一种用于治疗和/或预防心肌缺血再灌注损伤的药物组合物及其制备方法与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于治疗和/或预防心肌缺血再灌注损伤的药物组合物及其制备方法。

背景技术：

心血管病是我国发病率和死亡率最高的疾病之一，而急性心肌梗死由于发病突然、进展迅速、死亡率高而严重威胁国民健康。溶栓和介入等再灌注治疗措施通过迅速开通闭塞的冠脉，恢复心肌血供，成功挽救了很多心肌梗死患者的生命，成为治疗心肌梗死的首选方法。然而，再灌注治疗也可以导致心肌缺血再灌注损伤，主要表现是再灌注引起的心律失常、心肌顿抑、微血管阻塞(无复流现象)和再灌注引起的心肌纤维化及心肌细胞的死亡(hausenloydj,yellondm.myocardialischemia-reperfusioninjury:aneglectedtherapeutictarget.jclininvest,2013,123:92-100；vanderheiders,steenbergenc.cardioprotectionandmyocardialreperfusion:pitfallstoclinicalapplication.circres,2013,113:464-77.)。近年来，如何有效改善心肌缺血再灌注损伤的研究方兴未艾。缺血预适应、缺血后适应、药物干预、过饱和氧疗、超低温疗法等，但是，这些方法能够真正运用于临床实践的却乏善可陈(vanderheiders,steenbergenc.cardioprotectionandmyocardialreperfusion:pitfallstoclinicalapplication.circres,2013,113:464-77.)。因此，深入探讨心肌缺血再灌注损伤发生的机制，寻找有效的减轻缺血再灌注损伤的手段和方法，目前仍是心肌保护领域的研究热点。

既往研究证实，肾素-血管紧张素系统(ras)失平衡和自噬水平异常在心肌重构中起着重要作用(jiw,weis,haop,xingj,yuanq,wangj,xuf,cheny.aldehydedehydrogenase2hascardioprotectiveeffectsonmyocardialischaemia/reperfusioninjuryviasuppressingmitophagy.frontpharmacol.2016；7:101；haopp,liuyp,hough,zhangmx,chenyg,zhangy,zhangc.usefulnessofangiotensin-(1–7)topredictmyocardialsalvageafterpercutaneouscoronaryinterventioninpatientswithacutemyocardialinfarction.intjcardiol.2013；168:614-6；haopp,chenyg,liuyp,zhangmx,yangjm,gaof,zhangy,zhangc.associationofplasmaangiotensin-(1-7)levelandleftventricularfunctioninpatientswithtype2diabetesmellitus.plosone.2013；8:e62788.)。寻找ras和自噬共同的调控因子或药物是科学研究的难点，也是心肌重构和心力衰竭靶向治疗的迫切需求。

