一种应用于电场下的肿瘤治疗制剂和系统的制作方法

发明涉及一种应用于电场下的肿瘤治疗制剂和系统，具体是利用电场下铂纳米颗粒催化组织液中水分解反应产生的羟基自由基，实现肿瘤细胞杀伤。

背景技术：

肿瘤是威胁人类健康乃至生命的最重要杀手之一，目前临床上治疗肿瘤的主要方法有外科手术法、化疗法、放疗法等，但均存在不同程度的缺陷与弊端。外科手术创口大、愈合慢、易感染，病人恢复时间长；化疗法易产生全身副作用与抗药性；放疗法在杀死肿瘤细胞的同时会降低患者自身免疫力。除上述疗法外，电化学治疗作为一种时下新兴的肿瘤治疗方法，也被多个国家应用于临床病例，如中国、德国、巴西等。电化学治疗肿瘤的原理，主要是利用组织液中的离子在电极附近发生的氧化还原反应，使阳极附近ph降低呈现酸性，阴极附近的ph升高呈现碱性。这种电极附近酸碱度的剧烈变化，可以有效杀死肿瘤细胞。

然而，现在电化学治疗发展的瓶颈在于，局部的酸碱度变化仅存在于电极周围大约2cm的范围内。于是根据临床病例的实际情况与通电剂量，需要进行合理的电极配制。例如，一个5cm*5cm大小的肿瘤，往往需要插入10根左右的治疗点击才能达到完全的治疗效果。这不但使得临床操作变得复杂化，而且还给患者平添了许多额外的痛苦。

近些年来，基于细胞毒性的活性氧实现肿瘤治疗的方法也逐步发展起来。比如光激发的光动力治疗、超声波介导的生动力治疗、类芬顿效应的化学动力治疗等等。这些治疗方法中产生的活性氧，如单线态氧、羟基自由基等，能够有效破坏癌细胞有效组分(脂质、蛋白质或dna)，引发细胞坏死或凋亡。在这些“动力疗法”中，纳米颗粒由于具有小尺寸、大比表面积、丰富的表面缺陷，能够有效增强催化活性，促进活性氧的产生，因而被广泛使用。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足之处，目的在于克服传统电化学疗法的诸多缺陷，借助纳米颗粒的优势与活性氧诱导癌细胞凋亡的原理，提供一种可以在电场下应用的肿瘤治疗制剂和系统。

本发明的技术方案如下：一种用于肿瘤治疗的制剂，所述制剂中包含铂纳米颗粒，该制剂在电场作用下，催化组织液中的水分解，产生具有细胞毒性的羟基自由基，对肿瘤区域细胞进行杀灭。

进一步地，所述制剂为铂纳米颗粒溶液。

进一步地，所述铂纳米颗粒可替换为与铂性质相似的其他贵金属催化剂，如钯、铱纳米颗粒。

一种肿瘤电化学治疗系统，包括上述制剂和发生所述电场的两个电极。

进一步地，所述制剂容置于一注射装置内。

进一步地，所述注射装置的注射头为惰性金属材料，构成所述两个电极中的其中一个电极，另一个电极环绕所述注射头。

进一步地，所述环绕于所述注射头的电极与注射装置一体。

本发明所述肿瘤治疗制剂为铂纳米颗粒水溶液，采用硼氢化钠室温还原法制备，pvp为稳定剂。铂纳米颗粒溶液通过电化学治疗系统的注射装置介入至肿瘤区域，注射头作为其中一个电极插入肿瘤中心，另一电极环绕肿瘤周围，施加电场后，铂纳米颗粒会催化组织液中的水分解，产生具有细胞毒性的羟基自由基，实现肿瘤细胞的杀伤。优选地，所述的铂纳米颗粒水溶液浓度为2mg/ml，注射剂量50μl；

本发明的一种用于肿瘤治疗的制剂，其优点如下：

1.通过电化学治疗系统将所述纳米颗粒制剂微创注射介入，能够更好地适应不规则肿瘤形状及传统治疗中难接触肿瘤位置；

2.仅依靠两根电极，且其中一个电极为注射装置的注射头，就可以实现对肿瘤细胞杀伤区域的精准控制，避免了传统电化学治疗中复杂的电极配置，操作更加方便；

3.利用铂纳米颗粒在电场驱动下催化水分解产生活性氧来杀伤肿瘤，治疗手段更加温和，减少了病人的痛苦与副作用；

附图说明

图1铂纳米颗粒(a)透射电镜图片，插图为高分辨透射电镜图片，(b)xrd图谱，(c)在水溶液和盐溶液中的动态光散射粒度分析。

图2验证铂纳米颗粒在电场下具有催化水分解产生羟基自由基效果的实验装置图。

图3直流电场下对亚甲基蓝的降解效果(a)亚甲基蓝降解速率曲线，对比无处理、只加铂纳米颗粒无电场、只加电场无铂纳米颗粒与加电场加铂纳米颗粒四种情况；(b)改变外加电压亚甲基蓝降解效率的变化；(c)亚甲基蓝降解效果与反应容器两端电压的关系。

