融合脂质体、组合物、试剂盒及其治疗癌症的用途的制作方法
专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。在请求并缴纳必要费用后，专利局将提供带有彩色附图的该专利或专利申请公开的副本。
本发明大体上涉及用于癌症疗法用途中的超分子组装体，其包括脂质体构建体。
背景技术：
免疫疗法被认为是癌症疗法中最有前途的领域之一，因为它可以利用人体自身的免疫系统抵抗癌症1,2。据表明3，肿瘤形成始于异种肿瘤细胞(包含足够的驱动突变和伴随(passenger)突变)4，这些异种肿瘤细胞受到免疫细胞的攻击5，引起异源性肿瘤生态位减少6，然后其逃避免疫细胞有效识别并招募抗炎性细胞(诸如调节性t细胞和肿瘤浸润巨噬细胞(tam))7。不同类型的癌症采用使其能够逃避免疫检测的机制，并从而逃避免疫细胞的杀伤。通常用作一线治疗方案的替代方案(化疗)通常包括脱靶副作用，这些副作用会损害粘膜、皮肤、骨髓以及其他组织，从而严重影响患者的生活质量。
主要的抗癌免疫疗法包括嵌合抗原受体t(car-t)细胞8，用于原发性和转移性癌症的肿瘤浸润白细胞(til)9，以及使用抑制性阻断抗体的免疫检查点阻断10。这些方法取决于癌细胞通过免疫细胞进行识别以使得能够杀死癌症7。例如，car-t细胞方法需要癌细胞(例如，yescartatm和cd19阳性癌细胞)上存在的标志物，til方法需要大量与肿瘤相关的突变，而免疫检查点阻断则需要抑制性分子的癌症高表达水平(例如，pd1l/pd2l水平高于50％)3,11。这些方法具有数种长期存在的严重副作用。car-t细胞需要分离和转染t细胞，以表达具有癌症结合蛋白(单链fv，scfv)的工程化t细胞受体，并使其在离体条件下生长和扩增。此外，car-t缺乏“关闭(off-switch)”功能，以使遭受严重副作用的患者能够改善整体健康状况。til方法需要进行肿瘤活检，以使得能够分离t细胞，使其活化、扩增并重新插入患者体内1。car-t细胞和til方法均能促进抗癌免疫活性。免疫检查点抑制剂可使免疫细胞能够攻击免疫逃避性癌症(例如，表达较高水平的pd1l)。通过采用抗pd1疗法，pd1介导的抑制信号被系统性抑制，并显示出包括自身免疫性副作用。所有上述方法都需要识别癌细胞的杀伤性t细胞作为功效的先决条件(即，癌细胞必须提供杀伤性t细胞识别的肽，并因此杀伤性t细胞被活化并杀死癌细胞)。
因此，迫切需要一种能够在利用免疫系统的天然能力攻击和杀死肿瘤细胞的同时规避有限的肿瘤特异性抗原的天然选择的技术。
技术实现要素：
本申请描述了免疫标记平台的实施方案，其使得能够通过特异性激活免疫系统来杀死癌细胞。该概念包括通过使用能够整合入靶细胞或与靶细胞反应的脂质修饰细胞膜以用免疫活化剂标记特定细胞，其中，脂质形成可以与膜融合的组装体(诸如脂质体、胶团和立方体)；并形成设计用于在肿瘤内或附近释放脂质的超分子组装体(诸如脂质凝胶、脂质海绵、双层或单层脂质片、丝状脂质结构和脂质螺旋体(cochleate))。与靶细胞反应的脂质颗粒是指在超分子组装体或免疫系统活化剂上发现的反应性基团与细胞表面的反应性基团(如表面上的蛋白质胺或其他反应性基团)的反应。例如，甲苯磺酰基-peg4-叠氮化物在从脂质体释放后，会与癌细胞/靶细胞表面的蛋白质发生反应。
在非限制性实例中，本发明的脂质体与癌细胞融合，并引起抗体在癌细胞膜上展示。我们在癌细胞上添加了一个新的靶标，使杀伤性t细胞能够识别癌细胞。免疫标记的癌细胞结合例如对特定病毒/非自身肽特异的效应/记忆杀伤t细胞。抗体组活化t细胞，t细胞杀死癌细胞，分泌促炎性细胞因子(il2、ifnγ等)并开始克隆扩增。所得的克隆是效应杀伤t细胞，其仅特异性地杀死相同的特定病毒/非自身肽呈递细胞。扩增的t细胞将寻找此类细胞，并且只会杀死那些或脂质体标记的细胞。
或者，当脂质体处理过的癌细胞遇到特异于“自身”肽的幼稚杀伤性t细胞时，抗体组通过t细胞受体结合幼稚杀伤性t细胞。由于幼稚t细胞没有被合法活化(由具有共同刺激分子的抗原呈递细胞活化)，它将经历无反应状态(anergy)，这意味着它不会被活化，因此不能杀死细胞、分泌促炎性细胞因子或被活化。
除了保留增强的通透性(res)效果(可改善脂质体到达肿瘤12)外，在我们的脂质体平台上，我们还将与健康细胞的中性相反的肿瘤细胞上固有的一般负电荷13-15用作选择性增强元素。
在一个方面，本发明提供了一种包含多个脂质的超分子组装体，其中，所述超分子组装体的至少一种脂质的亲水头被官能团或一种或多种免疫系统活化剂官能化。该官能团是结合对(诸如硫醇-马来酰亚胺、叠氮化物-炔烃、醛-羟胺等)的成员。
在另一方面，本发明提供了融合脂质体，其包含脂质双层，所述脂质双层包含多个具有14至24个碳原子的脂质分子，其中，至少一种所述脂质分子被特异性结合对的第一官能团官能化，所述特异性结合对的第一官能团能够与所述结合对的互补第二官能团结合。
在另外的方面，本发明提供了制备融合脂质体的方法，所述融合脂质体具有结合在外叶(outerleaflet)处的免疫系统活化剂，所述方法包括使官能化的融合脂质体与免疫系统活化剂反应，所述脂质体包含脂质双层，所述脂质双层包含多个脂质分子，所述脂质分子具有(a)14至24个碳原子，和(b)特异性结合对的第一官能团，所述特异性结合对的第一官能团能够与所述结合对的互补第二官能团结合，所述免疫系统活化剂用所述结合对的互补第二官能团官能化，其中，所述第二官能团与所述第一官能团结合，从而产生具有结合在外叶处的所述免疫系统活化剂的所述融合脂质体。
在另一方面，本发明提供了一种制备融合脂质体的方法，所述融合脂质体具有结合在内叶和外叶(innerandouterleaflet)处的免疫系统活化剂，所述方法包括以下步骤：(i)使具有14至24个碳原子的多个脂质分子与免疫系统活化剂反应，其中，至少一种所述脂质分子被特异性结合对的第一官能团官能化，免疫系统活化剂用结合对的第二官能团官能化，其中，所述第二官能团与所述脂质分子的第一官能团结合，从而产生与免疫系统活化剂连接的脂质分子；以及(ii)由步骤(i)中获得的所述脂质分子制备所述融合脂质体，从而产生用结合在内叶和外叶处的所述免疫系统活化剂官能化的融合脂质体。
在又一另外的方面，本发明提供了一种制备融合脂质体的方法，所述融合脂质体具有结合在内叶(innerleaflet)处的免疫系统活化剂和实际上最少结合在外叶处的免疫系统活化剂。
在另一方面，本发明提供一种通过用免疫系统活化剂标记癌细胞来治疗癌症的方法，所述方法包括向癌症患者施用融合脂质体，其中，所述方法包括以下步骤：(i)向癌症患者施用活化免疫系统的融合脂质体，所述活化免疫系统的融合脂质体包含：(a)脂质双层，所述脂质双层包含多个具有14至24个碳原子的脂质分子，和特异性结合对的第一官能团，所述特异性结合对的第一官能团能够与所述结合对的互补第二官能团结合；和(b)免疫系统活化剂，所述免疫系统活化剂包含与所述第一官能团结合的所述结合对的所述互补第二官能团；或(ii)向所述癌症患者施用官能化的融合脂质体，所述官能化的融合脂质体包含脂质双层，所述脂质双层包含多个具有14至24个碳原子的脂质分子，其中，至少一种所述脂质分子被特异性结合对的第一官能团官能化，所述特异性结合对的第一官能团能够与所述结合对的互补第二官能团结合；以及在步骤(ii)之后，施用用所述结合对的互补第二官能团官能化的免疫系统活化剂，所述结合对的互补第二官能团能够与所述脂质分子的第一官能团结合。
在进一步的方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含(a)含融合脂质体的第一容器，所述融合脂质体包含(a)脂质双层，所述脂质双层包含多个具有14至24个碳原子的脂质分子，其中，至少一种所述脂质分子用特异性结合对的第一官能团官能化，所述特异性结合对的第一官能团能够与所述结合对的互补第二官能团结合；(b)第二容器，其包含用结合对的第二官能团官能化的t细胞活化剂，所述结合对的第二官能团能够与所述脂质分子的第一官能团结合；以及(c)小册子，所述小册子具有用于治疗癌症的方法的说明，所述方法包括向癌症患者施用(a)的融合脂质体，然后施用(b)的t细胞活化剂。
在又一另外的方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如以上实施方案中任一项所定义的融合脂质体和药学上可接受的载体。
各种实施方案可以允许各种益处，并且可以与各种应用结合使用。一个或更多个实施方案的细节在附图和以下描述中阐述。根据说明书和附图以及根据权利要求书，所描述的技术的其他特征、目的和优点将是显而易见的。
附图说明
根据结合附图的以下详细描述，将更充分地理解和领会所公开的实施方案。本文包括和描述的附图是示意性的，并且不限制本发明的范围。还应注意，在附图中，某些元件的尺寸可能被放大，因此出于说明目的未按比例绘制。尺寸和相对尺寸不一定与实施本发明的实际缩小相对应。
图1a示意性地示出：左侧是形成脂质双层并用第一官能团f1修饰的脂质分子；以及右侧是用第二官能团f2修饰的免疫系统活化剂。
图1b示意性地示出：左侧是形成脂质双层并用包含第一官能团f1和第一间隔子的第一交联子修饰的脂质分子；以及右侧是用包含第二官能团f2和第二间隔子的第二交联子修饰的免疫系统活化剂。
图2a-f示出了癌细胞的作用方式和脂质体免疫标记。a.脂质体平台布局：结合对(i)共价连接至接头分子(ii)并连接至脂质头基团。经修饰的脂质与其他融合增强脂质一起使用以构成脂质体。b.带有结合对的一个官能团的接头的单克隆抗体(mab)(i)，连接至带有其他结合对的接头(ii)，所述接头(ii)共价连接到脂质头(iii)。c.接头与抗体连接以及与脂质头基团连接的实例：nhs被添加到接头的一端，叠氮化物或bcn(二环[6.1.0]非-4-炔)被添加到接头的另一端，生成两个“可点击的”交联子。伯胺(来自抗体的二酰基磷脂酰乙醇胺或赖氨酸侧基)攻击nhs(离去基团，lg)，并用可点击的接头标记脂质头基团和抗体。通过两个可点击的交联子形成的接头，叠氮化物和bcn反应，在脂质头和抗体之间形成共价键。d.融合与摄取分析：fitc(绿色荧光)标记的脂质体(制剂n8：dotap:dopc:dope:dope-fitc:dspe-peg2k35:52.5:10:0.2:x，其中x为5、2.5、1.25、0.625，摩尔比)与叠氮化物结合的peg接头(194da)一起使用。将脂质体与癌细胞以0.5mm的脂质孵育，洗涤并用标记有与叠氮化物反应的dbco(二苯并环辛炔)-cy5的红色荧光探针染色。e.用于将t细胞活化抗体传递给肿瘤的不同方法的图示：in(i)方法是通过将mab结合到脂质体的内叶处来实现的，并使用铜依赖性点击反应，以去除制备过程中的试剂、催化剂和未结合的单克隆抗体来实现。out(ii)方法是通过在制备脂质体后将mab结合到脂质体的外叶处来实现的。通过将mab结合到脂质体的内叶和外叶处来实现in/out方法。f.癌细胞的免疫标记-作用方式：n8脂质体(dotap:dopc:dope:dope-fitc:dspe-peg2k35:52.5:10:0.2:2.5，摩尔比)与叠氮化物结合的peg4(194da)接头一起使用。将脂质体与癌细胞以5mm脂质孵育1小时，洗涤并用抗cd3-peg4-bcn和抗cd8-peg4-bcn标记1小时，然后洗涤。免疫标记的癌细胞活化杀伤性t细胞并被杀死(脱粒红色箭头和红点表示)。
图3a-c示出了钙黄绿素缀合的脂质体的制备的校准。a.通过“点击”化学法合成脂质体缀合的6-庚炔-pe的薄层色谱。b.磷脂疏水尾的长度对脂质体细胞摄取(37℃)和脂质体细胞融合(4℃)的影响。c.脂质体制剂中胆固醇浓度对脂质体细胞摄取(37℃)和脂质体细胞融合(4℃)的影响。
图4示出脂质体组合物活性研究：与癌细胞融合。将dspe\dope-peg4-n3修饰的脂质体或对照脂质体(未修饰的dspe)与4t1mcherry细胞在0.5mm脂质下于37℃孵育1小时，洗涤并且使用dbco-cy5进行染色，然后使用流式细胞仪进行分析(分别为橙色和蓝色)。呈现的是每种脂质体组合物cy5标记的细胞的平均百分比。误差柱代表标准偏差。
