氯氮平在制备肿瘤治疗药物及其作为自噬抑制剂中的应用、药物组合物的制作方法
本申请涉及医药领域，具体而言，涉及氯氮平在制备肿瘤治疗药物及其作为自噬抑制剂中的应用，还涉及一种用于治疗肿瘤的药物组合物。
背景技术：
在医学上，癌(cancer)是指起源于上皮组织的恶性肿瘤，是恶性肿瘤中最常见的一类。根据世界卫生组织的最新实况报道，肿瘤即癌症是世界第二大死因(心血管疾病为第一大死因)，就全球范围而言，近六分之一的死亡是由癌症造成的。世界死亡率最高的癌症类型依次为：肺癌、肝癌、结肠直肠癌、胃癌及乳腺癌。其发病率和死亡率不仅与性别有关，发达地区和欠发达地区在此也表现出了明显的差异。癌症现已成为我国人口死亡的首要原因。
癌细胞是肿瘤产生的根源，是正常细胞变异的结果。癌细胞与正常细胞不同，有无限生长、转化和转移三大特点，能够无限增殖并破坏正常的细胞组织。癌细胞除了分裂失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分，也因此难以消灭。并且癌细胞具有强有力的抵抗死亡的能力，很难杀灭，导致肿瘤难以治愈。
当今，对恶性肿瘤治疗以手术、放射治疗、化学药物治疗、中医中药的治疗及免疫治疗等手段为主。对肿瘤治疗药物的选择，其毒性作用及抗药性等方面严重影响其疗效，因为大多肿瘤治疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也对正常组织的细胞有杀伤，尤其是增殖旺盛的骨髓造血细胞及胃肠道细胞，长期服用肿瘤治疗药物易使患者免疫功能降低，甚至患者难以忍受胃肠反应，而被迫中断治疗，使治疗失败。所以要找到一种疗效好同时又不对人体造成伤害或者伤害较小的肿瘤治疗药物，同时能够有效控制肿瘤生长和肿瘤细胞转移成为目前亟待解决的技术问题。
肿瘤细胞为了向自身提供过增长的能量需求，自噬信号被激活从而不断降解自身蛋白来满足肿瘤细胞的恶性增殖需求，所以很多种类的肿瘤细胞的基础自噬水平比正常细胞显著增高。因此在一些种类的肿瘤细胞中抑制自噬水平可以抑制肿瘤细胞的增殖，为肿瘤治疗药物的研发提供了新的思路。
氯氮平，又称8-氯-11(4-甲基-1-哌嗪基)-5h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂
目前针对氯氮平的其他应用未见报道，特别是氯氮平未被用于肿瘤治疗领域，也未被发现具有抑制自噬的作用。
技术实现要素：
本发明通过大量的实验证明，目前在临床应用中对精神分裂症的阳性或阴性症状产生较好疗效的氯氮平可以阻断细胞的自噬流，能够作为自噬抑制剂使用，基于氯氮平的抑制自噬作用，本发明也通过大量的实验证明其对肿瘤细胞有杀伤作用，能够抑制肿瘤细胞生长和转移，因而可以被用来制备肿瘤治疗药物。
根据本申请的第一方面，提供了氯氮平在制备肿瘤治疗药物中的应用。
进一步的，所述肿瘤包括胰腺癌和乳腺癌。
进一步的，所述肿瘤治疗药物为抑制肿瘤生长的药物。
进一步的，所述肿瘤治疗药物为对肿瘤细胞有杀伤作用的药物。
进一步的，所述肿瘤治疗药物为抑制肿瘤细胞转移的药物。
进一步的，所述的氯氮平在制备肿瘤治疗药物时用于杀灭肿瘤细胞。
进一步的，所述的氯氮平在制备肿瘤治疗药物时用于抑制肿瘤的生长。
进一步的，所述的氯氮平在制备肿瘤治疗药物时用于抑制肿瘤细胞的转移。
进一步的，所述的氯氮平在制备肿瘤治疗药物时用于杀灭肿瘤细胞和抑制肿瘤的生长。
进一步的，所述的氯氮平在制备肿瘤治疗药物时用于杀灭肿瘤细胞和抑制肿瘤细胞的转移。
进一步的，所述的氯氮平在制备肿瘤治疗药物时用于抑制肿瘤的生长和抑制肿瘤细胞的转移。
进一步的，所述的氯氮平在制备肿瘤治疗药物时用于杀灭肿瘤细胞、抑制肿瘤的生长和抑制肿瘤细胞的转移。
根据本申请的第二方面，提供了氯氮平作为自噬抑制剂的应用。
进一步的，氯氮平作为自噬抑制剂用于杀灭肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的生长或抑制肿瘤细胞的转移。
进一步的，所述氯氮平浓度为10～40μm。
根据本申请的第三方面，提供了一种用于治疗肿瘤的药物组合物，活性成分为氯氮平。
进一步的，药物组合物制成口服液、颗粒剂、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、滴丸剂、注射剂、纳米制剂或靶向制剂中的任意一种。
