石墨烯改性的光敏剂纳米复合材料及其应用的制作方法

本发明属于医学用光动力治疗材料技术领域，具体涉及一种石墨烯改性的光敏剂纳米复合材料及其应用专利申请事宜。

背景技术

光敏剂是一种常用药剂，为适应一些特定疾病的治疗应用，需要将光敏剂进行纳米化负载从而制备成纳米药物。光敏剂纳米化技术应用时，依据纳米载体的性质，包括有机高分子载体和无机载体两类。其中纳米氧化钛粒子属于无机载体，它具有非常大的表面积比和内孔的体积，孔道规则且大小易调整，内外表面均易于修饰，因其形状和大小的可控性高、水溶性好、性质稳定、生物相容度高等优势，更重要的是，纳米氧化钛粒子对单态氧等小分子具有可透性，而单态氧是光动力治疗中的关键因子。因此，纳米氧化钛粒子是一种可提高光敏剂的光动力效应的理想的纳米载体，近年来被越来越多的研究者所重视。

就tio2@photosan纳米光敏剂而言（anticancereffectofphotodynamictherapywithphotosan-loadedtitaniumdioxidenanoparticlesonpanc-1pancreaticcancercellsinvitro，scienceofadvancedmaterials,2016,8(5):1145-1153），由于整合有tio2纳米结构和有机光敏剂photosan两者的优点，可提高photosan的被动靶向性能和结构稳定性，因而在一些细胞实验中表现出对肿瘤细胞的杀伤效果。但实际的应用效果表明，氧化钛包裹photosan纳米光敏剂（tio2@photosan）在水溶性、主动靶向性能方向尚存在一定缺陷，因而与实际医疗应用的期待效果尚有一定距离。

石墨烯（graphene，g）是世界上最薄的新型二维纳米材料，最先由曼切斯特大学的geim和novoselov通过微机械力剥离石墨成功制备并观察到了由一层密集的、处于蜂窝状晶体点阵上的碳原子以sp2杂化连接形成的单原子层二维原子晶体。由于石墨烯是具有优异的电学、力学和热学性质，因此石墨烯在复合材料、传感器、能源等领域具有重要的应用前景，成为近年来纳米领域研究的热点。

在纳米生物医学领域，石墨烯的衍生物氧化石墨烯（grapheneoxide，go），因其巨大的比表面积，丰富的含氧基团（羟基，羧基，环氧基团等）易于修饰，因而受到了广泛关注。氧化石墨烯（go）能与蒽醌类π环结构抗肿瘤药物，以π-π堆积力，形成大π键的共轭形式，吸附在氧化石墨烯上，实现药物运送功能。另一方面，氧化石墨烯（go）表面拥有大量的羧酸、羟化物、环氧化物π-π疏水作用，可通过氢建、离子键结合药物分子；同时通过共价键及非共价键结合，能够使表面覆盖的亲水基团增加，从而增加生物相容性；再有，氧化石墨烯（go）表面能够与靶向配体或激活基团结合用于靶向运输。基于这些特性，利用氧化石墨烯（go）来对一些药物分子进行纳米化应用或改性进行了较多尝试，但针对不同分子进行改性或纳米化应用时，受限于药物分子或作用目标自身特性，其最终效果往往并不一致。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种氧化石墨烯（go）/石墨烯（g）改性的光敏剂纳米复合材料，从而为相关疾病的治疗奠定材料应用基础。

本申请所采用的技术方案详述如下。

一种氧化石墨烯/石墨烯改性的光敏剂纳米复合材料，为氧化石墨烯/石墨烯@二氧化钛（tio2）@光敏剂photosan，结构式表示为：go@tio2@ps、g@tio2@ps，简写为：g/go@tio2@ps；

其中g表示石墨烯（graphene）；go表示氧化石墨烯（grapheneoxide）；ps表示光敏剂（photosan），具体例如为：血卟啉、血卟啉衍生物、竹红菌素、酞菁类光敏剂等中一种；