图5a-b示出与doxil和未标记(无fitc和无叠氮化物)脂质体相比，使用不同dspe-peg2000比例的n8制剂处理的癌细胞组的荧光阳性细胞百分比和平均荧光强度。a.确定了不同癌细胞系的脂质体摄取和融合介导的标记，并表示为对荧光信号呈阳性的门控细胞的百分比。b.呈现了脂质体处理的细胞的平均荧光指数/强度(mfi)。荧光的增加与癌细胞内或癌细胞上的荧光基团数量成正比。条形图中显示了总门控细胞中荧光标记细胞的平均值(每管10000个，一式三份，两个独立的重复)。误差柱代表标准偏差。
图6示出了用fitc标记的脂质体处理的4t1mcherry细胞的z堆叠。将4t1mcherry细胞与(dotap:dopc:dope:dope-fitc:dspe-peg2k35:52.5:10:0.2:2.5)以5mm脂质在37℃下孵育1小时。使用赫斯特将细胞核染色。洗涤细胞并使用共聚焦激光扫描显微镜(lsm710)成像。比例尺代表20μm。
图7a-c示出脂质体靶向癌细胞的细胞质膜。a.a549人肺癌细胞在实验前使用pkh26染料染色，并与脂质体(dotap:dopc:dope:dope-fitc:dspe-peg2k35:52.5:10:0.2:2.5)一起以5mm脂质孵育1小时。细胞核用赫斯特染色(蓝色)。洗涤细胞并使用共聚焦激光扫描显微镜(lsm710)成像。b.louis肺癌(鼠)与b中的细胞进行相同的处理。c.b16鼠黑素瘤细胞与a中的细胞进行相同的处理。比例尺20μm。
图8示出了经过免疫标记的脂质体处理的4t1mcherry细胞与杀伤性t细胞共孵育的共聚焦时间流逝。将用5mm脂质处理1小时，并且补充有抗cd3和抗cd8，用peg4-bcn修饰(2step方法)的4t1mcherry细胞(红色，较大的贴壁细胞–因为每个通道都分成不同的列，因此显示为浅灰色灰度)与cfse(绿色)标记的原代杀伤性t细胞(较小的，非贴壁细胞)共同孵育。共培养温度保持在37℃，保持在5％co2下。呈现的是每50分钟拍摄的共聚焦图像。比例尺代表20μm。
图9示出了未处理的4t1mcherry细胞与杀伤t细胞共孵育的共聚焦时间流逝。将4t1mcherry细胞(红色，较大的贴壁细胞–因为每个通道都分成不同的列，因此显示为浅灰色灰度)与cfse标记的原代杀伤性t细胞共孵育。共培养温度保持在37℃，保持在5％co2下。呈现的是每50分钟拍摄的共聚焦图像。比例尺代表20μm。
图10示出了共聚焦时间流逝图像中的红色像素百分比的图像分析。呈现的是在图8和9所示的不同时间点(0、300、600和900分钟)的时间段拍摄的图像中红色像素的百分比。显示了2step(黑色圆圈)或未经处理的对照(灰色圆圈)的红色像素(癌细胞信号)的百分比。使用fiji图像分析软件在相同的参数下进行图像定量。
图11a-c示出了在三阴性乳腺癌小鼠模型中免疫标记脂质体的系统性功效和生物分布。在带瘤小鼠中比较了两种方法；一步法和两步法。在第3天和第10天静脉内注射脂质体制剂(红色箭头)。注射包含dope-peg4-bcn的2step标记脂质体，并在注射后3小时静脉注射“可点击的”mab(用peg-叠氮化物标记的mab)；1step:in-mab与内叶相连；或与内叶和外叶都连接的in+out-mab；2step对照-包含与2step相同的脂质制剂，但具有未标记mab。a.呈现肿瘤大小平均值和误差柱(标准误差)。b.呈现单个蜘蛛图(每个图代表一组，每个系列代表来自一只小鼠的肿瘤大小数据)。c.与注射后24小时的doxil制剂相比，有或没有抗cd3和抗cd8mab结合到外叶(out)处的n8脂质体(dotap:dopc:dope:dspe-peg200035:52.5:10:2.5，其中dope使用peg-叠氮化物(n8)或抗cd3和抗cd8(n8+out)修饰)的生物分布。
图12a-c示出了在72小时时从免疫标记脂质体分离自动物的肿瘤、肾和肝的免疫组织化学和组织学分析。a.分离肿瘤、肾和肝，福尔马林中性碱固定，包埋在石蜡中，然后使用苏木精和曙红(h&e)或抗cd3进行染色。h&e染色通常用于检测表明组织损伤的组织形态变化。抗cd3染色用于检测所选组织中的t细胞(深棕色，有些用绿色箭头突出显示)。每张显微照片左侧的插图代表幻灯片概览。b.从携带4t1肿瘤的小鼠中分离出肿瘤、肾、肝、肺和脾，并消化成单细胞。将细胞与0.5mmn8制剂的脂质(2step或out)孵育1小时，然后洗涤并使用dbco-cy5染色。使用流式细胞仪分析来自2只小鼠的一式三份的原代细胞的cy5荧光。c.棕色像素(t细胞信号)使用fiji进行量化，并表示为测试的目标区域(roi)的百分比。将肿瘤、肝和肾的图像至少分为10个roi(约100μm2，不包括肿瘤坏死核心)，并进行cd3染色分析。误差柱代表标准偏差。
具体实施方式
在以下描述中，将描述本申请的各个方面。为了说明的目的，阐述了特定的配置和细节以便提供对本申请的透彻理解。然而，对于本领域的技术人员来说将显而易见的是，可以在没有本文呈现的具体细节的情况下实践本申请。此外，可以省略或简化众所周知的特征，以免混淆本申请。
权利要求中使用的术语“包括”是“开放式的”，并且是指所列举的元件，或者它们在结构或功能上的等同形式，以及未列举的任何其他元件。不应将其解释为限于其后所列出的；它不排除其他元件或步骤。需要将其解释为指定所提及的所述特征、整数、步骤或组件的存在，但并不排除一个或更多个其他特征、整数、步骤或组件或其组的存在或增加。因此，表述“包括x和z的设备”的范围不应限于仅由组件x和z组成的设备。同样，表述“包括步骤x和z的方法”的范围不应限于仅由这些步骤组成的方法。
除非特别说明，否则如本文所用，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的两个标准偏差内。在一个实施方案中，术语“约”是指在所使用的数字的所报告数值的10％以内，优选在所报告的数值的5％以内。例如，术语“约”可以立即理解为在规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。在其他实施方案中，取决于例如所使用的实验技术，术语“约”可以表示较高的变化容忍度。所述规定值的变化是本领域技术人员所理解的，并且在本发明的范围内。作为说明，数值范围“约1至约5”应解释为不仅包括约1至约5的明确列举的值，而且还包括指示范围内的各个值和子范围。因此，包括在该数值范围内的是各个值(诸如2、3和4)，以及子范围(诸如1-3、2-4、3-5，以及分别为1、2、3、4、5或6)。同样的原理适用于仅列举一个数值的最小值或最大值的范围。除非上下文另有清楚说明，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。其他类似的术语(诸如“基本上”、“通常”、“至多”等)应被解释为修饰术语或值，使得其不是绝对的。这样的术语将由环境和这些术语所修饰的术语来定义，因为这样的术语是本领域技术人员所理解的。这至少包括针对给定实验、技术或用于测量值的仪器的预期实验误差、技术误差和仪器误差的程度。
如本文所使用的，术语“和/或”包括一个或更多个相关联的所列项目的任何和所有组合。除非另有定义，否则本文中使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。进一步将理解的是，诸如在常用词典中定义的那些术语，应被解释为具有与其在说明书和相关技术的上下文中的含义相一致的含义，并且不应在理想化或过于正式的形式中进行解释，除非在此明确地定义。为了简洁和/或清楚起见，可能不会详细描述众所周知的功能或构造。
以下方面、句子和实施方案描述了本发明的超分子组装体，其制备和用途。除非另有说明，否则所有方面、句子和实施方案应被理解为能够与任何其他方面、句子和实施方案结合，除非这种结合在技术上没有意义或另外明确指出。
为了清楚起见，超分子组装体的具体实施方案是在融合脂质体的具体构型的背景下定义的，但是它们也适用于超分子组装体的其他构型。
根据本发明已经发现，具有不同比例的带正电荷的脂质(诸如dotap)和两性离子脂质(诸如dape、二酰基磷脂酰乙醇胺、dapc)的某些组合显著改善了与癌细胞的融合。本发明的脂质体标记平台用于优先标记具有结合对的一个官能团的癌细胞(诸如点击化学)(图2a)。该官能团用于添加免疫活化剂，诸如单克隆抗体(mab)(实施例1至4)。本文进一步表明，将本发明的脂质体施用于癌症的动物模型引起的生物分布特征类似于doxil制剂(包封在脂质体中的阿霉素)的生物分布特征，其是用于治疗癌症的常规处方并用作治疗的基准或“金标准”(实施例5)。另外，携带t细胞活化抗体的本发明脂质体的施用引起t细胞显著地募集至肿瘤但不募集至肝和肾。此外，还发现脂质体与原发性肿瘤细胞、肾脏细胞、肝肺细胞或脾细胞孵育并进行融合测试，与肿瘤细胞进行了有效融合，而健康组织来源的细胞与免疫标记脂质体的融合却非常低(图11b)。总的来说，图10c中所示的数据与图11a-c一起，强调相对于诸如健康组织如肝脏，脂质体对肿瘤细胞的选择性，尽管由于不同的作用方式而增加了脂质体的存在。最后，与缺乏t细胞活化抗体的官能团的对照脂质体处理的动物相比，在用本发明的脂质体处理的动物中肿瘤的生长被显著抑制。
在一个方面，本发明提供了一种包含多个脂质的超分子组装体，其中，所述超分子组装体的至少一种脂质的亲水头被官能团或一种或多种免疫系统活化剂官能化。该官能团是结合对的成员。
如本文所用，术语“结合对”是指一对不同的分子，每一个分子包含自身特定的官能团，两个官能团彼此之间具有特定的特异性(或互补性)。换句话说，相较于与其他分子结合，这些基团在正常条件下优先彼此结合。结合可以是共价的或非共价的。此类结合对的非限制性实例是硫醇-马来酰亚胺、叠氮化物-炔烃、醛-羟胺等。
通常，官能团是分子内原子或键的特定基团或部分，其负责那些分子的特征性化学反应。特别地，本文所定义的官能团或结合对的官能团是指能够与所述结合对的另一个官能团(以下称为“第二官能团”)结合的结合对的原子或键的特定反应性基团或部分(以下称为“第一官能团”)。如上所述，第一和第二官能团彼此互补。在上述非限制性实例中，第一官能团是硫醇、叠氮化物或醛，它们的互补(第二)官能团分别是马来酰亚胺、炔烃或羟胺。
通常，本文所定义的交联试剂(或交联子)是指含有两个或更多个反应性末端(官能团)的分子，该末端能够化学连接蛋白质或其他分子上的特定反应性基团(伯胺、巯基等)。特别地，本文定义的交联子包含官能团和间隔子。
在某些实施方案中，本文定义的第一官能团构成第一交联子的反应性末端，本文定义的第二官能团构成第二交联子的反应性末端(图1b)。在其他实施方案中，省略了交联子的间隔子，从而在结合对中仅保留官能团(图1a)。
在某些实施方案中，超分子组装体选自脂质颗粒(诸如脂质体、胶团和立方体系(cubosome))，其能够与靶细胞融合，或与靶细胞反应；和设计用于在肿瘤内或附近释放脂质的超分子组装体，诸如脂质凝胶、脂质海绵、双层或单层脂质片、丝状脂质结构或脂质螺旋体。
在一个方面，本发明提供了一种通过用免疫系统活化剂标记癌细胞来治疗癌症的方法，所述方法包括向癌症患者施用融合脂质体，其中所述方法包括以下步骤：(i)向所述癌症患者施用活化免疫系统的融合脂质体，其包含：a)脂质双层，其包含多个具有14至24个碳原子的脂质分子，和特异性结合对的第一官能团，其能够与所述结合对的互补第二官能团结合；和(b)免疫系统活化剂，其包含与所述第一官能团结合的所述结合对的所述互补第二官能团；或(ii)向所述癌症患者施用官能化的融合脂质体，其包含脂质双层，该脂质双层包含多个具有14至24个碳原子的脂质分子，其中，至少一种所述脂质分子被特异性结合对的第一官能团官能化，所述特异性结合对的第一官能团能够与所述结合对的互补第二官能团结合；以及在步骤(ii)之后，施用用结合对的互补第二官能团官能化的免疫系统活化剂，所述结合对的互补第二官能团能够与所述脂质分子的第一官能团结合。