氯氮平通过抑制自噬活动，在对各种正常组织细胞无明显毒性的作用下，对胰腺癌及乳腺癌细胞系在内的多种肿瘤细胞系有强烈的致死能力，而且氯氮平对在小鼠上移植的胰腺癌肿块生长有明显的抑制作用，此外，氯氮平还能显著地抑制上述肿瘤细胞的转移能力。解决了传统技术中因为抗癌药物以及癌症治疗方式在杀伤肿瘤细胞的同时，也对正常组织的细胞有杀伤，不能有效控制肿瘤生长和肿瘤细胞转移的技术问题。提供了氯氮平在抑制自噬、肿瘤治疗药物制备中的新用途，从而拓展了氯氮平的应用范围，具有重大的现实意义。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，使得本申请的其它特征、目的和优点变得更明显。本申请的示意性实施例附图及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为本申请实施例1中锌离子探针的染色结果；
图2为本申请实施例2中蛋白免疫印迹方法的检测结果；
图3为本申请实施例3中人胰腺癌细胞patu8988t的细胞活性统计柱状图；
图4为本申请实施例3中正常胰腺导管上皮细胞hpde6c7的细胞活性统计柱状图；
图5为本申请实施例4中人乳腺癌细胞mcf7的细胞活性统计柱状图；
图6为本申请实施例4中正常乳腺导管上皮细胞mcf10a的细胞活性统计柱状图；
图7为本申请实施例5中灌胃处理后的小鼠胰腺癌瘤块生长曲线；
图8为本申请实施例6中瘤体注射后的小鼠胰腺癌瘤块生长曲线；
图9为本申请实施例7中人胰腺癌细胞patu8988t发生转移的细胞的结晶紫染色结果；
图10为本申请实施例7中人胰腺癌细胞patu8988t的迁移率和浸润率的统计结果；
图11为本申请实施例8中人乳腺癌细胞mcf7发生转移的细胞的结晶紫染色结果；
图12为本申请实施例8中人乳腺癌细胞mcf7的迁移率和浸润率的统计结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”以及他的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列部分的整体，不必限于清楚地列出的那些部分，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些整体固有的其它部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
需要说明的是，本申请实施例中的未具体列明的具体操作均适用于本领域内的常规操作或常规实验手段，应当理解为本领域技术人员依据现有技术可以合理获知。
在无特殊说明的情况下，本申请中的术语可以做以下解释，或者本领域技术人员根据本领域内的公知常识做合理的扩大或限缩解释，凡是本领域人员可以根据本申请的申请日之前的现有技术内容合理获知均可。
自噬：自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。
锌离子探针fluozin-3-am染色方法：fluozin-3-am是一种检测细胞内锌离子的荧光探针，该探针与细胞内的锌离子结合后荧光强度显著升高，可将细胞用该探针孵育染色，并使用荧光显微镜来观察荧光强度，用于反映细胞内锌离子浓度的大小。
western-blot检测法：蛋白免疫印迹法，是应用分子生物学、生物化学和免疫遗传学中时常会用到的一种实验方法，并且是一种能对蛋白进行定性和半定量的分析方法，是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，并且通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
ep管：微型离心管，实验室耗材，是一种小型的离心管，与微型离心机配套使用，用于微量试剂的分离。
ddh2o：doubledistilledwater的缩写，即双蒸水，是将经过一次蒸馏后的水再次蒸馏所得到的水。
bca反应工作液：bca是bicinchoninicacid(二奎林甲酸蛋白)的缩写，bca法是一种广为使用的蛋白定量法，其中用到的bca反应工作液是试剂a(bca碱性溶液)和试剂b(硫酸铜溶液)的混合液，试剂a与试剂b的比例为50:1。