图4方波交流电场下的效果(a)方波半周期分别为1s、10s、30s、60s和∞时的波形输出，(b)通方波交流电10分钟后，两电极所在容器溶液的ph值变化，(c)采用不同方波半周期的亚甲基蓝降解速率，(d)分别在方波与直流电场下，对比有无铂纳米颗粒羟基自由基探针apf荧光强度的变化。

图5电场下几种贵金属颗粒对亚甲基蓝的降解效果对比(a)相同方法合成相同尺寸、相同浓度的pt、pd、ir和au纳米颗粒图示；(b)四种纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱；(c)四种纳米颗粒的动态光散射粒径分布；(d)四种纳米颗粒降解亚甲基蓝的效果；(e-h)四种纳米颗粒降解亚甲基蓝过程中随时间变化的紫外-可见吸收光谱。

图6乳腺癌4t1细胞治疗结果(a)不同浓度铂纳米颗粒对4t1细胞的细胞毒性，(b)分别改变方波交流输出的半周期为1s、10s、30s、60s以及∞，通电五分钟后，铂纳米颗粒对4t1细胞的杀伤情况，(c)4t1细胞在共聚焦显微镜下的活细胞(绿色)与死细胞(红色)分布，(d)活性氧探针dcfh-da表现细胞内产生活性氧的情况。

图7balb/c小鼠4t1瘤模型治疗结果(a)本发明方法进行肿瘤治疗时的实际操作示意图，(b)不同治疗组的平均肿瘤体积生长曲线，(c)4t1荷瘤鼠在经过本发明方法治疗前与治疗30后的照片，(d)各治疗组每只小鼠肿瘤的生长曲线。

图8为肿瘤电化学治疗系统的示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实例对本发明作进一步的说明。

实例1

铂纳米颗粒通过硼氢化钠还原法制得，pvp作为稳定剂，最终产物水合动力学半径在10～15nm之间，能够在水和盐溶液中稳定分散。

称取64mgpvp与1ml六水合氯铂酸混合与圆底烧瓶中，另配制22mg硼氢化钠溶于36ml冰水中备用，将硼氢化钠的水溶液逐滴加入到圆底烧瓶中，室温下搅拌4小时，得到的铂纳米颗粒产物通过100kda超滤管浓缩。

图1(a)是铂纳米颗粒的tem图。从中可以看出铂纳米颗粒具有较均匀的尺寸分布。测量插图高分辨透射电镜图中的晶格条纹可得晶面间距分别为0.19nm与0.23nm，与jcpds卡片的面心立方铂(pdf#04-0802)对应。(b)图的xrd图谱进一步证明了这一结果。这种方法合成的铂颗粒在水和盐溶液中均具有很好的分散性，从动态光散射(c)图中可以看出，铂纳米颗粒的粒径约为15nm。

该方法合成的铂纳米颗粒尺寸均一，粒径小，具有高比表面积，便于后续表面催化反应的进行。在水溶液与盐溶液中良好的稳定性，为在肿瘤模型中的治疗奠定了基础。

实例2

为屏蔽电极上反应的影响，设计了图2的双盐桥反应装置，并利用亚甲基蓝的降解证明羟基自由基产生。

首先，外加直流电场时(输出电压为20v，实际电压7v)，图3(a)是铂纳米颗粒对浓度为30μm亚甲基蓝降解的效果。对比不做任何处理、仅施加电场不加铂纳米颗粒以及仅加铂纳米颗粒无外加电场三种情况，可以证明铂纳米颗粒在外加直流电场下具有降解亚甲基蓝的效果。图(b)通过改变外加电场电压从3v～20v，随着电压的增加，铂纳米颗粒对亚甲基蓝的降解效果逐渐增加，且亚甲基蓝的降解程度与电压呈正比线性关系，见图(c)，证明在本发明中，外加电场是影响羟基自由基产生的关键。

实例3

由于交变电场能够有效降低电极反应造成的肿瘤周围组织ph变化，减少电极副作用。因此，利用图2双盐桥反应装置，改变电源输出为方波交流，探究铂纳米颗粒产生羟基自由基的效果。

