本发明涉及药物提取技术领域，具体是一种山豆根提取物的制备方法及山豆根提取物的应用。
背景技术：
在我国鼻咽癌已经成为耳鼻咽喉恶性肿瘤的主要癌种和病死因素，在中国南部两广地区(如广东、广西等)尤其高发，发病率由南向北递减。发病率在20岁以上的人群中随着年龄增长递增，在45～60岁左右达到峰值。鼻咽癌的病因可能与遗传、环境和eb病毒感染等因素有关，目前比较有效的治疗手段提倡调强放疗。未来随着我国人口老龄化不断加重，鼻咽癌的发病、死亡水平可能还将不断上升，而由此带来的癌症负担也将持续增长，防控形势严峻，而目前有效治疗鼻咽癌的药物十分紧缺。
山豆根，为豆科植物越南槐的干燥根和根茎，其苦，寒；有毒。有清热解毒，消肿利咽之功效，常用于火毒蕴结，乳蛾喉痹，咽喉肿痛，齿龈肿痛，口舌生疮。研究表明，山豆根主要含生物碱、黄酮及多糖类等成分，目前从山豆根分离得到生物碱类成分有20多种，以苦参碱、氧化苦参碱为主。已有动物实验表明，山豆根提取物对在体肿瘤生长有较好的抑制作用，其水提物能抑制多种肿瘤生长。现有技术的提取方法得到的山豆根提取物对于抗鼻咽癌肿瘤的抑制率低，效果差。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种山豆根提取物的制备方法及山豆根提取物的应用，制备的山豆根提取物对于鼻咽癌细胞cne-1和cne-2的生长具有非常好的抑制作用，可用于治疗鼻咽癌。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种山豆根提取物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、提取：将山豆根粉碎后过筛得山豆根粗粉，将山豆根粗粉与乙醇水溶液按照1g:8～12ml混合，浸提3～6天后得到第一浸提液，并将浸提过程中产生的滤渣与乙醇水溶液按照1g:8～12ml混合，再次浸提3～6天后得到第二浸提液，合并第一浸提液和第二浸提液得到浸提液，其中，乙醇水溶液的体积分数为50％～80％；
步骤二、浓缩：将浸提液减压处理至无乙醇味为止，得到浓缩液；
步骤三、萃取：浓缩液酸化至ph为3～4，用乙酸乙酯萃取，萃取时浓缩液与乙酸乙酯的体积比为1:1～3，得到萃取液；
步骤四、洗脱：将萃取液减压旋蒸得浸膏，浸膏用5～8倍重量的纯净水溶解后过大孔树脂柱进行吸附处理，吸附完成后用乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液中乙醇的含量为5％～95％；
步骤五、过滤：向洗脱液中加入8～10倍体积的纯净水在8～10mpa的压力下进行膜分离过滤处理，得到过滤液；
步骤六、干燥：过滤液采用反渗透膜或纳滤膜在8～10mpa的压力下浓缩干燥，得到山豆根提取物。
优选的是，步骤一中的提取还可以通过以下过程进行：将山豆根粉碎后过筛得山豆根粗粉，将山豆根粗粉与乙醇水溶液按照1g:8～12ml混合，加热至60～80℃，提取1～1.5小时，得到第一浸提液，并收集提取过程中的滤渣再与乙醇水溶液按照1g:8～12ml混合，加热至60～80℃，提取1～1.5小时，得到第二浸提液，合并第一浸提液和第二浸提液得到浸提液，其中，乙醇水溶液的体积分数为50％～80％。
优选的是，步骤二中浓缩时的温度为40～70℃，压力为0.1～0.8mpa。
优选的是，步骤三中萃取具体为：浓缩液与乙酸乙酯按照体积比为1:1～3混合，搅拌均匀，静置分层，取乙酸乙酯层液体，得萃取液i，再将剩余的水相液体与乙酸乙酯按照体积比为1:1～3混合，搅拌均匀，静置分层，再取乙酸乙酯层液体，得萃取液ii，萃取液ii，再将剩余的水相液体与乙酸乙酯按照体积比为1:1～3混合，搅拌均匀，静置分层，再取乙酸乙酯层液体，得萃取液iii，合并萃取液i、萃取液ii、萃取液iii，得到萃取液。
