本发明涉及中药组合物领域，具体涉及一种治疗耐药细菌病组合物及其制备方法和应用。
背景技术：
细菌耐药性(resistancetodrug)又称抗药性，系指细菌对于抗菌药物作用的耐受性，耐药性一旦产生，药物的化疗作用就明显下降。鉴于目前严峻的细菌耐药性趋势，世界卫生组织发表了世界上最具耐药性的、最能威胁人类健康的“超级细菌”。根据危险程度的不同可以分为三类：“严重致命、高度致命、中度致命”三类，代表了我们所需要特异性抗生素的急迫程度。同样的，对产生广泛耐药的细菌分为3个级别，其中，级别1：严重碳青霉烯耐药性鲍氏不动杆菌、绿脓杆菌、肠杆菌；级别2：高度耐药性屎肠杆菌(万古霉素耐药性)；金黄色葡萄球菌(甲氧西林、万古霉素耐药性)；幽门螺杆菌(克拉霉素耐药性)；弯曲杆菌、沙门氏杆菌、淋球菌(喹诺酮耐药性)；级别3：中等耐药性肺炎双球菌、流感嗜血杆菌、和志贺氏杆菌。现实中实际产生广泛耐药的细菌未分级别的还有不少,如结核杆菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌等。
产生耐药菌的主要原因是耐药菌产生灭活(钝化)酶、抗菌药物作用靶位改变、改变细菌外膜通透性、细菌生物被膜的形成、交叉耐药性等。抗菌药物的不合理使用和过度使用是微生物耐药的主要原因。据报道，2000至2010年，用于人类的抗菌药物使用量增加了36％。原本用于治疗患病动物的抗菌药物，却在许多国家被广泛应用于农业、鱼类及海产品养殖，作为动物生长的促进剂或预防疾病。世界卫生组织(who)指出发达国家和发展中国家有越来越多的人感染了现有方法无法治疗的“超级细菌”。每年，全球约70万人死于耐药菌感染，大部分在发展中国家；最近的估计数字表明，到2050年，这个数字可能会上升到1000万，多于目前癌症死亡人数。
抗生素滥用不仅严重影响人类健康，也会导致经济损失。细菌耐药已经成为全球严峻的公共卫生问题，耐药性肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、屎肠球菌和志贺氏杆菌等，以及结核杆菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌等，都具有大的耐药性和难被治疗。越难治就越滥用抗生素，越滥用抗生素，耐药性菌就越多，问题就越严重，时刻危害着人类的健康。
技术实现要素：
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种治疗耐药细菌病组合物及其制备方法和应用。
本发明上述目的通过以下技术予以实现：
一种治疗耐药细菌病组合物，其包含下述重量份的下述组分：半边莲花200—400重量份、黄芩100—300重量份、x100—300重量份，其中x为檵木叶、牡荆花、地胆草花、救必应、丁香中的一种或多种。
优选地，所述组合物还包含辅料200—700重量份，所述辅料为糊精、葡萄糖中的一种或多种。
本发明还提供一种治疗耐药细菌病组合物的制备方法，其包括如下步骤：
s1、以乙醇溶液提取半边莲花和黄芩的混合物2次，每次1-2小时，过滤后合并滤液，并在60-80℃下减压浓缩成稠膏a，其中，每次提取所用的乙醇溶液的浓度为75％，每次提取所用的乙醇溶液的重量为所述半边莲花和黄芩的混合物的总重量的10-20倍；
s2、以乙醇溶液提取x2次，每次1-2小时，过滤后合并滤液，并在60-80℃下减压浓缩成稠膏b，其中，第一次提取所用的乙醇溶液的浓度为50％，第二次提取所用的乙醇溶液的浓度为30％，每次提取所用的乙醇溶液的重量为x的重量的8-12倍，所述x为选自檵木叶、牡荆花、地胆草花、救必应、丁香中的一种或多种；