本发明前期研究显示，血管紧张素转化酶2(ace2)—血管紧张素-(1–7)[ang-(1–7)]—mas受体(masr)/血管紧张素ii(angii)2型受体(at2r)轴为心肌重构和心功能不全的评估和干预提供了新靶点和新思路(haopp,liuyp,hough,zhangmx,chenyg,zhangy,zhangc.usefulnessofangiotensin-(1–7)topredictmyocardialsalvageafterpercutaneouscoronaryinterventioninpatientswithacutemyocardialinfarction.intjcardiol.2013；168:614-6；haopp,chenyg,liuyp,zhangmx,yangjm,gaof,zhangy,zhangc.associationofplasmaangiotensin-(1-7)levelandleftventricularfunctioninpatientswithtype2diabetesmellitus.plosone.2013；8:e62788；haop,yangj,liuy,zhangm,zhangk,gaof,cheny,zhangc,zhangy.combinationofangiotensin-(1–7)withperindoprilisbetterthansingletherapyinamelioratingdiabeticcardiomyopathy.scirep.2015；5:8794；haopp,yangjm,zhangmx,zhangk,chenyg,zhangc,zhangy.angiotensin-(1-7)treatmentmitigatesrightventricularfibrosisasadistinctivefeatureofdiabeticcardiomyopathy.amjphysiolheartcircphysiol.2015；308:h1007-19；dongb,yuqt,daihy,gaoyy,zhouzl,zhangl,jiangh,gaof,lisy,zhangyh,bianhj,liucx,wangn,xuh,pancm,songhd,zhangc,zhangy.angiotensin-convertingenzyme-2overexpressionimprovesleftventricularremodelingandfunctioninaratmodelofdiabeticcardiomyopathy.jamcollcardiol.2012；59:739-47)。血管紧张素iv(angiv)与angii1型受体(at1r)和at2r的亲和力很弱，远低于angii和血管紧张素iii(angiii)，所以angiv一度被认为无生物学活性。随着近年来angiv特异性结合位点at4r的发现，angiv的生物学功能开始被研究和认识到。angiv可改善缺血再灌注和angii诱导的心肌损伤和功能异常(yangh,zengxj,wanghx,zhanglk,dongxl,guos,duj,lihh,tangcs.angiotensinivprotectsagainstangiotensinii-inducedcardiacinjuryviaat4receptor.peptides.2011；32:2108-15；parkbm,chasa,leesh,kimsh.angiotensinivprotectscardiacreperfusioninjurybyinhibitingapoptosisandinflammationviaat4rinrats.peptides.2016；79:66-74)。另外，angiv可抑制angii诱导的心肌细胞凋亡和肥厚，并抑制心肌成纤维细胞增殖和胶原合成(yangh,zengxj,wanghx,zhanglk,dongxl,guos,duj,lihh,tangcs.angiotensinivprotectsagainstangiotensinii-inducedcardiacinjuryviaat4receptor.peptides.2011；32:2108-15)。联合at4r基因沉默、at4r拮抗剂或下游信号通路pi3k-akt-mtor抑制剂后angiv的心肌保护作用减弱(yangh,zengxj,wanghx,zhanglk,dongxl,guos,duj,lihh,tangcs.angiotensinivprotectsagainstangiotensinii-inducedcardiacinjuryviaat4receptor.peptides.2011；32:2108-15；arkbm,chasa,leesh,kimsh.angiotensinivprotectscardiacreperfusioninjurybyinhibitingapoptosisandinflammationviaat4rinrats.peptides.2016；79:66-74.)。这提示，angiv可能发挥at4r依赖性的心血管保护作用。

自噬是将细胞内受损的蛋白质及细胞器运输到溶酶体内进行消化降解的过程。它是机体一种自我吞噬的过程。通过此过程，细胞可以降解掉自身不需要的成分，循环利用氨基酸以及其他可以被重新利用的物质。本发明前期研究结果显示，缺血再灌注可引起心肌细胞自噬过度激活，pink1/parkin介导的心肌细胞线粒体自噬在心肌缺血再灌注损伤的发生和发展中起着不可忽视的作用(jiw,weis,haop,xingj,yuanq,wangj,xuf,cheny.aldehydedehydrogenase2hascardioprotectiveeffectsonmyocardialischaemia/reperfusioninjuryviasuppressingmitophagy.frontpharmacol.2016；7:101.)。

近年来国内外研究报道，ras新老成员angii、at1r、at2r、ang-(1–7)和masr参与心肌细胞自噬的发生和调控。已知angii通过at1r促进心肌细胞产生自噬小体，而at2r抑制at1r对自噬的上调作用。最近研究报道，angii加重心肌细胞氧化应激并诱导自噬和心肌重构，而ang-(1–7)结合masr拮抗angii的这一作用(porrelloer,delbridgelm.cardiomyocyteautophagyisregulatedbyangiotensiniitype1andtype2receptors.autophagy.2009；5:1215-6；linl,liux,xuj,wengl,renj,gej,zouy.masreceptormediatescardioprotectionofangiotensin-(1-7)againstangiotensinii-inducedcardiomyocyteautophagyandcardiacremodellingthroughinhibitionofoxidativestress.jcellmolmed.2016；20:48-57.)。

