一种用于骨软骨修复的组织工程复合支架及其制备方法与流程

本发明属于高分子材料领域，具体地说，涉及一种用于骨软骨修复的组织工程复合支架及其制备方法。

背景技术

关节软骨全层损伤往往并发软骨下骨硬化或囊性变等损伤，骨坏死后期因关节面塌陷可致关节软骨结构破坏，因此长骨干骺端病损无论原发于关节软骨或骨，到后期均表现为骨软骨同时破坏，目前对这种软骨合并软骨下骨损伤的治疗困难，效果欠佳。近十几年组织工程的发展为骨软骨修复提供了可行的措施。单纯组织工程软骨修复关节骨软骨复合缺损时，移植体与移植床的愈合的界面是软骨-软骨界面的整合；若合并软骨下骨缺损，则尚有软骨-骨界面的整合。其修复过程中上述两种界面的整合较慢，移植体在移植床存在植入早期的不稳定等潜在的不稳定因素，可能导致修复失败因素。因此构建组织工程骨-软骨复合物，旨在修复软骨下骨缺损同时，使移植体在缺损区的整合固定界面由软骨-骨变为骨-骨界面，从而加快界面的愈合。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明针对现有骨软骨修复过程中两种界面整合较慢，移植体在移植床存在植入早期的不稳定等潜在的不稳定因素，可能导致修复失败的问题，提供了一种用于骨软骨修复的组织工程复合支架及其制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种用于骨软骨修复的组织工程复合支架，通过将细胞悬液滴加到细胞-多孔材料复合体上，然后凝胶化，得到。

进一步地，所述细胞悬液是通过将软骨细胞重悬于水凝胶大分子单体溶液中得到。

进一步地，所述水凝胶大分子单体为甲基丙烯酸酯化透明质酸、丙烯酸酯化透明质酸、海藻酸钠、聚乙二醇二丙烯酸酯、琼脂糖、甲基丙烯酸酯化壳聚糖或丙烯酸酯化壳聚糖中的一种。

进一步地，所述细胞-多孔材料复合体是将成骨细胞悬液或干细胞悬液滴加到细胞粘附型多孔支架材料上，置于37℃培养箱孵育0.5-2h，加入相应的细胞培养基培养14-28天，隔一天更换一次培养基。

进一步地，所述细胞粘附型多孔支架材料为含有胶原、明胶、粘连蛋白或细胞粘附性多肽的多孔支架。

本发明还公开了一种用于骨软骨修复的组织工程复合支架的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤1，将成骨细胞悬液或干细胞悬液滴加到细胞粘附型多孔支架材料上，置于37℃培养箱孵育0.5-2h，加入相应的细胞培养基培养14-28天，隔一天更换一次培养基，得到细胞-多孔材料复合体；

步骤2，将软骨细胞重悬于水凝胶大分子单体溶液中得到细胞悬液；

步骤3，将步骤2得到的细胞悬液滴加到步骤1得到的细胞-多孔材料复合体上，然后凝胶化，得到用于骨软骨修复的组织工程复合支架。

进一步地，步骤1中细胞粘附型多孔支架材料为含有胶原、明胶、粘连蛋白或细胞粘附性多肽的多孔支架。

进一步地，步骤2中水凝胶大分子单体为甲基丙烯酸酯化透明质酸、丙烯酸酯化透明质酸、海藻酸钠、聚乙二醇二丙烯酸酯、琼脂糖、甲基丙烯酸酯化壳聚糖或丙烯酸酯化壳聚糖中的一种。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明中细胞粘附型多孔支架材料为含有胶原、明胶、粘连蛋白或细胞粘附性多肽的多孔支架，均是常用的生物医用材料，具有良好的生物相容性，在体内可生物降解。

2)本发明中水凝胶大分子单体海藻酸钠、透明质酸、琼脂糖、壳聚糖也具有良好的生物相容性和生物降解性；聚乙二醇二丙烯酸酯可用于体内的具有生物惰性的一种生物材料，它在体内不会引起凝血反应，通过肾脏排出体内。

3)本发明复合支架可以作为骨-软骨组织工程/修复支架材料等，具有有益的技术效果和广泛应用前景。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明实施例1得到的复合支架的活、死细胞染色图；

