本发明涉及一种生物粘附微球制剂的制备方法，属于生物制剂技术领域。
背景技术
生物粘附给药系统是一类借助天然或合成的聚合物材料，通过其与机体组织粘膜表面产生较长时间的紧密接触，从而延长药物在粘膜、粘液局部的滞留时间或保持在接近吸收窗的位置，控制药物在局部定位释放，达到增加药物吸收、提高药物生物利用度，或提高局部病变组织药物浓度、改善疗效、减小毒副作用目的的药物递送系统。生物粘附给药系统一般经口腔、鼻腔、眼部、消化道、阴道、直肠等部位给药，这些部位均覆有粘膜层。粘膜的上皮细胞层分泌粘液，粘液一般以粘附在粘膜表面的凝胶体层形式存在。
生物粘附给药系统的优势在于：（1）所载药物在特定粘膜部位定位释药，延长药物在病灶部位的保留时间，提高治疗局部疾患的效果；（2）口服给药体系中，制剂可粘附在消化道粘膜表面，通过延长药物在消化道的滞留时间，延长药物的作用时间；对于在消化道溶解度小或具有特定吸收部位的药物能增加其吸收总量及吸收效率，提高药物的生物利用度；（3）运用生物粘附缓（控）释制剂还可以降低给药频率，减少给药剂量，方便用药。
粘附材料在生物粘附给药系统的粘附作用中起着关键的作用。一般认为，为了形成较好的粘附作用，聚合物需要具备以下特征：具有足够数量的氧键化学基团（一oh和一cooh）；较高的分子量；分子链柔软性好；可诱导粘膜层扩散渗透的合适的表面张力。目前研究和应用较多的生物粘附材料主要为聚丙烯酸类、纤维素类、多糖类及他们的衍生物，这些聚合物材料均含有较多的羧基或羟基或氨基或磺酸基，能与粘膜粘液产生相互作用。此外，透明质酸、藻酸盐，不同的树胶如瓜耳胶、黄原胶及果胶等也有报道用作生物粘附材料。
相对于传统制剂，粘附微球制剂有更多质量指标的要求，且因为粘附材料的加入，软材粘度过高，传统工业化生产方法难以同时兼顾缓释、粘附、成球多方面的要求。但实验室研究采用的液中干燥法又往往需要使用大量的有机溶剂（包括易挥发的分散相极性溶剂及高沸点的连续相非极性溶剂），存在影响因素多、工艺条件复杂、溶剂回收困难等多方面的问题，难以适应工业化生产的要求。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题：针对现今开发出来的粘附微球生产方法无法兼顾成球性、释放度和粘附性的问题，提供了一种生物粘附微球制剂的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
（1）取壳聚糖、氢氧化钾和异丙醇混合搅拌并升温至40～60℃，微波碱化0.5～2h，得到壳聚糖液；
（2）向壳聚糖液中滴加溴代乙烷反应4～10h，得到反应液a；
（3）向反应液中添加甲醇并混合均匀，得到反应液b，用0.01mol/l盐酸溶液将反应液b调节ph值至7，得到反应液c，再往反应液c中添加丙酮，得到反应液d；
（4）将反应液d静置1～2h，析出沉淀，过滤后得到滤渣，再用丙酮和乙醚多次洗涤滤渣，然后烘干得到烷基化壳聚糖；
（5）取多巴胺盐酸盐和去离子水混合，得到多巴胺水溶液；
（6）取烷基化壳聚糖放入去离子水中超声震荡30min后得到分散液；
（7）将多巴胺水溶液和分散液混合搅拌，并维持超声20～40min，得到粘附微球分散液；
（8）将粘附微球分散液过滤，将滤渣干燥后得到生物粘附微球制剂。
步骤（1）所述壳聚糖、氢氧化钾和异丙醇的质量比为1：2：20。
步骤（3）所述甲醇和丙酮的质量比为2：1。
步骤（4）所述丙酮和乙醚的质量比为1：1，洗涤次数为5～8次。
步骤（5）所述多巴胺盐酸盐和去离子水的质量比为1：20。
步骤（6）所述烷基壳聚糖和去离子水的质量比为1：10。
本发明与其他方法相比，有益技术效果是：
（1）壳聚糖能被人体的溶菌酶降解为天然的代谢物，具有无毒、能被人体完全吸收的特点，同时还可以起到缓释的作用；将壳聚糖烷基化处理后，使得壳聚糖同时具有亲水性主链和疏水性支链，并且使得壳聚糖在水中聚集成外部亲水而内部疏水的微球形态，使得粘附微球能够负载一些非水溶性的药物，并将其用于水体系中，大大提高了粘附微球的药物负载能力；
（2）多巴胺中含有丰富的乙氨基和邻苯二酚官能团，能够很好地黏附在微球表面，并为微球提供极强的粘附性，能够黏附在细胞表面；
（3）本发明所制备的生物粘附微球制剂将壳聚糖改性提高药物负载性能并使其成球，再利用壳聚糖微球微孔结构达到缓释的效果，再用多巴胺将壳聚糖微球粘附在细胞表面，达到粘附效果；生物相容性好，在保证成球形和释放度的同时，使其具有良好的粘附性。
具体实施方式