氨肽酶n(aminopeptidasen，apn)又称为亮氨酸氨基肽酶、丙氨酰氨基肽酶、氨肽酶m和cd13，是一种高度保守的内在膜锌依赖性金属蛋白酶(velezjc,ierardijl,blandam,morinellita,arthurjm,raymondjr,janechmg.enzymaticprocessingofangiotensinpeptidesbyhumanglomerularendothelialcells.amjphysiolrenalphysiol.2012；302:f1583-94.)。已知氨肽酶n可通过裂解n末端精氨酸将angiii代谢为angiv(kongj,zhangk,mengx,zhangy,zhangc.dose-dependentbidirectionaleffectofangiotensinivonabdominalaorticaneurysmviavariableangiotensinreceptorstimulation.hypertension.2015；66:617-26)。尽管ras参与调控心肌细胞自噬，ras新成员angiv及上游代谢酶氨肽酶n是否参与调控细胞自噬尚未见报道。重组氨肽酶n能否作为一个新的药物用于心肌缺血再灌注损伤的治疗尚不明确。

技术实现要素：

本发明首次发现了重组apn蛋白对心肌损伤具有保护作用。基于此，本发明主要目的是，提供一种用于治疗和/或预防心肌缺血再灌注损伤的药物组合物及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一个方面，提供一种重组apn蛋白在制备治疗和/或预防心肌损伤药物中的应用。

进一步的，所述心肌损伤为缺血再灌注损伤。

本发明第二个方面，提供一种用于治疗和/或预防心肌缺血再灌注损伤的药物组合物，所述药物组合物至少包括重组apn蛋白。

进一步的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或辅料。所述药学上可接受的载体或辅料选自填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、渗透压调节剂或表面活性剂中的一种或几种。

进一步的，所述药物组合物为包载重组apn蛋白的壳聚糖纳米颗粒。

进一步的，所述药物组合物的剂型为口服制剂。将包载重组apn蛋白的壳聚糖纳米颗粒与药学上可接受的载体或辅料混合，制备成口服制剂。

本发明第三个方面，提供以上所述药物组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将壳聚糖溶于冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节ph，得溶液i；

(2)将重组apn加入tpp水溶液中溶解，在磁力搅拌的同时，将重组apn和tpp混合溶液滴加入上述溶液i中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒；经离心、洗涤、冷冻干燥即得。

进一步的，壳聚糖分子量范围200～1500kda，脱乙酰度大于92％。

进一步的，步骤(1)调节ph值至6.0～7.0，优选的，调节ph值至6.5。

进一步的，步骤(2)纳米颗粒粒径小于700nm，优选的纳米颗粒粒径为100～500nm。

重组apn作为一种重组蛋白，口服给药生物利用度低，静脉、皮下或肌肉注射给药存在半衰期短、给药不方便等缺点。壳聚糖可以附着到黏膜的表面，并能打开上皮细胞的紧密联结，因此，壳聚糖可作为大分子药物的促进剂以提高其生物利用度。为了改善重组apn口服生物利用度低的缺点，并达到缓释、长效的目的，本发明专利采用离子交联法将其制备成壳聚糖纳米颗粒。在试验过程中发现，不同壳聚糖分子量、壳聚糖溶液ph等都会影响对重组apn的包封效果，其中利用壳聚糖分子量范围为200～1500kda，脱乙酰度大于92％，壳聚糖溶液ph值在6.0～7.0范围内，对重组apn的包封率高达81.9％；当壳聚糖分子量小于200kda或大于1500kda时，包封率会逐渐下降。

