木犀草素在制备缓解胰岛beta细胞内质网应激的药物中的用途的制作方法

本发明涉及医药领域,具体涉及一种化合物制备缓解内质网应激的药物中的用途。

背景技术：

内质网是真核细胞内蛋白质合成、脂质生成和钙离子贮存的主要场所。多种蛋白需要在内质网中折叠、组装、加工、包装及向高尔基体转运，这是一个需要细胞精确调控的过程。内质网含有一种免疫球蛋白结合蛋白和蛋白二硫键异构酶，可以帮助与促进蛋白质的正确折叠。不能正确折叠的畸形肽链或未组装成寡聚体的蛋白质亚单位，无论是在内质网腔内还是在内质网膜上，一般不能进入高尔基体，主要通过泛素依赖性降解途径被蛋白酶体所降解。当内质网中未折叠或错误折叠蛋白累积，就会造成内质网应激，引发未折叠蛋白质反应。

内质网应激是指细胞受到内外因素的刺激时，内质网形态、功能的平衡状态受到破坏后发生分子生化的改变，蛋白质加工运输受阻，内质网内累积大量未折叠或错误折叠的蛋白质，细胞会采取相应的应答措施，缓解内质网压力，促进内质网正常功能的恢复。引发内质网应激的因素很多，缺血低氧、葡萄糖或营养物匮乏、钙离子紊乱等可造成急性应激损伤；而病毒感染、分子伴侣或其底物的基因突变等能引发慢性应激损伤。

胰腺β细胞是专一产生和调节胰岛素分泌的细胞，自身具有高度发达的内质网。内质网相关蛋白在β细胞中均有较高表达，是对内质网应激最敏感的组织细胞之一。胰腺β细胞是专一产生和调节胰岛素分泌的细胞，自身具有高度发达的内质网。当血糖增高时，胰腺β细胞分泌胰岛素，同时胰岛素的增加激活了β细胞的内质网合成胰岛素原。当进入内质网腔内胰岛素生理负荷和内质网内折叠能力之间不平衡或是内质网ca²⁺耗竭不能维持β细胞的稳态时，导致内质网应激发生，因而造成对β细胞的毒性，伴随β细胞死亡和胰岛素分泌降低，进而产生糖尿病。

本发明涉及的化合物木犀草素(luteolin)是一种天然黄酮类化合物，在自然界中分布广泛，因最初是从木犀草科木犀草属草本植物木犀草的叶、茎、枝中分离出而得名，可从多种天然药材、蔬菜果实中分离得到。目前发现主要存在于金银花、菊花、荆芥、白毛夏枯草、洋蓟、紫苏属、黄芩属、裸花紫珠等天然药材中，以及芽甘蓝、洋白菜、菜花、甜菜、椰菜、胡萝卜、芹菜、甜椒、辣椒、落花生等蔬菜果实中，其它如橄榄油和红酒等植物产品以及野凤仙花、百里香草、唇形科植物全叶青兰草、筋骨草等也含有木犀草素。对于本发明涉及的木犀草素在制备治疗或者缓解胰岛素分泌细胞的内质网应激药物中的用途属于首次公开，而且其对由毒胡萝卜素(thapsigargin,thap)诱导的胰岛素分泌细胞内质网应激具有良好的效果，不存在由于其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，极有可能被开发成治疗或缓解2型糖尿病的药物。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种木犀草素，即式i所示化合物在作为制备治疗或缓解内质网应激药物中的应用，木犀草素能够有效地抑制thap对ins-1细胞的毒性作用，该作用呈浓度依赖性，而且木犀草素本身对细胞毒性很小，可进一步开发为治疗内质网应激的药物，具有广泛的应用前景。

所述化合物木犀草素结构如式i所示：

本发明一个方面提供了木犀草素作为内质网应激的抑制剂的用途。

本发明另一个方面提供了木犀草素作为制备治疗内质网应激的药物中的用途。

本发明另一个方面提供了木犀草素作为制备抑制毒胡萝卜素的毒性的药物用的用途。

本发明另一个方面提供了木犀草素作为抑制内质网应激导致的细胞凋亡的的药物中的用途。

本发明另一个方面提供了木犀草素在制备内质网应激导致的疾病中的药物中的用途。

所述内质网应激导致的疾病选自糖尿病，阿尔兹海默症，2型糖尿病。

本发明再一个方面提供了一种治疗内质网应激的药物，其中以木犀草素作为活性成分。

附图说明

图1为不同浓度的木犀草素对ins-1存活率的影响。

图2为木犀草素抑制由thap诱导的细胞毒性作用的结果。

图3为木犀草素处理thap诱导erstress细胞后，相关mran水平结果。

图4为木犀草素处理thap诱导细胞蛋白水平。

具体实施方式

实验中ins-1细胞(大鼠胰岛素瘤细胞)的为本科室所有；mtt购自碧云天生物技术研究所；胎牛血清购自美国gibico公司；细胞培养板购自美国康宁公司；rpmi1640培养基购自美国gibico公司；cck8购自东仁化学科技(上海)有限公司。

