本发明涉及医药领域，特别是一种白藜芦醇和丙酮酸钠组合配方的治疗宫颈癌药物及制备方法。
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：宫颈癌可分为外生型宫颈癌和内生型宫颈癌。外生型宫颈癌症状为息肉状、菜花状赘生物，常伴感染，肿瘤质脆易出血；内生型宫颈癌症状为宫颈肥大、质硬。子宫颈癌是全球妇女最常见的恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌，位居全球第二位。如不采取相应治疗措施，因子宫颈癌导致的死亡病例将上升25％。医学的发展使很多癌症已有了较好的治疗效果，尽管手术、放化疗等治疗手段已经日趋成熟，但对晚期或转移性宫颈癌疗效仍不尽人意，宫颈癌的药物治疗已经成为当前研究热点之一。白藜芦醇(resveratrol)是一种广泛存在于葡萄、虎杖、花生等多种植物中的多酚化合物，是一种天然的植物抗毒素，是防治肿瘤的绿色抗癌药物。体内外实验表明，白藜芦醇对大多数肿瘤的起始、增殖、发展这三个主要阶段均有抑制乃至逆转作用。其抗肿瘤机制可以通过抗氧化、阻滞细胞周期、促进肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化、抑制环氧化物酶和细胞色素p450的活性、干扰相关信号转导通路、抑制肿瘤血管生成等发挥作用。但与临床一线抗肿瘤药物相比，活性相对较低，其机制可能与上调促癌基因vegf-β的表达相关。丙酮酸钠(sodiumpyruvate)丙酮酸钠是最常见的丙酮酸盐，别名焦葡萄酸钠、2-羰基丙酸钠盐，分子式为c3h3nao3，是一类内源性小分子物质。丙酮酸钠在医学上、诊断试剂以及医疗器械中被广泛用作缓冲剂、赋形剂和抗氧化剂。已有结果证明丙酮酸钠可能有助于改善甚至防止肝细胞功能障碍发生后的出血性休克，丙酮酸钠能够通过抑制caspase-3以及改善gsh/gssg比率，抑制细胞凋亡，证明外源性丙酮酸钠具有改善细胞氧化还原状态的作用。但是至今未见其在单独治疗宫颈癌方面的报道。本发明将白藜芦醇与丙酮酸钠组合起来用于治疗宫颈癌具有明显的效果。大大提高单药使用的效果。并通过实验证明，丙酮酸钠和白藜芦醇联合用药能显著抑制宫颈癌细胞组蛋白h4的表达进而抑制宫颈癌细胞的增殖，具有深远的医学应用价值和意义。技术实现要素：本发明的目的在于针对上述现有技术分析和存在问题，提供一种白藜芦醇和丙酮酸钠组合配方的治疗药物，该组合药物在应用于宫颈癌治疗中比单独使用活性更高、更有效。本发明的技术方案：一种白藜芦醇和丙酮酸钠组合配方的治疗宫颈癌药物，它是由白藜芦醇和丙酮酸钠组成，其配比为白藜芦醇与丙酮酸钠的摩尔比为1:20-1000。首先将丙酮酸钠溶于pbs缓冲液中，配制1m丙酮酸钠母液，即称取0.5562g丙酮酸钠(sigma公司)溶于5mlpbs缓冲液中，使用时稀释至所需处理浓度；然后将白藜芦醇溶于无水乙醇中，配制10mm白藜芦醇母液，即称取白藜芦醇(macklin公司)0.02284g溶于10ml无水乙醇中，使用时稀释至所需处理浓度。联合用药时，先将丙酮酸钠、白藜芦醇稀释至给药浓度，然后混合，再使用；现用现配。本发明的优点是：1)白藜芦醇与丙酮酸钠均为常见药物，价格实惠、易于制备且安全性高；2)白藜芦醇与丙酮酸钠同时给药对宫颈癌有协同的抑制作用，通过单独使用丙酮酸钠和白藜芦醇与丙酮酸钠组合抑制人宫颈癌细胞增殖的试验，结果表明：该白藜芦醇与丙酮酸钠组合药物治疗宫颈癌有显著的协同效应，提高了药物疗效，效果显著，具有医学上的统计学意义。附图说明图1为丙酮酸钠和白藜芦醇作用于宫颈癌细胞给药方式图。图2为丙酮酸单独对人宫颈癌细胞增殖活性的抑制效果(***p＜0.001vscon)。图3为丙酮酸和白藜芦醇联合治疗分别对人宫颈癌细胞增殖活性的抑制效果(***p＜0.001vscon)。图4a是使用不同浓度丙酮酸钠(0mm、50mm、100mm)处理hela细胞24小时后收细胞检测组蛋白h4的表达变化。图4b为白藜芦醇单独使用对宫颈癌细胞和正常细胞的组蛋白h4和h2b蛋白表达的影响，即丙酮酸钠和白藜芦醇单独治疗前后，人宫颈癌细胞中组蛋白h4蛋白表达情况及定量分析(*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001vscon)。图4c是使用100μm白藜芦醇并同时用丙酮酸钠(0mm、50mm、100mm)处理hela细胞24小时后收细胞检测组蛋白h4的表达变化；具体实施方式实施例1：丙酮酸和白藜芦醇单独或联合治疗分别对人宫颈癌细胞增殖活性的抑制作用。1.所用材料：人宫颈癌细胞系为hela细胞；白藜芦醇为购买于macklin公司，无菌无水乙醇配制10mm母液，使用时以pbs稀释，现配现用；丙酮酸钠为购买于sigma公司，无菌pbs溶解配制为1m母液，使用时稀释，现配现用；配制含10％胎牛血清、1％双抗(青霉素和链霉素)的deem高糖培养基用于培养细胞，cck8细胞增殖与活性检测。2.