s3、将所述稠膏a与所述稠膏b合并，得到稠膏c；以及
s4、将所述稠膏c与辅料配制成所述治疗耐药细菌病组合物。
优选地，步骤s4包括将所述辅料加入所述稠膏c，搅匀后经颗粒机制成湿颗粒，然后在60—80℃下干燥，整粒、分装、封口，以得到治疗耐药细菌病组合物颗粒剂。
优选地，所述步骤s1)中所述稠膏a的重量为所述半边莲花和黄芩的混合物的总重量的1/3-2/3；所述步骤s2)中所述稠膏b的重量为所述x的总重量的1/4-1/2；所述步骤s3)中所述稠膏c的重量为所述半边莲花、所述黄芩以及所述x的总重量的1/4-3/4。
本发明还提供一种上述组合物在制备用于治疗耐药细菌病的药物中的应用。
进一步的，所述耐药细菌病中的耐药细菌为耐药性肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、屎肠球菌、志贺氏杆菌、结核杆菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、或创伤弧菌。
本发明提供的组合物采用半边莲花、黄芩等中草药作为有效成分，其中，半边莲花味辛，性平，归心、小肠、肺经；利尿消肿，清热解毒，用于大腹水肿，面足浮肿，痈肿疔疮，蛇虫咬伤；现代用于抗溃疡，治腹泻作用；黄芩味苦、性寒，泻火祛湿，除湿热；现代化学和药理学研究表明：黄芩对痢疾杆菌、伤寒杆菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、溶血性琏球菌(a，b)等有抑制作用。
同时，在本发明提供的组合物中佐以檵木叶、牡荆花、地胆草花、救必应、丁香等，具有很好的抗菌、提高机体免疫力功能；该处方配伍既有中医的清热解毒、驱邪扶正之功，又有现代医学的抗菌、杀虫、调节免疫功能之效，具有维持肠道健康的功效，是治疗耐药细菌感染性疾病的良方，具有很好的抗耐药细菌感染性疾病的作用。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，下面结合具体实施方式做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。本发明中水提、醇提等操作及条件，除特别说明外，采用现有技术。
本发明的实施例提供一种治疗耐药细菌病组合物，其包含下述重量份的下述组分：半边莲花200—400重量份、黄芩100—300重量份、x100—300重量份，其中x为檵木叶、牡荆花、地胆草花、救必应、丁香中的一种或多种。
本发明提供的治疗耐药细菌病组合物中的各成分的药效简要介绍如下：
半边莲花
【性味与归经】味甘、性平，归心、肺、小肠经。
【功效】清热解毒；利水消肿。
【药理作用】
1、抑菌作用：半边莲煎液用平板挖沟法，对金黄色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌有抑制作用。
2、免疫调节作用：本品所含的多糖在体外可促进cona诱导的小鼠脾细胞淋巴细胞转化，其最适浓度为400r/ml。sc给药1周后可明显提高小鼠外周血淋巴细胞中酯酶阳性细胞的百分率，促进dncb诱导的迟发型变态反应。
黄芩
【性味与归经】味苦、性寒，归心、肺、胆、大肠经。
【功效】泻实火，除湿热。
【药理作用】
1、抗菌作用：对痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、溶血性琏球菌(a，b)、肺炎双球菌、白喉杆菌等有抑制作用。
2、抗病毒作用：黄芩煎剂25-100％浓度，体外试验对乙型肝炎病毒dna复制有抑制作用。
3、保肝、利胆、抗氧化作用。
檵木叶