loadingbuffer：western-blot检测法中使用的上样缓冲液，用于显示电泳的进程以及使样品沉到点样孔中而不漂浮起来。
acr-bis：丙烯酰胺:亚甲基双丙烯酰胺溶液。
tris-hcl缓冲液：三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
sds缓冲液：十二烷基硫酸钠缓冲液。
temed：四甲基乙二胺，用于配制sds-page胶。
marker：蛋白标记，预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪。
pvdf膜：聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidenefluoride)是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
tbst：含有tris-hcl，nacl和tween20，是蛋白免疫印迹法中常用的一种缓冲液。
hela细胞：海拉细胞，是一种人工培养、具有无限增殖能力的细胞，在医学界被广泛应用于肿瘤研究、生物实验或者细胞培养。
台盼蓝实验法：是利用台盼蓝只能将死细胞染成蓝色而活细胞不能被染上的方法检测细胞存活率的一种快速简便的方法。
裸鼠成瘤实验：即在裸鼠皮下注入肿瘤细胞，观察肿瘤的形成、发展及抗肿瘤药物的效果。
transwell实验：将transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，可以进行细胞迁移、细胞浸润等多种方面的研究。
matrigel:在室温条件下，matrigel聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，可用于对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达等的研究。
dmem培养基:是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基。
bsa：牛血清白蛋白，又称第五组分，是牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kda，等电点为4.7。
od600：指某种溶液在600nm波长处的吸光值，用以反映溶液内的细胞密度。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
实施例1：氯氮平调控细胞浆中锌离子水平的检测
一、实验分组
对照组：dmso处理
实验组1：10μm氯氮平处理
实验组2：10μm氯氮平联合1μmfty720处理
实验组3：10μm氯氮平联合20μmns8593处理
二、实验方法
采用锌离子探针fluozin-3-am染色方法对各组药物处理后的hela细胞浆中荧光强度进行比较，具体方法为：
将hela细胞分别经过各组药物处理；将药物处理后的细胞用pbs冲洗三遍；将洗净后的细胞用锌离子探针fluozin-3-am(2μm)孵育染色30分钟；将染色后的细胞用荧光显微镜进行拍照。
三、实验结果
图1为对照组和3个实验组使用锌离子探针fluozin-3-am染色后的荧光显微镜下的图像，由左至右依次为：对照组、实验组1、实验组2、实验组3。其中，附图1中的相关内容翻译或解释如下：clozapine代表氯氮平，fty720代表一种trpm7非特异性抑制剂，ns8593代表另一种trpm7非特异性抑制剂。
图1表明，与对照组相比，经10μm氯氮平处理后的hela细胞浆中的荧光强度显著升高；与实验组1相比，经10μm氯氮平联合1μmfty720处理后的hela细胞浆中的荧光强度明显降低；与实验组1相比，经10μm氯氮平联合20μmns8593处理后的hela细胞浆中的荧光强度也明显降低。
四、结论
使用氯氮平作为trpm7非特异性激动剂可以显著升高细胞浆中的锌离子水平，即氯氮平可以通过激活trpm7的活性来调控细胞浆中的锌离子水平，并且氯氮平对于锌离子水平升高的作用可以被叠加trpm7非特异性抑制剂(fty720或者ns8593)所抵消。
在前期研究中发现锌离子对自噬流有调控能力，在实施例1中证明了氯氮平可以显著升高细胞浆中锌离子水平的基础上，通过以下实施例2来验证氯氮平对细胞自噬活动的影响。