应用方法：1)取对数生长期的细胞，以5×104个/ml的浓度接种于在96孔板(100μl/孔)；2)贴壁培养12h后，弃掉培养基，向96孔培养板单独加入不同浓度丙酮酸钠(0mm、10mm、50mm、100mm、150mm、200mm)和白藜芦醇(100μm)与不同浓度丙酮酸钠(0mm、5mm、10mm、50mm、100mm)组合药物的培养基，培养24h；3)弃掉旧培养基，向每孔中加入含有10％的cck-8溶液的培养基100μl；4)将96孔板放在co2浓度为5％的细胞培养箱中孵育3小时5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度a450；6)细胞增殖活力计算：细胞活力(％)＝[a450(加药)－a450(空白)]/[a450(0加药)－a450(空白)]×100a450(加药)：具有细胞、cck8溶液和药物溶液的孔的吸光度；a450(空白)：具有培养基和cck8溶液而没有细胞的孔的吸光度；a450(0加药)：具有细胞、cck8溶液而没有药物的孔的吸光度。3.检测结果采用cck8法检测不同细胞和不同药物处理组的细胞生长情况，从图1和图2结果可以看出，使用不同浓度的丙酮酸钠(0mm、10mm、50mm、100mm、150mm、200mm)处理hela细胞24h后各组细胞存活率为99.16％、88.18％、73.74％、61.08％、38.56％、27.59％，与对照组99.16％(0mm)相比，丙酮酸钠(10mm、50mm、100mm、150mm、200mm)存在统计学意义(p＜0.001)；结果见表1当用不同浓度的丙酮酸钠(0mm、5mm、10mm、50mm、100mm)与白藜芦醇(100μm)组合配方使用后，各组细胞存活率为74.62％、73.68％、66％、53.05％、35.53％与单独用丙酮酸钠(0mm、5mm、10mm、50mm、100mm)用药各组相比，差异均具有统计学意义；其结果见表2表1丙酮酸钠0mm10mm50mm100mm150mm200mm细胞生存率％99.1688.1873.7461.0838.5627.59表24.结论一定浓度的丙酮酸钠可以抑制宫颈癌细胞的增殖，丙酮酸钠与白藜芦醇组合配方应用能够更有效的抑制宫颈癌细胞的增殖。实例2：丙酮酸钠和白藜芦醇分别对人宫颈癌hela细胞组蛋白h4表达的影响。使用不同浓度丙酮酸钠(0mm、50mm、100mm)处理hela细胞24小时后收细胞检测组蛋白h4的表达变化；使用100μm白藜芦醇并同时用丙酮酸钠(0mm、50mm、100mm)处理hela细胞24小时后收细胞检测组蛋白h4的表达变化；1.所用材料：细胞，同实施例1；药物，同实施例1；白藜芦醇浓度为100μm，丙酮酸钠浓度为(0mm、50mm、100mm)；h4抗体购买于abcam公司；β-actin购买于abclonal公司，兔二抗购买于abclonal公司，westernbolt显色液购买于bio-rad公司。2.所用方法：1)提取蛋白，聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)电泳、转膜2)蛋白免疫印迹：①从转膜夹板中取出pvdf膜，根据目的蛋白大小裁剪pvdf膜，tbst在脱色摇床上清洗5min；②封闭：5％脱脂牛奶室温封闭1h；③孵育一抗：h4抗体1：:2000稀释配制一抗工作液，将pvdf膜放置于抗体孵育盒，加入适当体积抗体没过pvdf膜，4℃100rmp3d摇床孵育过夜，tbst清洗10min/3次；④孵育二抗：1:5000稀释比配制二抗工作液，室温100rmp3d摇床孵育1h，tbst清洗10min/3次；⑤显色：配制显色液，a液b液1:1混合，避光保存。将膜放置在成像板上，加入适当显色液，反应两分钟后，操作蛋白成像仪曝光。3.检测结果为探讨丙酮酸钠和白藜芦醇诱导宫颈癌细胞凋亡效应的可能机制，我们采用westernblotting方法检测hela细胞组蛋白h4的表达情况。图4a、b为丙酮酸钠和白藜芦醇对宫颈癌hela细胞系的组蛋白h4表达的影响，图4a使用丙酮酸钠(0、50、100mm)单独处理hela细胞24小时后，通过westernblotting检测了组蛋白h4的蛋白表达情况，和白藜芦醇(0、10、50、100、200μm)单独处理hela细胞24小时后，通过westernblotting检测了组蛋白h4的蛋白表达情况，与对照组相比，作用结果显示：丙酮酸钠可以显著下调组蛋白h3、h4的表达(p＜0.05)，白藜芦醇能显著下调组蛋白h4的表达(p＜0.05)。图4c显示为丙酮酸钠(0、50、100mm)与白藜芦醇(100μm)联合用药处理hela细胞系24h后组蛋白h4表达的影响，与对照组相比，丙酮酸钠与白藜芦醇联合用药也能显著下调组蛋白h4的表达(p＜0.01)。4.结论丙酮酸钠与白藜芦醇可以显著降低组蛋白h4的表达，进而影响宫颈癌细胞基因组表达，调控宫颈癌细胞的死亡。当前第1页12