本发明属于生物技术领域，涉及一种有解酒功效的植物(药食两用)水提物快速筛选的方法，特别涉及一种快速筛选解酒植物的秀丽隐杆线虫醉酒模型的建立方法。
背景技术：
我国酒文化历史悠久，适量饮酒可改善人体血液循环、解除疲劳，但当摄入量超过人体限度后，会产生昏睡、胃出血、肝损伤、神经系统麻痹等症状，对人体造成巨大危害，因此大量具有解酒效果的解酒药(如葛花汤、甘得乐醒酒饮料、醒来悦醒酒饮料、鼎尊醒酒饮料等植物醒酒药)问世。但大多解酒药的药效作用大多通过建立小鼠醉酒模型去验证，通过检测小鼠血液指标及相关代谢酶，以评价作用效果。此方法存在过程较复杂、试验组样本数量限制、试验周期长，且经济成本较高的缺点。
秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans,c.elegans)作为科学研究中常用且非常重要的一种模式动物，具有以下特点和优势：个体较小，成虫约1.5mm长，成本低，便于在实验室上大量培养和操作；生活周期短，在20℃下平均生活史为3.5天，便于快速进行表型分析。因此可利用秀丽隐杆线虫建立一种醉酒模型，以解决小鼠试验的不足之处。
技术实现要素：
本发明的目的是，针对上述现有技术的不足，提供一种快速筛选解酒植物的秀丽隐杆线虫醉酒模型建立方法及应用，通过秀丽隐杆线虫醉酒模型的建立，能从多种药食两用的植物中快速筛选出解酒药效显著的植物，具有高效筛药、降低成本、试验结果可靠的特点。
为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种快速筛选解酒植物的秀丽隐杆线虫醉酒模型建立方法，该方法步骤如下：
(1)采用常规液体培养法对野生型秀丽隐杆线虫(n2)进行培养，使虫液浓度控制为2000-2500虫/ml，秀丽隐杆线虫以菌液浓度为100mg/ml的浓缩op50菌液为食；
上述提及的虫液浓度是指培养液中秀丽隐杆线虫的浓度；而文中的虫液则是指培养秀丽隐杆线虫后的秀丽隐杆线虫浓度为2000-2500虫/ml的培养液。
(2)待秀丽隐杆线虫生长至刚进入成虫期时，于虫液中加入酒精溶液，使酒精溶液体积终浓度为1％-5％，干预24h，此时，秀丽隐杆线虫表现为醉酒状态。
上述方法建立的醉酒模型中，秀丽隐杆线虫的头部摆动频率为10-40次/30s、吞咽运动为10-40次/30s、运动轨迹呈现出不协调的正弦波长且有拖尾现象，寿命为10-12d，线虫体内总抗氧化能力为15-25u/mg，氧自由基(ros)水平为80-100a.u.，线虫体内酒精浓度为30-50ng/μg蛋白。
上述提及采用常规液体培养法对野生型秀丽隐杆线虫(n2)进行培养是指参照文献(stiernaglet.maintenanceofc.elegans[j].wormbook,2006:1-11.)的方法对秀丽隐杆线虫进行同期化与基础培养。
本发明同时提供上述方法在快速筛选药食两用解酒植物中的应用。
应用时，是将药食两用植物提取物粉末用水完全溶解，并通过0.22微米的过滤膜除菌，然后以5-30mg/ml的体积终浓度加入到上述方法所建立的醉酒模型中，干预24h。干预完后，检测秀丽隐杆线虫，秀丽隐杆线虫的头部摆动频率为50-100次/30s、吞咽运动为50-90次/30s、运动轨迹呈现出较协调的正弦波长且拖尾现象减弱，寿命为14-20天，线虫体内总抗氧化能力为5-12u/mg及氧自由基(ros)水平为40-60a.u.，线虫内部酒精浓度为0-30ng/μg蛋白，秀丽隐杆线虫表现出一种趋于正常运动的状态，表示该药食两用植物具有解酒作用，且秀丽隐杆线虫的检测指标(头部摆动频率、吞咽运动、运动轨迹、寿命、总抗氧化能力、氧自由基水平及线虫体内酒精浓度)越趋向于线虫体内无酒精浓度检出时的指标，则表明该药食两用植物解酒作用越显著。
