吸收值，计算存活率，以评价egcg-fe/pvp纳米球的生物相亲性，结果如图4所示。由图4可见，即使egcg-fe/pvp纳米球在浓度为200μg/ml时，细胞存活率也在80%以上，说明egcg-fe/pvp纳米球的生物相亲性好。
应用实施例1
a）将淀粉样蛋白aβ进行预处理，即将蛋白先用高极性溶剂六氟异丙醇（hfip）溶解，其终浓度为1mg/ml，然后在4℃、450rpm下搅拌2小时，然后经冷冻干燥后，用ph=7.410mmpbs和去离子水重分散，得到浓度为0.25mm的淀粉样蛋白储备液；
b）将实施例1制得的egcg-fe/pvp纳米球与步骤a）制备的淀粉样蛋白储备液按不同比例混合，使所得混合液中蛋白浓度为20μm，纳米球浓度分别为0μg/ml、2μg/ml、10μg/ml、50μg/ml；然后将其分别加入到96孔板中，每孔加入100μl，于振荡器中37℃、150rpm进行振荡。
1.于不同时间分别测定混合溶液中蛋白的荧光（测荧光前，加入100μl100μmtht，10min后，将96孔板置于酶标仪中进行荧光测定），并记录数据；
根据所测得的荧光值计算出egcg-fe/pvp纳米球对蛋白的抑制率，结果如图5所示。
由图5可见，含有egcg-fe/pvp纳米球的蛋白组的荧光值比不含egcg-fe/pvp纳米球的蛋白组的荧光弱，说明egcg-fe/pvp纳米球对蛋白的聚集有一定的抑制效果；且随着egcg-fe/pvp纳米球浓度的增高，抑制效果更强；浓度为2μg/ml、10μg/ml、50μg/mlegcg-fe/pvp纳米球的对aβ的抑制率分别为29.4%、33%、35.3%；
2.两天后，将所得混合溶液滴加到铜网上，静置数分钟，然后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1~2分钟用滤纸吸去负染色液，再用蒸馏水滴在铜网上洗1~2次，待其干燥后进行电镜扫描，结果如图6所示。
由图6可见，不含egcg-fe/pvp纳米球的aβ易聚集形成纤维蛋白，而含有egcg-fe/pvp纳米球的蛋白aβ仅部分聚集形成纤维蛋白，说明egcg-fe/pvp纳米球对aβ的聚集具有抑制效果。
3.两天后，将所得混合溶液进行超滤处理，然后取超滤上清20μl滴加到云母片上，待其干燥后用去离子水清洗1~2次，干燥后进行原子力显微镜（afm）测试，结果如图7所示。
由图7可见，不含egcg-fe/pvp纳米球的aβ聚集形成大量纤维蛋白，而含有egcg-fe/pvp纳米球的蛋白aβ仅有部分聚集形成纤维蛋白，且随着egcg-fe/pvp纳米球浓度的增加，大部分aβ蛋白只形成小颗粒而不是纤维，这进一步说明egcg-fe/pvp纳米球对aβ的聚集具有抑制效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。