【性味与归经】味苦，涩，性凉。归肝、胃、大肠经。
【功效】清热解毒，收敛，止血。
【药理作用】抗菌作用：体外试验对葡萄球菌、链球菌、伤寒及大肠杆菌等均有抑菌或杀菌作用。檵木叶主要含有没食子酸、鞣质、黄酮类(主要是槲皮素)。乙醇提取物对绿脓杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、肠炎杆菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌均有抑制作用，其抑菌活性成分可能为香豆素类及鞣质。
牡荆花
【性味与归经】味苦、性寒。归肺经。
【功效】解表化湿，祛痰平喘；解毒，祛风解表，除湿，杀虫，止痛。
【药理作用】
1、抗菌作用：牡荆茎叶水煎剂在体外对金黄色葡萄球菌和炭疽杆菌有显著抗菌作用，对大肠杆菌、乙型链球菌、白喉杆菌、伤寒杆菌、绿脓肝菌和痢疾杆菌等也有一定抗菌作用。
2、增强机体免疫功能：牡荆挥发油0.35ml/(kg·d)灌胃，连续6d，有增强腹腔巨噬细胞对鸡红细胞吞噬作用的趋势。主成分丁香烯能增加血清igg水平，表明有增强体液免疫的作用。
地胆草花
【性味与归经】味苦、性凉，归胃经，大肠经。
【功效】清热解毒，利尿消肿，凉血。
【药理作用】
具有较强的抗菌作用，水煎液和醇提液均对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等具有抑制作用。常用于各种炎症性疾病：感冒，急性扁桃体炎，咽喉炎，眼结膜炎，流行性乙型脑炎，百日咳，急性黄疸型肝炎，肝硬化腹水，急、慢性肾炎，疖肿，湿疹。
救必应
【性味与归经】味苦，性凉。归肺；肝；大肠经
【功效】清热解毒，利湿，消肿止痛。
【药理作用】
1、抗菌作用：煎剂试管内能抑制金黄色葡萄球菌，溶血性链球菌及痢疾(弗氏)、伤寒、绿脓杆菌。
2、止血作用和对平滑肌的影响：化学成分树皮含黄酮甙、酚类、鞣质、三萜甙，并分离出救必应酸
丁香
【性味与归经】性辛，味温，归肺、脾、胃、肾四经。
【功效】温中、暖肾、降逆。
【药理作用】
1、抗菌、抗病毒：丁香油和丁香酚有广谱的抗菌作用。丁香中的鞣花单宁有抗单纯疱疹病毒作用。
2、抗真菌：其水煎剂或乙醇浸出液有广谱的抗真菌作用，或杀死作用。丁香酚对白色念珠菌和新型隐球菌有显著的杀灭作用。
3、杀灭寄生虫：其水提物能杀死犬和猪蛔虫。丁香油的作用较水煎剂的作用强。
4、杀灭滴虫：丁香油、丁香酚和乙酰丁香酚对毛滴虫具有很强的杀死作用。
本发明提供的组合物采用半边莲花、黄芩等中草药作为有效成分，其中，半边莲花味辛，性平，归心、小肠、肺经；利尿消肿，清热解毒，用于大腹水肿，面足浮肿，痈肿疔疮，蛇虫咬伤；现代用于抗溃疡，治腹泻作用；黄芩味苦、性寒，泻火祛湿，除湿热；现代化学和药理学研究表明：黄芩对痢疾杆菌、伤寒杆菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、溶血性琏球菌(a，b)等有抑制作用。
同时，在本发明提供的组合物中佐以檵木叶、牡荆花、地胆草花、救必应、丁香等，具有很好的抗菌、提高机体免疫力功能；该处方配伍既有中医的清热解毒、驱邪扶正之功，又有现代医学的抗菌、杀虫、调节免疫功能之效，具有维持肠道健康的功效，是治疗耐药细菌感染性疾病的良方，具有很好的抗耐药细菌感染性疾病的作用。
在本发明的一些实施例中，所述组合物中还可以包含辅料200—700重量份。可以理解的是，辅料的主要作用为赋形、稀释和防腐等，本发明对于辅料的种类没有特殊限制，其可以为各种常用的辅料，例如，在本发明的一些实施例中，所述辅料为糊精、葡萄糖中的一种或多种。