优选的是，步骤四中大孔树脂柱的径高比为1:8～12，吸附完成后，先用3～10倍大孔树脂柱体积的纯净水洗脱，弃去水洗液，再用8～10倍大孔树脂柱体积的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，其中，乙醇水溶液的体积分数依次为20％、40％、60％、80％、95％。
优选的是，步骤五中过滤时采用微孔滤膜过滤器进行膜分离过滤处理，微孔滤膜过滤器的孔径为500d或1kd或5kd或10kd。
优选的是，步骤四中的洗脱操作可以替换为离心操作，具体为：向步骤三得到的萃取液中加入体积分数为50～65％的乙醇水溶液，混合离心、过滤后，得到离心液，再将离心液进行步骤五中的过滤操作。
所述的山豆根提取物的制备方法得到的抗鼻咽癌提取物。
所述的制备方法制备的山豆根提取物在抗鼻咽癌药物中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明制备的山豆根提取物对于鼻咽癌cne-1细胞株具有较强的抑制生长作用，其于54.50μg/ml作用cne-1细胞48小时后，到达了半数抑制生长的效果；对于鼻咽癌cne-2细胞株具有较强的抑制生长作用，其于38.10μg/ml作用cne-2细胞48小时后，到达了半数抑制生长的效果。本发明制备的山豆根提取物对于鼻咽癌细胞cne-1和cne-2的生长具有非常好的抑制作用，当加入的山豆根提取物的浓度达到100μg/ml时，48小时后，对于鼻咽癌细胞cne-1的抑制率高达86.95％，对于鼻咽癌细胞cne-2的抑制率高达96.13％，
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
<实施例1>
步骤一、提取：将山豆根粉碎后过筛得山豆根粗粉，将山豆根粗粉与乙醇水溶液按照1g:8ml混合，浸提3天后得到第一浸提液，并将浸提过程中产生的滤渣与乙醇水溶液按照1g:8ml混合，再次浸提3天后得到第二浸提液，合并第一浸提液和第二浸提液得到浸提液，其中，乙醇水溶液的体积分数为50％；
步骤二、浓缩：将浸提液置于提取浓缩罐中减压处理至无乙醇味为止，得到浓缩液；步骤二中浓缩时的温度为40℃，压力为0.1mpa。
步骤三、萃取：浓缩液用盐酸酸化至ph为3～4，用乙酸乙酯萃取，萃取时浓缩液与乙酸乙酯的体积比为1:1，得到萃取液；步骤三中萃取具体为：浓缩液与乙酸乙酯按照体积比为1:1混合，搅拌均匀，静置分层，取乙酸乙酯层液体，得萃取液i，再将剩余的水相液体与乙酸乙酯按照体积比为1:1混合，搅拌均匀，静置分层，再取乙酸乙酯层液体，得萃取液ii，再将剩余的水相液体与乙酸乙酯按照体积比为1:1混合，搅拌均匀，静置分层，再取乙酸乙酯层液体，得萃取液iii，合并萃取液i、萃取液ii、萃取液iii，得到萃取液。
步骤四、洗脱：将萃取液减压旋蒸得浸膏，浸膏用5倍重量的纯净水溶解后过大孔树脂柱进行吸附处理，吸附完成后用乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液中乙醇的含量为5％；步骤四中大孔树脂柱的径高比为1:8，吸附完成后，先用3倍大孔树脂柱体积的纯净水洗脱，弃去水洗液，再用8倍大孔树脂柱体积的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，其中，乙醇水溶液的体积分数依次为20％、40％、60％、80％、95％。
步骤五、过滤：向洗脱液中加入8倍体积的纯净水置于微孔滤膜过滤器中，在8mpa的压力下进行膜分离过滤处理，得到过滤液；步骤五中微孔滤膜过滤器的孔径为500d或1kd或5kd或10kd。
步骤六、干燥：过滤液采用反渗透膜或纳滤膜在8mpa的压力下浓缩干燥，得到山豆根提取物。
<实施例2>
步骤一、提取：将山豆根粉碎后过筛得山豆根粗粉，将山豆根粗粉与乙醇水溶液按照1g:10ml混合，浸提5天后得到第一浸提液，并将浸提过程中产生的滤渣与乙醇水溶液按照1g:10ml混合，再次浸提5天后得到第二浸提液，合并第一浸提液和第二浸提液得到浸提液，其中，乙醇水溶液的体积分数为70％；