类似地，本发明提供了(1)用于通过用免疫系统活化剂标记癌细胞来治疗癌症的融合脂质体，其中，所述融合脂质体包含：(a)脂质双层，其包含多个具有14至24个碳原子的脂质分子，和特异性结合对的第一官能团，其能够与所述结合对的互补第二官能团结合；和(b)免疫系统活化剂，其包含与所述第一官能团结合的所述结合对的互补第二官能团；或(2)用于治疗癌症的官能化的融合脂质体和官能化的免疫系统活化剂的组合，其中，所述官能化的融合脂质体包含脂质双层，所述脂质双层包含多个具有14至24个碳原子的脂质分子，其中，至少一种所述脂质分子被能够与所述结合对的互补第二官能团结合的特异性结合对的第一官能团官能化，并且所述免疫系统活化剂用结合对的互补第二官能团官能化，所述结合对的互补第二官能团能够与所述脂质分子的第一官能团结合，并且该组合用于通过剂量方案来施用，所述剂量方案包括在施用所述官能化的免疫系统活化剂之前施用所述官能化的融合脂质体。
如本文所用，术语“脂质体”是指脂质纳米颗粒或构建体，其包含由内叶和外叶组成的脂质双层，其包封脂质体的水性内部。
如本文所用，术语“融合脂质体”是指脂质体构建体，其优先与靶细胞的质膜融合并且以较小的程度为内吞作用所摄取。
通常，如本文所定义，术语“标记细胞”涉及在结构上将它们与未修饰的细胞区分开的任何修饰。特别地，本发明的细胞用融合脂质体的官能团或免疫系统活化剂修饰或“标记”。
在一个实施方案中，所述免疫系统活化剂通过所述第二官能团与至少一种所述脂质分子的第一官能团在融合脂质体的外叶处结合。
在一个实施方案中，所述免疫系统活化剂通过所述第二官能团与至少一种所述脂质分子的第一官能团在融合脂质体的内叶处结合。
在一个实施方案中，所述免疫系统活化剂通过所述第二官能团与至少一种所述脂质分子的第一官能团在融合脂质体的外叶和内叶处结合。
在一个实施方案中，所述免疫系统活化剂选自t细胞活化剂；促炎性细胞因子；记忆杀伤t细胞活化肽；呈递病毒肽的可溶性人白细胞抗原(shla)；和超级抗原。特别地，免疫系统活化剂可以是t细胞激活剂，诸如抗cd3抗体、抗cd8抗体、抗nkg2d抗体或它们的组合、能够结合cd3和cd8的抗体，以及能够结合cd3和nkg2d的抗体，或抗nkg2d二聚抗体，或所述抗体的功能片段(scfv或fab)；促炎性细胞因子选自il2、il-6、il-17、il-1、tnfα和ifnγ，或它们的组合，可选地通过可水解的接头可逆地与脂质连接；记忆杀伤t细胞活化肽是抗微生物肽，诸如α-防御素；并且超级抗原是葡萄球菌中毒性休克综合症毒素1、tsst-1或具有类似作用的抗原，所述抗原可以将t细胞受体结合到靶细胞的mhc/hla并诱导级联反应最终引起杀伤性t细胞活化。
本文所述的抗体或其功能片段也指单链可变片段(scfv)；抗体的功能片段；单域抗体，诸如纳米抗体；和重组抗体；(ii)抗体模拟物，诸如亲和体分子；affilin；affimer；affitin；alphabody；anticalin；avimer；darpin；fynomer；kunitz结构域肽；和抗体类似物(monobody)；或(iii)适体。
应当明确的是，本发明中使用的抗体或其功能片段不实现靶向剂的功能(将脂质体带至特定的靶细胞)，而是具有免疫系统活化剂的功能。
在某些实施方案中，免疫活化剂可以通过释放免疫检查点施加的免疫抑制来起作用。根据本发明可以被操纵以释放免疫抑制的检查点可以选自pd1-pdl1、pd1-pdl2、cd28-cd80、cd28-cd86、ctla4-cd80、ctla4-cd86、icos-b7rp1、b7h3、b7h4、b7h7、b7-cd28样分子、btla-hvem、kir-mhci类或ii类、lag-3-mhci类或ii类、cd137-cd137l、ox40-ox40l、cd27-cd70、cd40l-cd40、tim3-gal9、t细胞活化v域ig抑制剂(vista)、干扰素基因的刺激物(sting)、t细胞免疫球蛋白和基于酪氨酸的免疫受体抑制基序域(tigit)、a2ar-腺苷和吲哚胺-2,3-双加氧酶(ido)-l-色氨酸。
能够阻断免疫检查点的试剂是本领域已知的16，并且根据本发明可以使用这些试剂。以下引用的出版物中的每一个以及pardoll，201217，均通过引用并入本文，如同在此完全公开一样。
例如，与脂质体结合的抗免疫检查点抗体(诸如抗pd1抗体)可以改善抗体的半衰期。或者，小分子免疫检查点抑制剂可包含在脂质体中并在肿瘤环境中释放。预期此类抗体或小分子抑制剂的靶向释放将显著减少副作用。
例如，根据本发明使用的抗pd-1抗体可以选自ohaegbulam等人18中公开的那些抗体，其全部内容通过引用并入本文，即ct-011(pidilizumab；人源化igg1；curetech)、mk-3475(lambrolizumab、pembrolizumab；人源化igg4；merck)、bms-936558(nivolumab；人igg4；bristol-myerssquibb)、amp-224(pd-l2igg2a融合蛋白；astrazeneca)、bms-936559(人igg4；bristol-myerssquibb)、medi4736(人源化igg；astrazeneca)，mpdl3280a(人igg；genentech)、msb0010718c(人igg1；merck-serono)；或根据本发明使用的抗体可以是medi0680(amp-514；astrazeneca)人源化igg4mab。
抗ctla4抗体可以是tremelimumab(pfizer)，一种完全的人igg2单克隆抗体；或ipilimumab，一种完全的人igg1单克隆抗体。
抗杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)抗体可以是lirilumab(bms-986015；由innatepharma开发并授权给bristol-myerssquibb)，一种完全的人单克隆抗体。
抗lag-3抗体针对淋巴细胞活化基因3。可以根据本发明使用的一种这样的抗体是单克隆抗体bms-986016(pembrolizumab；人源化igg4；merck)。
表2列出了小分子免疫检查点抑制剂的代表性清单。
表2
mulleretal.naturereviewscancer6,613–625(2006年8月)
在一个实施方案中，脂质体包含在生理ph下为阳离子的部分。因此，在一个实施方案中，至少一种所述脂质分子进一步包含阳离子基团、阳离子天然聚合物或合成聚合物、阳离子氨基糖、阳离子聚氨基酸或阳离子两亲癌细胞结合肽。
特别地，包含阳离子基团的至少一种脂质分子选自1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷氯化物(dotap)、双十八烷基酰胺基甘氨酰基精胺(dogs)、1,2-二-o-十八碳烯基-3-三甲铵丙烷(dotma)、二甲基双十八烷基铵(18:0ddab)和n1-[2-((1s)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基丙基)氨基]丁基-甲酰胺基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]-苯甲酰胺(mvl5)；合成聚合物选自聚乙烯亚胺(pei)和聚(2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)；天然聚合物为多糖，诸如壳聚糖；氨基糖为葡糖胺，阳离子聚氨基酸选自聚(l-赖氨酸)、聚(l-精氨酸)、聚(d-赖氨酸)、聚(d-精氨酸)、聚(l-鸟氨酸)和聚(d-鸟氨酸)；或所述两亲癌细胞结合肽选自天蚕素a(kwklfkkiekvgqnirdgiikagpavavvgqatqiak；(seqidno:1)；天蚕素a1-8(kwklfkki；(seqidno:2)和环状cngrc(seqidno:3)。
在一个更具体的实施方案中，包含阳离子基团的所述脂质分子是dotap。
在一个实施方案中，所述至少一种所述脂质分子是磷脂，所述磷脂选自由以下项组成的组：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸或它们的组合，它们中的每一种包含一个或两个相同或不同的脂肪酸残基，其中，磷脂酰部分中的脂肪酸残基为饱和的、单不饱的和或多不饱和的，并且碳链长度为14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个碳，如磷脂和溶血磷脂构型的肉豆蔻酰基、硬脂酰基、棕榈酰基、油酰基、亚油酰基、亚麻酰基(包括共轭亚麻酰基)、花生四烯酰基，及它们的组合。
在特定的实施方案中，所述磷脂选自由以下项组成的组：1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(popc)和1,2-二油酰基-3-磷脂酰乙醇胺(dope)；1,2-二肉豆蔻酰基-3-磷脂酰胆碱(dmpc)；1,2-二硬脂酰基-3-磷脂酰胆碱(dspc)；1,2-二肉豆蔻油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(14:1(δ9-顺式)pc)；1,2-二反肉豆蔻油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(14:1(δ9-反式)pc)；1,2-二棕榈油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:1(δ9-顺式)pc)；1,2-二反棕榈油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:1(δ9-反式)pc)；1,2-二油酰基(dipetroselenoyl)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1(δ6-顺式)pc)；1,2-二油酰基-3-磷脂酰胆碱(18:1(δ9-顺式)pc(dopc))；1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1(δ9-反式)pc)；1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:2(顺式)pc(dlpc))；1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:3(顺式)pc)；1,2-二(二十碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(20:1(顺式)pc)；1,2-二(花生四烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(20:4(顺式)pc)；1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(22:6(顺式)pc)；1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(22:1(顺式)pc)；1,2-二(二十四碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(24:1(顺式)pc)；1,2-二肉豆蔻酰基-3--3-磷脂酰乙醇胺(dmpe)；1,2-二棕榈酰基-3-磷脂酰乙醇胺(dppe)；二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)；1,2-二油酰基-3-磷脂酰乙醇胺(dope)；1,2-二硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺(dspe)；1,2-二肉豆蔻酰基-3-磷脂酰丝氨酸(dmps)；1,2-二棕榈酰基-3-磷脂酰丝氨酸(dpps)；棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)；和1,2-二油酰基-3-磷脂酰丝氨酸(dops)。更特别地，所述磷脂选自dopc、popc、dmpc、dppc、dope、pope、dspe、dmpe和dppe。