同时，本发明还提供了一种治疗耐药细菌病组合物的制备方法，其包括如下步骤：
s1、以乙醇溶液提取半边莲花和黄芩的混合物2次，每次1-2小时，过滤后合并滤液，并在60-80℃下减压浓缩成稠膏a，其中，每次提取所用的乙醇溶液的浓度为75％，每次提取所用的乙醇溶液的重量为所述半边莲花和黄芩的混合物的总重量的10-20倍；
s2、以乙醇溶液提取x2次，每次1-2小时，过滤后合并滤液，并在60-80℃下减压浓缩成稠膏b，其中，第一次提取所用的乙醇溶液的浓度为50％，第二次提取所用的乙醇溶液的浓度为30％，每次提取所用的乙醇溶液的重量为x的重量的8-12倍，所述x为选自檵木叶、牡荆花、地胆草花、救必应、丁香中的一种或多种；
s3、将所述稠膏a与所述稠膏b合并，得到稠膏c；以及
s4、将所述稠膏c与辅料配制成所述治疗耐药细菌病组合物。
可以理解的是，用乙醇溶液进行提取的操作方法及原理为本领域技术人员所公知，本发明对此不再赘述。
在本发明提供的治疗耐药细菌病组合物的制备方法中，所述x为选自檵木叶、牡荆花、地胆草花、救必应、丁香中的一种或多种。可以理解的是，在步骤s2)中，x可以有多种选择，其可以为檵木叶、牡荆花、地胆草花、救必应、或丁香中的一种，也可以为檵木叶、牡荆花、地胆草花、救必应、或丁香中的两种或多种。同样的，当x为檵木叶、牡荆花、地胆草花、救必应、或丁香中的两种或多种时，可以分别将x进行提取，过滤并浓缩后合并稠膏，得到稠膏b，也可以是将x一起进行乙醇提取，过滤并浓缩至稠膏b。
可以理解的是，减压浓缩的具体操作方法及原理为本领域技术人员所公知，本发明对此不再进行赘述，本发明可以采用本领域常用的减压浓缩方法。
进一步的，在本发明的一些实施例中，步骤s4包括将所述辅料加入所述稠膏c，搅匀后经颗粒机制成湿颗粒，然后在60—80℃下干燥，整粒、分装、封口，以得到治疗耐药细菌病组合物颗粒剂。可以理解的是，湿颗粒的制备方法、整粒、分装及封口的方法为本领域技术人员所述公知，本发明对此不再进行赘述。
进一步的，在本发明的一些实施例中，所述步骤s1)中所述稠膏a的重量为所述半边莲花和黄芩的混合物的总重量的1/3-2/3，例如1/2。所述步骤s2)中所述稠膏b的重量为所述x的总重量的1/4-1/2，例如1/3。所述步骤s3)中所述稠膏c的重量为所述半边莲花、所述黄芩以及所述x的总重量的1/4-3/4，例如1/3。
另外，本发明还提供一种上述组合物在制备用于治疗耐药细菌病的药物中的应用。
具体的，在本发明的一些实施例中，所述耐药细菌病中的耐药细菌为耐药性肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、屎肠球菌和志贺氏杆菌等，以及结核杆菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、或创伤弧菌。
下面通过实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
实施例1
一种治疗耐药细菌病组合物，其是由半边莲花、黄芩、檵木叶、救必应、丁香、糊精、葡萄糖按下述重量份配比制备而成的药剂：
以下详细说明本实施例的治疗耐药细菌病组合物的制备工艺：
(1)将半边莲花、黄芩一起，以10倍量75％乙醇提取2次，每次1小时，滤过后合并滤液，回收乙醇，在75℃减压浓缩成稠膏a(其中，药材与稠膏a之间的重量比为2：1)。
(2)将檵木叶、救必应、丁香分别以8倍量50％乙醇、30％乙醇提取2次，每次1小时，滤过后合并滤液，在75℃下减压回收乙醇、浓缩成稠膏b。
(3)合并稠膏a和稠膏b，得到稠膏c(其中，药材的总重量与稠膏c的重量比为3：1)，备用。
