异川楝素的医药用途的制作方法

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种异川楝素的医药用途。

背景技术：

恶性肿瘤是世界性的公共问题,对国民经济、社会发展、人民健康都造成极大影响,肿瘤预防与控制已经成为全球卫生战略的重点。肿瘤细胞的重要特征是不能进行正常的分化，启动正常的凋亡过程，因此，发展防治肿瘤药物将造福于人类。

乳腺癌是女性中发病率最高、最常见的恶性肿瘤。世界卫生组织(who)国际癌症研究机构(internationalagencyforresearchoncancer,iarc)通过经常性地搜集、储存、整理、分析和评价全球的肿瘤登记数据并公布：2012年全球新发恶性肿瘤病例1409万,死亡820万,全球女性有超过167万乳腺癌新发病例，占女性全部恶性肿瘤发病构成的首位，几乎每4例女性恶性肿瘤病例中，就有1例是乳腺癌病例；同期死于乳腺癌的女性患者约有52万例，也位于女性恶性肿瘤死亡顺位的首位。近年来，全球女性乳腺癌的发病率和死亡率水平呈现逐年上升的态势，并且占全球女性全部恶性肿瘤发病、死亡的构成也有所增加。

三阴性乳腺癌是乳腺癌中较为严重的一种。三阴性乳腺癌是指癌组织免疫组织化学检查结果为雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)和原癌基因her-2均为阴性的乳腺癌。这类乳腺癌占所有乳腺癌病理类型的10.0％～20.8％，具有特殊的生物学行为和临床病理特征，预后较其他类型差，死亡风险较高。三阴性乳腺癌临床表现为一种侵袭性病程，其远处转移风险较高，内脏转移机会较骨转移高，脑转移几率也较高。三阴性乳腺癌的远处转移风险在3年时达到高峰，之后可能会有所下降。三阴乳腺癌的预后与肿瘤大小和淋巴结状况关系不大，复发迅速。因缺乏内分泌及抗her2治疗的靶点，目前还没有特有的针对三阴性乳腺癌的治疗指南，因此其治疗一般按乳腺癌常规标准治疗进行。

在癌症治疗中，尽管传统的放、化疗已经取得了很大的进展，但由于其在杀伤癌细胞的同时，也对人体产生不同程度的毒副作用，其中主要是骨髓抑制和免疫功能低下，可造成白细胞减少症等，有时甚至不得不中断治疗，从而也限制了药物的疗效。为了克服传统的放、化疗所带来的一系列弊病，近年来药学工作者不断的探索，开发更加安全有效的植物药进行防治癌症成为了当前研究的热点领域。

川楝子为楝科植物川楝meliatoosendansieb.etzucc.的干燥成熟果实，以“楝实”之名始载于《神农本草经》，多分布于河南、甘肃、湖南、广西、四川、贵州、云南等地。味苦性寒，有小毒，有泻火、止痛、杀虫作用，主治胃痛、虫积腹痛、疝痛、痛经等。疏肝泄热，行气止痛，杀虫。用于肝郁化火，胸胁、脘腹胀痛，疝气疼痛，虫积腹痛。异川楝素(isotoosendanin，iso-chuanliansu)是川楝子中分离纯化的楝烷型三萜类化合物，目前对异川楝素的药理活性的研究尚不明确。