实施例1、木犀草素对ins-1细胞的毒性实验：

实验步骤如下：

1、接种ins-1细胞：用含10％(v/v)胎牛血清的rpmi1640培养基配成单个细胞悬液，以每孔100000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积100μl；

2、培养ins-1细胞：在37℃，5％(v/v)co2培养条件下培养24小时；

3、加入木犀草素：吸弃每个孔中的培养基，向各个孔加入100μl用10％(v/v)胎牛血清的rpmi1640培养基稀释成相应浓度的木犀草素，对照孔加入不含药物的10％(v/v)胎牛血清的rpmi1640培养基100μl；

4、呈色：培养24小时后，每孔加5mg/mlmtt溶液10μl，在37℃，5％(v/v)co2培养条件下继续培养4小时，然后加入dmso，至普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶解；

5、测量与计算：在570nm测定吸收值，木犀草素不同浓度下的细胞的存活率为该浓度下细胞吸光度值比上对照孔的吸光值，再乘以100％。

实验结果：参见图1，不同浓度的木犀草素对ins-1存活率基本没有影响，显示出木犀草素毒性较低。

实施例2、木犀草素抑制毒胡萝卜素(thap)对ins-1细胞的毒性作用实验：

实验步骤如下：

1、接种ins-1细胞：用含10％(v/v)胎牛血清的rpmi1640培养基配成单个细胞悬液，以每孔100000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积100μl；

2、培养ins-1细胞：在37℃，5％(v/v)co2培养条件下培养24小时；

3、加入木犀草素和thap：吸弃每个孔中的培养基，向各个孔加入100μl用10％(v/v)胎牛血清的rpmi1640培养基稀释成相应浓度的木犀草素，再加入0.5mmthap,阳性组为单独加0.5mm的thap,对照孔加入不含药物的10％(v/v)胎牛血清的rpmi1640培养基100μl；

4、呈色：培养24小时后，每孔加cck8溶液10μl，在37℃，5％(v/v)co2培养条件下继续培养1-4小时，

5、测量与计算：在450nm测定吸收值，木犀草素不同浓度下对thap的抑制作用为该浓度下细胞吸光度值比上对照孔的吸光值，再乘以100％。

实验结果：参见图2，单独组的thap可以降低细胞活力，降至45％，加入木犀草素后可以抑制这种作用，而且随着木犀草素浓度的升高，抑制thap的作用越强，细胞活力越高，显示木犀草素可以抑制由thap诱导的内质网应激作用。

实施例3、木犀草素对thap诱导的内质网应激相关信使rna的抑制试验

1、收集细胞总rna：6孔细胞培养板每孔加入1mltrizol试剂(ambion)，室温放置5分钟后，吸取上清液至1.5mleppendorf管；每管加0.2ml氯仿，震荡，室温孵育15分钟，4℃12000rpm离心15分钟，吸取上层液相转入另一个1.5mleppendorf管；加入0.5ml异丙醇，震荡，室温孵育10分钟，4℃12000rpm离心10分钟；吸弃上清，加入75％(v/v)乙醇1ml，洗涤沉淀，4℃12000rpm离心10分钟，吸弃上清；室温下晾干使之变透明；加入depc处理双蒸水20μl溶解rna，-80℃保存备用；紫外分光光度计检测260/280吸光度比值，计算rna浓度。

2、将rna逆转录为cdna：反应体系：rna1mg，5×primescriptrtmastermix(takara)4μl，depc处理的三蒸水至总体积20μl。小心混匀后37℃15min，85℃5秒。

3、实时荧光定量pcr检测各样品的atf4、xbp1s、bip、chop的rna水平：反应体系(10μl)：cdna模板1μl，qpcrmastermix(promega)5μl，正反引物0.4μl，depc处理的三蒸水3.2μl。混匀后，95℃10分钟预变性，95℃15秒，60℃1分钟(40个循环)。