上述提及药食两用植物提取物粉末是指将购买的数种药食两用植物分别粉碎成粉，分别以1g:10ml的料液比利用水浸提法反复浸提两次以提取有效成分，过滤，合并两次滤液；然后转至旋转真空浓缩机中进行滤液浓缩，将浓缩液置于玻璃皿中密封，于-80℃冷冻至少2h，最后快速取出，冷冻干燥。
与现有技术相比，本发明方法的有益效果为：采用秀丽隐杆线虫这种公认的模式生物用于评价，方便易得，能有效降低试验成本；秀丽隐杆线虫生长周期短，短时间内能大量繁殖得到成千上万条线虫用于试验，可以保证样本量足够的多，减少试验误差，保证评价结果的准确性；可开展高通量筛选试验，高效得出试验结果，试验周期大大缩短。
具体实施方式
实施例1秀丽隐杆线虫醉酒模型的建立
以野生型秀丽隐杆线虫(n2)作为模型建立基础，秀丽隐杆线虫的同期化与基础培养参照参考文献(stiernaglet.maintenanceofc.elegans[j].wormbook,2006:1-11.)中的液体培养法进行。秀丽隐杆线虫以菌液浓度为100mg/ml的浓缩op50为食，虫液浓度控制为2000-2500虫/ml。此时，检测秀丽隐杆线虫，其头部摆动频率为50-100次/30s、吞咽运动为50-90次/30s、运动轨迹呈现出左右协调的正弦波长，寿命为18-25d，线虫体内总抗氧化能力为5-12u/mg，氧自由基(ros)水平为40-60a.u.，线虫体内未检出外部摄入的酒精。
待秀丽隐杆线虫生长至刚进入成虫期时，于虫液中加入酒精溶液，使酒精溶液体积终浓度为1％-5％，干预24h。此时检测秀丽隐杆线虫，线虫的头部摆动频率为10-40次/30s、吞咽运动为10-40次/30s、运动轨迹呈现出不协调的正弦波长且有拖尾现象，寿命为10-12d，线虫体内总抗氧化能力为15-25u/mg，氧自由基(ros)水平为80-100a.u.，线虫体内酒精浓度为30-50ng/μg蛋白，此时的线虫表现出醉酒状态。
实施例2秀丽隐杆线虫醉酒模型的验证
药食两用植物提取物粉末的提取：将购买的多种药食两用植物分别粉碎成粉，并分别按1g:10ml的料液比利用水浸提法反复浸提2次以提取有效成分，过滤，合并2次滤液。然后转至旋转真空浓缩机中进行滤液浓缩，再将浓缩液置于玻璃皿中，密封，放置-80℃冰箱中冷冻至少2h。最后快速取出冷冻后的药皿置于冷冻干燥机中，进行冷冻干燥成粉。
方法：设置空白组(虫液+水)、对照组(虫液+酒精溶液)、药物组(虫液+酒精溶液+药液)，其中：
空白组：野生型秀丽隐杆线虫的同期化与基础培养参照参考文献(maintenanceofc.elegans)中的方法采用液体培养法进行。秀丽隐杆线虫以菌液浓度为100mg/ml的浓缩op50为食，虫液浓度控制为2000-2500虫/ml。在液体培养基中培育至年轻的成虫，此时，秀丽隐杆线虫体内未检出外部摄入的酒精，各检测指标(头部摆动频率、吞咽次数、运动轨迹、寿命、线虫体内总抗氧化能力、氧自由基水平)见实施例1中第1段描述。
对照组：是在上述空白组的基础上，当秀丽隐杆线虫生长至刚进入成虫期时于虫液中加入酒精溶液，使酒精溶液体积终浓度为1％-5％，干预24h。此时，秀丽隐杆线虫为醉酒状态，各检测指标(头部摆动频率、吞咽次数、运动轨迹、寿命、线虫体内总抗氧化能力、氧自由基水平、体内酒精浓度)见实施例1中第2段描述。
药物组：是将药食两用植物提取物粉末用水完全溶解后通过0.22微米的过滤膜除菌，然后以5-30mg/ml的体积终浓度加入到对照组表现为醉酒状态的线虫虫液中，干预24h。检测秀丽隐杆线虫的头部摆动频率、吞咽次数、运动轨迹、寿命、线虫体内总抗氧化能力、氧自由基水平及体内酒精浓度等各项指标。