技术实现要素：

本发明的目的旨在提供一种异川楝素的新的医药用途。

具体地说，本发明的第一方面是提供了一种异川楝素在制备防治乳腺癌的药物中的应用。

在一优选例中，所述异川楝素是作为唯一的活性成分用于制备防治乳腺癌的药物。

在另一优选例中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

本发明的第二方面是提供了一种异川楝素在制备防治乳腺癌转移的药物中的应用。

在一优选例中，所述异川楝素是作为唯一的活性成分用于制备防治乳腺癌转移的药物。

在另一优选例中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。

附图说明

图1异川楝素对多种乳腺癌细胞的杀伤作用

(a)mda-mb-231(b)mcf-7(c)4t1

图2异川楝素用药对雌性balb/c小鼠4t1实体瘤的影响

图3异川楝素用药对雌性balb/c4t1荷瘤小鼠血清生化指标的影响

图4异川楝素用药乳腺癌细胞迁移的抑制作用——划痕实验结果

(a)mda-mb-231(b)4t1

从左至右分别为模型组，异川楝素低剂量组，异川楝素中剂量组，异川楝素高剂量组

图5异川楝素用药乳腺癌细胞迁移的抑制作用——小室迁移实验结果

(a)mda-mb-231(b)4t1

从上至下分别为模型组，异川楝素低剂量组，异川楝素中剂量组，异川楝素高剂量组

图6异川楝素用药对雌性balb/c小鼠4t1实体瘤的影响

图7异川楝素用药对雌性balb/c荷瘤小鼠4t1死亡率的影响

图8异川楝素用药对雌性balb/c小鼠4t1实体瘤转移的影响-活体成像结果

图9异川楝素用药对雌性balb/c小鼠4t1实体瘤转移率的影响

图10异川楝素用药对雌性balb/c小鼠4t1实体瘤转移的影响-肺部he染色结果

a：空白组b：模型组c：异川楝素0.1mg/kgd：异川楝素1mg/kge：5-氟尿嘧啶

具体实施方式

本发明的问世部分是基于这样一个意外发现：异川楝素对大多数肿瘤均有一定的抑制作用，尤其是三阴性乳腺癌。因此，该化合物可有望开发成为一种预防或者治疗三阴性乳腺癌的药物。

进而，本发明提供了异川楝素在制备防治乳腺癌和乳腺癌转移的药物中的应用。本发明的异川楝素(isotoosendanin，iso-chuanliansu)为无色细针状晶体，熔点为270～273℃，易溶于吡啶，微溶于甲醇、丙酮和二氧六环，难溶于氯仿、苯和水。异川楝素的分子式为c30h38o11，结构式如下：

本发明的异川楝素可通过商业途径从上海源叶生物科技有限公司等处购买获得，亦用本领域的常规方法从川楝子中提取获得，例如：将川楝子药材打粉，用水、20％～95％乙醇、丙酮、乙酸乙酯、汽油或石油醚等回流提取制得。

本发明的异川楝素可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的异川楝素及可药用载体。较佳地，本发明的药物组合物含有0.1-99.9％重量百分比的作为活性成分的本发明的异川楝素。“可药用载体”不会破坏本发明的异川楝素的药学活性，同时其有效用量，即能发挥药物载体作用时的用量对人体无毒。

所述可药用载体包括但不限于：软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。

其他常用的药物辅料如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联pvp、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。

本发明的异川楝素以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道或局部途径给药。口服制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；非肠道给药制剂包括注射液等；局部给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。优选为口服制剂。

本发明的异川楝素以及其药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉、尿道、阴道等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

实施例1.异川楝素对多种乳腺癌细胞的杀伤作用

本发明首先考察了用mtt法检测异川楝素作用于不同种属的多种乳腺癌细胞的存活率与异川楝素浓度的关系。

mtt法又称mtt比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理是利用活细胞内线粒体脱氢酶能将四甲基偶氮唑蓝转化为蓝紫色衍生物甲瓒的原理来检测活细胞数目。用三联剂(10％sds-5％异丁醇-0.01mhcl)溶解甲瓒结晶后，用酶标仪于570nm与630nm处测量吸光值。可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。

1.1实验材料

1.1.1细胞株

mda-mb-231细胞株；mcf-7细胞株(人乳腺癌细胞株)；4t1细胞株(小鼠乳腺癌细胞株)

1.1.2受试药物及其制备

异川楝素(购自上海源叶生物有限公司)，溶于dmso(二甲基亚砜)制成0.1m的母液。

1.1.3主要试剂

dmem，rpmi1640，胎牛血清(gibco公司)，二甲基亚砜(dmso)(gibco公司)，mtt(sigma公司)，其它试剂为国产分析纯等。

1.1.4主要仪器设备

层流超净台；二氧化碳培养箱，购自thermo公司；倒置相差显微镜，购自olympus公司；酶标仪，购自biotek公司。

1.2实验方法

将mcf-7、mda-mb-231、4t1等细胞以6000个/孔的细胞密度接种于96孔板中，每孔细胞悬液100μl，约12小时后待细胞贴壁生长状态良好时，加入不同浓度的itsn(0,0.1,0.3,1,3,10μm)。48h后，每孔加入10μlmtt(终浓度为0.5mg/ml)，37℃细胞培养箱中5％co2条件下孵育4h后，加入三联剂50μl溶解甲瓒结晶。反应12h后置于酶标仪，读取570nm与630nm处的吸光度值(od)。给药组除以对照组的值定为细胞存活率，按下述公式计算：