在一个实施方案中，融合脂质体进一步包含与至少一种所述脂质分子连接的稳定部分。
如本文所用，术语“稳定部分”是指与没有稳定部分的相同脂质体相比，当被掺入脂质体的脂质双层中时提供了延长的血液循环半衰期的部分。
在一个具体的实施方案中，所述稳定部分选自聚乙二醇(peg)、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、右旋糖酐、聚氨基酸、甲基-聚噁唑啉、聚甘油、聚(丙烯酰基吗啉)和聚丙烯酰胺。例如，稳定部分是分子量为约106da至约4kda的peg，例如：106da(peg2)、194da(peg4)、600da(peg600)、2kda(peg2000)和4kda(peg4000)。在更具体的实施方案中，稳定部分是分子量为约2kda的peg。
在一个实施方案中，所述稳定部分通过可剪切的肽接头(诸如用于基质金属蛋白酶(mmp)-1的vpmsmrgg(seqidno:4)、用于mmp-2的ipvslrsg(seqidno:5)或ggggplgvrggggk(seqidno:6)，用于mmp-3的rpfsmimg(seqidno:7)，用于mmp-7的vplsltmg(seqidno:8)，用于mmp-9的vplslysg(seqidno:9)以及用于膜类型1-基质金属蛋白酶(mt1-mmp)的ipeslrag(seqidno:10))与至少一种所述脂质分子连接，所有这些肽接头都可以在n和/或c末端被氨基酸残基、peg和其他接头修饰。
在某些实施方案中，可剪切的接头是ph敏感的可剪切的接头，诸如二硫代二丙酸氨基乙酯(dtp)或二硫代3-己醇(dth)。
在某些实施方案中，设计用于释放脂质但不是融合脂质体的超分子组装体包含聚合物(诸如peg、聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga))和藻酸盐。
在某些实施方案中，多个脂质中的至少一种脂质的亲水性头部各自用结合对的第一官能团或第二官能团官能化，所述结合对能够在正常条件下彼此结合而不是优先与别的分子结合，或在它们之间形成共价键或非共价高亲和力缀合物，其中，结合对的第一官能团和第二官能团例如但不限于(i)点击化学反应的反应性基团；(ii)生物素和生物素结合肽或生物素结合蛋白。
如本文所用，术语“高亲和力”是指化学或生物物理缔合，诸如螯合剂-金属偶联(例如，ni和包含多个his-残基(诸如his6)的肽序列)，或在结合对两个成员之间的缀合，如抗体和其靶表位或生物素和抗生蛋白链菌素等，其中，两个结合对之间的缔合的kd为10-4m至10-30m，例如，10-6m、10-7m、10-8m、10-9m、10-10m、10-11m、10-12m或12-13m。
在一个实施方案中，特异性结合对的所述第一官能团能够与所述结合对的所述互补第二官能团形成共价键。
在一个具体的实施方案中，特异性结合对的所述第一官能团能够通过点击化学反应与所述结合对的所述互补第二官能团形成共价键。
在一个特定的实施方案中，i)所述特异性结合对的第一官能团是炔烃或膦，而所述结合对的第二官能团是叠氮化物，或反之亦然；ii)特异性结合对的第一官能团是环烯、环炔、环丙烷、异腈(异氰化物)或乙烯基硼酸，而所述结合对的第二官能团是四嗪，或反之亦然；iii)所述特异性结合对的第一官能团为炔烃或马来酰亚胺，而所述结合对的第二官能团为硫醇，或反之亦然；iv)所述特异性结合对的第一官能团是共轭二烯，而所述结合对的第二官能团是经取代的烯烃，或反之亦然；v)所述特异性结合对的第一官能团是烯烃、炔烃或乙炔铜，而所述结合对的第二官能团是硝酮，或反之亦然；vi)所述特异性结合对的第一官能团是醛或酮，而所述结合对的第二官能团是烷氧基胺、羟胺、肼或酰肼，或反之亦然；或vii)所述特异性结合对的第一官能团是醛、酮、异硫氰酸盐/酯、羧酸或其衍生物，诸如酯、酸酐、酰基卤、甲苯磺酰基和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，而所述结合对的第二官能团是胺，或反之亦然。在一个更具体的实施方案中，特异性结合对是炔烃-叠氮化物。
在一个实施方案中，特异性结合对的所述第一官能团能够与所述结合对的所述互补第二官能团形成非共价键。
在一个特定的实施方案中，特异性结合对的第一官能团是生物素，而所述结合对的第二官能团是生物素的结合伴侣，结合伴侣选自生物素结合肽或生物素结合蛋白，或反之亦然。例如，所述生物素结合蛋白可以选自抗生物素蛋白、链霉亲和素和抗生物素抗体；并且所述生物素结合肽选自aegefcswappkascgdpak(seqidno:11)、cswrppfravc(seqidno:12)、cswappfkasc(seqidno:13)和cnwtppfktrc(seqidno:14)[saggioandlaufer.biotinbindersselectedfromarandompeptidelibraryexpressedonphage.biochem.j.(1993)293,613-616；通过引用结合到本文中，就如同完全附上]。半胱氨酸残基可以形成二硫键，并且接头可以连接至n-或c-末端或两个末端。
在一个实施方案中，融合脂质体进一步包含在脂质双层与第一官能团之间的第一间隔子(图1b)。
在一个实施方案中，免疫系统的活化剂进一步包含在免疫系统的活化剂与第二官能团之间的第二间隔子(图1b)。
在一个实施方案中，第一或第二间隔子选自由以下项组成的组：peg；(c6-c12)烷基；酚的、苯甲酸的或萘的一元、二元或三元羧酸，四氢芘的一元、二元或三元羧酸，或它们的盐；环醚；戊二酸；琥珀酸；粘康酸；己二酸；庚二酸；辛二酸；壬二酸；和癸二酸；以及肽，例如，长度约为2～20个氨基酸残基，如长度为3个氨基酸残基的聚甘氨酸肽。
在特定实施方案中，第一或第二间隔子是分子量为约106da至约4kda的peg，例如：106da(peg2)、194da(peg4)、600da(peg600)、2kda(peg2000)和4kda(peg4000)；并且更特别地，第一或第二间隔子是分子量为约194da的peg(peg4)。
或者，在特定的实施方案中，第一或第二间隔子为(c6-c12)烷基，优选为庚基或十二烷酰基。
在一个实施方案中，融合脂质体进一步包含胆固醇(cho)或其衍生物。
在一个实施方案中，脂质体的尺寸最大为200nm，例如，约15nm至约200nm、约20nm至约100nm、约50nm至约150nm、约50nm至约90nm、约80nm至约100nm、约110nm至约200nm，例如，约100nm。
在某些实施方案中，融合脂质体在其亲水性核心中进一步包含一种或更多种免疫系统活化剂，诸如促炎性细胞因子(如il2、il-6、il-17、il-1、tnfα和ifnγ)；至少一种刺激分子，如离子霉素；和至少一个记忆杀伤t细胞活化肽。
在某些实施方案中，所述免疫系统活化剂通过所述第二官能团与至少一种所述脂质分子的第一官能团在融合脂质体的外叶、内叶或者外叶和内叶处结合；免疫系统活化剂选自t细胞活化剂；促炎性细胞因子；记忆杀伤t细胞活化肽；和超级抗原；至少一些所述脂质进一步包含阳离子基团、阳离子天然聚合物或合成聚合物、阳离子氨基糖、阳离子聚氨基酸或两亲癌细胞结合肽；至少一些脂质是选自以下磷脂组成的组：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸或它们的组合，它们中的每一种包含一个或两个相同或不同的脂肪酸残基，其中，磷脂酰部分中的脂肪酸残基是饱和的、单不饱和的或多不饱和的，并且具有14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个碳的碳链长度，诸如磷脂和溶血磷脂构型的肉豆蔻酰基、硬脂酰基、棕榈酰基、油酰基、亚油酰基、亚麻酰基(包括共轭亚麻酰基)、花生四烯酰基，及它们的组合；所述脂质体进一步包含与至少一种所述脂质或所述阳离子聚合物连接的稳定部分；所述特异性结合对的所述第一官能团能够与所述结合对的所述互补第二官能团形成共价键，或者所述特异性结合对的所述第一官能团能够与所述结合对的所述互补第二官能团形成非共价键；第一或第二间隔子选自由以下项组成的组：peg；(c6-c12)烷基；酚的、苯甲酸的或萘的一元、二元或三元羧酸，四氢芘的一元、二元或三元羧酸，或它们的盐；环醚；戊二酸；琥珀酸；粘康酸；己二酸；庚二酸；辛二酸；壬二酸；和癸二酸；以及肽，例如，长度约为2～20个氨基酸残基，如长度为3个氨基酸残基的聚甘氨酸肽；脂质体的尺寸最大为200nm，例如，约15nm至约200nm、约20nm至约100nm、约50nm至约150nm、约50nm至约90nm、约80nm至约100nm、约110nm至约200nm，例如，约100nm。
在一个特定的实施方案中，所述免疫系统活化剂是t细胞活化剂；包含阳离子基团的至少一种脂质分子选自1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷氯化物(dotap)、双十八烷基酰胺基甘氨酰基精胺(dogs)、1,2-二-o-十八碳烯基-3-三甲铵丙烷(dotma)、二甲基双十八烷基铵(18:0ddab)，和n1-[2-((1s)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基丙基)氨基]丁基-甲酰胺基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]-苯甲酰胺(mvl5)，所述合成聚合物选自聚乙烯亚胺(pei)和聚(2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)，所述天然聚合物为壳聚糖，所述氨基糖为葡糖胺；阳离子聚氨基酸选自聚(l-赖氨酸)、聚(l-精氨酸)、聚(d-赖氨酸)、聚(d-精氨酸)、聚(l-鸟氨酸)和聚(d-鸟氨酸)，或所述两亲癌细胞结合肽选自天蚕素a；天蚕素a1-8；和环状cngrc；至少一种所述脂质分子选自由以下项组成的组：1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(popc)和1,2-二油酰基-3-磷脂酰乙醇胺(dope)；1,2-二肉豆蔻酰基-3-磷脂酰胆碱(dmpc)；1,2-二硬脂酰基-3-磷脂酰胆碱(dspc)；1,2-二肉豆蔻油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(14:1(δ9-顺式)pc)；1,2-二反肉豆蔻油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(14:1(δ9-反式)pc)；1,2-二棕榈油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:1(δ9-顺式)pc)；1,2-二反棕榈油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:1(δ9-反式)pc)；1,2-二油酰基(dipetroselenoyl)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1(δ6-顺式)pc)；1,2-二油酰基-3-磷脂酰胆碱(18:1(δ9-顺式)pc(dopc))；1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1(δ9-反式)pc)；1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:2(顺式)pc(dlpc))；1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:3(顺式)pc)；1,2-二(二十碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(20:1(顺式)pc)；1,2