一种靶向双包埋聚合物囊泡及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物医药领域，涉及一种靶向双包埋聚合物囊泡及其制备方法与应用。

背景技术

众所周知，肿瘤的多药耐药是导致肿瘤化疗失败的主要原因。单一的抗肿瘤药物对肿瘤细胞毒性很难达到有效治疗的目的，多种抗肿瘤药物的协同作用正成为肿瘤治疗的一种新的手段。幸运的是，一些生物相容性的两亲性高分子材料形成的囊泡可以作为一种药物载体，通过把疏水性药物包埋在双层的外壳中，亲水性药物包裹在内核中，在进一步修饰囊泡表面后，可以靶向作用于肿瘤细胞，从而提高癌症的治疗效果。所谓两亲性高分子，也就是含有亲水链段和疏水链段的高分子材料。其中外消旋聚丙交酯[poly(d,l-lacticacid),pdlla]和聚乙交酯[poly(glycolide),pga]就是一类常常被选用的疏水链段，因为它既具有生物相容性又具有生物可降解性，也已被美国fda批准使用。它在人体内可以降解成为小分子，从而易于被排出体外，所以它被广泛应用于生物医药领域。作为一种药物载体，pluronic本身就具有很好的生物相容性，而且已经商业化使用。其次，pluronic结构中的peo嵌段的羟基具有良好的可修饰性，可以进一步改造，因此被科学家们广泛研究。

在药物释放体系中，获得一种新型结构，且能够高效治疗癌症的药物载体是亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种由五嵌段聚合物形成的新型叶酸靶向的聚合物囊泡即叶酸-pluronic-聚(d,l-丙交酯-b-乙交酯)(fa-f127-pdllaga)，能够同时包埋亲水性和疏水性药物分子，并靶向作用于肿瘤细胞。同时还提供了该聚合物的制备方法以及包埋方法。

本发明聚合物具体结构式如下：

其合成路线如图2，具体制备方法是：

(1)按照重量比，先将干燥过的叶酸(folicacid,fa)(0.77-0.91g,1.75-2.07mmol)与1,3-二环己基碳二亚胺(dcc)(0.36g,1.75mmol)加入50ml无水dmso溶液中，并在室温下搅拌24h。接着将干燥后的f127(20g,1.59mmol)和4-二甲氨基吡啶(dmap)(0.02mg,0.17mmol)加到fa与dcc的混合溶液中，置于室温下搅拌48h。然后将上述的混合液离心(5000rpm,5min)，于透析袋(mwco＝3.5kda)中用8-10倍体积的dmso透析，分别在3h、5h、8h各换液一次。若有沉淀，低速离心除去。接着在去离子水中透析3天后，使用旋转蒸发仪把透析袋中的溶液低温缓慢旋干得到的沉淀即为fa-f127-oh。

(2)用fa-f127-oh做大分子引发剂和辛酸亚锡([sn(oct)2])为催化剂，在无水、无氧的条件下，引发环状单体d,l-丙交酯(d,l-lactide,d,l-la)和乙交酯(ga)进行开环聚合反应，最终得到所需的共聚物。具体合成方法为：反应瓶通过多次抽真空-通氩气除氧除湿后，在通氩气条件下加入fa-f127-oh、d,l-la、ga和sn(oct)2，d,l-la的量为fa-f127-oh重量的70％，ga的量为fa-f127-oh重量的80％，辛酸亚锡的量为d,l-la和ga单体总投料重量的0.1-0.15％，将反应物加热至140-160℃，在搅拌下反应持续7-9小时；将反应物用二氯甲烷溶解，然后沉入甲醇中，有白色物质沉出，过滤；然后再用二氯甲烷溶解聚合物，并沉入甲醇中，过滤，干燥，得到fa-f127-pdllaga共聚物；通过核磁共振(nmr)和fa紫外全扫描的手段表征共聚物fa-f127-pdllaga，确定其结构特征和含量。

(3)称量fa-f127-pdllaga和紫杉醇(ptx)按重量比5：1溶解于1-2mldmf中，盐酸阿霉素(dox·hcl)溶解于适量的pbs中，涡旋震荡3-5min或超声1-2min以助其完全溶解，其中dox的量为聚合物的50％，pbs的量与聚合物的量相同；然后将dmf溶液在温和的搅拌条件下逐滴缓慢的滴加到pbs溶液中，滴完后再搅拌1-2h；再将混合后的溶液转移到透析袋中(mwco＝3500)，透析5.5h，分别在0.5h、1h、2h、2h换一次去离子水，以便除去未包埋的dox和ptx。待透析完成后，低速离心(3000rpm,5min)，即为所需的纳米粒子溶液。ptx含量通过高效液相色谱(hplc)在227nm处检测得到；dox含量通过紫外分光光度计在480nm处检测得到。