本发明取得的有益效果：

本发明首次发现重组apn蛋白可作为线粒体自噬的调控因子应用于心肌损伤治疗。

本发明药物组合物为重组apn蛋白与壳聚糖制备得到的纳米颗粒，其包封率可达81.9％；纳米粒形态为类球体，粒径小于700nm，集中在100～500nm间。本发明药物组合物可改善心肌缺血再灌注大鼠左室收缩和舒张功能，提高心肌内自噬底物p62的蛋白水平。联合应用angiv受体at4r拮抗剂lvv-h7可逆转重组apn壳聚糖纳米颗粒的心肌保护作用，表明本发明药物组合物的心肌保护作用依赖于下游产物angiv。重组apn壳聚糖纳米颗粒干预可下调线粒体自噬标记蛋白pink1和parkin的水平。体外实验也证实，本发明药物组合物可改善缺氧/复氧后大鼠原代心肌细胞的收缩和舒张性能，本发明药物组合物的体外作用亦依赖于下游产物angiv。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1.重组apn壳聚糖纳米颗粒透射电镜示意图(x10⁵)；

图2.重组apn壳聚糖纳米颗粒粒度分布图；

图3.重组apn壳聚糖纳米颗粒灌胃给药对心肌缺血再灌注损伤(i/r)大鼠的左室收缩和舒张功能的影响：超声心动图结果显示重组apn干预改善缺血再灌注大鼠的左室收缩和舒张功能。a：超声心动图结果示意图；b-e：定量分析左室射血分数(lvef)、缩短分数(fs)、二尖瓣舒张早期与晚期血流速度比值(e/a)和二尖瓣瓣环舒张早期与晚期峰值速度比值(e’/a’)。*p<0.05&**p<0.01vs.假手术对照组(sham)；^#p<0.05&^##p<0.01vs.模型组(i/r)。

图4.重组apn壳聚糖纳米颗粒灌胃给药对心肌缺血再灌注损伤(i/r)大鼠心肌内自噬底物p62的影响；a-b:westernblot检测心肌内p62的蛋白水平。*p<0.05&**p<0.01vs.假手术对照组(sham)；^##p&lt;0.01vs.i/r模型组。

图5.重组apn壳聚糖纳米颗粒灌胃给药对心肌缺血再灌注损伤(i/r)大鼠心肌线粒体自噬的影响；a-c：westernblot检测pink1和parkin的蛋白水平。*p<0.05&**p<0.01vs.假手术对照组(sham)；^#p<0.05&^##p<0.01vs.i/r模型组。

图6.重组apn壳聚糖纳米颗粒干预对缺氧/复氧状态下大鼠原代心肌细胞收缩和舒张性能的影响；a-b：westernblot检测细胞内apn的蛋白水平；c-g：定量分析心肌细胞最大收缩幅度(ps)、最大缩短/复长速率(±dl/dt)、收缩达峰时程(tps)和舒张90％时程(tr90)。**p<0.01vs.缺氧/复氧对照组；^#p<0.05&^##p<0.01vs.重组apn组。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

本发明所用重组apn蛋白购于安迪生物(r&dsystems)科技有限公司。

实施例1一种用于治疗和/或预防心肌缺血再灌注损伤的药物组合物

所述药物组合物为包载重组apn蛋白的壳聚糖纳米颗粒。

所述包载重组apn蛋白的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将25mg分子量为800kda壳聚糖溶于8ml10％的冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节ph至6.5，得溶液i；

(2)取浓度为1.5μmol/dl重组apn溶液2ml，0.5mg/ml三聚磷酸钠(tpp)水溶液2ml混合搅拌(1000转/分钟)均匀，将重组apn和tpp混合溶液以1滴/3～5秒的速度滴加入上述溶液i中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒；经离心、洗涤、冷冻干燥即得。将混悬液于4℃下高速离心20分钟(15000转/分钟)，收集沉淀物，用三蒸水洗涤3次，每次3分钟，冷冻干燥即得。

实施例2一种用于治疗和/或预防心肌缺血再灌注损伤的药物组合物

所述药物组合物为包载重组apn蛋白的壳聚糖纳米颗粒。

所述包载重组apn蛋白的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将14mg，分子量为200kda壳聚糖溶于8ml10％的冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节ph至6.5，得溶液i；

