2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的应用的制作方法

本发明涉及化合物用途技术领域，更具体地，涉及柑橘挥发油类化合物用途技术领域，特别涉及2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的产品中的应用。

背景技术：

铜绿假单胞菌(pseudomonasaerginosa，pa)是自然界中(存在于水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等)常见的条件致病菌之一，可引起呼吸系统、慢性创伤、泌尿系统、软组织等机体重要系统感染，严重危害人类健康。目前铜绿假单胞菌感染的治疗主要是以复合使用抗生素治疗为主，然而，随着抗生素的滥用，铜绿假单胞菌被诱导产生的抵抗性变异使得传统抗菌药物不再能满足临床需求。源于中药材中的天然植物活性成分具有特异性好、来源广泛、副作用小等优势，因此添加天然植物活性成分的功能性群体感应抑制剂保健品及药物是当今研究对抗铜绿假单胞菌感染治疗的关注重点。

2-(甲氨基)苯甲酸甲酯(methyln-methylanthranilate)是从芸香科柑橘类水果(citrusreticulaiablanco)和果皮中提取的一种挥发油类中的含氮化合物，它的结构式如下：

2-(甲氨基)苯甲酸甲酯(methyln-methylanthranilate)

目前，广陈皮挥发油已经被证实具有抗氧化、抗菌和抗病毒活性等生物活性，其抗菌活性的报道主要针对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、霉菌等，但未见其挥发油中的特有成分2-(甲氨基)苯甲酸甲酯用于铜绿假单胞菌感染后的治疗或与传统抗菌药物联合开发预防和治疗铜绿假单胞菌感染。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的产品中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的产品中的应用。基于2-(甲氨基)苯甲酸甲酯具有较好对铜绿假单胞菌群体感应毒力因子的产生及生物膜形成的抑制活性，可用于制备具有预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的产品，适合大规模推广应用。

所述的产品包括药物或保健品；

具体可以将2-(甲氨基)苯甲酸甲酯和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂制备成注射液、片剂、粉针剂、颗粒剂、胶囊、膏剂、霜剂或口服液剂型的药物，药物的剂型不限。

所述保健品是用于预防或治疗铜绿假单胞菌感染的保健品。

所述保健品为液体喷剂、漱口水、粉剂、膏剂或润喉片等多种形式。

所述的2-(甲氨基)苯甲酸甲酯是从芸香科柑橘类水果(citrusreticulaiablanco)和果皮中提取的2-(甲氨基)苯甲酸甲酯化合物单体。

所述的2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的有效浓度为2.5～6.25mg/ml细菌悬液，其中，细菌悬液的浓度为1*10⁶个/ml。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对铜绿假单胞菌群体感应毒力因子的产生及生物膜形成的抑制活性强：经生长曲线、绿脓菌素、弹性蛋白酶、鼠李糖脂、生物膜、实时荧光定量pcr等实验，结果显示2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对铜绿假单胞菌的生长无显著抑制，但对其毒力因子(包括绿脓菌素、弹性蛋白酶、鼠李糖脂)和生物膜形成均有显著性抑制(p<0.05)，可用于制备具有预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的保健品或药物，适用于大规模推广作用。

(2)2-(甲氨基)苯甲酸甲酯抑制铜绿假单胞菌群体感应的有效剂量小，潜在副作用也小，使用更安全。

(3)2-(甲氨基)苯甲酸甲酯资源广泛，易于获得，成本较低。

(4)2-(甲氨基)苯甲酸甲酯能和不同的添加剂、赋形剂制备成不同的保健品及药物剂型，能方便人们食用及临床应用。

附图说明

图1是不同浓度的2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对铜绿假单胞菌抑制的生长曲线图。

图2是2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对铜绿假单胞菌群体感应系统中与毒力因子(包括绿脓菌素、弹性蛋白酶、鼠李糖脂)和生物膜形成抑制相关基因的实时荧光定量pcr影响结果图。其中，基因表达量柱状图上的不同字母*和**分别表示各组间的差异具有显著性(p<0.05)和(p<0.001)。

