一种包被小分子氯化锂的壳聚糖生物敷料的制备工艺的制作方法

本发明属于创面修复技术领域，涉及一种包被小分子氯化锂的壳聚糖生物敷料的制备工艺。

背景技术：

皮肤是人体最大的组织器官，它作为机体屏障，隔绝外界病原体和危险因素，它易于遭受各种物理、化学或生物的损伤，成人皮肤创伤后为瘢痕性愈合，对于重要部位或是大面积皮肤损伤病人，修复后皮肤挛缩及缺乏附件结构，严重影响病人生理功能，同时造成病人心理负担。

生物活性因子、干细胞、组织工程皮肤等多种方法被应用到皮肤修复。上述方法均能够在一定程度上缩短创面愈合时间，减少创面纤维化程度。随着组织工程技术的发展，多种组织工程支架被开发出来，具备抗感染，减少炎症，促进血管化，抑制瘢痕等相关的功能。其中壳聚糖是一种天然生物材料，具有良好的稳定性，细胞相容性，可降解调节性和孔径可变性。另外，壳聚糖能够模拟细胞外基质的多糖大分子，及抗菌作用。同时，壳聚糖具有细胞因子的结合位点，能够吸附组织细胞释放的细胞因子，对移植创面具有持久释放，持续作用的特点。因此，壳聚糖是应用最为广泛的构建组织工程支架的原材料。

复合生长因子是近年来组织工程支架的趋向，生长因子可以作为调节细胞行为的重要营养物质，并且能够对创面发挥积极作用，但是生长因子的生产成本很高，并且需要较高的保存条件，这样增加该种生物支架的成本，同时影响该生物支架的大面积推广。

小分子化合物是近年来细胞生物领域最为关注的热点。目前，多个实验室通过小分子的方向实现了细胞的直接分化、转分化、去分化，甚至重编程，小分子被广泛关注，主要是由于小分子制作工艺简单，易于运输和保存，成本较低，小分子能够实现调节细胞的时间及空间的可控性，目前，复合药物生物支架初露端倪，但是如何制备有效的小分子复合生物支架仍然是一个难题，因此，构建复合小分子的生物支架是皮肤修复领域潜在的重要发展方向。

技术实现要素：

本发明提出了一种包被小分子氯化锂的壳聚糖生物敷料的制备工艺，解决了上述技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：一种包被小分子氯化锂的壳聚糖生物敷料的制备工艺，其特征在于，包括以下工艺步骤：

s1、配制1％的乙酸水溶液；

s2、取适量的氯化锂粉末溶于上述乙酸水溶液中，使氯化锂的浓度达到50mmol/l，得到氯化锂溶液；

s3、将适量的壳聚糖粉末溶于上述氯化锂溶液中，使其质量体积比达到1.5％，室温搅拌使壳聚糖充分溶解，得到混合溶液；

s4、将混合溶液进行冷冻，之后放入冷冻干燥机中冻干，得到复合氯化锂的壳聚糖多孔海绵支架；

s5、将复合氯化锂的壳聚糖多孔海绵支架进行高温高压处理，得到中间产品；

s6、将中间产品进行烘干，得到最终产品，即复合支架的生物敷料。

作为进一步技术方案，s3中室温搅拌的时间为3h。

作为进一步技术方案，s4中将混合溶液置于-20℃的环境中进行冷冻，冷冻时间至少为12h，冻干时间为24h。

作为进一步技术方案，s5中高温高压处理时压力具体为0.5公斤～0.8公斤，温度具体为120℃～125℃，处理时间为至少20min。

作为进一步技术方案，s6中的烘干温度为60℃，烘干时间为24h。

与现有技术相比，本发明工作原理和有益效果为：

1、本发明中，氯化锂，实验证明氯化锂具有抗炎、增加细胞活性，抗凋亡能力等特点，是wnt信号通路的激活剂，而wnt信号通路在创面修复过程中发挥重要作用，并且与皮肤创面毛囊的再生具有直接关系，因此，氯化锂可能直接诱导创面wnt信号通路的活化对创面的再生性修复具有积极作用。通过实验研究发现不同浓度的氯化锂的复合对wnt信号通路的激活能力存在差别。更重要的是氯化锂是临床上批准使用的药物，同时前面提到的壳聚糖也是临床上认可的生物材料，将二者有机结合，形成新一代的生物敷料，具有良好的临床转化和应用前景，但是氯化锂的浓度对wnt信号通路的激活能力的影响并不是呈有规律的变化的，因此很长时间的研究都得不到较理想的氯化锂的浓度数据，而本研究终于发现了氯化锂的创面使用浓度，形成更为有效的皮肤修复组织工程支架促进创面少瘢痕性愈合。

