一种碳点载药体系的制备方法与流程

本发明涉及一种载药体系的制备方法，特别是碳点载铁紊乱疾病相关药物的制备方法，属于生物科学技术领域。

背景技术

铁是人体必需的微量元素，铁缺乏或铁过载都会导致人体的疾病状态。铁过载会导致过氧化损伤，提高患癌率，研究表明铁过载与多种癌症的发生、发展有关。癌症是当今威胁人类健康和生存质量的一大杀手，也是致死的主要原因之一。目前临床的治疗方法包括手术切除、化学治疗、放射治疗、中西医结合疗法等。在传统治疗癌症的化疗过程中，盐酸阿霉素是一种常用的广谱抗癌药物，不仅可以杀死癌细胞，也可以杀死健康细胞，有很大的副作用。所以，寻找一种无毒的载体，能运载抗癌药物到达指定的癌细胞部位进行释放，以此达到靶向治疗的目的非常重要。人体铁缺乏会影响生长发育，甚至会引起贫血等疾病。柠檬酸铁是一种常用的补铁剂，但是其口感差、对胃肠道消化系统有刺激、并且生物利用率低，难以达到有效补铁。所以，寻找一种无毒的，能克服柠檬酸铁应用缺点的载体也是非常重要的。

碳是日常生活中最常见的材料，也是人体的重要组成元素。碳点是一种新型的、粒径小于10nm的碳纳米材料，具有粒径小，易修饰，生物相容性好，无毒性和优良的光学性质，已被成功用于生物成像、催化、生物传感、药物输送等多个领域。因此，将碳点用作药物载体，制备成碳点载药体系，用来治疗铁紊乱相关疾病如癌症和缺铁性贫血等，预期会缓解单独药物利用的弊端。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种碳点载药体系的制备方法，所得到的cds-dox分别在不同ph值的缓冲溶液中具有缓释性，且释放率依次降低，克服了盐酸阿霉素作为抗癌药物有毒副作用和柠檬酸铁口感差、生物利用率低的缺陷。

本发明解决其技术问题采取的技术方案是这样的：

本发明利用牡丹花粉为原料、尿素为修饰试剂，采用水热法制备得到碳点。将所得碳点与dox或fac以不同的质量比进行偶联反应，优化得到高载药量的cds-dox和cds-fac的制备条件。并分别研究了cds-dox和cds-fac在不同ph值介质或胃肠液的体外释放情况。

具体的，本发明的碳点载药体系的制备方法包括以下步骤：

(1)按照质量比称取牡丹花粉和尿素，m牡丹花粉：m尿素＝1:1～1:5，溶于水中，充分搅拌后转至聚四氟乙烯反应釜中，200℃下水热反应10小时，冷却至室温，得到棕黑色溶液，过滤、离心，除去大颗粒杂质，静止、取上清液，透析除去游离的尿素，所得溶液即碳点，记为cds；

(2)取一定体积的cds溶液于烘箱烘干，称量所得到的固体碳点的质量，计算出碳点溶液的质量浓度；

(3)配制一定质量浓度的盐酸阿霉素(dox)溶液，然后取步骤(1)得到的cds溶液与dox溶液，按两种溶液中纯物质质量比mcds:mdox＝(1：0.5)～(1：3)进行溶液混合，在振荡器上避光反应，透析除去游离的盐酸阿霉素，得到cds-dox；

或者，将步骤(1)得到的cds溶液与一定质量浓度的柠檬酸铁(fac)溶液，按两种溶液中纯物质质量比mcds:mfac＝(1：0.5)～(1：2)进行溶液混合，然后在振荡器上避光反应，透析除去游离的柠檬酸铁，得到cds-fac。

将上述方法制得的碳点在透射电镜下观察，发现cds为实心圆球状，粒径约为5nm(图1)。

将cds与dox在避光条件下进行偶联反应，测试产物(cds-dox)的紫外-可见吸收光谱(图2)，从图2中看到，cds在波长230–240nm处有特征吸收峰，这是cds中的c＝c的π-π*伸缩振动。dox在488nm处显示出特征吸收峰。当cds与dox结合后，cds-dox在510nm范围处出现了吸收峰，与dox的特征峰相比，发生了红移，这是因为形成了cds-dox，cds与dox之间有相互作用。

为了研究碳点载药体系cds-dox的药物释放特征，申请人进行了体外释放研究。将制得的cds-dox溶液放入透析袋(mwco1000)，再分别放入80ml三种不同ph值分别为7.4、6.5和5.0的pbs缓冲溶液中，置于37℃恒温振荡器中，研究药物的释放。间隔一定的时间间隔取出1ml释放介质，同时补入1ml相同的释放介质。以释放介质为空白对照，测定一定时间cds-dox中dox的释放量。结果发现，随着介质酸度的增加，dox释放量增加。释放80小时后，ph＝5.0时，dox释放约69.1％；而ph＝7.4时仅释放了14.7％，ph＝6.5时释放了22.7％(图3)；这说明cds-dox具有缓释性。由于人体内正常细胞呈中性，而癌细胞表面呈酸性，因此，说明cds-dox同时具有癌细胞靶向释放的特征。