图3是2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对铜绿假单胞菌的代谢物聚类分析影响结果图，其中，blank为空白背景组，control为对照组，qualitycontrol为质量控制组，sample为实验组。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明是以2-(甲氨基)苯甲酸甲酯(简称为pcr-m)的浓度均以活性成分>95％纯度的提取物为例，但并不局限为提取液或浸膏。当以其他形式如浸膏方式应用时，使用量应折算成本发明中所公开的纯提取物形式的量。

以下实施例中所使用的实验材料如下：

菌株(铜绿假单胞菌atcc9027)为市售产品；lb培养基购买自生工生物工程(上海)股份有限公司；细胞rna提取试剂盒、反转录试剂盒和实时荧光定量pcr试剂盒均购自takara公司。

以下实施例所使用的实验方法如下：

生长曲线实验：铜绿假单胞菌活化后离心并用pbs重悬，配制成1*10⁶个/ml的细菌悬液。将96孔板中每孔加入100μl细菌悬液，置于全自动生长曲线测定仪中培养，温度37℃，震荡速度调至中档并持续，每隔1h检测2-(甲氨基)苯甲酸甲酯处理组和对照组在600nm波长处的吸光值，绘制出铜绿假单胞菌在0、1.25mg/ml、2.5mg/ml、3.75mg/ml、5mg/ml、6.25mg/ml的pcr-m作用下的生长曲线。

绿脓菌素实验：选择2.5mg/ml的pcr-m进行铜绿假单胞菌绿脓菌素抑制的分析。将铜绿假单胞菌活化后配制成1*10⁶个/ml的细菌悬液，加入pcr-m并使其终浓度为2.5mg/ml，37℃、200rpm条件下在lb液体培养基中培养24h后取2.0ml菌液，2.0ml氯仿加入到10000rpm、5min离心后上清中，震荡30min后离心，然后取1ml氯仿层加入1ml体积浓度为0.2mol/l盐酸，震荡30min离心分层，于520nm波长用酶标仪检测其吸光值，并计算出pcr-m对铜绿假单胞菌绿脓菌素的抑制率，每组样品重复3次，对照组以pbs代替pcr-m。抑制率＝[(od对照组－od实验组)/od对照组]×100％，下同。

弹性蛋白酶实验：选择2.5mg/ml的pcr-m进行铜绿假单胞菌弹性蛋白酶抑制的分析。将铜绿假单胞菌活化后配制成1*10⁶个/ml的细菌悬液，加入pcr-m并使其终浓度为2.5mg/ml，37℃、200rpm条件下在lb液体培养基中培养24h后取1.0ml菌液，800μl2％刚果红弹性蛋白溶液(ph＝7.2)加入到5000rpm、5min离心后上清中，震荡培养6h后离心并于495nm波长用酶标仪检测其吸光值，并计算出pcr-m对铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的抑制率，每组样品重复3次，对照组以pbs代替pcr-m。

鼠李糖脂实验：选择2.5mg/ml的pcr-m进行铜绿假单胞菌鼠李糖脂抑制的分析。将铜绿假单胞菌活化后配制成1*10⁶个/ml的细菌悬液，加入pcr-m并使其终浓度为2.5mg/ml，37℃、200rpm条件下在lb液体培养基中培养24h后取2.0ml菌液离心，将上清用盐酸调ph至2.0，然后加入2.0ml乙酸乙酯，震荡15min后离心分层，取1.5ml乙酸乙酯混合液体挥干，沉淀物并用1.0ml无菌水复溶，取200μl0.19％苔黑酚-浓硫酸溶液，80℃水浴40min后离心于421nm波长用酶标仪检测其吸光值，并计算出pcr-m对铜绿假单胞菌鼠李糖脂的抑制率，每组样品重复3次，对照组以pbs代替pcr-m。