-二(花生四烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(20:4(顺式)pc)；1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(22:6(顺式)pc)；1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(22:1(顺式)pc)；1,2-二(二十四碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(24:1(顺式)pc)；1,2-二肉豆蔻酰基-3--3-磷脂酰乙醇胺(dmpe)；1,2-二棕榈酰基-3-磷脂酰乙醇胺(dppe)；二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)；1,2-二油酰基-3-磷脂酰乙醇胺(dope)；1,2-二硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺(dspe)；1,2-二肉豆蔻酰基-3-磷脂酰丝氨酸(dmps)；1,2-二棕榈酰基-3-磷脂酰丝氨酸(dpps)；棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)；和1,2-二油酰基-3-磷脂酰丝氨酸(dops)；所述稳定部分选自聚乙二醇(peg)、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、右旋糖酐、聚氨基酸、甲基-聚噁唑啉、聚甘油、聚(丙烯酰基吗啉)和聚丙烯酰胺；所述特异性结合对的第一官能团能够通过点击化学反应与所述结合对的互补第二官能团形成共价键，i)所述特异性结合对的第一官能团是炔烃或膦，而所述结合对的第二官能团是叠氮化物，或反之亦然；ii)特异性结合对的第一官能团是环烯、环炔、环丙烷、异腈(异氰化物)或乙烯基硼酸，而所述结合对的第二官能团是四嗪，或反之亦然；iii)所述特异性结合对的第一官能团为炔烃或马来酰亚胺，而所述结合对的第二官能团为硫醇，或反之亦然；iv)所述特异性结合对的第一官能团是共轭二烯，而所述结合对的第二官能团是经取代的烯烃，或反之亦然；v)所述特异性结合对的第一官能团是烯烃、炔烃或乙炔铜，而所述结合对的第二官能团是硝酮，或反之亦然；vi)所述特异性结合对的第一官能团是醛或酮，而所述结合对的第二官能团是烷氧基胺、羟胺、肼或酰肼，或反之亦然；或vii)所述特异性结合对的第一官能团是醛、酮、异硫氰酸盐/酯、羧酸或其衍生物，诸如酯、酸酐、酰基卤、甲苯磺酰基和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，而所述结合对的第二官能团是胺，或反之亦然，或者所述特异性结合对的第一官能团是生物素，而所述结合对的第二官能团是所述生物素的结合伴侣，所述结合伴侣选自生物素结合肽或生物素结合蛋白，或反之亦然；以及所述第一间隔子或第二间隔子是分子量为约106da至约4kda的peg，或(c6-c12)烷基，优选庚基或十二烷酰基。
在一个更具体的实施方案中，t细胞活化剂选自抗cd3抗体、抗cd8抗体、抗nkg2d抗体或它们的组合、能够结合cd3和cd8的抗体以及能够结合cd3和nkg2d的抗体，或抗nkg2d二聚抗体；包含阳离子基团的至少一种脂质分子是dotap；所述磷脂选自dopc、popc、dmpc、dppc、dope、pope、dspe、dmpe和dppe；稳定部分是分子量为约106da至约4kda的peg；特异性结合对是炔烃-叠氮化物，所述生物素结合蛋白选自抗生物素蛋白、链霉亲和素和抗生物素抗体，或所述生物素结合肽选自aegefcswappkascgdpak(seqidno:11)、cswrppfravc(seqidno:12)、cswappfkasc(seqidno:13)和cnwtppfktrc(seqidno:14)；以及第一间隔子或第二间隔子是分子量为约194da的peg(peg4)。
在一个更特定的实施方案中，稳定部分是分子量为约2kda的peg。
在第一特定实施方案中，融合脂质体包含(a)dopc:dotap:dspe-peg2k:dope-peg4-n3或dopc:dotap:dspe-peg2k:dope-peg4-bcn；或(b)dmpc:胆固醇:dmpe-peg4-n3或dmpc:胆固醇:dmpe-peg4-bcn，其中，其中，peg2k代表分子量为约2kda的peg，peg4代表分子量为约194da的peg，并且dopc的相对摩尔量可达约80％，dotap的相对摩尔量可达约80％，dspe-peg2k的相对摩尔量可达约20％，dope-peg4的相对摩尔量可达约20％，hspc的相对摩尔量可达约65％，胆固醇的相对摩尔量可达约40％，dmpc的相对摩尔量可达约70％，并且融合脂质体具有约50nm至约300nm的尺寸，例如，80nm或100nm。
在第二特定实施方案中，融合脂质体包含(i)摩尔比为52.5:35:0.6:10、52.5:35:1.25:10、52.5:35:2.5:10、52.5:35:5:10、52.5:35:0.6:5、52.5:35:1.25:5、52.5:35:2.5:5、52.5:35:5:5、65:20:5:10、50:35:5:10、52.5:35:1.25:7、52.5:35:1.25:5，或52.5:35:2.5:7的dopc:dotap:dspe-peg2k:dope-peg4-n3或dopc:dotap:dspe-peg2k:dope-peg4-bcn或(ii)摩尔比为60:35:5的dmpc:胆固醇:dmpe-peg4-n3或dmpc:胆固醇:dmpe-peg4-bcn。
在第三特定实施方案中，融合脂质体包含摩尔比为52.5:35:2.5:5或52.5:35:2.5:10的dopc:dotap:dspe-peg2k:dope-peg4-n3。
在第一至第三特定实施方案中，所述t细胞活化剂通过所述第二交联子与至少一种所述脂质分子的第一交联子在融合脂质体的外叶处缀合。
在第一至第三特定实施方案中，所述t细胞活化剂通过所述第二交联子与至少一种所述脂质分子的第一交联子在融合脂质体的内叶处缀合。
在第一至第三特定实施方案中，所述t细胞活化剂通过所述第二交联子在至少一种所述脂质分子的第一交联子在融合脂质体的内叶和外叶处缀合。
在第一至第三特定实施方案中，所述t细胞活化剂通过所述第二官能团与至少一种所述脂质分子的第一官能团在融合脂质体的外叶处缀合。
在第一至第三特定实施方案中，所述t细胞活化剂通过所述第二官能团与至少一种所述脂质分子的第一官能团在融合脂质体的内叶处缀合。
在第一至第三特定实施方案中，所述t细胞活化剂通过所述第二官能团在至少一种所述脂质分子的第一官能团在融合脂质体的内叶和外叶处缀合。
在某些实施方案中，(ii)的第一步是在(iii)的第二步之前立即、1小时，2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、1天、2天、3天或多至1周执行。
在某些实施方案中，上述任一实施方案的脂质体的熔化温度(tm)低于45℃，在该温度下融合脂质体保持在非晶体过渡相，从而提供脂质体与细胞膜融合所需的膜流动性。
在某些实施方案中，使用上述任一实施方案的方法治疗的癌症选自由以下项组成的组：乳腺癌(诸如三阴性乳腺癌)、黑色素瘤和肺癌。
在另一方面，本发明提供了融合脂质体，其包含脂质双层，所述脂质双层包含多个具有14至24个碳原子的脂质分子，其中，至少一种所述脂质分子被特异性结合对的第一官能团官能化，所述特异性结合对的第一官能团能够与所述结合对的互补第二官能团结合。
融合脂质体的组成和尺寸(诸如脂质分子、官能团、间隔子、免疫系统活化剂、阳离子基团、阳离子天然聚合物或合成聚合物、阳离子氨基糖、阳离子聚氨基酸或两亲癌细胞结合肽，以及稳定部分)，如以上涉及使用它们的治疗方法的实施方案中所定义。
在某些实施方案中，融合脂质体进一步包含脂质双层与所述第一官能团之间的第一间隔子。
在某些实施方案中，融合脂质体进一步包含用结合至所述第一官能团的所述结合对的互补第二官能团官能化的免疫系统活化剂。
在某些实施方案中，免疫系统活化剂通过所述第二官能团与至少一种所述脂质分子的第一官能团在融合脂质体的外叶处结合。
在某些实施方案中，免疫系统活化剂通过所述第二官能团与至少一种所述脂质分子的第一官能团在融合脂质体的内叶处结合。
在某些实施方案中，免疫系统活化剂通过所述第二官能团与至少一种所述脂质分子的第一官能团在融合脂质体的外叶和内叶处结合。
在某些实施方案中，免疫系统活化剂进一步包含在免疫系统活化剂与第二官能团之间的第二间隔子。
在某些实施方案中，免疫系统的活化剂选自t细胞活化剂；促炎性细胞因子；记忆杀伤t细胞活化肽；和超级抗原。
在某些实施方案中，免疫系统活化剂是t细胞活化剂。
在某些实施方案中，t细胞活化剂选自抗cd3抗体、抗cd8抗体或它们的组合；以及能够结合cd3和cd8的抗体。
在另外的方面，本发明提供了制备具有结合在外叶处的免疫系统活化剂的融合脂质体的方法，所述方法包括使官能化的融合脂质体与免疫系统活化剂反应，所述官能化的融合脂质体包含(a)脂质双层，所述脂质双层包含多个具有14至24个碳原子的脂质分子和特异性结合对的第一官能团，所述特异性结合对的第一官能团能够与所述结合对的互补第二官能团结合，所述免疫系统活化剂被所述结合对的第二官能团官能化，其中，第二官能团与所述第一官能团结合，从而产生与所述t细胞活化剂在外叶处缀合的所述融合脂质体。
在又一另外的方面，本发明提供了制备具有结合在内叶和外叶处的免疫系统活化剂的融合脂质体的方法，所述方法包括以下步骤：(i)使具有14至24个碳原子的多个脂质分子与免疫系统活化剂反应，其中，至少一种所述脂质分子被特异性结合对的第一官能团官能化，所述免疫系统活化剂被结合对的第二官能团官能化，其中，所述第二官能团与所述脂质分子的所述第一官能团结合，从而产生与免疫系统活化剂连接的脂质分子；以及(ii)由步骤(i)中获得的所述脂质分子制备所述融合脂质体，从而产生用结合在内叶和外叶处的所述t细胞活化剂官能化的融合脂质体。
仍在另一方面，本发明提供了制备具有结合在内叶处的免疫系统活化剂的融合脂质体的方法。该方法基于动力学反应控制的概念。脂质体是由脂质双层自组装而成的，其反应速率比两个官能团之间形成的化学键高得多。因此，在溶液中发生任何明显的化学反应之前，未反应的免疫系统活化剂和其他试剂或催化剂(诸如用于铜依赖性点击化学反应的铜催化剂)，被包封在脂质体的水性内部。未被包封在脂质体内部的化学反应所需的免疫系统活化剂和/或其他试剂从溶液中进一步物理除去，例如通过洗涤形成的脂质体。或者，可以在某一点改变反应条件(诸如溶液的ph)，以停止或抑制脂质体外部发生的化学反应，而由于脂质双层屏障，脂质体水性内部的反应条件保持不变。用于点击化学反应以形成本发明脂质体的催化剂的非限制性实例是乙酰丙酮化铜(ii)、异腈化铜(i)和由铜(i)盐或铜(ii)盐使用抗坏血酸钠作为还原剂生成的任何其它活性铜(i)催化剂。免疫系统活化剂和其他试剂或催化剂可以通过例如透析或凝胶过滤去除，或使免疫激活剂或脂质的一个或两个官能团与过量的相应的游离官能团反应，这些游离官能团会耗尽免疫活化剂或脂质的官能团，从而终止或抑制反应。
因此，制备具有结合在内叶处的免疫系统活化剂的融合脂质体的方法包括以下步骤。在第一步骤中，将具有14至24个碳原子的多个脂质分子在溶液中与t细胞活化剂混合，其中，至少一种所述脂质分子被特异性结合对的第一官能团官能化，所述t细胞活化剂用结合对的第二官能团官能化，所述结合对的第二官能团能够在合适的反应条件下结合所述脂质分子的所述第一官能团。在不引入任何试剂或催化剂的情况下，两个官能团之间的化学反应相对较慢。结果，脂质分子在第一反应步骤中自组装成脂质体，从而将所述t细胞活化剂分子的某些部分包封在脂质体的水性内部中。在第二步骤中，将未被包封并保留在脂质体外部的溶液中的t细胞活化剂分子除去或洗去。可选地，可以如上所述抑制脂质分子与未包封的t细胞活化剂分子的反应。在第三步骤中，使脂质分子与在第一步骤制备的脂质体的水性内部的包封的t细胞活化剂反应，其中，所述t细胞活化剂的所述第二官能团与所述脂质分子的第一官能团结合，从而产生了用所述t细胞活化剂在内叶处官能化的融合脂质体。