实施例2：氯氮平抑制自噬活性的检测
一、实验分组
空白对照组：正常培养基+10％胎牛血清
实验组1：20μm氯氮平处理
实验组2：20μm氯氮平与5μmbafilomycina1联合使用处理
实验组3：5μmbafilomycina1处理
实验组4：50μmrapamycin处理
二、实验方法
采用western-blot检测法(蛋白质免疫印迹方法)对各组细胞进行后续的处理和检测，具体方法为：
a、蛋白质提取及浓度测定
(1)细胞：培养细胞的六孔板置于冰上，吸掉培养基，每孔加入100μl细胞裂解液，冰上静置3-5min，用细胞刮将细胞刮下，收集细胞裂解液于1.5ml离心管中，在混旋仪上振荡20s，冰上静置30min。
(3)将静置后的ep管置于低温离心机内，4℃离心(15000rpm×18min)。
(4)轻轻吸取上清于另一标好的ep管内，即得到总蛋白溶液。
(5)检测蛋白浓度：各样本取5μl蛋白溶液加入20μlddh2o稀释5倍，取10μl于96孔板中，每个样品做2个复孔。
(6)在96孔板的最前一列中加入蛋白标准品a-h，浓度由高到低。
(7)避光条件下配制bca反应工作液(a：b＝50：1)混匀，每孔加入100μl工作液，轻轻震荡混匀，用锡纸包裹避光37℃温箱内孵育30min。
(8)酶标仪检测562nm波长下各孔光密度(od)值，及蛋白样品的浓度。
(9)未使用蛋白分装后于-80℃保存。
b、蛋白变性
根据所需的蛋白量及实验上样次数计算加入的蛋白液体积。以每孔30μg总蛋白需上样4次以便检测不同的试验指标进行电泳为例，计算所需蛋白溶液体积(μl)＝(30μg蛋白/蛋白浓度)×5，再补ddh2o至15μl×5＝75μl，再加入3μl×5＝15μl的6×loadingbuffer(6×loadingbuffer:β-巯基乙醇＝9:1)，封好口，沸水中煮5min，4℃保存。
c、sds-page凝胶电泳
(1)制备10％的聚丙烯酰胺分离胶(2块胶量)：取配胶专用瓶，分别加入以下试剂，注意混匀：ddh2o4ml；30％acr-bis3.3ml；1.5mtris-hcl缓冲液(ph8.8)2.5ml；10％sds缓冲液0.1ml；10％过硫酸胺(ap)0.1ml，temed0.004ml，混匀，用1ml枪吸取分离胶注入电泳槽的玻璃平板夹层中，注意不要形成气泡，加入胶量约2/3小玻璃板高度即可，再缓缓加入约1ml异丙醇液封压线，室温聚合30min左右。
(2)制备5％聚丙烯酰胺浓缩胶(2块胶量)：取配胶专用瓶，分别加入以下试剂，注意混匀：ddh2o2.7ml；30％acr-bis0.67ml；1.0mtris-hcl缓冲液(ph6.8)0.5ml；10％sds缓冲液0.04ml；10％过硫酸胺0.04ml；temed0.004ml，混匀。
(3)将凝好的分离胶顶部的异丙醇轻轻倒去，用滤纸吸干残存液体，将浓缩胶注入夹层顶部，插入梳子，室温聚合30min。
(4)胶凝固后，将凝胶板固定于电泳装置的上缓冲液室，加入电泳液，拔出梳子，用微量进样器吸取18μl样品溶液加至加样孔，在第一个样孔加入marker，最后一个样孔加入1×loadingbuffer，放入以倒好1×tris-甘氨酸电泳缓冲液的电泳装置中。
(5)接通电源，浓缩胶电压为90v，电泳约30min，分离胶电压为120v，电泳直至溴酚兰抵达分离胶底部，原则上应根据目的蛋白分子量的大小，调节电压的大小和分离胶的时间。
(6)关闭电源，取下凝胶，根据marker切取包含目的蛋白的胶，供下一步的转膜用。
d、转膜(全湿法)
(1)根据裁剪的目的胶的大小剪取适当大小的pvdf膜，并在膜上剪角做标记，置于甲醇中浸湿1-3min，再转移到1×转膜缓冲液中。
(2)按负极侧-多孔滤棉-厚滤纸-胶-pvdf膜-厚滤纸-多孔滤棉-正极侧的顺序装好转膜装置，然后置入bio-rad电泳仪内，倒入1×转膜液，冰浴转膜，根据目的蛋白的分子量确定转膜时间，一般多用恒流350ma，转移2h，或400ma，转移1.5h。
(3)转膜结束后，将pvdf膜剪去一角以标记膜的正反面，使marker在左侧并且由下到上为增大顺序，剪角在左上，用1×tbst溶液漂洗3次×10min。
e、免疫反应
(1)将漂洗后的转印膜放入5％脱脂奶粉封闭液中室温封闭2h，并在摇床上缓慢摇动。