生物膜实验：选择2.5mg/ml的pcr-m进行铜绿假单胞菌生物膜抑制的分析。将铜绿假单胞菌活化后配制成1*10⁶个/ml的细菌悬液，向96孔板中加入pcr-m并使其终浓度为2.5mg/ml，37℃条件下在lb液体培养基中静置培养24h，去离子水洗涤培养基和浮游铜绿假单胞菌，加入200μl0.1％结晶紫溶液染色10min，加入200μl95％乙醇溶解，然后于590nm波长用酶标仪检测其吸光值，并计算出pcr-m对铜绿假单胞菌生物膜的抑制率，每组样品重复3次，对照组以pbs代替pcr-m。

实时定量pcr实验：选择2.5mg/ml的pcr-m进行铜绿假单胞菌群体感应系统毒力因子及生物膜形成相关基因表达量抑制的分析。提取pcr-m处理后的铜绿假单胞菌细胞总rna，反转录成cdna，之后利用实时荧光定量pcr检测不同基因表达水平。

代谢组学实验：选择2.5mg/ml的pcr-m进行铜绿假单胞菌代谢物动态变化分析。提取pcr-m处理后的铜绿假单胞菌细胞总代谢物，用甲醇复溶后利用超高压液相色谱质谱联用仪检测铜绿假单胞菌代谢物变化信息。

实施例1：2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对铜绿假单胞菌生长的影响

对加入不同浓度的2-(甲氨基)苯甲酸甲酯作用48h的铜绿假单胞菌，绘制的生长曲线如图1所示，不同浓度的pcr-m对铜绿假单胞菌的生长无显著抑制。

实施例2：2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对铜绿假单胞菌的绿脓菌素、弹性蛋白酶、鼠李糖脂和生物膜的影响

按绿脓菌素、弹性蛋白酶、鼠李糖脂和生物膜的实验方法考察pcr-m对铜绿假单胞菌的抑制作用，结果如表1所示。实验结果显示2.5mg/ml的pcr-m对铜绿假单胞菌绿脓菌素、弹性蛋白酶、鼠李糖脂和生物膜的抑制率分别为86.4％、20.5％、40.5％和46.8％，经单因素方差分析表明pcr-m对铜绿假单胞菌毒力因子(包括绿脓菌素、弹性蛋白酶、鼠李糖脂)和生物膜形成均有显著性抑制(p<0.05)。

表1是2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对铜绿假单胞菌的绿脓菌素、弹性蛋白酶、鼠李糖脂和生物膜的抑制

其中，表中不同字母*和**分别表示各组间的差异具有显著性(p<0.05)和(p<0.001)。

实施例3：2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对铜绿假单胞菌群体感应系统中与毒力因子及生物膜形成相关基因的实时荧光定量pcr影响

通过实时定量pcr实验检测pcr-m对铜绿假单胞菌群体感应系统相关基因转录水平调控，有显著变化的基因如图2所示。

实验结果显示铜绿假单胞菌生长过程中与毒力因子或生物膜形成相关基因lasa、pqsa、phzm、mvfr、pelf、lasr、chic、lasi、lasb、rhli、rhlr、psla、rpos等相对表达量均下调，且差异极显著(p<0.001)；这表明pcr-m对铜绿假单胞菌群体感应系统的转录水平有显著调控作用，进而降低感染铜绿假单胞菌后产生毒力因子及形成生物膜的概率，减弱铜绿假单胞菌毒性，产生预防和治疗铜绿假单胞菌感染的效果。

实施例4：2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对铜绿假单胞菌代谢物的影响

通过非靶向代谢组学实验检测pcr-m对铜绿假单胞菌在代谢物水平的动态变化，有显著性变化的差异代谢物的表达量对各组(包括空白背景组、对照组、质量控制组和实验组)样本进行聚类结果如图3所示。结果显示经差异代谢物聚类分析后，对照组和加入pcr-m的实验组可明显区分，这表明pcr-m对铜绿假单胞菌群体感应系统的代谢物水平有显著调控作用，进而降低感染铜绿假单胞菌后产生毒力因子及形成生物膜的概率，减弱铜绿假单胞菌毒性，产生预防和治疗铜绿假单胞菌感染的效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。