结果显示：检测到药物组的线虫头部摆动频率为50-100次/30s、吞咽运动为50-90次/30s、运动轨迹呈现出较协调的正弦波长且拖尾现象减弱，寿命较对照组有效提高，为14-20天，线虫内部酒精浓度为0-30ng/μg蛋白，线虫表现出一种趋于正常运动的状态且线虫体内总抗氧化能力为5-12u/mg及氧自由基(ros)水平为40-60a.u.。检测结果在空白组与对照组之间，表明该植物具解酒功效，越趋向于空白组状态则表明该植物解酒作用越显著。
实施例3葛根水提取物对醉酒线虫的解酒应用
按实施例2的分组方法进行，药食两用植物采用葛根。
葛根从药店购买，按实施例2中的提取方法制成葛根提取物粉末，将葛根提取物粉末用水完全溶解后通过0.22微米的过滤膜除菌，然后以5mg/ml的体积终浓度加入到对照组的虫液中，干预24h。检测秀丽隐杆线虫的头部摆动频率、吞咽次数、运动轨迹、寿命、线虫体内总抗氧化能力、氧自由基水平及体内酒精浓度等各项指标。
结果显示：检测到药物组的线虫头部摆动频率为65次/30s、吞咽运动为80次/30s、运动轨迹呈现出较协调的正弦波长且拖尾现象减弱，寿命为20d，线虫内部酒精浓度为10ng/μg蛋白，线虫表现出一种趋于正常运动的状态且线虫体内总抗氧化能力为9u/mg及氧自由基(ros)水平为55a.u.检测结果接近空白组，表明葛根具解酒功效。
实施例4葛花水提取物对醉酒线虫的解酒应用
按实施例2的分组方法进行，药食两用植物采用葛花。
葛花从药店购买，按实施例2中的提取方法制成葛花提取物粉末，将葛花提取物粉末用水完全溶解后通过0.22微米的过滤膜除菌，然后以10mg/ml的体积终浓度加入到对照组的虫液中，干预24h。检测秀丽隐杆线虫的头部摆动频率、吞咽次数、运动轨迹、寿命、线虫体内总抗氧化能力、氧自由基水平及体内酒精浓度等各项指标。
结果显示：检测到药物组的线虫头部摆动频率为70次/30s、吞咽运动为85次/30s、运动轨迹呈现出较协调的正弦波长且拖尾现象减弱，寿命为18d，线虫内部酒精浓度为10ng/μg蛋白，线虫表现出一种趋于正常运动的状态且线虫体内总抗氧化能力为12u/mg及氧自由基(ros)水平为50a.u.检测结果接近空白组，表明葛花具解酒功效。
实施例5五味子水提取物对醉酒线虫的解酒应用
按实施例2的分组方法进行，药食两用植物采用五味子。
五味子从药店购买，按实施例2中的提取方法制成五味子提取物粉末，将五味子提取物粉末用水完全溶解后通过0.22微米的过滤膜除菌，然后以20mg/ml的体积终浓度加入到对照组的虫液中，干预24h。检测秀丽隐杆线虫的头部摆动频率、吞咽次数、运动轨迹、寿命、线虫体内总抗氧化能力、氧自由基水平及体内酒精浓度等各项指标。结果显示：检测到药物组的线虫头部摆动频率为60次/30s、吞咽运动为75次/30s、运动轨迹呈现出较协调的正弦波长且拖尾现象减弱，寿命为16d，线虫内部酒精浓度为20ng/μg蛋白，线虫表现出一种趋于正常运动的状态且线虫体内总抗氧化能力为8u/mg及氧自由基(ros)水平为40a.u.检测结果接近空白组，表明五味子具解酒功效。
实施例6枳椇子水提取物对醉酒线虫的解酒应用
按实施例2的分组方法进行，药食两用植物采用枳椇子。
枳椇子从药店购买，按实施例2中的提取方法制成枳椇子提取物粉末，将枳椇子提取物粉末用水完全溶解后通过0.22微米的过滤膜除菌，然后以30mg/ml的体积终浓度加入到对照组的虫液中，干预24h。检测秀丽隐杆线虫的头部摆动频率、吞咽次数、运动轨迹、寿命、线虫体内总抗氧化能力、氧自由基水平及体内酒精浓度等各项指标。
结果显示：检测到药物组的线虫头部摆动频率为55次/30s、吞咽运动为70次/30s、运动轨迹呈现出较协调的正弦波长且拖尾现象减弱，寿命为14d，线虫内部酒精浓度为25ng/μg蛋白，线虫表现出一种趋于正常运动的状态，且线虫体内总抗氧化能力为7u/mg及氧自由基(ros)水平为40a.u.检测结果接近空白组，表明枳椇子具有解酒功效。