(2)将一抗用5％脱脂奶粉封闭液稀释至适当浓度，在膜上覆盖适量的抗体，4℃孵育过夜。
(3)用1×tbst洗3次×15min，在摇床上摇动。
(4)5％脱脂奶粉封闭液稀释二抗至适当浓度，在膜上覆盖适量的抗体，室温湿盒孵育1-2h。
(5)用1×tbst洗3次×15min，在摇床上摇动。
(6)将ecl中的a和b两种试剂等体积混合，均匀加到膜上(避光)，用化学发光凝胶图像系统拍照。
三、实验结果
图2显示了蛋白免疫印迹的方法检测的hela细胞中，空白对照组，实验组1至4中加药后4小时，自噬标记蛋白lc3的两种形式的转化结果及p62蛋白的水平结果。其中，附图2中的相关内容翻译或解释如下：lc3代表微管相关蛋白1轻链3，normalizedlc3ii代表归一化的lc3ii值，gapdh代表gapdh内参蛋白，p62代表自噬选择性底物p62蛋白，normalizedp62代表p62表达水平的归一化值，ctl代表空白对照组，clozapine代表氯氮平，baf-a1代表巴弗洛霉素a1，rapamycin代表雷帕霉素。
如图2所示，氯氮平加药四小时后lc3ii的转化明显增加，当lc3i转化成lc3ii的水平增加时，说明自噬水平受到调控，揭示了氯氮平对自噬有迅速的调控作用。而且当联合氯氮平与bafilomycina1(baf-a1：一种溶酶体抑制剂)用药后，lc3ii的转化没有进一步增加，提示氯氮平抑制了自噬活动。雷帕霉素(rapamycin)处理组(实验组4)具有减少p62蛋白水平的作用，相反的，氯氮平处理组(实验组1)增加了p62蛋白的水平，进一步验证了氯氮平抑制自噬活动。
四、结论
氯氮平可以抑制hela细胞自噬活动的进行，可以作为自噬抑制剂使用。
肿瘤细胞为了向自身提供过增长的能量需求，自噬信号被激活从而不断降解自身蛋白来满足肿瘤细胞的恶性增殖需求，所以很多种类的肿瘤细胞的基础自噬水平比正常细胞显著增高。因此在实施例2验证了氯氮平能够抑制自噬的基础上，通过以下实施例3至8来验证氯氮平在杀灭肿瘤细胞、抑制肿瘤生长、抑制肿瘤细胞转移中的应用。
实施例3：氯氮平对人胰腺癌细胞patu8988t致死能力的测试
一、实验分组
空白对照组：dmso处理
实验组1：10μm氯氮平处理
实验组2：20μm氯氮平处理
实验组3：40μm氯氮平处理
二、实验方法
采用台盼蓝实验法对细胞进行检测，具体为将空白对照组(ctl)细胞和加药组(实验组1、2、3)细胞用胰酶消化后，和固定体积的台盼蓝试剂混匀，再用移液器吸取10μl的混匀液加入白细胞计数器，放置到显微镜下进行计数，分别在加药24小时、48小时和72小时后进行测量。染有台盼蓝的细胞计为死细胞，反之为活细胞。最终每组活细胞与总细胞数的比率计为细胞活性。
三、实验结果
图3显示了人胰腺癌细胞patu8988t的细胞活性在不同浓度clozapine(10μm、20μm、40μm)不同时长(24h、48h、72h)处理下的差异。其中，附图3中的相关内容翻译或解释如下：clozapine代表氯氮平，横坐标中ctl代表空白对照组，纵坐标cellviability代表细胞活性。
图4显示了正常胰腺导管上皮细胞hpde6c7的细胞活性在不同浓度clozapine(10μm、20μm、40μm)不同时长(24h、48h、72h)处理下的差异。其中，附图4中的相关内容翻译或解释如下：clozapine代表氯氮平，横坐标中ctl代表空白对照组，纵坐标cellviability代表细胞活性。
如图3所示，在胰腺癌patu8988t细胞中，氯氮平显著降低了细胞活性并呈时间和计量依存趋势。
如图4所示，在正常胰腺导管上皮细胞系hpde6c7细胞中，加药组与对照组的细胞活性差异较小。
四、结论
氯氮平对胰腺癌细胞patu8988t有致死能力，但对于正常胰腺导管上皮细胞hpde6c7杀伤力较小。
实施例4：氯氮平对人乳腺癌细胞mcf7致死能力的测试
一、实验分组
空白对照组：dmso处理
实验组1：10μm氯氮平处理
实验组2：20μm氯氮平处理
实验组3：40μm氯氮平处理
二、实验方法
采用台盼蓝实验法对细胞进行检测，具体为将空白对照组(ctl)细胞和加药组(实验组1、2、3)细胞用胰酶消化后，和固定体积的台盼蓝试剂混匀，再用移液器吸取10μl的混匀液加入白细胞计数器，放置到显微镜下进行计数，在加药48小时后进行测量。染有台盼蓝的细胞计为死细胞，反之为活细胞。最终每组活细胞与总细胞数的比率计为细胞活性。