(4)制软材：将葡萄糖及糊精加入稠膏c，搅匀得软材。
(5)制粒：将所述软材经颗粒机制得湿颗粒，然后在75℃下干燥，整粒、分装，封口，即得到治疗耐药细菌病组合物颗粒剂。
实施例2
一种治疗耐药细菌病组合物，其是由半边莲花、黄芩、檵木叶、牡荆花、地胆草花、糊精、葡萄糖按下述重量份配比制备而成的药剂：
以下详细说明本实施例的治疗耐药细菌病组合物的制备工艺：
(1)将半边莲花、黄芩一起，以10倍量75％乙醇提取2次，每次1小时，滤过后合并滤液，回收乙醇，在75℃减压浓缩成稠膏a(其中，药材与稠膏a之间的重量比为2：1)；
(2)将檵木叶、牡荆花、及地胆草花分别以8倍量50％乙醇、30％乙醇提取2次，每次1小时，滤过后合并滤液，在75下℃减压回收乙醇、浓缩成稠膏b；
(3)合并a和稠膏b，得到稠膏c(其中，药材的总重量与稠膏c的重量比为3：1)，备用。
(4)制软材以及(5)制粒的工艺同实施例1。
体外抑菌实验
1)最低抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration,mic)实验
将本发明提供的组合物以二倍梯度稀释配制成多份样品液，分别加入等量金黄色葡萄球菌；大肠杆菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌、致泻大肠埃希菌、副溶血弧菌、沙门菌、福氏痢疾志贺氏菌、阴沟肠杆菌、创伤弧菌菌液中，密封，在28℃培养24小时，肉眼观察培养物最低无细菌生长者，即为该组合物的mic(mg/ml)值。
试验结束后记录各菌液中组合物的mic(mg/ml)值，其中，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌、致泻大肠埃希菌、副溶血弧菌、沙门菌、福氏痢疾志贺氏菌、阴沟肠杆菌、创伤弧菌的mic(mg/ml)值分别0.78，3.13，0.29，6.25，12.50，0.78，12.50，12.50，1.56，0.78。
2)体外抑耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)实验
mrsa感染的死亡率高，已成为全球关注的严重感染性疾病。几乎所有mrsa对现有的β-内酰胺类、头孢菌素类、大环内酯类、喹喏酮类等抗生素均不敏感，万古霉素等糖肽类抗生素成为治疗mrsa感染的最后一道防线，一旦万古霉素耐药成为普遍现象，临床将面临无药可用的严重局面。
根据美国临床实验室标准化协会(clinicalandlaboratorystandardsinstitute，clsi)规定，以苯唑西林抗生素为标准，采用k-b纸片法测定抑菌环直径，抑菌圈≤11mm为耐药，≥17mm为敏感；采用肉汤稀释法测定最低抑菌浓度，mic<2μg/ml为敏感，>4μg/ml为耐药。
mic实验方法为：把本发明提供的组合物以二倍梯度稀释配制样品液，分别加入等量金黄色葡萄球菌和mrsa，密封，28℃培养24小时，肉眼观察培养物最低无细菌生长者，即为该提取物的mic(mg/ml)值。实验结果为：金黄色葡萄球菌、mrsa的mic(mg/ml)值分别0.39，0.39。结果表明本发明组合物对金黄色葡萄球菌、抑菌效果是一致的，即mrsa本发明的组合物没有耐药性。
体内抗菌活性试验
将小鼠腹腔注射最低致死量(mld)浓度菌悬液给各组小鼠(除正常组外)腹腔注射造成感染，分别为本发明的组合物组、黄连组、正常组及模型组。每天按剂量对小鼠进行灌胃，连续灌胃3d。于第3天全部药物组灌胃给药1h后，以预试验所得的各菌种注射量0.5/20(ml/g)，感染后6h后再给药1次。感染后每天继续给存活小鼠灌胃给药，直至实验结束。