图4(a)是不同半周期时间下方波交流电的波形图，(b)图为在不同半周期时间下，通电10分钟后，电极所在容器中ph值的变化，可以看出施加直流电时，电极附近溶液已呈现极酸极碱，而使用方波交流电，电极附近溶液ph值几乎没有明显变化。图(c)为在不同半周期时间电场下，铂纳米颗粒对亚甲基蓝的降解情况，随着半周期时间的延长，铂纳米颗粒对亚甲基蓝的降解效果逐渐增加，半周期为60s时，效果最好。图(d)是利用荧光分子探针apf检测羟基自由基，体系中有铂纳米颗粒时，随时间的增加，apf荧光强度明显增加，无铂纳米颗粒或不通电时，荧光强度几乎无变化。

由此证明，方波交流电下，不但能够减少电极反应带来的影响，而且控制合适的半周期时，不会降低铂纳米颗粒产生羟基自由基的效果，更加适合在肿瘤治疗中应用。

实例4

为进一步探究铂纳米颗粒制剂在电场下作用的机理，本发明中用相同方法合成了其他三种贵金属纳米颗粒：pd、ir和au，对比研究了其产生羟基自由基的能力。

选用相同浓度(100μm/ml，见图5a)和相似尺寸(约16nm，见图5c)的四种贵金属纳米颗粒，其紫外-可见光谱吸收见图5b。图5(d)为外加输出电压为20v时，降解浓度为30μm亚甲基蓝有机染料分子效果，详细亚甲基蓝紫外-可见吸收光谱随时间的变化见图e-h。从中可以看出，pd、ir均能够在一定程度上降解亚甲基蓝，且pd的效果与pt相似，而au无法降解亚甲基蓝。pt、pd与ir均为具有催化效果的贵金属，由此证明羟基自由基的产生与催化氧化反应有关。

实例5

本发明中所使用铂纳米颗粒无明显细胞毒性，图6(a)中1～200μg/ml浓度范围内的铂纳米颗粒与小鼠乳腺癌细胞4t1共培养，细胞存活率均维持较高水平。不同半周期时间方波交流电场下，铂纳米颗粒对4t1细胞的杀伤效果不同，从图(b)中可以看出60s时效果最好。同时使用方波交流电电场本身对细胞的杀伤效果，要比通电相同时间下直流电的杀伤效果小得多，说明方波交流电能够有效降低电极对细胞的副作用。图(c)进一步改变通电电流与通电时间，最终确定最优治疗参数为电流5ma并通电10分钟。经过该最优参数处理后，图(d)中可以看到经过钙黄绿素与碘化丙啶染色处理，近一半细胞被碘化丙啶染色呈现红色，为死细胞，另一半虽被钙黄绿素染为绿色，但已丧失基本细胞形态。相比之下，未经过任何处理的空白组、仅与铂纳米颗粒共培养的pt组和仅施加方波交流电场的e组，均未有任何细胞被染为红色，且所有细胞均呈贴壁状态，形态正常。图(e)为经过细胞内活性氧探针dcfh-da处理后，铂纳米颗粒与方波交流电场共同作用下的细胞内有明显荧光出现，即活性氧在细胞内部产生。相比之下，其他三组均无荧光。

在不同半周期时间的方波交流电场下，铂纳米颗粒使水分子分解产生羟基自由基，不仅能够有效促进亚甲基蓝的降解，还具有很强的细胞杀伤能力。方波交流电的使用，大大降低了电极反应造成的电极周围溶液ph的剧烈变化，减少了电极对正常细胞与组织的损伤。

实例6

以小鼠乳腺癌4t1皮下实体瘤模型为例，通过注射的方式将50μl铂纳米颗粒的水溶液(2mg/ml)介入肿瘤区域，半周期时间60s的方波交流电通过一电极插入肿瘤中心，一电极贴皮环绕肿瘤周围的方式施加，在体系电流5ma的剂量下持续通电15分钟，图7(a)为电极施加方式示意图，具体结构示意图如图8所示。

对起始4t1皮下模型瘤大小为500mm³左右的balb/c小鼠进行治疗，20只小鼠随机分为4组，每组5只。治疗后每两天测量肿瘤尺寸，并根据公式：肿瘤体积＝(长*宽²)/2进行计算，图(b)为测量14天后各组平均肿瘤体积的变化趋势。从中可以看出，经过铂纳米颗粒与方波交流电处理后的肿瘤逐渐变小，而其他三组肿瘤则持续增长。e+pt组小鼠的肿瘤经过治疗后，先表面变黑变硬，后结痂脱落，30天后肿瘤已完全消失不见，原肿瘤处只剩下一个浅浅的粉色痕迹，见图(c)。图(d)为四组小鼠中每一只的肿瘤体积变化曲线，当小鼠死亡或肿瘤体积达到2000mm³时停止统计，从中可以看出，经过铂纳米颗粒和方波交流电处理这一组所有小鼠的肿瘤均呈现逐步缩小的趋势，说明方波交流电场下的铂纳米颗粒确实具有优异的肿瘤治疗效果。