三、实验结果
图5显示了人乳腺癌细胞mcf7的细胞活性由不同浓度clozapine(10μm、20μm、40μm)处理48小时后的差异。其中，附图5中的相关内容翻译或解释如下：clozapine代表氯氮平，横坐标中ctl代表空白对照组，纵坐标cellviability代表细胞活性。
图6显示了正常乳腺导管上皮细胞mcf10a的细胞活性由不同浓度clozapine(10μm、20μm、40μm)处理48小时后的差异。其中，附图6中的相关内容翻译或解释如下：clozapine代表氯氮平，横坐标中ctl代表空白对照组，纵坐标cellviability代表细胞活性。
如图5所示，在乳腺癌mcf7细胞中，氯氮平显著降低了细胞活性，并呈计量依存趋势。
如图6所示，在正常乳腺导管上皮细胞mcf10a中，加药组与对照组的细胞活性无显著差异。
四、结论
氯氮平对乳腺癌细胞mcf7有致死能力，但对于正常乳腺导管上皮细胞mcf10a无杀伤力。
实施例5：氯氮平灌胃处理抑制小鼠胰腺癌肿瘤生长的实验
一、实验分组
对照组：pbs灌胃处理(7个平行组)
实验组：1.2mg/ml氯氮平灌胃处理(7个平行组)
二、实验方法
a裸鼠皮下成瘤实验：
1、待patu8988t细胞达80-90％左右密度时，收集细胞前一天晚上更换新鲜培养基。
2、胰酶消化细胞后用预冷的pbs洗两遍，目的为去除细胞中的血清。
3、用pbs或者无血清培养基吹打细胞沉淀至合适的浓度，一般皮下瘤接种的细胞量为(1-5)×106个细胞/支，接种体积为0.1ml，因此细胞悬液的浓度为1-5×107个细胞/ml。
4、细胞消化后应尽快接种到裸鼠皮下，一般尽量在半小时内完成，途中将细胞悬液放在冰上降低细胞的代谢。
5、选择的裸鼠在5-8周龄，体重18-20g左右，种植部位选择血供丰富区域，如腋窝中后部、腹股沟中上部。
6、接种前用枪将细胞悬液充分的吹散，防止细胞成团而降低细胞成活率。
7、接种时，针头在皮下进针深一点，约1cm深，减少注射后细胞悬液从针眼溢出。
b小鼠在瘤药物注射及肿瘤体积测量方法
待小鼠肿瘤超过一公分后，每天对小鼠用pbs或1.2mg/ml的氯氮平进行灌胃，然后用游标卡尺测量肿瘤的相关参数并计算肿瘤体积，肿瘤体积＝长径*短径*短径/2。
三、实验结果
图7显示了pbs对照组与clozapine(1.2mg/ml)灌胃组的小鼠胰腺癌瘤块生长曲线。其中，附图7中的相关内容翻译或解释如下：pbs代表磷酸缓冲盐溶液，clozapine代表氯氮平，横坐标中daysafterintragastricadministration代表灌胃后的天数，纵坐标relativetumorvolume代表相对肿瘤体积。
如图7所示，与pbs灌胃小鼠肿瘤相比，氯氮平灌胃组小鼠的肿瘤体积增长显著降低(*p<0.05，**p<0.01)。
四、结论
氯氮平能够抑制小鼠胰腺癌肿瘤的生长。
实施例6：氯氮平瘤体注射抑制小鼠胰腺癌肿瘤生长的实验
一、实验分组
对照组：pbs注射(10个平行组)
实验组1：40μm氯氮平注射(10个平行组)
实验组2：40μm氯氮平、10μmfty720联合注射(10个平行组)
实验组3：10μmfty720注射(10个平行组)
二、实验方法
a裸鼠皮下成瘤实验：
1、待patu8988t细胞达80-90％左右密度时，收集细胞前一天晚上更换新鲜培养基。
2、胰酶消化细胞后用预冷的pbs洗两遍，目的为去除细胞中的血清。
3、用pbs或者无血清培养基吹打细胞沉淀至合适的浓度，一般皮下瘤接种的细胞量为(1-5)×106个细胞/支，接种体积为0.1ml，因此细胞悬液的浓度为1-5×107个细胞/ml。
4、细胞消化后应尽快接种到裸鼠皮下，一般尽量在半小时内完成，途中将细胞悬液放在冰上降低细胞的代谢。
5、选择的裸鼠在5-8周龄，体重18-20g左右，种植部位选择血供丰富区域，如腋窝中后部、腹股沟中上部。
6、接种前用枪将细胞悬液充分的吹散，防止细胞成团而降低细胞成活率。
7、接种时，针头在皮下进针深一点，约1cm深，减少注射后细胞悬液从针眼溢出。
b小鼠在瘤药物注射及肿瘤体积测量方法