各目标rna的正反引物

oligonamesequence(5'to3')

denv2eproteinfgaggggagcgaagagaatgg

denv2eproteinrgccccatagattgctccgaa

denv2ns1fggcatttgtggaatccgctc

denv2ns1ragagcattttcgctttgccc

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gapdhrcttcccattctcggccttg

实验结果：参见图3，thap诱导下，内质网应激的相关信使rna上调，木犀草素处理后，erstress的相关mran(atf4、xbp1s、bip、chop)水平下降，并具有浓度依赖性。在10μm浓度下显著降低了atf4、xbp1s、bip、chop的mrna的水平，显示其具有缓解内质网应激的能力。

实施例4、木犀草素对thap诱导ins-1内质网应激的相关蛋白质表达试验

1、收集细胞总蛋白：ins-1细胞用木犀草素和thap处理后，24h提蛋白：冷pbs洗细胞，6孔板每孔加入ripa裂解液加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。

2、检测样品蛋白浓度：蛋白标准品用双蒸水稀释至0，0.0008，0.0016，0.0032，0.004，0.006，0.008mg/ml的梯度浓度；取蛋白标准品和蛋白样品各2.5μl加入到24孔板中，每孔加入1×g250工作液1.5ml，使每孔终体积为2.5ml，室温震荡3分钟，用酶标仪测定每孔570nm吸光；根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。处理数据，样品加入相应体积的ripa裂解液和上样缓冲溶液使每个样品蛋白浓度一致。100℃变性5min，-20℃保存备用。

3、蛋白免疫印迹检测木犀草素和thap处理后的凋亡相关蛋白的表达差异：10％sds聚丙烯酰胺凝胶的配置：按顺序加入各种试剂，配置10％的分离胶迅速在玻璃间隙灌注，流出灌注浓缩胶所需的时间(约梳子下方下缘的0.8cm)，迅速在分离胶上覆盖一层无水乙醇，待分离胶聚合后，倒去无水乙醇层，用滤纸吸干，继续灌注浓缩胶，插上梳子。电泳：接通电源，起始用80v恒压进行电泳，待染料前沿进入分离胶后，再改为120v，根据预染蛋白marker的分离程度和目标蛋白的分子量确定电泳时间，一般跑75min左右。

4、转膜：从玻璃板中取出凝胶，剪切凝胶大小的pvdf膜，并在甲醇中浸泡1min，再用转移缓冲液(1*tris/glycinebuffer，biorad)浸泡5min。将凝胶，滤纸，pvdf膜都浸泡在转移液中，按以下顺序安装转膜装置：负极--棉垫--滤纸--凝胶--pvdf膜--滤纸--棉垫--正极，上述物品逐一叠放，准确对齐。将转膜装置置于转膜盒内，确认电极无误，加入转膜液至覆盖整个转膜装置，转膜盒及上方均用冰块覆盖，接通电源，100v恒压转膜70min左右，结束后，取出pvdf膜。

5、蛋白封闭：将pvdf膜置于封闭液中，室温摇床浸泡1h，以封闭非特异性抗原。封闭后，tbs/tt室温摇床洗膜3次，每次5min接着孵育一抗。

6、一抗杂交：将pvdf膜蛋白面向上置于小盒子内，加入chop(cellsignaling)、txnip(cellsignaling)、cleavedcaspased3(cellsignaling)一抗的tbs/t配置的5％(w/v)脱脂牛奶缓冲液，4℃摇床过夜。pbst室温摇床洗膜六次，每次5min。将pvdf膜蛋白面向上置于小盒子内，加入含有二抗(兔抗或鼠抗，proteintech)的tbs/t配置的5％(w/v)脱脂牛奶缓冲液，室温摇床1小时。pbst室温摇床洗膜六次，每次5min。

7、化学发光显影：按比例均匀加入ecl显影液a/b液(cst)，将pvdf膜浸泡在发光液中，反应2min。取出pvdf膜，置于暗盒中，暗室曝光，放置x光底片，曝光，取出显影，晾干胶片，记录，保存。

实验结果：参见图4，对照空白组和单独的木犀草素处理组显示txnip蛋白水平很低，chop蛋白和cleavedcaspased3蛋白基本没有表达。然而在thap诱导下，txnip蛋白、chop蛋白、cleavedcaspased3蛋白水平显著升高，加入木犀草素处理后，txnip蛋白、chop蛋白、cleavedcaspased3蛋白均下降，并且随着木犀草素浓度的升高，其下降更明显，此结果与基因水平基本一致，说明木犀草素可以抑制相关凋亡蛋白的表达。

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<110>南方医科大学

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