细胞存活率(％)＝给药组od(570nm-630nm)/对照组od(570nm-630nm)×100％

1.3统计学处理

实验数据均用平均值±标准误表示，用spss17.0统计软件进行分析，以one-wayanova方式进行方差分析，p<0.05为具有统计学显著性差异标准。

1.4实验结果

由图1可知，本发明中异川楝素可显著抑制人乳腺癌细胞mcf-7、mda-mb-231、小鼠乳腺癌细胞4t1的生长，提示异川楝素可用于多种乳腺癌的治疗。除此之外，人乳腺癌细胞mda-mb-231与小鼠乳腺癌细胞4t1为三阴性乳腺癌细胞系，mcf-7为er阳性乳腺癌细胞系，从mtt实验结果来看，在同个剂量下，异川楝素对三阴性乳腺癌细胞的杀伤作用明显大于非三阴性乳腺癌细胞系，提示异川楝素可作为潜在的三阴性乳腺癌的治疗药物。

表1异川楝素对多种乳腺癌细胞的生长(％)的影响

与空白组比较，**p<0.01，***p<0.001

实施例2.异川楝素的体内抗三阴性乳腺癌实体瘤作用

在确定了异川楝素在体外对这几种乳腺癌细胞具有较强的杀伤作用之后，尤其是确定了异川楝素在体外对三阴性乳腺癌细胞系有极强的杀伤作用后，本发明首先进一步考察了本发明异川楝素的体内抗三阴性乳腺癌实体瘤作用。

2.1实验材料

2.1.1受试动物

雌性balb/c小鼠

2.1.2受试药物及其制备

异川楝素溶于0.5％cmc-na(羧甲基纤维素钠)溶液。5-fu(上海邦成)溶于生理盐水中。

2.2实验方法

2.2.1体内荷瘤小鼠抗肿瘤实验

采用荷瘤小鼠体内实验，培育一定数量的4t1细胞，消化后离心去除胰酶，无血清培养基重悬计数，稀释至1.0×10⁷cells/ml于离心管中，插冰上，皮下注射(sc)接种该浓度肿瘤细胞于balb/c小鼠右腋下，注射量0.1ml/只。按体重随机分组，分别为模型组(0.5％cmc-na)、阳性药5-氟尿嘧啶组、异川楝素低剂量组(1mg/kg)、异川楝素高剂量组(3mg/kg)。将药物用0.5％cmc-na溶解至所需浓度，于接种后3周开始按体重每日灌胃(ig)给药，模型组ig给予同等体积的0.5％cmc-na，5-氟尿嘧啶(用dd水溶解至2.5mg/ml)组腹腔注射(ip)，每隔一天注射一次；连续给药14d。每隔一周用游标卡尺测量瘤径，记录体外瘤的长与宽(mm)。末次给药后24h，摘眼球采血，供离心分离血清后测定血清alt和ast活力用；取瘤组织，称重，拍照。按下公式计算肿瘤体积(tumorvolumn)与肿瘤抑制率(tumorinhibitionratio)。

tumorvolumn(mm³)＝a*b*b/2，其中a指瘤的长度，b指瘤的宽度。以瘤体积与模型组有显著性差异，p<0.05为药物具有抗肿瘤活性的标准。

tumorinhibitionratio(％)＝[(c-t)/c]×100,其中c指cmc-na对照组平均瘤体积，t指给药组平均体积。以瘤体积有显著性差异，且肿瘤抑制率>30％为药物具有抗肿瘤活性的标准。

2.3统计学处理

实验数据均用平均值±标准误表示，用spss17.0统计软件进行分析，以one-wayanova方式进行方差分析，p<0.05为具有统计学显著性差异标准。

2.4实验结果

2.4.1异川楝素用药对雌性balb/c小鼠4t1实体瘤的影响

与模型组比较，如表2、图2所示，接种4t1的小鼠在连续给予itsn(1mg/kg)14d后，瘤体积显著减小(p<0.05)，表明itsn(1mg/kg)对4t1实体瘤有效，且肿瘤抑制率超过30％，表明异川楝素具有显著的体内抗三阴性乳腺癌活性。相对于5-fu组异川楝素用药剂量更低，而抗肿瘤效果相近，表明本发明异川楝素抗三阴性乳腺癌在剂量上有一定优势。

表2异川楝素用药对雌性balb/c小鼠4t1实体瘤的影响

与模型组比较，*p<0.05

2.4.2对血清生化指标的影响

由表3、图3可知，异川楝素用药组对荷瘤小鼠无显著肝毒性，提示本发明中异川楝素在保持疗效的同时，对肝损伤指标无明显影响，说明本发明异川楝素在抗肿瘤剂量上不会诱导明显的肝损伤。