图2是细胞在本发明实施例1得到的复合支架中的增殖情况。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明公开了一种用于骨软骨修复的组织工程复合支架，通过将细胞包覆型水凝胶滴加到细胞-多孔材料复合体上，然后凝胶化，得到。

其具体的制备方法为：

步骤1，将成骨细胞悬液或干细胞悬液滴加到细胞粘附型多孔支架材料上，置于37℃培养箱孵育0.5-2h，加入相应的细胞培养基培养14-28天，隔一天更换一次培养基，得到细胞-多孔材料复合体；

其中细胞粘附型多孔支架材料为含有胶原、明胶、粘连蛋白或细胞粘附性多肽的多孔支架；例如明胶海绵、透明质酸-明胶复合多孔支架、粘连蛋白基多孔支架等。

成骨细胞为mc3t3-e1、hfob1.19等；干细胞为间充质干细胞(msc)、胚胎干细胞(esc)或诱导多功能干细胞(ipsc)等；

步骤2，将软骨细胞重悬于水凝胶大分子单体溶液中得到细胞悬液；其中水凝胶大分子单体为甲基丙烯酸酯化透明质酸、丙烯酸酯化透明质酸、海藻酸钠、聚乙二醇二丙烯酸酯、琼脂糖、甲基丙烯酸酯化壳聚糖或丙烯酸酯化壳聚糖中的一种；

步骤3，将步骤2得到的细胞悬液滴加到步骤1得到的细胞-多孔材料复合体上，然后凝胶化(凝胶化反应可以为紫外光聚合或络合交联反应等)，得到用于骨软骨修复的组织工程复合支架。

本发明中细胞粘附型多孔支架材料为含有胶原、明胶、粘连蛋白或细胞粘附性多肽的多孔支架，均是常用的生物医用材料，具有良好的生物相容性，在体内可生物降解。

本发明中水凝胶大分子单体海藻酸钠、透明质酸、琼脂糖、壳聚糖也具有良好的生物相容性和生物降解性；聚乙二醇二丙烯酸酯可用于体内的具有生物惰性的一种生物材料，它在体内不会引起凝血反应，通过肾脏排出体内。

本发明复合支架可以作为骨-软骨组织工程/修复支架材料等，具有有益的技术效果和广泛应用前景。

实施例1

步骤1，将明胶多孔材料(明胶海绵)切成0.5cmx0.5cmx0.5cm小块，放置于无菌培养皿中，紫外灯照射过夜。胰酶消化mc3t3-e1细胞，并重悬于增殖培养基(dmem加10％血清)中，细胞密度为10⁷个/ml。将细胞悬液平均加到之前紫外照射过的明胶多孔材料上，可用枪头挤压海绵，使明胶多孔材料充分吸收细胞悬液，将含有细胞悬液的明胶多孔材料放到37℃培养箱2h，然后转移到24孔板中；加入骨诱导培养基(dmem培养基加10％血清，100nm地塞米松，50ug/ml维生素c，10mmβ-磷酸甘油钠)，共诱导14天，隔一天换一次培养液，得到mc3t3-e1-明胶多孔材料复合体；

步骤2，将p1代软骨细胞重悬于2％(w/v)海藻酸钠溶液，得到细胞悬液；

步骤3，将步骤2得到的细胞悬液滴加到步骤1得到的mc3t3-e1-明胶多孔材料复合体上，然后滴加适量的cacl2溶液(100mm)，待凝胶凝固后，将细胞-明胶多孔材料-海藻酸钠凝胶复合体重新放入24孔板中，放入37℃培养箱培养，在软骨细胞培养基中孵育14天，即得复合支架。

本发明得到的用于骨软骨修复的组织工程复合支架有利于细胞的存活，并可以促进软骨细胞和成骨细胞或干细胞的增殖，具体见图1和图2。

图1为细胞-明胶多孔材料-海藻酸钠凝胶复合体的死-活细胞染色(live-deadassay)，从图中可以看出，90％以上的细胞为活细胞；而且，明胶多孔材料与海藻酸钠水凝胶很好的整合在了一起。图2为细胞在复合体中的增殖检测(mtt法)，如图所示，复合支架可以促进细胞的持续增殖。