步骤二、浓缩：将浸提液置于提取浓缩罐中减压处理至无乙醇味为止，得到浓缩液；步骤二中浓缩时的温度为50℃，压力为0.4mpa。
步骤三、萃取：浓缩液用盐酸酸化至ph为3～4，用乙酸乙酯萃取，萃取时浓缩液与乙酸乙酯的体积比为1:2，得到萃取液；步骤三中萃取具体为：浓缩液与乙酸乙酯按照体积比为1:2混合，搅拌均匀，静置分层，取乙酸乙酯层液体，得萃取液i，再将剩余的水相液体与乙酸乙酯按照体积比为1:2混合，搅拌均匀，静置分层，再取乙酸乙酯层液体，得萃取液ii，再将剩余的水相液体与乙酸乙酯按照体积比为1:2混合，搅拌均匀，静置分层，再取乙酸乙酯层液体，得萃取液iii，合并萃取液i、萃取液ii、萃取液iii，得到萃取液。
步骤四、洗脱：将萃取液置于旋转薄膜蒸发仪中减压旋蒸得浸膏，浸膏用7倍重量的纯净水溶解后过大孔树脂柱进行吸附处理，吸附完成后用乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液中乙醇的含量为55％；步骤四中大孔树脂柱的径高比为1:10，吸附完成后，先用8倍大孔树脂柱体积的纯净水洗脱，弃去水洗液，再用10倍大孔树脂柱体积的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，其中，乙醇水溶液的体积分数依次为20％、40％、60％、80％、95％。
步骤五、过滤：向洗脱液中加入10倍体积的纯净水利用振荡器充分混合均匀，置于微孔滤膜过滤器中，在10mpa的压力下进行膜分离过滤处理，得到过滤液；步骤五中微孔滤膜过滤器的孔径为500d或1kd或5kd或10kd。
步骤六、干燥：过滤液采用反渗透膜或纳滤膜在10mpa的压力下浓缩干燥，得到山豆根提取物。
<实施例3>
步骤一、提取：将山豆根粉碎后过筛得山豆根粗粉，将山豆根粗粉与乙醇水溶液按照1g:12ml混合，浸提6天后得到第一浸提液，并将浸提过程中产生的滤渣与乙醇水溶液按照1g:12ml混合，再次浸提6天后得到第二浸提液，合并第一浸提液和第二浸提液得到浸提液，其中，乙醇水溶液的体积分数为80％；
步骤二、浓缩：将浸提液置于提取浓缩罐中减压处理至无乙醇味为止，得到浓缩液；步骤二中浓缩时的温度为70℃，压力为0.8mpa。
步骤三、萃取：浓缩液用盐酸酸化至ph为3～4，用乙酸乙酯萃取，萃取时浓缩液与乙酸乙酯的体积比为1:3，得到萃取液；步骤三中萃取具体为：浓缩液与乙酸乙酯按照体积比为1:3混合，搅拌均匀，静置分层，取乙酸乙酯层液体，得萃取液i，再将剩余的水相液体与乙酸乙酯按照体积比为1:3混合，搅拌均匀，静置分层，再取乙酸乙酯层液体，得萃取液ii，再将剩余的水相液体与乙酸乙酯按照体积比为1:3混合，搅拌均匀，静置分层，再取乙酸乙酯层液体，得萃取液iii，合并萃取液i、萃取液ii、萃取液iii，得到萃取液。
步骤四、洗脱：将萃取液减压旋蒸得浸膏，浸膏用8倍重量的纯净水溶解后过大孔树脂柱进行吸附处理，吸附完成后用乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液中乙醇的含量为5％～10％；步骤四中大孔树脂柱的径高比为1:12，吸附完成后，先用6倍大孔树脂柱体积的纯净水洗脱，弃去水洗液，再用10倍大孔树脂柱体积的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，其中，乙醇水溶液的体积分数依次为20％、40％、60％、80％、95％。
步骤五、过滤：向洗脱液中加入2-10倍体积的纯净水置于微孔滤膜过滤器中，在10mpa的压力下进行膜分离过滤处理，得到过滤液；步骤五中微孔滤膜过滤器的孔径为500d或1kd或5kd或10kd。
步骤六、干燥：过滤液采用反渗透膜或纳滤膜在10mpa的压力下浓缩干燥，得到山豆根提取物。
<实施例4>