在某些实施方案中，具有结合在内叶处的免疫系统活化剂的融合脂质体的制备方法包括以下步骤：(i)在包含多个具有14至24个碳原子的脂质分子的溶液中制备脂质体，其中，至少一种所述脂质分子被特异性结合对的第一官能团官能化，并且t细胞活化剂被结合对的第二官能团官能化，所述结合对的第二官能团能够与所述脂质分子的所述第一官能团结合，从而包封一部分所述t细胞活化剂；(ii)从溶液以及所有可选的试剂和催化剂中除去未包封的t细胞活化剂；(iii)使脂质分子与在步骤(i)中制备的脂质体的水性内部的包封的t细胞活化剂反应，其中，所述t细胞活化剂的所述第二官能团结合至所述脂质分子的所述第一官能团，从而产生了用所述t细胞活化剂在内叶处官能化的融合脂质体。
在某些实施方案中，溶液进一步包含至少一种氧化还原催化剂。在特定的实施方案中，至少一种氧化还原催化剂是铜(i)盐，在步骤(ii)中除未包封的t细胞活化剂之外，还除去铜(i)盐，并且步骤(iii)中的反应是铜依赖性点击化学反应。
制备脂质体的方法是本领域众所周知的19。例如，可以在引起脂质体形成的条件下，将有机溶剂中的脂质溶液注入温度高于tm的水性溶液中。通过纳米组装组装器或其它类似装置，从而产生融合脂质体；或注入脂质溶液到具有的tm以上温度的水性溶液中并混合，从而获得脂质体溶液，并通过挤出机挤出脂质体溶液，挤出机包括至少一个载体和至少一个具有50至400nm直径的孔的蚀刻膜。
在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含(a)包含融合脂质体的第一容器，所述融合脂质体包含(a)脂质双层，所述脂质双层包含多个具有14至24个碳原子的脂质分子，其中，至少一种所述脂质分子被特异性结合对的第一官能团官能化，所述特异性结合对的第一官能团能与所述结合对的互补第二官能团结合；(b)第二容器，其包含用结合对的第二官能团官能化的t细胞活化剂，所述结合对的第二官能团能够与所述脂质分子的所述第一官能团结合；(c)小册子，所述小册子具有用于治疗癌症的方法的说明，所述方法包括向癌症患者施用(a)的融合脂质体，然后施用(b)的t细胞活化剂。
在某些实施方案中，超分子组装体包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)，经由二硫代二丙酸氨基乙酯(dtp)连接甲氧基-peg(mpeg)的可选的胆固醇基半琥珀酸酯(chems)和可选的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(dspe)，或经由二硫代3-己醇(dth)连接到mpeg的1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酸(dspa)，其中，超分子组装体在酸性ph下不稳定，即发生酸触发的不稳定。ph敏感的制剂的dope:chems摩尔比为6:4且mope-dtp-dspe或mpeg-dth-dspa为5-15％。
在又一另外的方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如以上实施方案中任一项所定义的融合脂质体和药学上可接受的载体。
在某些实施方案中，以上实施方案中任一项的融合脂质体缺乏靶向剂。
术语“载体”是指与活性剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。药物组合物中的载体可包含粘合剂，诸如微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮(polyvidone)或聚乙烯吡咯酮(povidone))、黄蓍胶、明胶、淀粉、乳糖或乳糖一水合物；崩解剂，诸如藻酸、玉米淀粉等；润滑剂或表面活性剂(诸如硬脂酸镁或十二烷基硫酸钠)；和助流剂，诸如胶体二氧化硅。
可以将组合物配制成用于通过注射(例如，通过推注注射或连续输注或直接肿瘤注射)进行肠胃外给药。注射用制剂可以单位剂型存在(例如，在安瓿或多剂量容器中)，并加入防腐剂或稳定剂。该组合物可以采取诸如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以包含配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，以便在使用前与合适的媒介物(如无菌的无热原的水)混合。
对于口服给药，药物制剂可以是液体形式，例如溶液、糖浆或悬浮液，或者可以作为药物产品存在，以在使用前用水、可注射的等渗剂或其他合适的媒介物重构。这样的液体制剂可以通过常规方法与药学上可接受的添加剂(诸如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如，杏仁油、油性酯或分馏植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸甲酯或山梨酸))一起制备。药物组合物可以采取例如片剂或胶囊剂的形式，其通过常规方式与药学上可接受的赋形剂(如粘合剂(例如，预糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠))制备。可以通过本领域公知的方法将片剂包衣。
可以适当地配制用于口服施用的制剂以控制释放活性化合物。
对于口腔施用，组合物可以采取以常规方式配制的片剂、粘膜粘附贴剂/胶粘剂或锭剂的形式。
所述组合物也可以配制成直肠组合物，诸如栓剂或保留灌肠剂，如含有诸如可可脂或其他甘油酯的常规栓剂基质。
对于通过吸入施用，根据本发明使用的组合物使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)，从加压包装或喷雾器以气雾剂形式方便地递送。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀以递送计量的量来确定。可以配制用于吸入器或吹入器的例如明胶或甘油的胶囊和筒，其中含有化合物和合适的粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
如本文所用，术语“治疗”是指获得期望的生理作用的手段。就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的症状而言，该作用可以是治疗性的。该术语是指抑制疾病，即阻止其发展；或改善疾病，即引起疾病消退。
尽管本文已经图示和描述了本申请的某些特征，但是许多修改、替代、改变和等同形式对于本领域普通技术人员将是显而易见的。因此，应理解，所附权利要求书旨在涵盖落入本申请的真实精神内的所有此类修改和改变。
细胞着色平台的应用：
该平台使终端用户可以使用具有不同官能团的脂质体或直接通过化学修饰来修饰靶细胞的细胞表面。
1、靶细胞标记(体内细胞修饰)：
1.1、抗癌：
1.1.1、标记癌细胞以被免疫系统细胞杀死。例如，通过在癌细胞上呈现炔基并全身注射炔或叠氮化物抗cd3和炔或叠氮化物抗cd8以诱导杀伤性t细胞杀死癌症。
1.1.2、标记癌细胞以被抗癌肽杀死。例如，通过在癌细胞上分别呈现炔基或叠氮化物基团，并通过注射需要膜锚的叠氮化物-抗癌肽来杀死细胞。
1.2、抗自身免疫性疾病：标记自身反应性细胞以被免疫系统细胞杀死。
2、效应细胞标记(离体细胞修饰)：
2.1、患者来源的杀伤性t细胞可以用一个新的基团进行体外标记，该新基团使得能够识别靶细胞，然后杀死靶细胞。例如，抗cd3-炔烃或叠氮化物可以与靶向肽-叠氮化物或炔(表位)或抗cd19抗体-叠氮化物或炔烃共价连接，可用于治疗b细胞淋巴瘤，或hla-mart1抗体-叠氮化物可杀死黑色素瘤细胞，或者抗gp120抗体叠氮化物或炔烃可杀死hiv感染的t细胞。
2.2、可以使用抗cd3-炔烃或叠氮化物标记原代调节性t细胞，抗cd3-炔烃或叠氮化物可以慢性炎症位点靶向的抗体-叠氮化物或炔烃或肽-叠氮化物或炔烃共价结合，以抑制ms、关节炎、牛皮癣等的炎症进展。
2.3、循环肿瘤细胞修饰：肿瘤细胞可以用免疫激活部分标记，这将引起针对这些细胞的免疫效应细胞的激活，从而产生新的癌症疫苗制剂。
现在将通过以下非限制性实施例说明本发明。
实施例
材料和方法
用乙醇注射产生免疫标记脂质体：
根据所需的组合物称重脂质(抗极性脂质或类脂)，并以所需脂质体体积的10％的最终体积溶于纯etoh溶液中。将脂质-etoh混合物加热至脂质的tm(熔化温度)以上。在相同的温度下将etoh注射入适当的缓冲液中，并使用挤出机将脂质缓冲液混合并挤出以产生所需大小分布的脂质体。
制备后脂质体修饰：
使用nhs酯化学反应(n-羟基琥珀酰亚胺)，使用接头和叠氮化物(结合对的一个成员)对含有乙醇胺基团的脂质体进行挤出后化学修饰。通常，nhs-聚乙二醇(peg)4-叠氮化物(nhs基团)的用量为每个伯胺基团(dope脂质)5摩尔当量。使用尺寸排阻色谱法去除未结合的过量物。
或者使用预先修饰的脂质制备脂质体，以产生类似的脂质体产物，该产物允许铜依赖性或非依赖性点击反应。简要地，在注射etoh之前，将用peg4-炔烃或叠氮化物预修饰的dspe或dope脂质掺入脂质混合物中。
peg4代表分子量为约194da的peg。
抗体修饰：
通常使用与脂质体化学修饰相同的方法对抗体进行常规修饰和清洗，但需稍加修饰。简而言之，每个抗体添加过量50摩尔的nhs-peg4-bcn(该结合对的另一成员)。使用尺寸排阻色谱法去除未结合的过量物。
使用修饰的抗体和修饰的脂质体创建2step、out、in+out、in方法：
2step：与结合对中一个成员(例如，叠氮化物)共价连接的脂质体以适当的稀释度直接用于细胞(或在动物模型中静脉注射)，然后洗涤处理过的细胞(不适用于体内设置)，使它们能够与用结合对的互补成员(例如，bcn)修饰的抗体反应。为了检测目的，使免疫脂质体标记的细胞能够与具有结合对的互补成员的荧光染料(例如，dbco)反应。
out：使与结合对的一个成员(例如叠氮化物)共价连接的脂质体能够与具有结合对的互补成员(例如，bcn)的抗体反应。然后将修饰的脂质体以适当的稀释度直接用于细胞(或在动物模型中静脉注射)，然后洗涤处理过的细胞(不适用于体内设置)。为了检测目的，使免疫脂质体标记的细胞能够与具有结合对的互补成员的荧光染料(例如，dbco)反应。
in+out：将共价结合到结合对的一个成员的脂质与具有结合对的互补成员的抗体混合，然后挤出。然后使用挤出机制备脂质体，并使反应能够完成(在25℃下，在400rpm下运行18小时)。修饰的脂质体以适当的稀释度直接用于细胞(或在动物模型下静脉注射)，然后洗涤处理过的细胞(不适用于体内设置)，并使其与具有结合对的互补成员的荧光染料反应。
in：将共价结合至结合对成员的脂质与具有结合对互补成员的抗体和所需的催化剂或试剂在挤出前混合。然后使用挤出机产生脂质体，并立即使用尺寸排阻法或透析法清洗脂质体，以抑制与外叶处抗体的反应。使得内叶反应能够在无催化剂或无试剂的缓冲液中完成(在400rpm，室温下18小时)。修饰的脂质体以适当的稀释度直接用于细胞(或在动物模型下静脉注射)，然后洗涤处理过的细胞(不适用于体内设置)，并使其与具有结合对的互补成员的荧光染料反应。
细胞生长与选择：
使用atcc推荐的培养基(通常是rpmi或dmem，并补充青霉素和链霉素、两性霉素b、热灭活的牛犊血清和l-谷氨酰胺)，在37℃和5％co2的条件下培养细胞系。使用hbss中的胰蛋白酶溶液在37℃下5～10分钟收获细胞，使用移液管收集细胞，然后在400g离心5分钟。将沉淀的细胞重悬于无热原的pbs--缓冲液(不含钙和镁)中或生长培养基中，然后在相差显微镜下使用台盼蓝作为活死识别染料用血球计数器计数。将细胞传代培养多达10代，并常规检测支原体。
基于流式细胞仪的单细胞的细胞着色分析：