实施例2

步骤1，将明胶多孔材料(明胶海绵)切成0.5cmx0.5cmx0.5cm小块，放置于无菌培养皿中，紫外灯照射过夜。胰酶消化mc3t3-e1细胞，并重悬于增殖培养基(dmem加10％血清)中，细胞密度为10⁷个/ml。将细胞悬液平均加到之前紫外照射过的明胶多孔材料上，将含有细胞悬液的明胶多孔材料放到37℃培养箱0.5h，然后转移到24孔板中；加入骨诱导培养基(dmem培养基加10％血清，100nm地塞米松，50ug/ml维生素c，10mmβ-磷酸甘油钠)，共诱导18天，隔一天换一次培养液，得到mc3t3-e1-明胶多孔材料复合体；

步骤2，将p1代软骨细胞重悬于含有光引发剂(irgacure2959)的2％(w/v)甲基丙烯酸酯化透明质酸溶液，得到细胞悬液；

步骤3，将步骤2得到的细胞悬液滴加到步骤1得到的mc3t3-e1-明胶多孔材料复合体上，365nm紫外光照射5分钟，待凝胶凝固后，将细胞-明胶多孔材料-甲基丙烯酸酯化透明质酸凝胶复合体重新放入24孔板中，放入37℃培养箱培养，得到复合支架。

实施例3

步骤1，将明胶多孔材料(明胶海绵)切成0.5cmx0.5cmx0.5cm小块，放置于无菌培养皿中，紫外灯照射过夜。胰酶消化mc3t3-e1细胞，并重悬于增殖培养基(dmem加10％血清)中，细胞密度为10⁷个/ml。将细胞悬液平均加到之前紫外照射过的40块明胶多孔材料上，将含有细胞悬液的明胶多孔材料放到37℃培养箱1h，然后转移到24孔板中；加入骨诱导培养基(dmem培养基加10％血清，100nm地塞米松，50ug/ml维生素c，10mmβ-磷酸甘油钠)，共诱导24天，得到mc3t3-e1-明胶多孔材料复合体；

步骤2，将p1代软骨细胞重悬于含有光引发剂(irgacure2959)的10％(w/v)聚乙二醇二丙烯酸酯溶液，得到细胞悬液；

步骤3，将步骤2得到的细胞悬液滴加到步骤1得到的mc3t3-e1-明胶多孔材料复合体上，365nm紫外光照射5分钟，待凝胶凝固后，将细胞-明胶多孔材料-聚乙二醇二丙烯酸酯凝胶复合体重新放入24孔板中，放入37℃培养箱培养，得到复合支架。

实施例4

步骤1，将胶原多孔材料(明胶海绵)切成0.5cmx0.5cmx0.5cm小块，放置于无菌培养皿中，紫外灯照射过夜。胰酶消化mc3t3-e1细胞，并重悬于增殖培养基(dmem加10％血清)中，细胞密度为10⁷个/ml。将细胞悬液平均加到之前紫外照射过的40块明胶多孔材料上，将含有细胞悬液的明胶多孔材料放到37℃培养箱1.5h，然后转移到24孔板中；加入骨诱导培养基(dmem培养基加10％血清，100nm地塞米松，50ug/ml维生素c，10mmβ-磷酸甘油钠)，共诱导28天，隔一天换一次培养液，得到mc3t3-e1-明胶多孔材料复合体；

步骤2，将p1代软骨细胞重悬于含有光引发剂(irgacure2959)的10％(w/v)琼脂糖溶液，得到细胞悬液；

步骤3，将步骤2得到的细胞悬液滴加到步骤1得到的mc3t3-e1-明胶多孔材料复合体上，365nm紫外光照射5分钟，待凝胶凝固后，将细胞-明胶多孔材料-琼脂糖凝胶复合体重新放入24孔板中，放入37℃培养箱培养，得到复合支架。

其中实施例中细胞粘附型多孔支架材料为含有胶原、明胶、粘连蛋白或细胞粘附性多肽的多孔支架；例如明胶海绵、透明质酸-明胶复合多孔支架、粘连蛋白基多孔支架等。

其中实施例中成骨细胞还可以为hfob1.19；成骨细胞还可以换成干洗细胞，干细胞可以为间充质干细胞(msc)、胚胎干细胞(esc)或诱导多功能干细胞(ipsc)等。

其中实施例中水凝胶大分子单体还可以为丙烯酸酯化透明质酸、甲基丙烯酸酯化壳聚糖或丙烯酸酯化壳聚糖中的一种。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。