雨生红球藻提取物的应用的制作方法

本发明属于日化领域，具体涉及雨生红球藻提取物的应用。

背景技术：

衰老是指随着时间的推移所有个体都将发生的功能性和器质性衰退的渐进过程。皮肤是研究衰老的良好场所，因皮肤浅表外露，利于在分子和细胞水平上研究机体的衰老。皮肤衰老主要有两种形式，自然衰老和光衰老。自然衰老由机体内在因素引起，常见表现为出现皱纹和皮肤松弛。光衰老又称光老化，由紫外线损害累积引起，是自然老化和紫外线辐射共同作用的结果，表现为皮肤暴露部位粗糙、皱纹加深加粗及真皮层弹性纤维变性等。皮肤衰老主要是真皮衰老，表现为真皮对外来化学物清除力下降，真皮层变薄，胶原蛋白和弹性蛋白的合成减少而分解增加，分解酶活性增强，i型胶原和iii型胶原的比例变小，胶原纤维变粗并出现异常交链。因此，提高皮肤成纤维细胞活性，促进胶原蛋白合成，可促使皮肤趋于年轻化，延缓皮肤衰老进程。

皮肤表象的衰老反映在细胞水平即为细胞衰老。事实上，动物体细胞的分裂次数均是有限的，细胞经过有限次分裂后，dna合成能力逐渐丧失或者有丝分裂能力降低而不能继续增殖，出现衰老现象。老化皮肤中，存在因fb(成纤维细胞)衰老引起的细胞增殖减弱、胶原等细胞外基质合成不足的同时降解增加，导致真皮老化。因此，延长细胞周期可有效减缓细胞衰老进程，延缓皮肤衰老。

雨生红球藻(haematococcuspluvialis)是绿藻门(chlorophyta)绿藻纲(chlorophyceae)团藻目(volvocales)红球藻科(haematococceae)红球藻属(haematococcus)的一种单细胞绿藻。雨生红球藻通常生长在靠近海边的岩石上，经常以血红色外壳形式附着在水潭或靠海的周期性有水的浅水湾边，也生长在雨后岩石上的小水坑内，零散地附着在不渗水的坚硬物体上。雨生红球藻的生命历程经过一个红色的休眠阶段之后，是一个绿色的游动阶段，再之后又是一个红色的休眠阶段。雨生红球藻是继螺旋藻、小球藻之后的又一高经济价值的微藻，其虾青素的含量为1.5％～3.0％。目前，虾青素的公认生物来源有3种：虾蟹等水产品的废弃物、红发夫酵母和雨生红球藻。其中，虾、蟹等水产品的废弃物中虾青素不仅含量低，而且提取费用高；天然红发夫酵母中虾青素的平均含量也仅为0.4％，含量低。因此，雨生红球藻被确认为自然界天然虾青素的最好生物来源。

虾青素(astaxanthin)属于类胡萝卜素，是一种天然色素，通常情况下呈鲜艳的红色或橙色，普遍存在于很多植物中，尤其是藻类、浮游植物中，也存在于少数细菌和真菌，以及虾、蟹、鲑鱼、鳟鱼等海洋动物中。虾青素具有清除自由基、保护血管、降低胆固醇、美白肌肤、防皱、防癌、保护视力、缓解关节疼痛等多方面作用。

雨生红球藻提取物含虾青素，还包括其他类胡萝卜素、不饱和脂肪酸、豆甾醇、油脂、酚类等物质。

本发明研究证实雨生红球藻提取物可有效干扰人成纤维细胞的细胞周期，在保持成纤维细胞活性的前提下，促使成纤维细胞进入休眠状态的g1/g0期，减缓成纤维细胞衰老进程，对抗真皮老化，延缓皮肤衰老。

技术实现要素：

本发明旨在提供雨生红球藻提取物的应用。

雨生红球藻提取物能够在保持成纤维细胞活性的前提下，促使成纤维细胞进入休眠状态的g1/g0期，延长成纤维细胞的细胞周期，减缓成纤维细胞衰老进程，从而对抗真皮老化，延缓皮肤衰老，可用于制备皮肤外用剂，作为抗皮肤衰老的活性成分，尤其是抗真皮层衰老的活性成分。