(2)取浓度为1.5μmol/dl重组apn溶液2ml，0.5mg/mltpp水溶液2ml混合搅拌(1000转/分钟)均匀，将重组apn和tpp混合溶液以1滴/3～5秒的速度滴加入上述溶液i中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒；经离心、洗涤、冷冻干燥即得。将混悬液于4℃下高速离心20分钟(15000转/分钟)，收集沉淀物，用三蒸水洗涤3次，每次3分钟，冷冻干燥即得。

实施例3一种用于治疗和/或预防心肌缺血再灌注损伤的药物组合物

所述药物组合物为包载重组apn蛋白的壳聚糖纳米颗粒。

所述包载重组apn蛋白的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将18mg分子量为1500kda壳聚糖溶于8ml10％的冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节ph至6.5，得溶液i；

(2)取浓度为1.5μmol/dl重组apn溶液2ml，0.5mg/mltpp水溶液2ml混合搅拌(1000转/分钟)均匀，将重组apn和tpp混合溶液以1滴/3～5秒的速度滴加入上述溶液i中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒；经离心、洗涤、冷冻干燥即得。将混悬液于4℃下高速离心20分钟(15000转/分钟)，收集沉淀物，用三蒸水洗涤3次，每次3分钟，冷冻干燥即得。

试验例1重组apn壳聚糖纳米粒制备工艺优化

将重组apn壳聚糖纳米颗粒混悬液滴到铜网上，2％磷钨酸钠染色，采用透射电镜观察。所得纳米粒电镜下形态为类球体，如图1所示。利用光散射测定仪测定纳米粒制剂的粒径范围，结果显示，重组apn壳聚糖纳米颗粒的粒径小于700nm，集中于100～500nm间。如图2所示。

表1为不同因素对包载重组apn蛋白的壳聚糖纳米颗粒的物理性质以及载药性能的影响。

试验例2重组apn壳聚糖纳米颗粒对大鼠心肌缺血再灌注损伤的功效研究

(一)实验方法

(1)动物模型建立：选取8周龄(体重180～200)雄性wistar大鼠，普通饮食喂养1周后吸入异氟烷麻醉，行气管插管并连接小动物呼吸机，于胸骨左缘第3～4肋间做一长约15mm横形切口，暴露心脏，用7-0无损伤丝线打一活结结扎冠状动脉左前降支，以心电图显示st段弓背向上抬高，心脏表面相应区域变为苍白作为结扎成功标志，结扎30min后，打开活结，恢复左前降支血流灌注。于再灌注24h后麻醉大鼠并取材。

(2)分组干预：将大鼠分为5组干预：假手术组(sham)、缺血再灌注手术组(i/r)、手术+实施例2包载重组apn蛋白的壳聚糖纳米颗粒组(i/r+apn)和手术+重组apn+angiv受体at4r拮抗剂lvv-h7组(i/r+apn+lvv-h7)，每组20只。包载重组apn蛋白的壳聚糖纳米颗粒采用灌胃途径给药，剂量为1μmol/kg/day，分3次给药，造模前5天开始灌胃。假手术组和手术组大鼠灌胃给予与其余组等容积的空白溶媒。lvv-h7利用皮下埋植渗透泵持续泵入给药，剂量为2mg·kg^-1·day^-1。

(3)心脏超声检测：在全部大鼠中，分别于干预前1天、再灌注24h后，由对课题内容不知情的技术人员应用vevo2100型超高分辨率小动物超声仪进行心脏超声检测。给予大鼠2％异氟烷吸入麻醉，仰卧位固定于37℃恒温加热板上，左胸前脱毛后进行超声检测，记录以下参数：左室后壁厚度(lvpwth)、室间隔厚度(ivsth)、左室内径、左室舒张末期容积(lvedv)、左室收缩末期容积(lvesv)、左室射血分数(lvef)和缩短分数(fs)。脉冲波多普勒测量二尖瓣舒张早期(e)和晚期(a)血流速度及其比值；组织多普勒测量二尖瓣瓣环舒张早期(e')和晚期(a')峰值速度及其比值。