表3异川楝素用药对雌性balb/c4t1荷瘤小鼠血清生化指标的影响

实施例3.异川楝素对多种乳腺癌细胞的迁移抑制作用

在确定了异川楝素在体外对这几种乳腺癌细胞具有较强的杀伤作用之后，本发明首先进一步考察了本发明异川楝素的低剂量体外抑制三阴性乳腺癌细胞系迁移的作用。

3.1实验材料

3.1.1细胞株

mda-mb-231细胞株(人乳腺癌细胞株)

4t1细胞株(小鼠乳腺癌细胞株)

3.1.2受试药物及其制备

异川楝素(购自上海源叶生物有限公司)，溶于dmso(二甲基亚砜)制成0.1m的母液。

3.1.3主要试剂

rpmi1640，胎牛血清(gibco公司)，二甲基亚砜(dmso)(gibco公司)，结晶紫溶液(life公司)，其它试剂为国产分析纯等。

3.1.4主要仪器设备

层流超净台；二氧化碳培养箱，购自thermo公司；倒置相差显微镜，olympusix81荧光显微镜，购自olympus公司；酶标仪，购自biotek公司；照相机，购自nikon公司。

3.2实验方法

3.2.1mda-mb-231、4t1细胞划痕实验

将mda-mb-231、4t1等细胞用胰酶消化后，重悬制成密度为3×10⁵个/ml的细胞悬液，接种于24孔板中，每孔细胞悬液1ml。均匀贴壁且细胞融合率在90％以上时，吸去原有培养基，加入dpbs200μl洗净残留的培养基，再加入200μldpbs。用灭菌后的200μl枪头再板底中央迅速划一道直线，将脱落的细胞洗去后，重复用dpbs清洗两次，每孔加入不含fbs的培养基1ml，给药组分别加入不同剂量的异川楝素(mda-mb-231：100nm、300nm、1000nm；4t1：10nm、30nm、100nm)。每孔取两个视野，用cellsensdimension图像采集工作站记录划痕的宽度，拍摄处用记号笔标记位置。分别拍摄标记位置加药后0h、24h、48h划痕的宽度变化，记录数据，计算相对细胞迁移率(migrationpercentage)。相对细胞迁移率定义为每个时间点对照组与给药组划痕宽度的差与对照组划痕宽度的比值，其公式如下：

migrationpercentage(％)＝(给药组划痕宽度-对照组划痕宽度)/对照组划痕宽度×100％3.2.2mda-mb-231、4t1细胞迁移实验

在24孔板中放置站立式小室，小室用0.5％明胶37℃包被30min，将提前饥饿一小时的细胞消化下来后，用不含血清的rpmi1640培养基重悬制成密度为1.5×10⁵个/ml细胞悬液。将mda-mb-231、4t1等细胞分别用不同浓度的异川楝素(mda-mb-231：100nm、300nm、1000nm；4t1：10nm、30nm、100nm)预孵15min后接种于小室中，每个小室细胞悬液100μl，下室加入600μl含10％胎牛血清的rpmi1640培养基。24h后，吸净小室中及下室的培养基，每孔加入提前-20℃预冷的甲醇1ml，于-20℃冰箱中固定30min后吸净甲醇，将小室取出倒置晾干，用0.1％结晶紫溶液染色15min。再pbs溶液中洗去结晶紫染色液，小室内部的细胞用湿润的棉签擦去，晾干后于倒置相差显微镜下拍摄小室底部被染成紫色的细胞，每个小室取5个视野，拍照。拍照后将小室置于33％冰醋酸溶液中，将洗脱液转移至96孔板中，读取570nm处的吸光度值(od)。对照组减去给药组的差除以对照组的值定为细胞迁移抑制率，按下述公式计算：

细胞迁移抑制率(％)＝(给药组od值-对照组od值)/对照组od值×100％

3.3统计学处理

实验数据均用平均值±标准误表示，用spss17.0统计软件进行分析，以one-wayanova方式进行方差分析，p<0.05为具有统计学显著性差异标准。

3.4实验结果

3.4.1异川楝素抑制mda-mb-231、4t1细胞迁移——划痕实验结果

划痕结果如表4、图4显示，以无明显毒性的剂量去给药后，中高两个剂量组细胞的爬行距离明显缩短，说明异川楝素明显抑制了细胞迁移，提示异川楝素有一定的抑制三阴性乳腺癌细胞迁移的作用。

表4异川楝素用药48h对三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231及4t1迁移的影响-划痕实验结果

