盐酸苄丝肼在制备治疗急性肺损伤药物中的应用的制作方法

本发明涉及盐酸苄丝肼在制备治疗急性肺损伤药物中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

急性肺损伤(acutelunginjury，ali)是由心源性以外的各种致病因素引起的急性的，进行性的缺氧性呼吸衰竭，其特征在于非心源性肺水肿，呼吸困难，目前临床上死亡率高，难以治愈。炎症是富含血管的组织在局部损伤后发生的一种生理反应。在此过程中，各种可溶性介质以及炎性细胞以系统的形式一同发挥作用，以消除引起机体损伤的因素表现为红、肿、热、痛和功能障碍。但当炎症反应过度时，炎症介质就会产生异常的身体反应，更进一步当炎症失控时，将导致严重的组织损伤。ali的本质即是不受控制的炎症反应，过度或失控的炎症反应将导致泡上皮细胞和内皮细胞的损伤，富含蛋白质的水肿液进入肺泡，进而造成肺部的水肿。如果在ali期间，病情没有得到有效控制，肺泡-毛细血管的通透性持续增加，最终将导致急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome，ards)。严重的急性炎症反应、肺泡上皮细胞的大量凋亡、肺泡-毛细血管通透性的不断增加将导致肺纤维化的慢慢形成。在细胞水平上，ali的形成与发展过程与肺泡-毛细血管膜完整性的破坏，过多的中性粒细胞迁移以及促炎性细胞因子的产生和分泌有密切联系。

盐酸苄丝肼(benserazidehydrochloride)是一种外周脱羧酶抑制剂，目前在医药市场上常与左旋多巴联合制成复合制剂多巴丝肼用于帕金森病的治疗，收载于中国药典2010年版(chp2010)，欧洲药典7.0版(ep7.0)和日版药典16版(jp16)。盐酸苄丝肼性质极不稳定，对溶剂ph、光线、温度及湿度的变化极为敏感。目前尚未有盐酸苄丝肼用作治疗ali药物的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供盐酸苄丝肼在制备治疗ali药物中的应用。

本发明通过动物实验研究了盐酸苄丝肼对ali的治疗效果，结果显示盐酸苄丝肼可以缓解小鼠ali导致的肺损伤和肺水肿，同时抑制了多种促炎性细胞因子的释放，从而达到治疗脂多糖所致的小鼠ali的作用。具体是通过脂多糖诱导c57bl/6小鼠构造ali模型，采用不同浓度的盐酸苄丝肼对其进行治疗，结果发现盐酸苄丝肼能够降低c57bl/6小鼠ali所造成的肺组织损伤，肺水肿以及抑制多种促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子(tnf-α)，白细胞介素-1β(il-1β)以及白细胞介素-6(il-6)的分泌。将盐酸苄丝肼通过添加药学上可接受的载体制备成临床需要的各种制剂，其有益效果是：为制备治疗ali药物提供了一种新途径。

附图说明

图1为空白对照组小鼠肺组织he染色镜检图。

图2为模型对照组小鼠肺组织he染色镜检图。

图3为阳性药对照组小鼠肺组织he染色镜检图。

图4为盐酸苄丝肼高剂量组小鼠肺组织he染色镜检图。

图5为盐酸苄丝肼中剂量组小鼠肺组织he染色镜检图。

图6为盐酸苄丝肼低剂量组小鼠肺组织he染色镜检图。

图7为盐酸苄丝不同剂量组对小鼠肺水肿治疗效果的数据统计分析结果图。

图8为小鼠血清中il-1β分泌的elisa结果。

图9为小鼠血清中tnf-α分泌的elisa结果。

图10为小鼠血清中il-6分泌的elisa结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例

建立c57bl/6小鼠ali动物模型及给药处理

所有小鼠均饲养于spf级动物房内，并采取自由采食及饮水的饲养方式。将60只c57bl/6小鼠(购自南京大学模式生物研究所)随机分成六组，每组10只，分别为空白对照组、模型对照组、阳性药对照组、盐酸苄丝肼高剂量组(30mg/kg/d)、盐酸苄丝肼中剂量组(20mg/kg/d)、盐酸苄丝肼低剂量组(10mg/kg/d)。