制备时以聚丙烯酸为分散剂，以氨水为催化剂，以水合肼为还原剂，具体制备步骤如下：

（一）一步湿法制备负载光敏剂photosan的氧化钛纳米粒子；具体而言：

（1）将0.1~0.3g聚丙稀酸（paa）溶解到4ml氨水后，加入1~4mg光敏剂photosan溶解，常温下快速搅拌使其充分溶解，形成溶液a；

（2）量取0.5~1ml的钛酸丁酯（teos）加入到2~3ml冰醋酸溶液中，轻微震荡几次，形成透明溶液b；

（3）将溶液b缓慢匀速滴加至溶液a中，滴加完成后继续反应4~24h（滴加过程和反应过程溶液均应在搅拌器搅拌下进行）；

反应完成后离心，清洗沉淀，真空冷冻干燥后所得即为负载photosan的氧化钛纳米空心球颗粒tio2@photosan；

（二）制备氧化石墨烯改性的光敏剂纳米复合材料氧化石墨烯@tio2@ps（go@tio2@ps），具体而言：

（1）将步骤（一）中所制备的tio2@photosan首先溶于二甲亚砜中制成1~10mmol/l的溶液a；

（2）取2~12mg氧化石墨烯（go）加入到100ml无水乙醇中，超声分散并搅拌形成透明溶液b；

（3）取10ml溶液a、10ml溶液b、ph=5.7~8.0的磷酸缓冲液80ml，混合均匀形成混合溶液c，反应过夜；

用100kda过滤管离心去除未吸附在氧化石墨烯上的过量tio2@photosan，并用水洗涤至滤液几乎看不到红色为止（大约6次），冷冻干燥，即得go@tio2@photosan纳米复合颗粒；

所得go@tio2@ps纳米复合颗粒可直接用于肿瘤的光热和光动力协同治疗；

（三）制备石墨烯改性的光敏剂纳米复合材料石墨烯@tio2@photosan（g@tio2@ps），具体而言：

将步骤（2）所得go@tio2@photosan纳米复合颗粒加入到0.25~0.5ml水合肼溶液(85%浓度，cr化学试剂级别)中，反应2~4小时；

反应结束后，离心、用超纯水清洗沉淀不少于三次，冷冻干燥，即得g@tio2@ps纳米复合颗粒；

所得g@tio2@ps纳米复合颗粒可直接用肿瘤的光热和光动力协同治疗。

制备过程中，氧化石墨烯可由石墨烯经改进的hummers方法制备获得；具体而言：

在冰水浴中装配好250ml的反应瓶，加入适量的浓硫酸，搅拌下加入2g石墨粉和1g硝酸钠的固体混合物，再分次加入6g高锰酸钾，控制反应温度不超过20℃（15~20℃左右），搅拌反应30min左右；

然后升温到35℃左右，继续搅拌30min再缓慢加入一定量的去离子水，续拌20min后，并加入适量双氧水还原残留的氧化剂，使溶液变为亮黄色；

趁热过滤，并用5%hcl溶液和去离子水洗涤直到滤液中无硫酸根被检测到为止；最后将滤饼置于60℃的真空干燥箱中充分干燥，即为氧化石墨烯。

总体而言，本申请的主要技术优势体现在如下几个方面：

（1）氧化钛本身是一种紫外激发型无机光敏剂，利用其作为有机光敏剂的载体，除有利于改善有机光敏剂本身固有的物理化学缺陷外，还可以整合有机/无机两种光敏剂的优点，拓展光敏剂的激活波段，提高疗效；本申请中，即是利用这一特点，通过利用空心氧化钛纳米颗粒包裹光敏剂，从而显著提高载药量，并进一步提高光敏剂的生物利用度；

（2）前期研究中，发明人发现氧化石墨烯能够通过官能羧酸基团（直接与羟基结合）与tio2结合，因而发明人认为，利用这一特性可以进一步改善tio2@photosan纳米光敏剂在水溶性、主动靶向性等性能方面的缺陷，从而为该材料在相关疾病治疗中的应用奠定基础；基于此，在本申请中，通过利用石墨烯/氧化石墨烯的再次包裹，进一步提高了纳米材料的水溶性，并整合了石墨烯的光热效应，从而使之具有光热和光动力治疗的双重功能，而通过光热和光动力的协同作用，可进一步提高疗效；

另一方面，本申请中利用石墨烯/氧化石墨烯优良的电子传导能力，实现光生电子-空穴的有效分离，改善了二氧化钛的光学性能，拓展其激发波段，为进一步提高疗效奠定了基础；

（3）初步应用试验表明，本申请所提供纳米材料产物具有毒性低的特点，在浓度100微克/毫升时仍然保持低的细胞毒性，因而具有较好的应用前景；

另一方面，应用试验表明，相较于原始的tio2@photosan纳米光敏剂材料，通过石墨烯/氧化石墨烯改性处理后，所制备的g/go@tio2@photosan纳米复合材料具有更好的水溶性、生物相溶性和低的细胞毒性，可用于肿瘤光热和光动力协同治疗，在特定肿瘤或癌细胞中，具有更好的杀伤效果，表现出较好的应用前景；同时本发明也为类似光敏剂的改良和制备提供了新的技术思路，因而具有较好的实用性和推广应用性。