通常，每个管使用500000个细胞，并以两个生物学重复一式三份进行实验。将细胞与fitc标记的脂质体在0.5mm脂质下于37℃在5％co2生长培养基中孵育所需的时间(通常为1小时)。然后在无热原的pbs--中将细胞洗涤3次。随后在pbs--中使用dbco-cy5(可点击的荧光染料)将细胞染色1小时。细胞再用pbs--洗涤3次，并使用在pbs--中1.6％的pfa固定15分钟，然后洗涤并重悬在pbs--中。在使用bdfacscalibur进行facs分析之前，将固定的细胞在4℃下保存若干分钟直至7天。
使用侧向散射和前向散射检测信号的手动门控对细胞进行分析，并进行相应的门控，以区分完整细胞和碎片。每个试管计数10000个细胞，并使用所需的荧光通道进行分析：fl1通道：绿色荧光通道(530±15nm，fl1)。使用的激光是488nm，15mw；fl4通道：红色荧光通道(661±8nm，fl4)。使用的激光是635nm，9mw。使用对照脂质体(或无脂质体)处理的细胞确定信号阈值，将门设置在未染色对照的荧光信号上方，以确定阳性信号，并计算阳性细胞的百分比。
原代杀伤性t细胞的分离：
使用不含热原的ficoll(1.077)分离小鼠原代脾细胞或补充柠檬酸三钠静脉血(以0.11m柠檬酸：血为1：9稀释)，并使用il2、抗cd3和抗cd28在5％co2下于37℃下灌注5～13天进行。它们被用作原代效应/记忆杀伤t细胞的来源20。
细胞的cfse染色
用于流式细胞仪：将1μlcfse原液(在dmso中为2.5mg/ml)添加到1ml含有1至800万个细胞的生长培养基中。立即涡旋细胞，并在组织培养箱中孵育30分钟。用生长培养基洗涤染色的细胞3次(1次洗涤：将细胞以400g离心5分钟，将沉淀的细胞重新悬浮在培养基中)。
荧光显微镜的改进方案：将1μlcfse原液(在dmso中为2.5mg/ml)添加到1ml含1至800万个细胞的无热原的pbs中。立即涡旋细胞，并在组织培养箱中孵育30分钟。用生长培养基将染色的细胞洗涤3次。
成像免疫脂质体标记的原代免疫细胞杀死癌细胞：
将4t1mcherry细胞用5mm脂质的n8脂质体(用peg4-叠氮化物修饰)在37℃，5％co2下处理1小时。使用无热原的pbs洗涤细胞3次，并使其能够与peg4-bcn标记的抗体在生长培养基中反应1小时，每100μl100mm脂质中的mab比例为12.5μg。将癌细胞在37℃和5％co2下与cfse染色的原代杀伤性t细胞共孵育，并在lsm710共聚焦显微镜的绿色和红色通道上每5分钟成像一次，持续24小时。在不将癌细胞暴露于脂质体的情况下进行了对照，但是在相同条件下使用了相同的供体杀伤性t细胞。
小鼠体内正交三阴性乳腺癌模型的诱导：
小鼠获自harlan(以色列envigo)，并在spf(无特定病原体)设施中进行12小时的明/暗循环，随意进食和饮水。所有进行的实验均得到机构动物研究伦理委员会的批准。使用30g针将4t1鼠癌细胞系(50μlpbs--中的300000个细胞)注射到7～8周龄雌性balb/c小鼠的乳腺脂肪垫中。注射细胞后5～10天出现可触及的肿瘤。通常，治疗始于平均肿瘤大小100mm3。根据动物研究伦理委员会的指示，于肿瘤大小为1000mm3或动物损失初始体重的15％的情况下，使用二氧化碳将动物安乐死。使用卡尺测量肿瘤的最大尺寸(l)和垂直于肿瘤的最大尺寸(w)。使用以下公式估算肿瘤体积(v)：
v＝w*w*l/2
所有治疗均通过静脉注射全身注射给带瘤小鼠。
合成并用于获得此处所示结果的化合物结构及其合成方案如下：
生物素-nhs的合成
向0.72克生物素(2.94mmol)中加入40毫升二甲基甲酰胺，然后加入1.69克nhs(14.68mmol)。向反应溶液中加入2.00克dcc(14.80mmol)，并在完成反应之前在环境温度下搅拌反应18小时。通过tlc(tlc流动相：80％乙酸乙酯:20％甲醇；染色pma)测试反应。过滤反应溶液，然后用100ml溶液(30％乙酸乙酯:70％己烷)稀释。过滤产物以得到600mg产物，该产物包含一些痕量的试剂。然后加入另外的50ml溶液以得到更多的沉淀。过滤除去沉淀物，得到66mg纯产物(通过tlc和nmr测试)。然后向反应溶液中另外添加100ml相同溶液以得到更多沉淀。分离后，分离出600mg产物与一些尿素副产物的混合物。纯产物(66mg)用于生物学应用的反应。
bcn-peg1100-nhs的合成
向30mgbcn-nhs(0.10mmol)中加入5ml氯仿，然后加入0.2ml三乙胺。向反应中加入100mgnh2-peg1100cooh(0.09mmol)，并将反应搅拌2小时，然后通过tlc(tlc流动相：80％氯仿，20％甲醇和100％氯仿；染色pma)进行测试。反应未完成(剩余nh2-peg1100cooh)。因此，另外添加15mg的bcn-nhs(0.05mmol)，并将反应搅拌另外1小时。根据tlc测试，反应完成(反应后无nh2-peg1100cooh残留，并且观察到新的极性较小的斑点)。通过旋转蒸发仪蒸发三乙胺。然后将反应物在3ml氯仿中稀释。加入30ml乙醚使产物沉淀。蒸发粗产物，得到120mg，原样用于下一步。
向120mgbcn-peg1100cooh(0.09mmol)中加入5ml乙腈，然后加入0.2ml三乙胺。向反应溶液中加入50mgdsc(0.20mmol)，并将反应搅拌2小时。通过tlc(tlc流动相：80％氯仿，20％甲醇；染色pma)测试反应。反应完成(反应后无bcn-peg1100cooh残留，并且观察到新的极性较小的斑点)。在减压下通过旋转蒸发仪将反应溶液蒸发至干。然后将反应残余物溶于10ml(5ml:5ml)的二氯甲烷:二乙醚的溶液中。将反应混合物搅拌15分钟，将残余物留在烧瓶中，同时通过旋转蒸发仪将反应溶液蒸发至干。通过tlc和nmr测试获得的固体-120mg(产率约93％)。该产品保存在冰箱中。
荧光脂质dspe-fitc、dope-fitc的合成
向105mg脂质(dspe或dope)中加入10ml氯仿，然后加入50mgfitc和1.0ml三乙胺。在添加5mldmf之前，将反应在环境温度下搅拌15分钟。将反应在环境温度下搅拌1小时，并根据tlc(tlc流动相：25％甲醇，75％氯仿；染色pma)完成反应。然后将反应物用氯仿稀释*10，并通过快速色谱纯化。产物用30％甲醇:70％氯仿洗脱。合并纯产物馏分并蒸发至干。分离出95mgdope-fitc和70mgdspe-fitc。产物结构通过nmr、tlc确认。
炔-peg-dspe缀合物的合成
在惰性条件下，向10克peg200或20克peg400(0.05摩尔)中加入150ml干thf，并通过冰浴将溶液冷却至0℃。15分钟后，将三份1.8克氢化钠分别加入到每个反应中，每份约0.6克。将反应在环境温度下再搅拌30分钟，然后添加炔丙基溴(每个反应2.8ml)。然后将反应搅拌过夜。在所有情况下，通过tlc(5％meoh:95％乙酸乙酯)获得产物。通过加入4mlhcl32％中和反应，然后蒸发至干。然后通过己烷洗涤除去痕量的炔丙基溴。产物的纯化在硅胶快速柱上进行。用乙酸乙酯将产物洗脱到90％乙酸乙酯:10％meoh中。将合并的馏分蒸发至干并进行ms分析。最好的产品馏分按原样用于下一步。在peg200-炔丙基部分的情况下为1.2克，在peg400-炔丙基部分的情况下为2.7克。
在每个反应中，向0.5grpeg200-炔丙基和1.0grpeg400-炔丙基中加入10mlthf和2ml三乙胺。将两个反应搅拌15分钟，然后将0.4克的甲苯磺酰氯添加到每个反应中。根据tlc(20％甲醇:80％氯仿)搅拌过夜后，反应完成。向两个反应中加入2ml三乙胺、0.5gdspe和5ml氯仿，并将反应在40℃下搅拌过夜，直至从tlc观察到反应完成。过滤两个反应以除去不溶性颗粒并蒸发至干。产物的纯化在硅胶快速柱上进行。将反应混合物各自溶解在5ml氯仿中，并加载在柱上，并通过梯度洗脱直至20％meoh:80％氯仿。蒸发dspe-peg200-炔丙基和dspe-peg400-炔丙基，得到约400mg的每种产物，其通过nmr鉴定。
dope-peg2000叠氮化物和dspe-peg2000叠氮化物的合成
向200mg脂质(dspe或dope)中加入10ml氯仿，然后加入1.50克粗nhs-peg2000-叠氮化物和2.0ml三乙胺。将反应搅拌过夜，根据tlc(tlc流动相：10％甲醇，90％氯仿；染色pma)，反应完成。加入400mg2-叠氮基乙胺，并将两个反应搅拌另外4小时。然后通过旋转蒸发仪蒸发反应以除去三乙胺和痕量的2-叠氮基乙胺。反应粗产物用20ml5％meoh:95％氯仿溶液稀释，并在硅胶柱上纯化。用8％甲醇:92％的二氯甲烷洗脱产物。合并根据tlc纯度≥90％的产物馏分并蒸发至干。为了获得纯的化合物，进行了结晶。在加入二乙醚后，两种产物均溶解在最小体积的二氯甲烷中，导致一些杂质沉淀，而产物是可溶的。因此，将产物溶液过滤并添加另外的二乙醚，直到观察到产物脂质的沉淀。结晶后，总共获得280mg的纯dope-peg2000-叠氮化物和75mg的纯dspe-peg2000-叠氮化物。产物结构通过nmr确认。
6-庚酸nhs与14dmpe、16dppe或18dspe的缀合物的形成
向200mg脂质(dppe、dmpe或dspe)中加入10ml氯仿，然后加入2.5ml三乙胺。在添加100mg6-庚酸nhs酯之前，将每个反应在环境温度下搅拌15分钟。将反应在室温搅拌2小时，并通过旋转蒸发仪浓缩至最小体积。然后将反应残余物溶于150ml乙酸乙酯、二乙醚溶液(100ml乙酸乙酯、50ml二乙醚)中。进行tlc以测试反应的转化水平(tlc流动相：20％甲醇，80％氯仿；染色pma)。在所有情况下，反应均已完成(反应后无脂质残留)。将反应溶液与50ml饱和碳酸氢钠溶液一起搅拌15分钟，然后除去水层，并用50ml氯化钠溶液洗涤有机层。丢弃水层后，将有机层用硫酸钠干燥，并通过旋转蒸发仪蒸发至干。获得了固体产物226mg的dppe-6庚酸(产率98％)、200mgdppe-6的庚酸(产率98％)和150mg的dspe-6庚酸(产率70％)。所有产物均通过nmr和tlc鉴定。
bcn-nhs的合成
根据公开的程序分子2013,18,7346-7363进行了一些更改，完成了该程序。向400mgbcn-oh(2.66mmol)中加入10ml乙腈，然后加入1.5ml三乙胺。向反应溶液中加入1.70克dsc(6.64mmol)，并在惰性条件下搅拌反应。通过tlc观察(tlc流动相：50％乙酸乙酯，50％己烷；染色pma)，将反应溶液在完成前在环境温度下搅拌过夜。通过旋转蒸发仪将反应溶液蒸发至干。然后将反应残余物溶于5ml氯仿中，并加入50ml二乙醚。将反应混合物搅拌15分钟，将残余物留在烧瓶中，同时通过旋转蒸发仪将反应溶液蒸发至干。所获得的固体–950mg(产率约95％)，根据tlc的纯度超过90～95％，因此该产物可用于下一步/接下来的步骤。
bcn-peg4-oh的合成
向300mgbcn-nhs(1.03mmol)中加入10ml乙腈，然后加入1.0ml三乙胺。首先向反应溶液中加入0.3mloh-peg4-nh2，将反应搅拌半小时，然后通过tlc测试反应未完成。然后将另外的0.2mloh-peg4-nh2添加至总共0.5mloh-peg4-nh2(2.83mmol)中，并将反应搅拌半小时，直至通过tlc观察到反应完成(tlc流动相：90％氯仿，10％甲醇；染色pma)。通过旋转蒸发仪在减压下将反应溶液蒸发至干，然后通过硅胶柱纯化。反应溶液用5％meoh:95％二氯甲烷洗脱。通过旋转蒸发仪将纯馏分蒸发至干。tlc测定了所得产物–200mg(53％)。根据tlc，纯度为约90％，因此该产物可用于下一步/接下来的步骤。
bcn-peg4-nhs的合成
向200mgbcn-peg4-oh(0.54m)中加入5ml乙腈，然后加入1ml三乙胺。向反应溶液中加入400mgdsc(1.56mmol)，并在环境温度下搅拌反应2小时，直至通过tlc观察到反应完成(tlc流动相：10％甲醇，90％二氯甲烷；染色pma)。然后在硅胶柱上纯化后，通过旋转蒸发仪将反应溶液蒸发至干。用二氯甲烷洗涤该柱，并用100％乙酸乙酯洗脱产物。通过旋转蒸发仪将纯馏分蒸发至干。所获得的产物–250mg(91％)通过tlc测试并通过tlc和nmr鉴定。根据tlc和nmr，纯度大于95％，因此该产物可用于下一步。产品保持在-20℃。
