一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法与流程

本发明涉及生物干细胞技术领域，尤其涉及一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法。

背景技术：

脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一类多能干细胞，来源于发育早期的中胚层，具有多向分化潜能、免疫调节作用、旁分泌作用且免疫原性低，不会引起排斥反应等功能，因此受到人们的广泛关注，具有广阔的前景。

本发明利用的就是脐带间充质干细胞的旁分泌作用。脐带间充质干细胞在培养过程中会分泌多种细胞生长因子，包括表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、肝细胞生长因子(hgf)、血管内皮生长因子(vegf)、神经生长因子(ngf)等。这些细胞因子具有调节机体免疫、促进细胞增殖、促进血管再生等功能，对受损皮肤、敏感皮肤以及改建性皮肤具有良好的修复、护理作用，能淡化色斑、恢复皮肤的光滑与弹性、减少皱纹、改善皮肤老化问题，促进伤口快速愈合，避免形成疤痕等，但是如何能够制备相关药剂，使其能够显著提高皮肤伤口的愈合速度，并且改善皮肤老化问题成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法，该凝胶能够显著提高皮肤伤口的愈合速度，还可以改善皮肤老化问题。

本发明是通过以下技术方案予以实现：一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)脐带间充质干细胞的分离培养鉴定：

a.脐带取样以及检测：取健康足月新生儿脐带8-12cm，置于含有脐带保存液的采集瓶中保存运输，另外采集母体外周血3-5ml用于病毒五项检测；

b.脐带清洗：用浸润有75％酒精的纱布对采集瓶外部进行消毒，然后在生物安全柜内打开瓶盖，用止血钳取出脐带置于200ml无菌杯中用75％酒精浸润2-4秒后迅速取出，并转移到一个新的200ml无菌杯中，然后用生理盐水将脐带反复清洗3-5次；

c.脐带处理：将脐带放置在盛有生理盐水的无菌平皿中，用止血钳挤压血管排空血管中的血液，用生理盐水继续清洗干净；用止血钳挤压脐带排除水分后放入100ml无菌烧杯中，用无菌剪刀将脐带剪成1mm³左右均匀的组织块；

d.脐带间充质干细胞培养：使用无菌药匙将组织块均匀接种于t75培养瓶中，每瓶150-300块，然后将培养瓶竖起，沿未接种组织块的一面瓶壁加入15ml原代无酚完全培养基；拧上瓶盖，翻转培养瓶，使接种组织块的瓶壁在上，放置于37℃，5％co2的培养箱中静置贴壁4h以上；之后翻转培养瓶，让培养基完全浸润每一块组织块，置于培养箱中培养；前七天保持培养瓶静止，第七天半量换液，第十二天观察到较多纤维状细胞爬出，此时工作人员去除组织块，半量换液继续培养，待细胞融合度>80％时用tryple将贴壁细胞消化下来接种到t175培养瓶中加入40ml扩增无酚完全培养基传代培养；每当细胞融合度达到80％-90％时传代一次，每次按1:3到1:6比例传代，直到p6代；

(2)脐带间充质干细胞上清液：收集每次传代时获得的细胞至500ml离心杯中，放到离心机内以3000rpm转速、时间持续30min进行离心得到脐带间充质干细胞上清液，将上清转移到nalgene1000ml方形瓶中储存备用；

(3)凝胶的配制：称取凝胶粉末1份和3份丙二醇一起灭菌，将灭菌好的凝胶粉末添加到丙二醇中，再依次加入2份dmso、35份无菌pbs，于冰箱内4摄氏度静置溶胀24h，然后再用磁力搅拌器搅拌48h得到凝胶。

(4)具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备：向步骤(2)脐带间充质干细胞上清液中加入医用苯扎溴铵，每升加入3ml的5％医用苯扎溴铵；再按1:2比例加入步骤(3)凝胶混合均匀，按3ml/支分装到预充式注射器中；将推杆推进预充管体内使管体倒转后管内的液体无法流出为准，用手指将针帽拧开，再推动推杆，使管体内的空气排除，管体内液体无法流出为最佳，然后拧紧针帽，具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶制备完成。

根据上述技术方案，优选地，脐带保存液包括50mlhyclonedmem/f-12培养基以及100u/ml庆大霉素；原代无酚完全培养基包括hyclonedmem/f-12的无酚红培养基以及体积浓度2％的血清替代物；扩增无酚完全培养基包括hyclonedmem/f-12无酚红培养基以及体积浓度1％血清替代物。