雨生红球藻提取物通过减缓成纤维细胞衰老进程，保持成纤维细胞的增殖活性、分泌胶原蛋白和/或弹性蛋白的活性、分泌糖胺多糖和/或糖蛋白的活性。

成纤维细胞分泌的胶原蛋白和/或弹性蛋白可以促进胶原纤维、和/或弹性纤维、和/或网状纤维的生成，分泌的糖胺多糖和/或糖蛋白促进基质的生成。胶原纤维、和/或弹性纤维、和/或网状纤维、和/或基质的生成，和/或成纤维细胞的增殖，保持真皮层的厚度、弹性、饱满度、代谢分泌和修复活性，稳固真皮层结构和功能，保持真皮层修复活性，进而保持皮肤的致密性、饱和度、弹性和修复活性，延缓皮肤衰老。

因此，雨生红球藻提取物可用于制备皮肤外用剂，作为皮肤外用剂中的抗皮肤衰老活性成分，尤其是作为皮肤外用剂中的抗真皮层衰老活性成分。

所述雨生红球藻提取物作为稳固真皮层结构和功能的活性成分和/或真皮层修复活性成分，对抗真皮层衰老，实现抗皮肤衰老功能，延缓皮肤衰老。

所述雨生红球藻提取物作为减缓成纤维细胞衰老的活性成分，延缓真皮层衰老，实现皮肤抗衰老。

所述雨生红球藻提取物作为促使成纤维细胞进入休眠状态的g1/g0期的活性成分，通过使成纤维细胞进入休眠状态的g1/g0期，延长成纤维细胞的细胞周期，保持成纤维细胞增殖活性，减缓成纤维细胞的衰老进程。

进一步，雨生红球藻提取物通过减缓成纤维细胞衰老进程，保持和/或促进分泌胶原蛋白和/或弹性蛋白的活性、分泌糖胺多糖和/或糖蛋白的活性。

雨生红球藻提取物通过保持和/或促进成纤维细胞分泌胶原蛋白和/或弹性蛋白的活性，促进胶原纤维、和/或弹性纤维、和/或网状纤维的生成，实现稳固真皮层结构和功能，和/或保持真皮层修复活性，和/或抗真皮层衰老；

通过保持和/或促进成纤维细胞分泌糖胺多糖和/或糖蛋白的活性，促进基质的生成，实现稳固真皮层结构和功能，和/或保持真皮层修复活性，和/或抗真皮层衰老。

本发明所用雨生红球藻提取物由雨生红球藻孢子经破壁、提取、干燥等工艺制备而成。破壁在3℃～8℃下进行，优选为4℃。用萃取溶剂提取后去除溶剂并干燥。所述的萃取溶剂为有机溶剂，优选为氯仿、乙醇或者其混合物；更优选的为氯仿和乙醇的混合物；进一步，氯仿与乙醇的体积比为1：0.8～1.5。提取温度为35℃～50℃，优选为40℃。

在本发明的一个优选方式中，萃取溶剂为氯仿与乙醇体积比1：1的混合物。具体为，雨生红球藻于冷室中均匀研磨破壁后，用氯仿与乙醇的混合溶剂萃取，得到雨生红球藻提取物。冷室温度为3℃～8℃，优选为4℃。氯仿与乙醇的体积比为1：0.8～1.5，优选为1：1。萃取温度为35℃～50℃，优选为40℃。

还包括萃取后进行干燥处理，干燥处理方法有真空干燥或冷冻干燥。

雨生红球藻产于西藏地区，为雨生红球藻孢子。优选的，选用菌种保藏编号cgmccno.15297的雨生红球藻(保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2018年2月5日)

上述雨生红球藻提取物的用量不高于0.002wt％时，对成纤维细胞无毒害作用。在0.0005wt％～0.002wt％的用量范围内，均可有效干预成纤维细胞的细胞周期，在保持成纤维细胞活性的前提下，促使更多成纤维细胞进入休眠状态的g1/g0期，延长成纤维细胞的细胞周期，减缓成纤维细胞衰老进程，对抗真皮老化，延缓皮肤衰老。