将实施例1中步骤一的提取替换为如下操作：
将山豆根粉碎后过筛得山豆根粗粉，将山豆根粗粉与乙醇水溶液按照1g:8ml混合，加热至60℃，提取1小时，得到第一浸提液，并收集提取过程中的滤渣再与乙醇水溶液按照1g:8ml混合，加热至60℃，提取1小时，得到第二浸提液，合并第一浸提液和第二浸提液得到浸提液，其中，乙醇水溶液的体积分数为50％。
其余过程及操作与实施例1中相同。
<实施例5>
将实施例2中步骤一的提取替换为如下操作：
将山豆根粉碎后过筛得山豆根粗粉，将山豆根粗粉与乙醇水溶液按照1g:10ml混合，加热至70℃，提取1.2小时，得到第一浸提液，并收集提取过程中的滤渣再与乙醇水溶液按照1g:10ml混合，加热至70℃，提取1.2小时，得到第二浸提液，合并第一浸提液和第二浸提液得到浸提液，其中，乙醇水溶液的体积分数为60％。
其余过程及操作与实施例2中相同。
<实施例6>
将实施例3中步骤一的提取替换为如下操作：
将山豆根粉碎后过筛得山豆根粗粉，将山豆根粗粉与乙醇水溶液按照1g:12ml混合，加热至80℃，提取1.5小时，得到第一浸提液，并收集提取过程中的滤渣再与乙醇水溶液按照1g:12ml混合，加热至80℃，提取1.5小时，得到第二浸提液，合并第一浸提液和第二浸提液得到浸提液，其中，乙醇水溶液的体积分数为80％。
<实施例7>
将实施例2中步骤四的洗脱可以替换为如下的离心操作：
向步骤三得到的萃取液中加入体积分数为50％的乙醇水溶液，混合离心、过滤后，得到离心液，再将离心液进行步骤五中的过滤操作。
其余过程及操作与实施例2中相同。
<实施例8>
将实施例2中步骤四的洗脱可以替换为如下的离心操作：
向步骤三得到的萃取液中加入体积分数为55％的乙醇水溶液，混合离心、过滤后，得到离心液，再将离心液进行步骤五中的过滤操作。
其余过程及操作与实施例2中相同。
<实施例9>
将实施例2中步骤四的洗脱可以替换为如下的离心操作：
向步骤三得到的萃取液中加入体积分数为65％的乙醇水溶液，混合离心、过滤后，得到离心液，再将离心液进行步骤五中的过滤操作。
其余过程及操作与实施例2中相同。
<抗鼻咽癌效果试验>
以实施例2制得的山豆根提取物进行抗鼻咽癌效果试验，此试验中实施例2在制备山豆根提取物的过程中，过滤时选用的微孔滤膜过滤器的孔径为1kd。
试验一、通过mtt实验发现制得的山豆根提取物对于鼻咽癌细胞cne-1具有特别明显的生长抑制效果。
实验材料
四甲基偶氮唑盐(mtt)和dmso购自于美国sigma公司。
实验方法
空白对照组：100μl的密度为2×104个/ml的细胞悬液和100μl的rpmi-1640培养基。
阴性对照组：100μl的密度为2×104个/ml的细胞悬液和100μl的含0.1％dmso的rpmi-1640培养基。
实验组：100μl的密度为2×104个/ml的细胞悬液和和分别加入100μl浓度分别为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml的实施例2制备的山豆根提取物。并按照山豆根提取物的浓度对应分组。
取对数生长期鼻咽癌细胞cne-1，消化混悬成浓度为2×104个/ml单个细胞，取100μl接种于96孔板，按上述浓度分组接种细胞，96孔板放入37℃、5％co2的饱和湿度培养箱中，12h后按分组给予浓度梯度分别为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml的山豆根提取物于96孔板中作用48小时，每孔加入20μl、5mg/mlmtt，在37℃、5％co2的饱和湿度培养箱中孵育4h后，移去上清液，加入150μldmso，在微量振荡器振荡10min致结晶完全溶解后于570nm处测定od值，6个平行复孔的平均值为一次实验结果。实验独立重复三次。用excel计算ic50值。
细胞增殖率＝(治疗组od平均值-空白组od平均值)/(阴性组od平均值-空白组od平均值)×100