本发明提供的聚合物是一个具有新型化学结构和靶向功能的药物载体，并且能同时包埋疏水和亲水性药物来协同作用，从而靶向治疗肿瘤细胞。与现有的fa-f127-pla相比，外消旋的pdlla是无定形结构，而pla是半结晶结构。与pla相比，pdllaga的结晶度更低亲水性更高。因此，与fa-f127-pla相比，fa-f127-pdllaga应该将更有利于进行两亲性药物的包埋。

附图说明

图1为本发明fa-f127-pdlla的化学结构式；

图2为本发明聚合物合成路线；

图3为本发明聚合物的核磁图谱；

图4为fa紫外全扫描图谱；

图5为本发明聚合物所形成纳米粒子的表征结果。

具体实施方式

实施例1

1、按照重量比，先将干燥过的叶酸(folicacid,fa)(0.77g,1.75)与1,3-二环己基碳二亚胺(dcc)(0.36g,1.75mmol)加入50ml无水dmso溶液中，并在室温下搅拌24h。接着将干燥后的f127(20g,1.59mmol)和4-二甲氨基吡啶(dmap)(0.02mg,0.17mmol)加到fa与dcc的混合溶液中，置于室温下搅拌48h。然后将上述的混合液离心(5000rpm,5min)，于透析袋(mwco＝3.5kda)中用8倍体积的dmso透析，分别在3h、5h、8h各换液一次。若有沉淀，低速离心除去。接着在去离子水中透析3天后，待透析完后用8％的nahco3溶液萃取反应液以除去未反应的fa等杂质。然后将萃取液使用旋转蒸发仪低温缓慢旋干。旋干后再用ch2cl2溶解，加入冰乙醚中纯化，反复两次，取沉淀烘干后即为fa-f127-oh。所得共聚物称重为10.60g,产率为51.19％。

2、反应瓶通过抽真空-通氩气除氧除湿后，在氩气条件下加入fa-f127-oh4.07g、d,l-丙交酯2.82g、乙交酯3.22g和辛酸亚锡6mg，将反应物加热至120℃，搅拌下，反应持续6小时；将反应物二氯甲烷溶解，然后沉入甲醇中，有白色物质沉出，过滤；然后再用二氯甲烷溶解聚合物，并沉入甲醇中，过滤，干燥，最终得到fa-f127-pdllaga共聚物1.78g，产率为17.62％。

结构表征¹hnmr(400mhz,cdcl3,ppm):1.1-1.2(m,ch3ofppoblockinf127),1.5-1.7(m,ch3ofpdllablock),3.3-3.7(m,och2ch2ofpeoblockandoch2chofppoblockinf127),4.7-5.0(m,ch2ofpgablock),5.1-5.3(m,chofpdllablock),

制备得到的fa-f127-pdllaga共聚物的分子量和pdlla以及pga的链段含量由fa-f127-pdllaga的核磁谱图计算得到(核磁图谱如图3)，结果为fa-f127-pdllaga的分子量(mn)为38568，pdlla链段的含量为31.2wt％，pga链段的含量为36wt％，即相应聚合物的结构式为fa-peo100-ppo65-peo100-p(dlla168-b-ga240)。其中fa紫外全扫描图4所示，说明fa成功与f127连接。通过计算得到fa在聚合物fa-f127-pdllaga中的摩尔含量为12.75％。

3、纳米粒子的配制：称量fa-f127-pdllaga10mg和紫杉醇(ptx)2mg溶解于2mldmf中，盐酸阿霉素(dox·hcl)5mg溶解于10gpbs中，涡旋震荡5min或超声2min以助其完全溶解；然后将dmf溶液在温和的搅拌条件下逐滴缓慢的滴加到pbs溶液中，滴完后再搅拌1-2h；再将混合后的溶液转移到透析袋中(mwco＝3500)，透析5.5h，分别在0.5h、1h、2h、2h换一次去离子水，以便除去未包埋的dox和ptx。待透析完成后，低速离心(3000rpm,5min)，即为所需的纳米粒子溶液。

纳米粒子表征：纳米粒子的粒径、形态及大小可由zetaplus粒径仪和透射电子显微镜(tem)等方法检测得到。结果如图5，粒径大小为106.71±6.0，离散度0.298±0.005。

药物的包埋率和载药量：ptx含量由高效液相色谱(hplc)检测得到，紫外检测波长227nm，流动相为乙腈：水＝6：4，进样量100μl，流速1ml/min，柱温35℃。dox含量有紫外分光光度计检测得到，紫外检测波长为480nm。计算得到的ptx包埋率为3.31±0.6％，dox包埋率为13.88±1.59％。