雨生红球藻提取物可用于制备皮肤外用剂，所述雨生红球藻提取物用作皮肤外用剂中的抗衰老活性成分，尤其是稳固真皮层结构和功能活性成分、真皮层修复活性成分和抗真皮层衰老活性成分中的一种或者多种。皮肤外用剂中雨生红球藻提取物的用量为0.0001wt％～1wt％，优选为0.0005wt％～0.02wt％，进一步优选为0.0005wt％～0.002wt％。

雨生红球藻提取物促使成纤维细胞进入休眠状态的g1/g0期，延长成纤维细胞周期，减缓成纤维细胞的衰老进程；保持成纤维细胞增殖活性，促进成纤维细胞胶原蛋白和/或弹性蛋白的分泌，合成胶原纤维、和/或弹性纤维、和/或网状纤维；促进糖胺多糖和/或糖蛋白的分泌，生成基质；稳固真皮层结构和功能，和/或保持真皮层修复活性，和/或抗真皮层衰老。

雨生红球藻提取物用于制备可促使成纤维细胞进入休眠状态的g1/g0期的皮肤外用剂。

雨生红球藻提取物可用于制备延长成纤维细胞周期、减缓成纤维细胞衰老进程的皮肤外用剂，保持成纤维细胞的增殖活性。

雨生红球藻提取物可用于制备保持成纤维细胞增殖活性的皮肤外用剂，促进胶原蛋白、和/或弹性蛋白、和/或糖胺多糖、和或糖蛋白分泌，稳固真皮层结构和功能，保持真皮层修复活性，抵抗真皮层衰老。

雨生红球藻提取物可用于制备促进胶原蛋白和/或弹性蛋白分泌、合成胶原纤维、和/或弹性纤维、和/或网状纤维的皮肤外用剂，稳固真皮层结构和功能，保持真皮层修复活性，抵抗真皮层衰老。

雨生红球藻提取物可用于制备促进糖胺多糖和或糖蛋白分泌、生成基质的皮肤外用剂，稳固真皮层结构和功能，保持真皮层修复活性，抵抗真皮层衰老。

一种皮肤外用剂，具有稳固真皮结构和功能活性、和/或真皮层修复活性、和/或抗真皮层衰老活性、和/或抗皮肤衰老活性，含有雨生红球藻提取物。其中，雨生红球藻提取物的含量为0.0001wt％～1wt％，优选为0.0005wt％～0.02wt％，进一步优选为0.0005wt％～0.002wt％，更优选为0.0008wt％～0.0012wt％。

含有雨生红球藻提取物的皮肤外用剂还可以含有其它活性成分，包括补水活性成分、美白活性成分、保湿活性成分、抗氧化活性成分、抗皱活性成分、祛斑活性成分、消痘活性成分、防晒活性成分、祛粉刺/痤疮活性成分、祛头屑活性成分、抗过敏活性成分或者皮脂腺抑制活性成分中的一种或者多种。

皮肤外用剂的剂型无特殊限制，可根据使用情况而定，如洁面霜、精华液、乳液、霜膏、化妆水(如柔肤水、爽肤水)、面膜、卸妆水、啫喱、气雾或者喷雾等。所有以涂抹、喷洒或者其它类似方法，散布于人体表面的任何部位，以达到清洁、保养、美容、修饰、改变外观或者修正人体气味，保持良好状态的基础化妆品、面部化妆品、头部护理品、身体护理品均可。

皮肤外用剂中还含有增稠剂、增溶剂、助溶剂、稳定剂、柔顺剂、气雾剂溶剂、防腐剂、表面活性剂、控释剂、缓释剂、芳香剂、调色剂、促渗剂、保湿剂、乳化剂、塑形剂或者珠光剂中的一种或者多种。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

(1)本发明雨生红球藻提取物可有效干预成纤维细胞的细胞周期，在保持成纤维细胞活性的前提下，延长成纤维细胞的细胞周期，减缓成纤维细胞衰老进程，对抗真皮老化，延缓皮肤衰老。