观察记录感染后根据实验要求观察动物的食欲、活动情况以及病情变化。死亡时及时解剖，肉眼观察体表有无病变，皮肤组织及淋巴结有无水肿、出血及肿大等病变，腹腔液多少及性质、胸腔器官及胸腔液有无变化。统计感染后3天内动物死亡情况，记录死亡例数及死亡时间，第5天处死所有动物，整个实验周期为5天。
感染后小鼠出现的共同临床症状为：接种初期，小鼠皆出现精神不振，萎靡，眼结膜粘连，活动减少，采食、饮水减少等症状。
相比而言，各给药组小鼠的食欲与活动情况要强于模型组。后期病鼠极度衰弱，眼为干酪样封闭，直至死亡。解剖后各组小鼠组织器官的主要病变包括接种部位的脓肿、腹膜腔粘液、有恶臭、肺脏淤血等。
在处死所有动物前，计算各组保护率(死亡率＝每组死亡动物数÷每组动物总数×100％)；记录感染后3天(72h)内各组小鼠的死亡时间，均作统计学分析。
实验结果为：在死亡率与存活时间方面：(1)正常组、各药物组与模型组相比，差异均有统计学意义(p<0.01)。(2)本发明提高的组合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、福氏痢疾志贺氏菌感染小鼠保护作用效果最佳。(3)与阳性对照组相比，在死亡率、生存时间方面，效果显著优于黄连。
动物体内对mrsa的抑制作用研究
接种初期小鼠皆出现精神不振，萎靡，眼结膜粘连，活动减少，采食、饮水减少。相比而言，各给药组小鼠的食欲与活动情况要强于模型组。后期病鼠极度衰弱，眼为干酪样封闭，直至死亡。解剖后各组小鼠组织器官的主要病变包括接种部位的脓肿、腹膜腔粘液、有恶臭、肺脏淤血等。
在处死所有动物前，计算各组保护率(死亡率＝每组死亡动物数÷每组动物总数×100％)，记录感染后3天(72h)内各组小鼠的死亡时间，均作统计学分析：各组间死亡率比较采用卡方检验，存活时间比较采用配对t检验。
实验测得药物对mrsa感染模型小鼠的保护作用，在死亡率与存活时间方面：(1)正常组、各药物组与模型组相比，差异均有统计学意义(p<0.01)。(2)本发明的组合物与阳性对照组相比，在死亡率、生存时间方面，效果优于黄连。
结果证明：本发明提供的组合物能显著降低mrsa感染模型小鼠的死亡率，并能显著延长存活时间。
体内抗菌活性试验及动物体内对mrsa的抑制作用研究的结果表明，在体内给本发明的组合物8.0g/kg剂量，动物体内对金黄色葡萄球菌和mrsa感染模型小鼠均能起到明显的保护作用，可显著降低死亡率和延长存活时间。即mrsa本发明组合物没有耐药性。
急性毒性实验
以健康昆明种小鼠为试验动物，实验前禁食(不禁水)12h后，分别给予1.2g(生药)/ml(最大浓度)的本发明组合物，每4h给药一次，每天给药3次；连续观察一周，记录受试小鼠有无明显异常和出现毒性反应的时间、症状表现和持续时间；观察是否有死亡例，及时进行大体尸解，观察脏器有无明显病理改变；每天称量动物体重；试验结束后处死所有实验动物，并进行尸解。计算各受试药物的日最大给药量，评价其安全性。
实验过程中未见死亡，无法测出ld50，故按照《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》规定进行最大给药量的试验测定。小鼠1天内灌胃给本发明组合物累计剂量为108g/kg(最大给药量＝1.2g(生药)/ml×0.3ml×3/10g×100＝108g(生药)/kg)，实验未观察到明显毒性反应，初步证明小鼠在该剂量下口服给药安全性较高。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。