(4)分子生物学检测：于再灌注24h后麻醉大鼠并将其安乐死，取出心脏。蛋白免疫印记法(westernblot)检测心肌组织中自噬底物p62、线粒体自噬标记蛋白pink1和parkin及线粒体标记蛋白coxiv的表达水平。

蛋白免疫印记(westernblot)具体步骤如下：

a.组织或细胞总蛋白的制备(整个过程在冰上进行)。

①每20mg的组织中加入200ul的蛋白裂解液(使用前数分钟已加2ulpmsf)，充分研磨组织，超声震碎；用细胞刮刀轻刮后将液体吸至一新ep管中。所有操作均在冰上完成；

②冰上静置30min；

③4℃条件下15000转/min×15min；

④采用bca法测定蛋白浓度；

⑤吸取出余上清液移入新的ep管中，另加入1/4体积的蛋白缓冲上样液(5×)；

⑥99℃煮沸10min，-80℃保存备用。

b.sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳

①准备间隙为1.0mm的玻璃板，安装电泳槽；

②配制相应浓度的分离胶

10％和15％分离胶配方(10ml)

③将配好的分离胶灌入玻璃板间隙至距离梳子下缘1cm处，分离胶上方加异丙醇约3ml以压平液面；

④待分离胶聚合后，倒掉上层异丙醇，并用吸水纸吸干残存的异丙醇；

⑤配制4％的浓缩胶(10ml)，并插入厚度为1.0mm的梳子

⑥浓缩胶完全聚合后，将凝胶放入电泳槽内，上下槽均加入1×电泳液，并检查是否有泄漏；

⑦轻轻垂直拔下梳子，分别取30ug蛋白样品按次序上样，另留一孔加入蛋白分子量标记物；

⑧电泳：初始采用90v恒压电泳至染料抵达浓缩胶与分离胶交界处，蛋白分子量标记物出现分开，改电压为110v恒压电泳至染料抵达分离胶底部，关闭电源。

c转膜

①裁剪pvdf膜，浸入甲醇中30秒左右，取出并在双蒸水中漂洗1次，与滤纸、海绵垫一同浸泡于预冷的转膜液中备用；

②安装转膜装置：塑料支架平放于含有预冷转膜液托盘中，黑面向下，依次叠放海绵垫、滤纸、凝胶、pvdf膜、滤纸、海绵垫，放置每一层时均去除层间气泡。用塑料支架夹夹紧上述各层后，放入转膜槽中，并同时放入冰盒，加满预冷转膜液后，盖紧埋于冰中；