(2)本发明雨生红球藻提取物的活性高，在含量极低的情况下即产生显著效果，不刺激皮肤，天然、安全且有效。

附图说明

图1是实施例1成纤维细胞分别使用空白组(nt)、sds对照组、红-1组、红-2组、红-3组、红-4组和红-5组培养基培养后成纤维细胞活性对比图。

图2是实施例2成纤维细胞分别在空白组nt(d)、红-1组(a)、红-6组(b)和红-7组(c)培养基培养24小后的细胞周期检测结果。

图3是实施例2成纤维细胞分别在空白组nt(d)、红-1组(a)、红-6组(b)和红-7组(c)培养基培养24小后的成纤维细胞状态图。

图4是实施例2成纤维细胞分别在空白组nt(d)、红-1组(a)、红-6组(b)和红-7组(c)培养基培养24小后再转入正常培养基培养24小时后的细胞周期检测结果。

图5是实施例2成纤维细胞分别在空白组nt(d)、红-1组(a)、红-6组(b)和红-7组(c)培养基培养24小时后再转入正常完全培养基培养24小后的成纤维细胞状态图。

图6是实施例2成纤维细胞分别在空白组nt(d)、红-1组(a)、红-6组(b)和红-7组(c)培养基培养24小时后再转入正常完全培养基培养24小后的成纤维细胞活性对比图。

图7是实施例2成纤维细胞分别在空白组nt(d)、红-1组(a)、红-6组(b)和红-7组(c)培养基培养24小时后再转入正常培养基培养48小时后的细胞周期检测结果。

图8是实施例2成纤维细胞分别在空白组nt(d)、红-1组(a)、红-6组(b)和红-7组(c)培养基培养24小时后再转入正常完全培养基培养48小后的成纤维细胞状态图。

图9是实施例2成纤维细胞分别在空白组nt(d)、红-1组(a)、红-6组(b)和红-7组(c)培养基培养24小时后再转入正常完全培养基培养48小后的成纤维细胞活性对比图。

具体实施方式

成纤维细胞主要位于皮肤真皮层，其生长状况是反应皮肤衰老的重要代表。本申请采用成纤维细胞作为研究对象，评价雨生红球藻提取物的延缓衰老功效。该评估方法由两部分独立的试验组成，第一部分是细胞毒性试验，筛选雨生红球藻提取物的适宜添加浓度。第二部分是细胞周期实验，在添加适宜浓度雨生红球藻提取物的培养基中培养成纤维细胞，测定其细胞周期之后，再将成纤维细胞放在正常培养基中培养，继续测定其细胞周期和细胞活性，观察成纤维细胞是否受损。通过细胞周期实验观察细胞周期长短变化。

现有观点认为，若活性成分能延长成纤维细胞的细胞周期，或避免成纤维细胞内端粒因外界氧化刺激致使端粒自身加速变短进而导致细胞周期变短的现象，则均认为具有延缓衰老功效。

雨生红球藻提取物由雨生红球藻孢子经破壁、提取、干燥等工艺制备而成，以虾青素为主要成分，还包括类胡萝卜素、不饱和脂肪酸、豆甾醇、油脂、酚类等物质。雨生红球藻提取物也被称为红球藻抗逆因子(hpes)，下述实施例的红球藻抗逆因子(hpes)指雨生红球藻提取物。

本发明所使用雨生红球藻提取物的制备方法为：将雨生红球藻(产于西藏地区，菌种保藏编号cgmccno.15297，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心)于4℃冷室中均匀研磨2分钟破壁后，再转入萃取瓶中，以氯仿：乙醇(1:1，v/v)为萃取剂于40℃条件下萃取45分钟，雨生红球藻与萃取剂的用量比为1g：10ml，去除萃取剂并干燥即得雨生红球藻提取物，用于以下实施例的细胞毒性和活性检测。