根据上述技术方案，优选地，按照份数比，凝胶粉末包括8份海藻酸丙二醇酯、2份普鲁兰以及1份硬脂酸钠。

本发明的有益效果是：

(1)采用了血清替代物代替胎牛血清培养脐带间充质干细胞，有效避免了细胞上清液中残留胎牛血清中的动物源成分，提高了产品的安全性，适合各种哺乳动物包括人类使用。

(2)本发明凝胶内含有细胞生长因子，可以与表皮细胞发生作用，促进上皮细胞新陈代谢，迅速修复受损细胞，加速表面伤口愈合，避免形成疤痕，同时还能使老化的皮肤恢复光滑与弹性。

附图说明

图1示出了根据本发明的实施例的制备流程示意图。

图2示出了根据本发明的实施例的原代脐带间充质干细胞示意图。

图3示出了根据本发明的实施例的p6代脐带间充质干细胞示意图。

图4示出了根据本发明的实施例的脐带间充质干细胞表面标志物cd105检测结果示意图。

图5示出了根据本发明的实施例的脐带间充质干细胞表面标志物cd34检测结果示意图。

具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

如图所示，本发明提供了一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)脐带间充质干细胞的分离培养鉴定：

a.脐带取样以及检测：取健康足月新生儿脐带8-12cm，置于含有脐带保存液的采集瓶中保存运输，另外采集母体外周血3-5ml用于病毒五项检测；

b.脐带清洗：用浸润有75％酒精的纱布对采集瓶外部进行消毒，然后在生物安全柜内打开瓶盖，用止血钳取出脐带置于200ml无菌杯中用75％酒精浸润2-4秒后迅速取出，并转移到一个新的200ml无菌杯中，然后用生理盐水将脐带反复清洗3-5次；

c.脐带处理：将脐带放置在盛有生理盐水的无菌平皿中，用止血钳挤压血管排空血管中的血液，用生理盐水继续清洗干净；用止血钳挤压脐带排除水分后放入100ml无菌烧杯中，用无菌剪刀将脐带剪成1mm³左右均匀的组织块；

d.脐带间充质干细胞培养：使用无菌药匙将组织块均匀接种于t75培养瓶中，每瓶150-300块，然后将培养瓶竖起，沿未接种组织块的一面瓶壁加入15ml原代无酚完全培养基；拧上瓶盖，翻转培养瓶，使接种组织块的瓶壁在上，放置于37℃，5％co2的培养箱中静置贴壁4h以上；之后翻转培养瓶，让培养基完全浸润每一块组织块，置于培养箱中培养；前七天保持培养瓶静止，第七天半量换液，第十二天观察到较多纤维状细胞爬出，此时工作人员去除组织块，半量换液继续培养，待细胞融合度>80％时用tryple将贴壁细胞消化下来接种到t175培养瓶中加入40ml扩增无酚完全培养基传代培养；每当细胞融合度达到80％-90％时传代一次，每次按1:3到1:6比例传代，直到p6代；

(2)脐带间充质干细胞上清液：收集每次传代时获得的细胞至500ml离心杯中，放到离心机内以3000rpm转速、时间持续30min进行离心得到脐带间充质干细胞上清液，将上清转移到nalgene1000ml方形瓶中储存备用；

(3)凝胶的配制：称取凝胶粉末1份和3份丙二醇一起灭菌，将灭菌好的凝胶粉末添加到丙二醇中，再依次加入2份dmso、35份无菌pbs，于冰箱内4摄氏度静置溶胀24h，然后再用磁力搅拌器搅拌48h得到凝胶。

(4)具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备：向步骤(2)脐带间充质干细胞上清液中加入医用苯扎溴铵，每升加入3ml的5％医用苯扎溴铵；再按1:2比例加入步骤(3)凝胶混合均匀，按3ml/支分装到预充式注射器中；将推杆推进预充管体内使管体倒转后管内的液体无法流出为准，用手指将针帽拧开，再推动推杆，使管体内的空气排除，管体内液体无法流出为最佳，然后拧紧针帽，具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶制备完成。

根据上述实施例，优选地，脐带保存液包括50mlhyclonedmem/f-12培养基以及100u/ml庆大霉素；原代无酚完全培养基包括hyclonedmem/f-12的无酚红培养基以及体积浓度2％的血清替代物；扩增无酚完全培养基包括hyclonedmem/f-12无酚红培养基以及体积浓度1％血清替代物。

根据上述实施例，优选地，按照份数比，凝胶粉末包括8份海藻酸丙二醇酯、2份普鲁兰以及1份硬脂酸钠。

本发明的有益效果是：

(1)采用了血清替代物代替胎牛血清培养脐带间充质干细胞，有效避免了细胞上清液中残留胎牛血清中的动物源成分，提高了产品的安全性，适合各种哺乳动物包括人类使用。

(2)本发明凝胶内含有细胞生长因子，可以与表皮细胞发生作用，促进上皮细胞新陈代谢，迅速修复受损细胞，加速表面伤口愈合，避免形成疤痕，同时还能使老化的皮肤恢复光滑与弹性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。