对上述六组小鼠采用基础饲料适应性喂养7天后，盐酸苄丝肼低剂量组小鼠注射盐酸苄丝肼10mg/kg/d、盐酸苄丝肼中剂量组小鼠注射盐酸苄丝肼20mg/kg/d和盐酸苄丝肼高剂量组小鼠注射盐酸苄丝肼30mg/kg/d，阳性药对照组小鼠注射地塞米松(dexamethasone，dex)4mg/kg/d、空白对照组和模型对照组则注射相应体积的生理盐水。连续给药处理7天后，断食12h，之后模型对照组、阳性药对照组、盐酸苄丝肼高剂量组、盐酸苄丝肼中剂量组、盐酸苄丝肼低剂量组注射10mg/kg脂多糖，而空白对照组小鼠注射相应体积的生理盐水。8h取血后处死小鼠，获得肺组织样本，随后进行elisa实验，干湿重评估肺水肿情况以及he染色。

he染色实验

实验结束后，剖取肺脏固定于10％福尔马林溶液内，常规取材，脱水，石蜡包埋，切片(4微米厚)。he染色：(1)石蜡切片常规脱蜡：二甲苯(i)15min→二甲苯(ii)(应完全透明)10min；(2)逐级下行梯度乙醇浸泡水化：100％乙醇(i)2min→100％乙醇(ii)2min→95％乙醇2min→80％乙醇2min→自来水冲洗片刻；(3)染色：蒸馏水洗片刻→苏木素液染核5min→自来水冲洗片刻→1％盐酸乙醇分化30s(提插数下)→流水冲洗片刻→弱氨水水溶液反蓝数秒→流水冲洗10min→置0.5％伊红水溶液中复染10min；(4)逐级上行梯度乙醇脱水：自来水冲洗片刻(分化伊红)→95％乙醇(i)2min→95％乙醇(ii)2min→100％乙醇(i)2min→100％乙醇(ii)2min；(5)透明：二甲苯(i)5min→二甲苯(ii)5min；(6)固定、封片：盖玻片下中性树脂固定、封片。(6)光学显微镜下检查。

光学显微镜下观察结果：空白对照组，肺组织由肺泡、肺内支气管分支及间质组成，结构清晰，肺泡壁未见增厚，肺泡上皮细胞结构完整，肺泡壁无充血、肺泡腔内无渗出物。肺内各级支气管上皮细胞无明显变性、坏死或脱落，如图1。模型对照组，肺组织结构同正常组，结构尚清晰，但肺泡萎陷，肺泡间隔增宽，淋巴细胞为主的炎细胞浸润，间质血管内见极少量或少量的白细胞靠边，伴有间质血管周围轻微或轻度出血，如图2。阳性药对照组，肺组织结构同正常组，结构尚清晰，轻微或轻度肺泡炎，肺间质血管内见极少量或少量的白细胞靠边，其中3只伴有间质血管周围轻微或轻度出血，如图3。盐酸苄丝肼高剂量组，肺组织结构同正常组，结构尚清晰，本组小鼠肺组织的病变与模型组一致，病变程度较模型组明显减轻，如图4。盐酸苄丝肼中剂量组，肺组织结构同正常组，结构尚清晰，本组小鼠肺组织的病变与模型组一致，病变程度较高剂量组略重，如图5。盐酸苄丝肼低剂量组，肺组织结构同正常组，结构尚清晰，本组小鼠肺组织的病变与模型组一致，病变程度较中剂量组略重，如图6。

干湿重法评估肺水肿

分离每只小鼠的左肺并且立即称重，记录数值为其湿重；在95℃下干燥两天后，再次称重以获得干重，基于湿重与干重的比率来评估小鼠肺水肿的严重程度。结果显示，阳性药对照组与盐酸苄丝肼不同剂量给药组均可以下降lps诱导的ali小鼠中肺的湿干重比，减缓小鼠体内的肺部水肿，其中盐酸苄丝肼高剂量组具有显著差异，如图7。

体内炎症反应

elisa检测小鼠血清中il-1β、tnf-α、il-6表达变化

血液标本收集完毕后，立即置于冰上。2h后，3000r/min4℃离心，时间为15min。提取血清后，按照试剂盒的操作说明书进行elisa检测。(1)加样：按照适当的比例稀释血清样品，将不同组的血清样品加入到预包被板条中，每孔100μl，每组设置至少三个复孔。(2)加检测抗体：50μl/well加入生物素化抗体工作液。混匀后，盖上封板膜，37℃孵育90分钟。(3)洗板：扣去孔内液体，300μl/well加入洗涤液；停留1分钟后弃去孔内液体。重复4次，每一次在滤纸上扣干。(4)加酶：100μl/well链霉亲和素-hrp工作液。盖上封板膜，37℃孵育30分钟。(5)洗板：重复步骤3。(6)显色：100μl/well加入tmd，37℃避光温育5-30分钟，根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判定终止反应。通常显色10-20分钟。(7)终止反应：100μl/well迅速加入终止液终止反应。小鼠血清中il-1β、tnf-α、il-6表达变化结果分别如图8、图9、图10，加入盐酸苄丝肼后，三种促炎性因子的表达均有显著性的下降，表明盐酸苄丝肼可以抑制促炎性细胞因子的释放，从而达到改善以及抑制急性肺损伤的作用，其中盐酸苄丝肼高剂量组的效果最好。

除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。