取5～10g壳聚糖、10～20g氢氧化钾和100～200g异丙醇混合搅拌并升温至40～60℃，微波碱化0.5～2h，得到壳聚糖液；向壳聚糖液中滴加2～4g溴代乙烷反应4～10h，得到反应液a；向反应液中添加100～200g甲醇并混合均匀，得到反应液b，用0.01mol/l盐酸将反应液b调节ph值至7，得到反应液c，再往反应液c中添加50～100g丙酮，得到反应液d；将反应液d静置1～2h，析出沉淀，过滤后得到滤渣，再用丙酮和乙醚洗涤滤渣5～8次，然后烘干得到烷基化壳聚糖；取1～2g多巴胺盐酸盐和20～40g去离子水混合，得到多巴胺水溶液；生物粘附微球制剂取2～4g烷基化壳聚糖放入20～40g去离子水中维持超声30min后得到分散液；生物粘附微球制剂将多巴胺水溶液和分散液混合搅拌，并维持超声20～40min，得到粘附微球分散液；生物粘附微球制剂将粘附微球分散液过滤，将滤渣干燥后得到生物粘附微球制剂。
实例1
取5g壳聚糖、10g氢氧化钾和100g异丙醇混合搅拌并升温至40℃，微波碱化0.5h，得到壳聚糖液；向壳聚糖液中滴加2g溴代乙烷反应4h，得到反应液a；向反应液中添加100g甲醇并混合均匀，得到反应液b，用0.01mol/l盐酸将反应液b调节ph值至7，得到反应液c，再往反应液c中添加50g丙酮，得到反应液d；将反应液d静置1h，析出沉淀，过滤后得到滤渣，再用丙酮和乙醚洗涤滤渣5次，然后烘干得到烷基化壳聚糖；取1g多巴胺盐酸盐和20g去离子水混合，得到多巴胺水溶液；生物粘附微球制剂取2g烷基化壳聚糖放入20g去离子水中维持超声30min后得到分散液；生物粘附微球制剂将多巴胺水溶液和分散液混合搅拌，并维持超声20min，得到粘附微球分散液；生物粘附微球制剂将粘附微球分散液过滤，将滤渣干燥后得到生物粘附微球制剂。
实例2
取8g壳聚糖、15g氢氧化钾和150g异丙醇混合搅拌并升温至50℃，微波碱化1.5h，得到壳聚糖液；向壳聚糖液中滴加3g溴代乙烷反应7h，得到反应液a；向反应液中添加150g甲醇并混合均匀，得到反应液b，用0.01mol/l盐酸将反应液b调节ph值至7，得到反应液c，再往反应液c中添加80g丙酮，得到反应液d；将反应液d静置1h，析出沉淀，过滤后得到滤渣，再用丙酮和乙醚洗涤滤渣6次，然后烘干得到烷基化壳聚糖；取1g多巴胺盐酸盐和30g去离子水混合，得到多巴胺水溶液；生物粘附微球制剂取3g烷基化壳聚糖放入30g去离子水中维持超声30min后得到分散液；生物粘附微球制剂将多巴胺水溶液和分散液混合搅拌，并维持超声30min，得到粘附微球分散液；生物粘附微球制剂将粘附微球分散液过滤，将滤渣干燥后得到生物粘附微球制剂。
实例3
取10g壳聚糖、20g氢氧化钾和200g异丙醇混合搅拌并升温至60℃，微波碱化2h，得到壳聚糖液；向壳聚糖液中滴加4g溴代乙烷反应10h，得到反应液a；向反应液中添加200g甲醇并混合均匀，得到反应液b，用0.01mol/l盐酸将反应液b调节ph值至7，得到反应液c，再往反应液c中添加100g丙酮，得到反应液d；将反应液d静置2h，析出沉淀，过滤后得到滤渣，再用丙酮和乙醚洗涤滤渣8次，然后烘干得到烷基化壳聚糖；取2g多巴胺盐酸盐和40g去离子水混合，得到多巴胺水溶液；生物粘附微球制剂取4g烷基化壳聚糖放入40g去离子水中维持超声30min后得到分散液；生物粘附微球制剂将多巴胺水溶液和分散液混合搅拌，并维持超声40min，得到粘附微球分散液；生物粘附微球制剂将粘附微球分散液过滤，将滤渣干燥后得到生物粘附微球制剂。
对照例：江西某医药有限公司生产的生物粘附微球制剂。
将实例及对照例的生物粘附微球制剂进行检测，具体检测如下：
体外释放度测定：照中国药典2005年版二部附录xc溶出度测定法第一法转篮法和xd释放度测定法第一法进行。释放介质为ph3.6磷酸盐缓冲液900ml；温度为37±0.5℃，转速50rpm。取生物粘附微球适量（约60mg），于规定时刻分别取出释放液2ml，以0.45um微孔滤膜过滤，取续滤液待测，同时补充释放介质2ml。另取生物粘附微球适量，研细，称取一定量（约16.7mg），以适量释放介质转移至250ml容量瓶，水浴超声2h，放冷，定容至刻度，以0.45um微孔滤膜过滤，取续滤液。以上样品分别于252nm下测定其紫外吸收度值。
体外粘附性测定：取昆明种小鼠（25～30g，雌雄不拘），禁食供水24h后，断颈处死，将胃取出，沿胃小弯剪开，生理盐水漂洗除去内容物后平铺固定于平整的橡胶垫丄，于胃粘膜表面均句撒上生物粘附缓释微球100颗，随后置于含有饱和kno3溶液的密闭容器中（rh93%）保湿30min后，取出，固定于45°斜面，用ph1.3盐酸-氯化钠溶液以22ml/min流速冲洗胃黏膜表面5min。计数表面滞留的颗粒，计算微球滞留百分率。
经实验证明：放大批次微球的收率为88.4%，微球载药量17.6%，包封率70.4%。有关物质含量小于0.7%，符合药典规定标准；
放大批次生物粘附微球在离体小鼠胃粘膜表面均有较好的粘附性，且批内无显著性差异（p>0.05）。