抑制率＝100％-细胞增殖率
当细胞的抑制率达到50％时的浓度即为ic50值。实验数据均用平均值±标准误差表示，采用统计spss11.5软件进行分析，以one-wayanova方式进行方差分析，两两比较采用lsd法，p＜0.01为具有统计学显著性差异标准。
实验结果
结果如表1所示，山豆根提取物对于cne-1细胞株具有较强的抑制生长作用，其于54.50μg/ml作用cne-1细胞48小时后，到达了半数抑制生长的效果，可以用于制备抗鼻咽癌药物。
试验二、通过mtt实验发现山豆根提取物对于鼻咽癌细胞cne-2具有特别明显的生长抑制效果。
实验材料
四甲基偶氮唑盐(mtt)和dmso购自于美国sigma公司。
实验方法
空白对照组：100μl的密度为2×104个/ml的细胞悬液和100μl的rpmi-1640培养基。
阴性对照组：100μl的密度为2×104个/ml的细胞悬液和100μl的含0.1％dmso的rpmi-1640培养基。
实验组：100μl的密度为2×104个/ml的细胞悬液和和分别加入100μl浓度分别为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml的实施例2制备的山豆根提取物。并按照山豆根提取物的浓度对应分组。
取对数生长期鼻咽癌细胞cne-2，消化混悬成浓度为2×104个/ml单个细胞，取100μl接种于96孔板，按上述浓度分组接种细胞，96孔板放入37℃、5％co2的饱和湿度培养箱中，12h后按分组给予浓度梯度分别为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml的山豆根提取物于96孔板中作用48小时，每孔加入20μl、5mg/mlmtt，在37℃、5％co2的饱和湿度培养箱中孵育4h后，移去上清液，加入150μldmso，在微量振荡器振荡10min致结晶完全溶解后于570nm处测定od值，6个平行复孔的平均值为一次实验结果。实验独立重复三次。用excel计算ic50值。
细胞增殖率＝(治疗组od平均值-空白组od平均值)/(阴性组od平均值-空白组od平均值)×100
抑制率＝100％-细胞增殖率
当细胞的抑制率达到50％时的浓度即为ic50值。实验数据均用平均值±标准误差表示，采用统计spss11.5软件进行分析，以one-wayanova方式进行方差分析，两两比较采用lsd法，p＜0.01为具有统计学显著性差异标准。
实验结果
结果如表1所示，山豆根提取物对于cne-2细胞株具有较强的抑制生长作用，其于38.10μg/ml作用cne-2细胞48小时后，到达了半数抑制生长的效果，这说明对于抑制鼻咽癌细胞cne-2的生长特别有效，可以用于制备抗鼻咽癌药物。
表1
同时，为了证明本发明制备的山豆根提取物的抗鼻咽癌的效果，将实验效果数据与对比例1进行比较，对比例1为现有技术中将山豆根粉碎后，用水于90-100℃加热提取，提取液浓缩，醇沉，离心除去沉淀，减压浓缩除去乙醇，得提取液；或者用40％-95％乙醇于80℃水浴加热提取，冷却，离心，浓缩除去乙醇，得提取液；用乙酸乙酯萃取提取液，乙酸乙酯萃取液进行硅胶柱分离，洗脱剂为不同体积比的二氯甲烷-甲醇，收集二氯甲烷与甲醇体积比为50:1比例的洗脱液，回收有机溶剂后即得山豆根抗肿瘤有效组分提取物。对比例1制得的山豆根抗肿瘤有效组分提取物的浓度为100μg/ml时，对于肿瘤细胞的抑制率只有68.14％。
由表1可知，本发明制备的山豆根提取物对于鼻咽癌细胞cne-1和cne-2的生长具有非常好的抑制作用，当加入的山豆根提取物的浓度达到100μg/ml时，48小时后，对于鼻咽癌细胞cne-1的抑制率高达86.95％，对于鼻咽癌细胞cne-2的抑制率高达96.13％，远远高于现有技术。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。