四甘醇对甲苯磺酸盐(hopeg4ots)的形成
向55克peg4(0.283摩尔)中加入400ml无水氯仿，并通过冰浴将溶液冷却至0℃。15分钟后，加入100ml三乙胺，并将反应另外搅拌15分钟。然后加入25gr对甲苯磺酰氯(0.132摩尔)，将反应在环境温度下搅拌过夜。过夜(100％乙酸乙酯)后，通过tlc测试转化率。然后将反应物通过旋转蒸发仪蒸发，然后用己烷:乙醚(2:1)溶液洗涤残留物以除去痕量的甲苯磺酰基。然后向残余物中加入乙酸乙酯，并用5％hcl、10％nh4ac和5％nacl的水溶液洗涤，然后用硫酸钠干燥有机层。通过旋转蒸发仪蒸发乙酸乙酯，得到18.6克hopeg4ots(产率41％)。根据tlc，纯度为约90％，因此该产物可用于下一步/接下来的步骤。产品保持在4℃。
四甘醇叠氮化物(hopeg4n3)的形成
向6.0克hopeg4ots(17.2mmol)中加入60ml乙醇，并将溶液搅拌5分钟。然后加入6.0克叠氮化钠(92.3mmol)，将反应混合物加热至65℃并搅拌过夜直至完成，如通过tlc(tlc流动相：90％氯仿，10％甲醇；染色pma)观察到的那样。然后将混合物过滤以除去不溶的叠氮化钠。通过旋转蒸发仪蒸发乙醇溶液，并将残余物溶于乙醚。过滤包含醚层的产物，并通过旋转蒸发仪浓缩，得到粗产物，然后通过快速硅胶柱进一步纯化。用5％meoh:95％氯仿洗脱产物。合并纯馏分(通过tlc≥90％纯度)并蒸发至干，得到用于下一步/接下来的步骤的0.50ghopeg4n3。
n3-peg4-nhs的形成
向450mghopeg4n3(2.05mmol)中加入15ml乙腈，然后加入1ml三乙胺。向反应溶液中加入800mgdsc(3.12mmol)，并在环境温度下搅拌过夜，直至通过tlc观察到反应完成(tlc流动相：10％甲醇，90％二氯甲烷；染色pma)。将残余物溶于二氯甲烷后，通过旋转蒸发仪将反应溶液蒸发至干。将合并的二氯甲烷层浓缩至3ml，并加入30ml石油醚。将反应混合物搅拌15分钟，并除去石油醚溶液。将残余物溶于二氯甲烷:乙醚(各10ml，1:1)。将获得的溶液蒸发至干，得到370mgnhspeg4n3(产率50％)。根据tlc和nmr，纯度大于95％，因此将产物用于下一步。将产物保存在-20℃的冰箱中。
实施例1、使用融合脂质体标记细胞
体外：
开发了一种免疫标记脂质体平台，使用具有各种tm(熔解温度)值的不同脂质，这些tm值由饱和度(存在双键)和酰基尾巴的长度确定。此类脂质组合物与不同比例的带正电的脂质和两性离子脂质(诸如dape、二酰基磷脂酰乙醇胺)的组合可显著改善与癌细胞的融合。我们的脂质体标记平台被用于标记具有结合对的一个官能团(诸如点击化学反应)的癌细胞(图2a)。使用几个化学合成步骤(图2b和c中显示的实例)，使用该官能团添加至免疫活化剂(诸如单克隆抗体(mab))，以使得能够将可点击的接头同时添加到磷脂头基和mab中。
实施例2、脂质体组合物、脂质体摄取和脂质体融合
发现用以下配方(hspc:胆固醇:6-庚炔-pe(dspe/dppe/dmpe)60:35:5)制备的脂质体是稳定的。
所有未按所述方法合成的材料均可商购。发现用以下配方(hspc:胆固醇:6-庚炔-pe(dspe/dppe/dmpe)60:35:5)制备的脂质体是稳定的。
hspc–氢化大豆磷脂酰胆碱；
pe-磷脂酰乙醇胺
dspe–二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
dppe–1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺
dmpe–1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺
6-庚酸接头是用于制备脂质体的铜依赖性炔烃的样品，该脂质体与mab仅在内叶结合。该接头后来被无铜炔烃接头取代。bcn或dbco是独立于铜的炔基，可在体内条件下与叠氮化物形成共价键。
第一步，将6-庚酸与nhs缀合，以形成具有nhs和炔基的双功能接头。使用该接头，pe上的胺基通过nhs基团与6-庚基-nhs缀合，并纯化了官能化的pe以制备脂质体。
这些带有炔烃官能化接头的脂质体可用于缀合各种叠氮化物修饰的分子，诸如肽、抗体、荧光团、生物素和糖类。我们将荧光团、钙黄绿素-叠氮化物(内部制备)缀合到含有炔烃连接体的脂质体上(图3a)。结合效率为17-20％。这些荧光脂质体用于测试不同脂质体制剂对细胞摄取或与脂质体融合的影响。脂质体制剂中疏水尾巴的长度和胆固醇的百分比对脂质体对细胞的摄取或融合没有显著影响(图3b-c)。
头基修饰会影响脂质体对靶细胞的作用：通过修饰头基，我们可以微调脂质体-靶细胞融合与内吞作用摄取脂质体的效果。
使用我们的平台研究了4t1细胞系(可从atcc获得的小鼠三阴性乳腺癌细胞(
实施例3、脂质体组成对癌细胞融合的影响
如图2d所示，测试了不同脂质组合物作为脂质体与癌细胞融合的能力，但是使用没有dope-fitc的脂质体。我们修改了净正电荷、酰基尾部饱和度，并因此修改了脂质混合物的tm(熔化温度)。我们已经获得了可调节的癌症标记脂质体，该脂质体在癌细胞的细胞膜上添加了一个官能团(结合对的一个成员)()。
实施例4、制剂优化
dspe-peg2000用作稳定剂并可改善体内条件下的循环半衰期，但由于空间位阻，还可能导致癌症-脂质体融合减少。因此，我们在脂质体免疫标记制剂n8，(核心制剂dotap:dopc:dope:dope-fitc:dspe-peg2k35:52.5:10:0.2:x，其中x为5、2.5、1.25、0.625，摩尔比)中测试了范围更广的dspe-peg2000。为了确定peg2000对癌细胞摄取和融合的影响，使用dope-fitc(ex488nm，em530nm)对脂质体进行荧光标记，并在制备后使用nhs-peg4-n3将其连接至接头peg4-n3(图2d)。将癌细胞在37℃下暴露于0.5mm脂质的脂质体中1小时，然后洗涤并用dbco-cy5(fl4)染色。绿色荧光通道(fl1)中的信号指示被癌细胞摄取的脂质体。红色荧光通道(fl4)中的信号表示我们的着色脂质体与癌细胞膜融合。在室温下，使用pbs中的1.6％低聚甲醛将细胞固定15分钟，并保持在4℃直至facs分析。a显示了阳性癌细胞对fitc信号的平均百分数，表明脂质体被摄取，对于cy5信号，这些细胞上叠氮化物基团的点击，从而表明了融合。此外，在b中，呈现了平均荧光强度的平均值，并且与每个癌细胞的荧光团数量成比例。总体上，免疫标记制剂中数量增加的dspe-peg2000表现出融合和摄取的抑制作用。
为了对使用流式细胞仪获得的上述结果进行补充，我们已经测试了荧光标记脂质体在不同癌细胞中的定位。显示了免疫标记脂质体在4t1mcherry细胞膜上的空间定位，这与我们脂质的膜定位有关。我们已经测试了对其他癌细胞类型进行免疫标记的能力，如所示的肺癌细胞系(人和鼠)和黑色素瘤细胞系(鼠)。
接下来，我们测试了免疫标记脂质体通过活化杀伤性t细胞诱导癌细胞死亡的能力。使用共聚焦时间流逝实验对已处理的癌细胞和未处理的癌细胞进行了实验，其具有来自相同供体的小鼠原代杀伤性t细胞(分别)。我们已经使用红色像素作为癌细胞进展/杀伤的标记物进行了图像定量(10)。
我们已经使用了四种不同的方法将杀伤性t细胞活化mab递送至肿瘤。我们使用的第一种方法称为“2step”，其中注射了(图2a)中描述的脂质体，并用结合对的一个官能团(例如叠氮基)标记了癌细胞，并且在脂质体注射后3小时，我们注射了标记有结合对另一官能团的mab。第二种方法(图2e，i)被称为“in”，其中内叶用于结合共价结合至另一结合对官能团的mab。第三种方法“out”(图2e，ii)，脂质体的外叶用于结合共价结合至另一结合对官能团的mab。第四种方法“in+out”(图2e，iii)脂质体的内叶和外叶用于结合共价结合至另一个结合对官能团mab。
实施例5、在动物模型中治疗癌症
如a所示，我们已经使用2step、in和in+out方法与2step对照(相同的2step脂质体，偶联不可点击的抗体)测试了我们的免疫标记脂质体的效果。在1b中示出了单个小鼠蜘蛛图，其中在每个治疗组图中将每只小鼠的肿瘤大小对时间表示为单个系列。我们已经在注射后24小时进一步测试了脂质体制剂在带瘤动物中的生物学分布(c)。该脂质体标记生物分布图类似于用作基准或“金标准”的doxil制剂。
从治疗开始72小时对小鼠进行组织学和免疫组化分析，以测试肿瘤和其他组织损伤以及t细胞募集。数据显示大量t细胞募集到肿瘤，但不募集到肝和肾(损伤分析尚在进行caspase和tunel染色)。使用离体选择性研究对体内研究进行补充，在该离体研究中，从携带4t1肿瘤的小鼠中收集器官并消化成单细胞。将这些正常组织和肿瘤起源细胞暴露于0.5mm脂质的n8(2step或out)脂质体，并使用可点击的染料(dbco-cy5)染色。使用b所示的流式细胞仪分析单细胞。与n8的生物分布图(2step或out)以及组织学分析一起考虑时，该数据表明我们的脂质体平台到达了多个器官，但选择性融合并募集t细胞至肿瘤。
对于2step和out方法，如图12a所示，用我们的脂质体治疗的带瘤动物表现出增加的t细胞向肿瘤的募集，而不向肝脏或肾脏募集，并且在图12c中进行了量化。当与离体选择性研究相结合时，此处显示的数据表明脂质体对与肿瘤来源的细胞融合具有选择性，并且与健康器官来源的原代细胞融合很少(图12b)。与生物分布研究相结合的数据解释了为什么肝脏组织玻片显示出t细胞浸润没有增加。从机理上讲，脂质体与带负电荷的癌细胞融合，并活化杀伤性t细胞，其通过趋化作用将额外的t细胞募集到癌症部位。吞噬细胞(诸如肝中的kuepfer细胞)摄取后，没有融合，但存在脂质体，脂质体本身并不能像癌症组织那样活化杀伤性t细胞。
总体而言，我们的数据表明，本文所述的发明可以系统地用于不同类型的癌症，并诱导旨在杀死体内条件下的肿瘤细胞的免疫反应。
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valproleuserleuthrmetgly
15
<210>9
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成物
<400>9
valproleuserleutyrsergly
15
<210>10
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成物
<400>10
ileprogluserleuargalagly
15
<210>11
<211>20
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成物
<400>11
alagluglygluphecyssertrpalaproprolysalasercysgly
151015
aspproalalys
20
<210>12
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成物
<400>12
cyssertrpargpropropheargalavalcys
1510
<210>13
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成物
<400>13
cyssertrpalaproprophelysalasercys
1510
<210>14
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成物
<400>14
cysasntrpthrproprophelysthrargcys
1510
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