附图说明

图1为对负载photosan的纳米氧化钛透射电镜（tem）图；形貌检测表明，可以观察到制备的纳米颗粒呈壳核结构，表面光滑规则，光敏剂被包裹在空腔中，形成纳米复合光敏剂；

图2为go@tio2@photosan纳米颗粒的tem图；

图3为g@tio2@photosan纳米颗粒的tem图；

图4为10mg/mlg@tio2@ps、go@tio2@ps、tio2@ps纳米光敏剂水溶液在功率为1.5w/cm²的980nm激光照射下的光热效应曲线图；

图5为g@tio2@ps纳米光敏剂、ps纳米、普通ps（各组最终形成浓度为0、25、50、75、100和200μg/ml对eca-109细胞cck-8细胞增殖能力检测结果影响:eca-109细胞培养基中加入上述不同比例的上述药物，培养48h后，采用cck8法检测细胞增殖能力（选用450nm处od值代表）；

图6为100μg/ml的g@tio2@ps纳米光敏剂、go@tio2@ps纳米光敏剂、ps纳米、普通ps对eca-109细胞annexinv与pi双染法测肿瘤细胞凋亡检测结果影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂、实验仪器等基本情况简要介绍说明如下。

生物材料：

人食管癌eca109细胞株，购自北京协和细胞库；

实验试剂：

鳞片石墨(xf010-1325目)烯，先丰纳米；

光敏剂photosan(一种血卟啉寡聚体混合物)，德国diolitec。

实施例1

本实施例所提供石墨烯改性的光敏剂纳米复合材料石墨烯@tio2@photosan，其结构式为g@tio2@photosan，g代表石墨烯；制备时以聚丙烯酸为分散剂，以氨水为催化剂，以水合肼为还原剂，具体制备过程简介如下。

（一）一步湿法制备负载photosan的氧化钛纳米粒子；具体而言：

（1）将0.165g聚丙稀酸（paa）溶解到4ml氨水后，加入1mg光敏剂photosan溶解，常温下快速搅拌使其充分溶解，形成溶液a；

（2）量取0.5ml的钛酸丁酯（teos）加入到2ml冰醋酸溶液中，轻微震荡几次，形成透明溶液b；

（3）将溶液b缓慢匀速滴加至溶液a中，滴加完成后继续反应24h（滴加过程和反应过程溶液均应在搅拌器搅拌下进行）；

反应完成后离心，清洗沉淀，真空冷冻干燥后所得即为负载photosan的氧化钛纳米空心球颗粒tio2@photosan。

对所制备氧化钛纳米空心球颗粒tio2@photosan进行扫描电镜观察，结果如图1所示。分析可以看出，所制备纳米空心球颗粒其直径分布在80-1000nm之间，平均直径约为120nm，其大小是纳米尺寸级别，因而可以在毛细血管中循环而不会形成栓塞。

（二）制备氧化石墨烯改性的光敏剂纳米复合材料氧化石墨烯@tio2@photosan（go@tio2@photosan，go代表氧化石墨烯），具体而言：

（1）将步骤（一）中所制备的tio2@photosan首先溶于二甲亚砜中制成1mmol/l的溶液a；

（2）取2mg氧化石墨烯（go）加入到100ml无水乙醇中，超声分散并搅拌形成透明溶液b；

（3）取10ml溶液a、10ml溶液b、ph=5.7的磷酸缓冲液80ml，混合均匀形成混合溶液c，反应过夜；

用100kda过滤管离心去除未吸附在氧化石墨烯上的过量tio2@photosan，并用水洗涤至滤液几乎看不到红色为止（大约6次），冷冻干燥，即得go@tio2@photosan纳米复合颗粒。

对所得go@tio2@photosan纳米复合颗粒进行扫描电镜观察，结果如图2所示。分析可以看出，其直径分布在80-1000nm之间，平均直径约为120nm，仍然属于纳米尺寸级别。

（三）制备石墨烯改性的光敏剂纳米复合材料石墨烯@tio2@photosan（g@tio2@photosan），具体而言：

将步骤（2）所得go@tio2@photosan纳米复合颗粒加入到0.25ml水合肼溶液(85%，cr级)中，反应2~4小时；

反应结束后，离心、用超纯水清洗沉淀不少于三次，冷冻干燥，即得g@tio2@photosan纳米复合颗粒；

对所得g@tio2@photosan纳米复合颗粒进行扫描电镜观察，结果如图3所示。分析可以看出，其直径分布在80-1000nm之间，平均直径约为120nm，仍然属于纳米尺寸级别。