3.4.2异川楝素抑制mda-mb-231、4t1细胞迁移——小室迁移实验结果

小室迁移结果如表5、图5显示，以无明显毒性的剂量给药后，中高两个剂量的异川楝素的视野中，迁移的细胞明显减少，提示异川楝素有一定的抑制三阴性乳腺癌细胞迁移的作用。

表5异川楝素用药48h对三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231及4t1迁移的影响-小室迁移实验结果

实施例4.异川楝素的体内抗乳腺癌癌实体瘤转移作用

在确定了异川楝素在体外对这几种肿瘤细胞具有较强的杀伤作用之后，本发明首先进一步考察了本发明异川楝素的体内抑制乳腺癌细胞转移作用。

4.1实验材料

4.1.1受试动物

雌性balb/c小鼠

4.1.2受试药物及其制备

异川楝素溶于0.5％cmc-na(羧甲基纤维素钠)溶液。5-fu(上海邦成)溶于生理盐水中。

4.2实验方法

4.2.1体内荷瘤小鼠抗肿瘤实验

采用荷瘤小鼠体内实验，培育一定数量的接种4t1-luc-gfp细胞，消化后离心去除胰酶，无血清培养基重悬计数，稀释至1.0×10⁷cells/ml于离心管中，插冰上，皮下注射(sc)接种该浓度肿瘤细胞于balb/c小鼠左侧#4乳垫皮下2mm处，注射量0.1ml/只。按体重随机分组，分别为model(0.5％cmc-na)、5-fu、异川楝素低剂量组(0.1mg/kg)、异川楝素高剂量组(1mg/kg)。将药物用0.5％cmc-na溶解至所需浓度，于接种后1周开始按体重每日灌胃(ig)给药，model组ig给予同等体积的0.5％cmc-na，5-fu(用dd水溶解至2.5mg/ml)组腹腔注射(ip)，每隔一天注射一次；连续给药5周。接种后2周每周进行一次活体成像实验，观察是否发生转移。每3天用游标卡尺测量瘤径，记录体外瘤的长与宽(mm)。末次给药后24h，摘眼球采血，供离心分离血清后测定血清alt和ast活力用；取瘤组织，取肺，取肝，取癌旁组织，称重，拍照，观察肺部、肝部是否有效肿瘤结节灶。按下公式计算肿瘤体积(tumorvolumn)与肿瘤抑制率(tumorinhibitionratio)。

tumorvolumn(mm³)＝a*b*b/2，其中a指瘤的长度，b指瘤的宽度。以瘤体积与模型组有显著性差异，p<0.05为药物具有抗肿瘤活性的标准。

tumorinhibitionratio(％)＝[(c-t)/c]×100,其中c指cmc-na对照组平均瘤体积，t指给药组平均体积。以瘤体积有显著性差异，且肿瘤抑制率>30％为药物具有抗肿瘤活性的标准。

4.3统计学处理

实验数据均用平均值±标准误表示，用spss17.0统计软件进行分析，以one-wayanova方式进行方差分析，p<0.05为具有统计学显著性差异标准。

4.4实验结果

4.4.1异川楝素用药对雌性balb/c小鼠4t1实体瘤的影响

与模型组比较，如表6、图6、图7所示，接种4t1-luc-gfp细胞的小鼠在连续给予itsn(0.1mg/kg及1mg/kg)5周后，高剂量组瘤体积显著减小(p<0.01)，表明itsn高剂量对4t1实体瘤均有效，且高剂量肿瘤抑制率超过30％；如图7所示，给药后，荷瘤小鼠的死亡率明显下降，表明异川楝素具有显著的体内抗三阴性乳腺癌活性。相对于5-fu组异川楝素用药剂量更低，而抗肿瘤效果相近，表明本发明异川楝素抗肿瘤在剂量上有一定优势。

表6异川楝素用药对雌性balb/c小鼠4t1实体瘤的影响

与模型组比较，***p<0.001

4.4.2异川楝素用药对雌性balb/c小鼠4t1实体瘤转移的影响

与模型组比较，如图8、图9、图10所示，接种4t1-luc-gfp细胞的小鼠在连续给予itsn(0.1mg/kg及1mg/kg)5周后，高剂量组的转移率明显降低。图8中的肺部he染色结果显示，高剂量组相对于模型组肺部结节灶的数量明显减少。相对于5-fu组异川楝素用药剂量更低，而抗肿瘤转移效果相近，表明本发明的异川楝素抗肿瘤转移在剂量上有一定优势。

本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。