待小鼠肿瘤超过一公分后，每天对小鼠用pbs或1.2mg/ml的氯氮平进行灌胃，然后用游标卡尺测量肿瘤的相关参数并计算肿瘤体积，肿瘤体积＝长径*短径*短径/2。
三、实验结果
图8显示了pbs对照组、clozapine注射组、clozapine和fty720注射组、fty720注射组的小鼠胰腺癌瘤块生长曲线。其中，附图8中的相关内容翻译或解释如下：pbs代表磷酸缓冲盐溶液，clozapine代表氯氮平，fty720代表一种trpm7非特异性抑制剂，横坐标中daysafterinjection代表注射后的天数，纵坐标relativetumorvolume代表相对肿瘤体积。
如图8所示，与pbs组小鼠肿瘤相比，氯氮平瘤体注射组(实验组1)小鼠的肿瘤体积增长显著减慢，并且实验组3的生长曲线表明经氯氮平干预后瘤块生长的减缓可以被联合注射fty720所抵消(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
四、结论
氯氮平能够抑制小鼠胰腺癌肿瘤的生长。
实施例7：氯氮平抑制人胰腺癌细胞patu8988t转移的实验
一、实验分组
对照组：dmso处理
实验组1：20μm氯氮平处理
实验组2：20μm氯氮平、1μmfty720联合处理
二、实验方法
a材料准备：
可拍照显微镜，transwell小室(孔径8μm)，transwell迁移实验的细胞培养板24孔板(与transwell小室相配套)，bd公司的matrigel，无血清dmem培养基，(1％胎牛血清)dmem培养基，dmem完全培养基，无菌pbs，棉签，胰酶(0.25％胰酶)，4％多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液(0.1％(g/ml)pbs结晶紫)
b步骤和流程
1、基质胶铺板：(细胞浸润实验所需，迁移实验无此步骤)
用bd公司的matrigel1：8稀释，包被transwell小室底部膜的上室面，37℃下放置30min使matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。
2、制备细胞悬液
①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12至24h，进一步去除血清的影响。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，(用pbs洗1－2遍)，用含bsa的无血清dmem培养基重悬，并调整细胞密度至5×105/ml。
3、接种细胞
①取细胞悬液100μl加入transwell小室。
②24孔板下室加入600μldmem完全培养基。
③培养细胞：常规培养24h。
4、结果统计
①取出transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的pbs洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。
②0.1％结晶紫染液染色20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用pbs洗3遍。
③测量被洗脱的细胞液od600数值、计数。
④计算细胞迁移率、浸润率(实验组od600值/对照组od600值)。
三、实验结果
图9显示了clozapine、clozapine和fty720处理后的人胰腺癌细胞patu8988t迁移或浸润到迁移小室下层的细胞经结晶紫染色的结果。其中，附图9中的相关内容翻译或解释如下：control代表对照组，clozapine代表氯氮平，fty720代表一种trpm7非特异性抑制剂，migration代表迁移，invasion代表浸润。
图10显示了clozapine、clozapine和fty720处理后的人胰腺癌细胞patu8988t迁移或浸润到迁移小室下层的迁移率(左图)或浸润率(右图)结果。其中，附图10中的相关内容翻译或解释如下：control代表对照组，clozapine代表氯氮平，fty720代表一种trpm7非特异性抑制剂，migrationrate代表迁移率，invasionrate代表浸润率。