文中提及的秀丽隐杆线虫的各项检测指标的检测方法：
(1)线虫运动的测定方法
秀丽隐杆线虫的同期化与基础培养根据参考文献(maintenanceofc.elegans)中的方法进行。用于试验的线虫采用液体培养，酒精干预时的终浓度控制在2000±100条/ml。同期化后的线虫生长至l4期，完成幼虫阶段最后一次蜕皮进入成虫期时，加入浓度为0.6mm的fudr溶液，并使其终浓度为0.12mm，以抑制线虫产卵及卵的孵出。12h后，将其进行分组且试验组加入不同浓度的酒精，使酒精体积终浓度为1％-5％，以空白组(加入有与试验组加入的酒精等体积的无菌水)作为对照，每组设3个平行。在20℃下轻微震荡培养24h后将实验组分别吸取20μl于ngm空白板上(每个板上线虫数量为40条左右)，20℃放置5min后，体视显微镜下记录30s内每条线虫头部的摆动次数及咽部吞咽次数。观察并记录各组线虫在ngm空白板上的运动轨迹，收集波长和振幅指标，综合分析各组线虫的运动性能。
(2)线虫寿命的测定方法
线虫寿命的统计，参照文献(solisgm,petrascheckm.measuringcaenorhabditiseleganslifespanin96wellmicrotiterplates[j].journalofvisualizedexperimentsjove,2011,(49):e2496-e2496.)的方法，待线虫结束l4期时按上面的分组方法将培养有线虫的培养液分为6组，在96孔板中培养，每孔120μl，每孔大约20条线虫，重复8孔。封口膜封膜后置于20℃培养，分组当天及之后每隔两天统计线虫存活数，每周在无菌环境下打开封口膜换气一次并更换新的封口膜，直至孔内线虫全部死亡停止记录，进行线虫生存寿命分析。
(3)线虫生化指标的测定方法
总抗氧化能力采用商业试剂盒测定，样品处理依照试剂盒要求进行。氧自由基(ros)根据文献(smithjv,luoy.elevationofoxidativefreeradicalsinalzheimer'sdiseasemodelscanbeattenuatedbyginkgobilobaextractegb761.[j].journalofalzheimersdisease,2003,5(4):287-300.)采用h2dcfda荧光探针法测定。
(4)线虫体内酒精浓度的测定方法
线虫体内酒精浓度的测定，参照参考文献(alaimojt,davissj,songss,etal.ethanolmetabolismandosmolaritymodifybehavioralresponsestoethanolinc.elegans[j].alcoholismclinical&experimentalresearch,2012,36(11):1840-1850.)采用气相色谱法，并加以改进。
线虫在干预结束后，转移至离心管中，于冷冻离心机中4℃，2000转下，离心2min，去除培养液。用预冷m9缓冲液快速清洗虫体两遍，去除虫体上的op50菌液及其他杂质，然后用冷的无菌水清洗一遍。最后弃去上清后，用冷的无菌水将各组线虫定容至1ml，并用封口膜将离心管封口处理，防止气体挥发。再将封口后的离心管置于超声波清洗机中，冰水浴环境下进行超声破碎，直至无完整虫体，破碎完全。破碎后置于冷冻离心机中4℃，12000转，离心10分钟，提取线虫体内的酒精溶液，上清液即为提取液。
乙醇标曲体积终浓度为0.0005％、0.001％、0.002％、0.003％、0.004％，在乙醇标曲及线虫提取液中加入正丁醇作为内标，使内标体积终浓度为0.002％。标曲及线虫样品经0.22微米过滤膜过滤处理，待上机检测。