综上结果可以看出，采用石墨烯/氧化石墨烯对tio2@photosan材料进行包裹改性时，材料总体尺寸级别并没有发生明显变化，因而可为后续实际应用奠定良好基础。

需要说明的是，制备过程中，氧化石墨烯由石墨烯经改进的hummers方法制备获得；具体而言：

在冰水浴中装配好250ml的反应瓶，加入适量的浓硫酸，搅拌下加入2g石墨粉和1g硝酸钠的固体混合物，再分次加入6g高锰酸钾，控制反应温度不超过20℃（15~20℃左右），搅拌反应30min左右；

然后升温到35℃左右，继续搅拌30min再缓慢加入一定量的去离子水，续拌20min后，并加入适量双氧水还原残留的氧化剂，使溶液变为亮黄色；

趁热过滤，并用5%hcl溶液和去离子水洗涤直到滤液中无硫酸根被检测到为止；最后将滤饼置于60℃的真空干燥箱中充分干燥，即为氧化石墨烯。

检验例

为对所制备g@tio2@photosan纳米材料性能及实际应用效果有进一步的了解，发明人进一步进行了光热效应、细胞毒性和pdt（光动力治疗）治疗的初步实验分析，相关实验简要介绍如下。

（1）光热效应

将所制备的g@tio2@ps、go@tio2@ps、tio2@ps纳米材料分散于超纯水中，制备浓度为10mg/ml的溶液，利用红外光热成像仪测定所得纳米颗粒的光热效应。测定时，设置光源强度为2.5w/cm²，波长为980nm，照射距离为0.5cm，溶液体积为1ml，照射时间5分钟。结果如图4所示。

从图4可以看出，相较于纯水与tio2@ps，含有g@tio2@photosan及go@tio2@ps、tio2@ps纳米材料的水溶液在经过短时照射后即表现出明显的光热效果，因而可为后续治疗应用奠定基础。

（2）细胞毒性

采用标准的cellcountingkit-8测增殖法对纳米材料的体外细胞毒性进行测定。具体而言：

将g@tio2@ps、go@tio2@ps、ps纳米颗粒以及ps颗粒超声分散于dmem培养液中，配制成浓度为1mg/ml；

将肿瘤细胞(人食管癌eca109细胞)播种在96孔板后（5×10³/孔），将纳米颗粒悬浮液加入到96孔板，最终分别形成浓度为0、25、50、100、150和200μg/ml，溶液体积为100微升；

共孵育48小时后，加入10微升kit-8溶液，继续孵育2小时；然后酶标仪测定450nm处的吸光度。结果如图5所示。

cck8（cellcountingkit-8）细胞毒性实验结果显示：g@tio2@ps、go@tio2@ps组（即图中g@tio2@ps-nss与go@tio2@ps-nss）细胞存活率在浓度为50μg/ml时开始轻微下降，随着药物剂量增大而逐渐降低，且两组在100μg/ml开始相较于对照组增殖显著降低(p<0.05)。

（3）光动力疗法（pdt）效果

采用annexin-v与pi双染法，利用流式细胞术通过检测细胞凋亡方式来对pdt效果进行评价，具体而言：

将肿瘤细胞（人食管癌eca109细胞）播种在24孔板后（1×10⁴/孔）；

将纳米颗粒悬浮液加入到24孔板(实验方法与步骤同前述细胞毒性试验)，最终形成浓度为100μg/ml，溶液体积为1ml；

共孵育24小时后，胰酶消化，pbs洗3遍，加入5μl的annexinv染料，避光继续孵育20min后，上机前加入5微升pi染料。

流式细胞检测结果如图6所示。数据记录表明：空白对照组、g@tio2@ps-nss、go@tio2@ps-nss、ps-nss、free-ps组凋亡率分别为(2.39%±0.86%)，(32.89%±4.02%)，(38.53%±4.89%)，(9.91%±3.18%)，(8.88%±2.58%)；对比可以看出，g@tio2@ps-nss、go@tio2@ps-nss与空白对照组比较，细胞凋亡率差异有统计学意义(p>0.05)。，也即，通过石墨烯或氧化石墨烯改性处理后，明显提升了光敏剂的应用效果。