负载利巴韦林的纳米硒在制备抑制手足口病病毒产品中的应用的制作方法

本发明属于医学领域，特别涉及一种负载利巴韦林的纳米硒在制备抑制手足口病病毒产品中的应用。

背景技术

手足口病(hand,footandmouthdisease，hfmd)是全球性传染病，由于其极强的传染性以及部分感染者可出现严重的中枢神经系统并发症，已经成为全世界共同关注的公共卫生问题。引起手足口病的肠道病毒有20多种型，其中ev71和ca16病毒感染较为常见。尽管手足口病是自限性疾病，但少数患儿可引起肺水肿、心肌炎、脑膜脑炎等重症发生，而ev71病毒是导致重症手足口病的最主要病原。

硒是人体必需的微量元素，在抗氧化、抗衰老、抗代谢的过程中发挥重要作用。研究表明宿主细胞内的硒含量与病毒的突变、复制和毒力密切相关，反复发生hfmd感染的患儿，血中硒的水平明显低于健康儿童。利巴韦林(rbv)是一种广谱抗病毒药物，研究表明，利巴韦林可以抑制ev71病毒感染vero细胞。目前，手足口病的治疗主要是对症和支持治疗，并没有有效的药物。因此，新型有效药物的研发迫在眉睫。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种负载利巴韦林的纳米硒在制备抑制手足口病病毒产品中的应用。

纳米硒(senps)作为药物载体，具有低毒性、小粒径、易功能化、高生物活性等特点。本发明通过合成senps及利巴韦林功能化纳米硒(se@rbv)，并且通过化学表征，确定了senps和se@rbv的分散性、稳定性。细胞存活率实验显示se@rbv可抑制ev71病毒复制。本发明将纳米硒运载利巴韦林，可以更高效的将药物载入细胞，为临床抗病毒增敏治疗提供新的用药途径和科学依据。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种负载利巴韦林的纳米硒在制备抑制手足口病病毒产品中的应用。

优选的，所述的病毒为ev71病毒。

进一步的，还提供一种负载利巴韦林的纳米硒在制备防治肠道病毒引起的手足口病产品中的应用。

所述的负载利巴韦林的纳米硒的有效浓度为7.8125μmol/l～31.25μmol/l，更优选为15.625μmol/l。

所述的负载利巴韦林的纳米硒的制备方法，是采用纳米硒负载利巴韦林实现的，包括如下步骤：

将利巴韦林溶液加入至纳米硒溶液中，搅拌反应后透析、水洗、干燥，得到纳米硒运载利巴韦林纳米载药体系，即负载利巴韦林的纳米硒。

优选的，反应体系中，利巴韦林与纳米硒的质量比值为160：1。

反应体系中，利巴韦林的终浓度为200μg/ml；

具体包括如下步骤：

(1)取2ml50mm维生素c溶液逐滴加入到0.25ml浓度为0.1m亚硒酸钠(na2seo3)溶液中，加入去离子水使终体积为25ml，磁力搅拌，经透析后获取纯化后纳米硒溶液；

(2)取步骤(1)制备的纳米硒溶液，加入浓度为2mg/ml的利巴韦林储液，使反应体系中利巴韦林的终浓度达到200μg/ml；磁力搅拌，反应后的溶液经过透析，离心，去离子水洗三遍，样品冷冻干燥得到纳米硒运载利巴韦林纳米载药体系，即负载利巴韦林的纳米硒。

优选的，步骤(1)中所述的磁力搅拌的条件为200rpm磁力搅拌2小时。

优选的，步骤(2)中所述的磁力搅拌的时间为1h。

优选的，步骤(2)中所述的离心的条件为10000rpm离心10分钟。

本发明的机理是：

通过获取分散均匀稳定的纳米硒运载利巴韦林纳米载药体系，探索纳米硒运载利巴韦林抑制病毒感染细胞效果。纳米硒具有良好的抗病毒活性，纳米硒负载利巴韦林(se@rbv)有效抑制ev71病毒感染细胞，se@rbv作为抗病毒药物增敏治疗具有重要的学术意义，为开阔临床抗病毒药物机制研究提供参考。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