③接通电源，以200ma电流转膜1.5hr；

④断开电源后，静置平衡10min后，取出塑料支架，依次去掉各层，取出pvdf膜；

d.封闭：转膜结束后，在pvdf膜的上缘作好标记后平放浸于5％脱脂牛奶中，轻微振荡，室温下封闭2hr；

e.洗涤：将pvdf膜自封闭液中取出后，1×tbst洗两次，5min/次；

f.孵育一抗：将pvdf膜放入预先按比例稀释好的一抗孵育液中，4℃下轻微振荡孵育过夜；

h.洗涤：将pvdf膜自一抗反应液中取出，1×tbst洗3次：15min/次；

i.孵育二抗：将pvdf膜放入预先按比例稀释好的二抗孵育液中，室温下轻微振荡孵育2hr；

j.洗涤：将pvdf膜自二抗孵育液中取出，1×tbst洗3次，15min/次；

k.显色

①暗室中，预先准备显影液和定影液；

②在一新ep管中混合等体积的solutiona和solutionb液，颠倒混匀；

③pvdf膜蛋白面朝上放置，将混合的a和b液加到pvdf膜上，覆盖上保鲜膜；

④将胶片压在保鲜膜上，蛋白面与胶片紧密结合，等待1～3min；

⑤将胶片依次显影、定影，晾干后扫描分析。

(5)新生大鼠心肌细胞的分离和培养：首先，将新生大鼠的左室剪碎后用0.08％胰蛋白酶消化以去除红细胞，然后在37℃下以0.25％胰蛋白酶和0.05％ⅱ型胶原蛋白酶对组织块进行消化。悬浮细胞接种于直径为100mm的培养板内，37℃下在含5％co2的培养箱内孵育1h，在此期间大部分心肌成纤维细胞快速贴到培养板壁上。未贴壁细胞接种于培养板上继续培养1h。成纤维细胞优先贴壁而大部分心肌细胞仍未贴壁。收集未贴壁心肌细胞并计数，以2.5×10⁴个细胞/孔的密度接种于24孔培养板，加上含10％fbs、100units·ml^-1青霉素、100units·ml^-1链霉素和0.1mmol/l溴脱氧尿苷的dmem培养基，标准培养条件下培养。利用myh免疫荧光染色判断95％的细胞为心肌细胞。接种后第2天，更换培养基。继续培养2天后，更换无血清培养基培养24h，准备后续干预实验。

(6)心肌细胞缺氧/复氧模型的建立：体外培养心肌细胞，更换无氧培养基后，将心肌细胞置于含5％co2-95％n2的缺氧密闭容器内孵育1h，然后更换为正常培养基，复氧孵育1h。

(7)将缺氧/复氧处理的新生大鼠心肌细胞分为以下3组干预：空白溶媒组、0.1um重组apn壳聚糖纳米颗粒和0.1um重组apn壳聚糖纳米颗粒+0.1umlvv-h7。分别于缺氧/复氧前6小时开始药物干预。soft-edge系统(美国ionoptix公司)检测细胞收缩和舒张特性，记录心肌细胞最大收缩幅度(peakshortening，ps)、最大缩短/复长速率(±dl/dt)、收缩达峰时程(time-to-ps，tps)和舒张90％时程(time-to-90％relengthening，tr90)。收集细胞，westernblot检测细胞中apn蛋白水平。

(8)统计学分析

对比各实验组上述指标的测量结果，进行统计学分析。统计学分析具体方法如下：采用spssv19软件进行数据分析。检测结果用平均值±标准误或中位数[四分位数间距]表示，如果服从正态分布，采用方差分析进行组间比较，如果组间差异有统计学意义，进一步采用bonferroni法进行两两比较。如果不服从正态分布，组间比较采用kruskal-wallis秩和检验，如果组间差异有统计学意义，进一步采用dwass-steel-critchlow-fligner法进行多重比较。双侧p＜0.05时认为差异有统计学意义。

(二)实验结果

小动物超声心动图检测结果显示，重组apn壳聚糖纳米颗粒灌胃给药可改善心肌缺血再灌注损伤(i/r)大鼠的左室收缩和舒张功能，联合应用angiv受体at4r拮抗剂lvv-h7可逆转重组apn壳聚糖纳米颗粒的心肌保护作用，表明重组apn的心肌保护作用依赖于下游产物angiv，如图3所示。

如图4所示，重组apn壳聚糖纳米颗粒灌胃给药可升高心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌内自噬底物p62的蛋白水平，而联合应用angiv受体at4r拮抗剂lvv-h7可逆转重组apn壳聚糖纳米颗粒的上述作用。

如图5所示，重组apn壳聚糖纳米颗粒干预可下调心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌内线粒体自噬标记蛋白pink1和parkin的水平。

重组apn壳聚糖纳米颗粒干预后，缺氧/复氧刺激的大鼠原代心肌细胞内apn蛋白水平升高，心肌细胞的收缩和舒张性能改善，本发明药物组合物的体外作用亦依赖于下游产物angiv，如图6所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。