将cds与fac在避光条件下进行偶联反应，测试产物(cds-fac)的紫外-可见吸收光谱(图4)，从图上可以看到，cds在波长240nm处有吸收峰，fac在260nm处有特征吸收峰。当cds与fac结合后，形成的cds-fac在260nm-270nm之间显示出特征吸收，fac相比，吸收峰位置发生了红移，并且变宽，这是因为fac连在cds表面，二者之间发生了相互作用。

为了研究碳点载药体系cds-fac的药物释放特征，申请人进行了体外释放研究。将制得的cds-fac和同体积的模拟胃液(ph＝1.3，胃蛋白酶)或肠液(ph＝7.4，胰蛋白酶)混合，注入透析袋(mwco1000)，再放入装有80mlph＝1.3盐酸溶液(或ph＝7.4pbs溶液)烧杯中，用锡箔纸密封烧杯口，置于37℃恒温振荡器中，研究药物的释放。间隔一定的时间间隔取出1ml释放介质，同时补入1ml相同的释放介质。以释放介质为空白对照，测定一定时间cds-fac中fac的释放量。结果发现，cds-fac在胃液中三小时内的释放率为13.37％，而肠液中的释放量达95％，cds-fac在肠液中的释放明显快于胃液(图5)，这说明cds-fac可减轻fac对胃的刺激作用，同时有利于小肠吸收，适合口服用药。

本发明取得的有益效果如下：

利用上述方法制得的cds-dox载药量高，制备方法简单，对肿瘤细胞有靶向释放作用，可提高dox的药效，降低毒副作用。所制得的cds-fac同样具有载药量高，制备方法简单的优点，对于其在模拟胃液、肠液中的释放，肠液中释放量远大于胃液，说明制备的cds-fac中的柠檬酸铁可被小肠大量吸收，适用于口服用药。

附图说明

图1是碳点(cds)的透射电镜图(tem)。

图2是碳点-盐酸阿霉素载药体系(cds-dox)的紫外-可见吸收光谱图。

图3是cds-dox在不同pbs缓冲溶液(ph分别为5.0，6.5，7.4)中的释放曲线。

图4是碳点-柠檬酸铁载药体系(cds-fac)的紫外-可见吸收光谱图。

图5是cds-fac在模拟胃肠液中的体外释放曲线。

具体实施方式

以下实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1一种由牡丹花粉制备碳点(cds)的方法

将采摘的牡丹花瓣放入电热鼓风干燥箱中，80℃烘干，将烘干的花瓣研磨成花粉，密封保存。按照m牡丹粉：m尿素＝1:3称取牡丹粉和尿素，放入烧杯中。加入10ml水，磁力搅拌器搅拌，均匀后，转入聚四氟乙烯内胆中。然后将反应釜放入电热鼓风干燥箱中200℃加热10小时，得到棕黑色溶液。过滤除去大颗粒杂质，4000rmp/min离心10分钟，静止数小时后取上清液，透析6小时，除去多余的修饰试剂尿素，即可得到碳点。取一定体积的cds溶液于80℃烘箱烘干，称量所得到的固体碳点的质量，求出碳点溶液的质量浓度。

实施例2一种由牡丹花粉制备碳点-阿霉素(cds-dox)载药体系的方法(载药量37.2％)

(1)碳点-阿霉素(cds-dox)载药体系的制备

所用碳点(cds)由实施例1中的方法得到。按质量比mcds：mdox＝1:2进行溶液配制，置于振荡器上避光反应12小时，透析除去游离的dox，制得cds-dox。

(2)碳点-阿霉素(cds-dox)载药体系载药量计算

分别绘制cds和dox在波长330nm和488nm处的标准曲线，将制备好的cds-dox溶液稀释10倍，用紫外分光光度计测其在330nm和488nm处的吸光度，根据标准曲线计算浓度，根据下面公式计算载药量：

实施例3一种由牡丹花粉制备碳点-柠檬酸铁(cds-fac)载药体系的方法(载药量54.0％)

(1)碳点-柠檬酸铁(cds-fac)载药体系的制备

所用碳点(cds)由实施例1中的方法得到。按质量比mcds：mfac＝1:1进行溶液配制，在振荡器上避光反应12小时，透析除去游离的fac,制得cds-fac。

(2)碳点-柠檬酸铁(cds-fac)载药体系载药量计算

绘制fac在波长260nm处的标准曲线，取上述透析后透析袋外的释放介质，用紫外分光光度计测其在260nm处的吸光度，根据标准曲线计算浓度，根据下面公式计算载药量：

说明：本发明中使用的化学物质的缩写式如下(物质的化学名称)：

cds：碳点

dox：盐酸阿霉素

fac：柠檬酸铁

cds-dox：碳点-盐酸阿霉素载药体系

cds-fac：碳点-柠檬酸铁载药体系。