实施例1细胞毒性实验

细胞培养：于37℃、5％co2的细胞培养箱内，人成纤维细胞al15012lf-p2在完全培养基中培养，至90％汇合时，消化种板。

细胞毒性测试方法：在al15012lf-p35000/孔96孔板上，分成表1的5个样品组(红-1、红-2、红-3、红-4、红-5)、空白组和sds对照组，每组平行3份，表1各样品组的红球藻提取物储备液用培养基(dmem，2％fcs，1％p/s)稀释100倍后(终浓度)加到孔中，空白组加入正常培养基(dmem，2％fcs，1％p/s)，sds对照组加入sds含量为2.5％的培养基(dmem，2％fcs，1％p/s)，然后向各组孔中接种细胞培养阶段培养的人成纤维细胞，于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养24小时后，移除培养基，加入mtt0.5mg/ml，3小时后小心吸去上清液，加入dmso，于550nm下进行检测；以sds(0.25％)作为参照，定义样品孔为t，未处理孔(空白组)为nt，以t与nt的比值(t/nt)≥90％视为无细胞毒性，比值<90％视为有细胞毒性。成纤维细胞活性如图1所示。

表1

由图1可知，sds(0.25wt％)对照组具有明显的细胞毒性，样品组(红-1、红-2、红-3、红-4、红-5)均未有细胞毒性(>90％)，红球藻提取物用量在0.0000002wt％～0.002wt％(约2ppb～20ppm)范围内，没有细胞毒性；即当红球藻提取物用量不大于0.002wt％时，可视为对细胞没有毒性，可在该浓度范围内继续进行后续的细胞周期实验。

实施例2细胞周期测试和细胞活性恢复mtt实验

在无细胞毒性的红球藻提取物用量在0.0000002wt％～0.002wt％范围内，以红-1的红球藻提取物储备液0.20wt％为最高浓度依次稀释2次，每次稀释两倍，得到红球藻提取物储备液分别为0.10wt％和0.05wt％的两组，如表1的红-6和红-7所示。选用表1所示的红-1、红-6和红-7作为样品组，进行细胞周期实验。

2.1.加样培养24小时

实验组别有空白组(nt)、红-1组、红-6组和红-7组，每组平行3份，将实施例1细胞培养阶段培养的成纤维细胞接种到各组使用的al15012lf-p30.1m/瓶t25细胞培养瓶中，用不含血清的培养基处理12h(同步化)后，空白组加入正常培养基(dmem，2％fcs，1％p/s)，样品组(红-1、红-6和红-7)加入表1所示各组红球藻提取物储备液用培养基(dmem，2％fcs，1％p/s)稀释100倍后的培养液(终浓度)，于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养24小时后，消化离心收集细胞，然后用pbs洗一次，之后用预冷的70％乙醇固定细胞，4℃放置固定过夜待染色；染色前将细胞从4℃冰箱取出，离心pbs洗一次，之后每管加500μl染液(pi50μg/ml，rnase100μg/ml)，充分混匀避光30min，即可上流式细胞仪进行检测。

细胞周期测定结果如表2和图2所示，细胞状态图如图3所示，空白组(nt)处于g1期的细胞比率为81.60％，红-1组(0.002wt％)处于g1期的细胞比率为92.51％，红-6组(0.001wt％)处于g1期的细胞比率为87.30％，红-7组(0.0005wt％)处于g1期的细胞比率为85.78％，随着雨生红球藻提取物(红球藻抗逆因子)质量浓度的增加，成纤维细胞进入g1期的比率逐渐增大，且均高于空白组(nt)，说明雨生红球藻提取物(红球藻抗逆因子)会干预细胞周期分布，促进细胞进入g0/g1休眠期，且随着雨生红球藻抗逆因子(hpes)质量浓度的提高，细胞进入g1期的比率加大。