纳米硒作为药物载体具有良好的抗病毒作用，实验观察将纳米硒运载利巴韦林能够协同抑制ev71病毒复制。

附图说明

图1是纳米硒运载利巴韦林(se@rbv)的表征；其中，图a和b是se@rbv的丁达尔效应；图c和d分别是senps和se@rbv的透射电镜图。

图2是细胞存活率实验结果图；其中，control为vero细胞作为对照组(cell)，mock为病毒对照组(virus)，ribavirin组：cell+virus+ribavirin，senps组：cell+virus+senps，se@rbv组：cell+virus+se@rbv；*：p<0.05。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用的ev71病毒购自中国科学院武汉病毒研究所。

实施例中所用的vero细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，目录号：gno10。

实施例1

(1)se@rbv载药体系制备

将2ml浓度为50mm的维生素c(vitaminc)溶液逐滴加入到0.25ml浓度为0.1m亚硒酸钠(na2seo3)溶液中，加入去离子水使总体积达到25ml。200rpm磁力搅拌2小时，经透析后获取纯化后纳米硒溶液(浓度为15.6μm)，冷冻干燥得到纳米硒(senps)。取上述纳米硒溶液10ml，加入1ml浓度为2mg/ml的利巴韦林(ribavirin，rbv)储液，磁力搅拌1h，反应后的溶液经过透析，10000rpm离心10分钟，去离子水洗三遍，样品冷冻干燥得到纳米硒运载利巴韦林载药体系(se@rbv)。

如图1a和b所示，se@rbv能产生纳米材料特有的丁达尔效应；透射电镜(tem)观察se@rbv形貌变化，如图1d，结果表明电镜下可以发现合成的纳米材料se@rbv具备小粒径，且均匀分散的特点；其中senps粒径为100nm，而se@rbv粒径为75nm，小粒径的se@rbv利于进入细胞。

(2)ev71病毒毒力测定

用dmem将ev71梯度稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-66个浓度，将病毒液按每孔100μl加入到细胞密度(1×10⁴cells/ml)96孔板中，设置正常对照组，将96孔板放置细胞培养箱中培养2h，弃上清用pbs洗3次，每孔加200μldmem，继续培养，显微镜下观察细胞状态，运用reed-muench法计算病毒tcid50，实验重复三次。经计算ev71的tcid50为1*10^-6。

(3)se@rbv对vero细胞毒性测定(mtt)

细胞存活率用mtt法进行测定。用0.25％胰酶消化vero细胞，以5×10⁴个/ml接种于96孔板中，每孔100μl。置37℃、5％co2培养箱培养24h后，加入100tcid50ev71病毒培养12h后，加入纳米硒溶液(15.6μm)、利巴韦林溶液(200μg/ml)、纳米硒负载利巴韦林溶液(se@rbv，浓度是12μm)各100μl，继续培养24h。加入5mg/mlmtt20μl/孔，37℃孵育5h后吸弃培养板孔中的液体，加入二甲基亚砜150μl/孔，振荡10min，紫色结晶物充分溶解后，测定各孔od570值。以对照组od570为100％，计算药物处理组细胞存活率。

细胞存活率(％)＝(od570实验组/od570对照组)×100％。

细胞存活率实验结果如图2所示。control为vero细胞作为对照组(cell)，mock为病毒对照组(virus)，ribavirin组：cell+virus+ribavirin，senps组：cell+virus+senps，se@rbv组：cell+virus+se@rbv。经以上述不同药物浓度药物处理24小时后，以正常细胞的生存率为100％，与病毒对照组相比，senps有抗ev71病毒效果，能提高细胞的生存率，ribavirin有较明显的抗ev71病毒效果，se@rbv则现明显地抑制病毒复制，提高细胞生存率。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。