如图9所示，与对照组相比，经氯氮平处理过的迁移或浸润到小室下层的胰腺癌细胞明显减少，并且实验组1和实验组2的对比结果表明，由氯氮平处理的减少效果由于叠加fty720而消失。
如图10所示，与对照组相比，经氯氮平处理过的胰腺癌细胞迁移率或浸润率明显减小，并且实验组1和实验组2的对比结果表明，由氯氮平处理的迁移率或浸润率减小的效果由于叠加fty720而消失。
四、结论
氯氮平有抑制胰腺癌细胞patu8988t转移的能力。
实施例8：氯氮平抑制人乳腺癌细胞mcf7转移的实验
一、实验分组
对照组：dmso处理
实验组1：20μm氯氮平处理
实验组2：20μm氯氮平、1μmfty720联合处理
二、实验方法
a材料准备：
可拍照显微镜，transwell小室(孔径8μm)，transwell迁移实验的细胞培养板24孔板(与transwell小室相配套)，bd公司的matrigel，无血清dmem培养基，(1％胎牛血清)dmem培养基，dmem完全培养基，无菌pbs，棉签，胰酶(0.25％胰酶)，4％多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液(0.1％(g/ml)pbs结晶紫)
b步骤和流程
1、基质胶铺板：(细胞浸润实验所需，迁移实验无此步骤)
用bd公司的matrigel1：8稀释，包被transwell小室底部膜的上室面，37℃下放置30min使matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。
2、制备细胞悬液
①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12至24h，进一步去除血清的影响。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，(用pbs洗1－2遍)，用含bsa的无血清dmem培养基重悬，并调整细胞密度至5×105/ml。
3、接种细胞
①取细胞悬液100μl加入transwell小室。
②24孔板下室加入600μldmem完全培养基。
③培养细胞：常规培养24h。
4、结果统计
①取出transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的pbs洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。
②0.1％结晶紫染液染色20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用pbs洗3遍。
③测量被洗脱的细胞液od600数值、计数。
④计算细胞迁移率、浸润率(实验组od600值/对照组od600值)。
三、实验结果
图11显示了clozapine、clozapine和fty720处理后的人乳腺癌细胞mcf7迁移或浸润到迁移小室下层的细胞经结晶紫染色的结果。其中，附图11中的相关内容翻译或解释如下：control代表对照组，clozapine代表氯氮平，fty720代表一种trpm7非特异性抑制剂，migration代表迁移，invasion代表浸润。
图12显示了clozapine、clozapine和fty720处理后的人乳腺癌细胞mcf7迁移或浸润到迁移小室下层的迁移率(左图)或浸润率(右图)结果。其中，附图12中的相关内容翻译或解释如下：control代表对照组，clozapine代表氯氮平，fty720代表一种trpm7非特异性抑制剂，migrationrate代表迁移率，invasionrate代表浸润率。
如图11所示，与对照组相比，经氯氮平处理过的迁移或浸润到小室下层的乳腺癌细胞明显减少，并且实验组1和实验组2的对比结果表明，由氯氮平处理的减少效果由于叠加fty720而消失。
如图12所示，与对照组相比，经氯氮平处理过的乳腺癌细胞迁移率或浸润率明显减小，并且实验组1和实验组2的对比结果表明，由氯氮平处理的迁移率或浸润率减小的效果由于叠加fty720而消失。
四、结论
氯氮平有抑制乳腺癌细胞mcf7转移的能力。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
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