表2

2.2加样培养24小时后再移入正常培养基培养24小时

实验组别和方法同2.1，不同之处在于，加样培养24小时后，移除原培养基，加入正常的完全培养基(dmem，2％fcs，1％p/s)再培养24小时。

细胞周期测定结果如表3和图4所示，细胞状态图如图5所示，空白组(nt)处于g1期的细胞占有率为73.84％，红-1组(0.002wt％)处于g1期的细胞占有率为79.65％，红-6组(0.001wt％)处于g1期的细胞占有率为76.53％，红-7组(0.0005wt％)处于g1期的细胞占有率为73.84％；添加雨生红球藻提取物的各样品组的g1期比率已不断接近空白组(nt)，且红-7组(0.0005wt％)的g1期比率已与nt相一致，均为73.84％。说明去除雨生红球藻提取物(红球藻抗逆因子)后，各样品组的成纤维细胞的细胞周期逐渐恢复至正常成纤维细胞的细胞周期分布水平，细胞开始分裂增殖，g1期细胞比率下降；且雨生红球藻提取物(红球藻抗逆因子)质量浓度越低，成纤维细胞的细胞周期越快恢复至正常分布水平。

表3

采用mtt法测定加样培养24小时后移入正常培养基培养24小时的成纤维细胞活性，定义样品孔为t，未处理孔(空白组)为nt，以t与nt的比值(t/nt)≥90％视为细胞活性正常。细胞活性测试结果如图6所示。

由表3和图6可知，因之前添加雨生红球藻提取物(红球藻抗逆因子)培养，样品组(红-1组、红-6组、红-7组)成纤维细胞处于g1期的细胞占有率较空白组(nt)增加，成纤维细胞增殖缓慢，故样品组(红-1组、红-6组、红-7组)成纤维细胞数量较空白组(nt)少，雨生红球藻提取物(红球藻抗逆因子)用量为0.0005wt％的红-7组细胞活性已大于90％，说明移入正常培养基培养24小时时成纤维细胞已开始恢复。

2.3.加样培养24小时后再移入正常培养基培养48小时

实验组别和方法同2.1，不同之处在于，加样培养24小时后，移除原培养基，加入正常的完全培养基(dmem，2％fcs，1％p/s)再培养48小时。

细胞周期测定结果如表4和图7所示，细胞状态图如图8所示，空白组(nt)和样品组(红-1组、红-6组、红-7组)处于g1期的细胞占有率均在83％附近。正常培养基培养48小时后，样品组(红-1组、红-6组、红-7组)均可恢复至与空白组(nt)相近的细胞周期分布。在除去雨生红球藻提取物(红球藻抗逆因子)后，细胞开始分裂和增殖，g1期细胞比例降低；随着细胞增多，细胞接触抑制，g1期比率再次增加，最终g1期均在83％。从图8可看出，细胞的形态均正常。

表4

采用mtt法测定加样培养24小时后移入正常培养基培养48小时的成纤维细胞活性，定义样品孔为t，未处理孔(空白组)为nt，以t与nt的比值(t/nt)≥90％视为细胞活性正常。细胞活性测试结果如图9所示。

由图9可知，移入正常培养基培养48h后，样品组(红-1组、红-6组、红-7组)与空白组nt相比，细胞活性均都大于90％，细胞活性正常。

由上述试验结果可知，被红球藻抗逆因子(hpes)干预过的成纤维细胞，在恢复正常培养后细胞活性不会受到影响；从细胞周期测试结构和恢复阶段mtt测试结果可得知，恢复正常培养基培养后，被红球藻抗逆因子(hpes)干扰过的成纤维细胞的细胞周期可恢复至与空白组nt一致的水平，且细胞活性正常，不受红球藻抗逆因子(hpes)影响。

综上所述，红球藻抗逆因子(hpes)可在体外有效干预人皮肤成纤维细胞细胞周期，在保持细胞活性的前提下，促使更多细胞进入休眠状态的g1/g0期，延长健康细胞的细胞周期，减少同一时间内的分裂次数，避免细胞过早消耗完分裂次数，提前进入程序衰老。

红球藻抗逆因子(hpes)在0.002wt％～0.0005wt％用量范围内，随着用量增大，促进细胞进入休眠状态g1/g0期的作用越明显。

使用红球藻抗逆因子(hpes)处理后，再恢复正常培养液培养，成纤维细胞的细胞周期恢复至与未经红球藻抗逆因子处理的正常成纤维细胞一致的水平，同时细胞活性保持正常，证明细胞活性正常，仍具有正常增殖能力。