2、本发明中，包裹氯化锂小分子的壳聚糖支架经过高温高压处理后，成为不溶于水的支架状态，同时由于壳聚糖的变性及与锂离子的反应，使支架具有了对锂离子缓释的效果，从而起到了良好的促进伤口愈合的作用，复合支架的孔径为85-245μm；孔率为80％左右；溶胀率为24-28；21天时的天然降解率为40％左右，并且实现了特别好的对伤口的愈合效果，解决了一直以来制备有效的小分子复合生物支架的技术难题。

3、本发明提供一种具有高效安全、可加快创面生理性愈合、重构与再生损伤皮肤的生物支架，解决了皮肤创伤愈合后的纤维化问题，促进创面少瘢痕性愈合，在创面修复领域具有显著的进步，并且小分子氯化锂与蛋白相比能够大大缩减生产成本，易于储存，有利于大范围推广，同时经过研究发现，小分子氯化锂能实现支架的缓慢释放，实现优异的愈合效果，同时通过动物水平研究发现复合包被的氯化锂组织工程支架，具有抑制皮肤损伤局部炎症反应，促进血管新生及减少纤维化形成。

4、本发明中，将氯化锂引入到生物敷料中，用于促进皮肤伤口的愈合，用高温高压的方式，实现氯化锂在复合支架中的缓释，以达到持续促进伤口愈合的目的，将临床上已经批准使用的药物及生物材料相互结合，具有良好的临床应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明复合支架的孔隙率、溶胀性、降解率以及对细胞活力的影响；

图2为本发明复合支架在动物水平上的促愈合效果；

图3为本发明不同处理组对伤口的相对愈合速度的对比；

图4为本发明不同处理组对伤口的相对表皮生长量的对比；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提出一种包被小分子氯化锂的壳聚糖生物敷料的制备工艺，

实施例一：

s1、配制1％的乙酸水溶液；

s2、取适量的氯化锂粉末溶于上述乙酸水溶液中，使氯化锂的浓度达到50mmol/l，得到氯化锂溶液；

s3、将适量的壳聚糖粉末溶于上述氯化锂溶液中，使其质量体积比达到1.5％，室温搅拌3h，使壳聚糖充分溶解，得到混合溶液；

s4、将混合溶液置于-20℃的环境中进行冷冻，冷冻时间至少为12h，之后放入冷冻干燥机中冻干，冻干时间为24h，得到复合氯化锂的壳聚糖多孔海绵支架；

s5、将复合氯化锂的壳聚糖多孔海绵支架进行高温高压处理，压力具体为0.5公斤～0.8公斤，温度具体为120℃～125℃，处理时间为至少20min，得到中间产品；

s6、将中间产品进行烘干，得到最终产品，烘干温度为60℃，时间为24h。

实施例二：

s1、配制1％的乙酸水溶液；

s2、取适量的氯化锂粉末溶于上述乙酸水溶液中，使氯化锂的浓度达到10mmol/l，得到氯化锂溶液；

s3、将适量的壳聚糖粉末溶于上述氯化锂溶液中，使其质量体积比达到1.5％，室温搅拌3h，使壳聚糖充分溶解，得到混合溶液；

s4、将混合溶液置于-20℃的环境中进行冷冻，冷冻时间至少为12h，之后放入冷冻干燥机中冻干，冻干时间为24h，得到复合氯化锂的壳聚糖多孔海绵支架；

s5、将复合氯化锂的壳聚糖多孔海绵支架进行高温高压处理，压力具体为0.5公斤～0.8公斤，温度具体为120℃～125℃，处理时间为至少20min，得到中间产品；

s6、将中间产品进行烘干，得到最终产品，烘干温度为60℃，时间为24h。

实施例三：

s1、配制1％的乙酸水溶液；

s2、取适量的氯化锂粉末溶于上述乙酸水溶液中，使氯化锂的浓度达到20mmol/l，得到氯化锂溶液；

s3、将适量的壳聚糖粉末溶于上述氯化锂溶液中，使其质量体积比达到1.5％，室温搅拌3h，使壳聚糖充分溶解，得到混合溶液；

s4、将混合溶液置于-20℃的环境中进行冷冻，冷冻时间至少为12h，之后放入冷冻干燥机中冻干，冻干时间为24h，得到复合氯化锂的壳聚糖多孔海绵支架；

s5、将复合氯化锂的壳聚糖多孔海绵支架进行高温高压处理，压力具体为0.5公斤～0.8公斤，温度具体为120℃～125℃，处理时间为至少20min，得到中间产品；

s6、将中间产品进行烘干，得到最终产品，烘干温度为60℃，时间为24h。

本发明的制备工艺是一种全新的复合支架的制备工艺，乙酸水溶液的选取以及氯化锂浓度的选择、冻干的过程、高温高压的处理都是工艺过程中的难点，其中氯化锂的浓度为50mmol/l对wnt信号通路的激活能力最强，而浓度的选取上并没有规律可言，是无法预期的，并且通过有限次的试验是不能得到的，申请人是在无数次试验过程中偶然得到的，并且通过反证确定了该浓度是最合理的浓度，同时其激活能力与乙酸水溶液作为溶剂也是分不开的，因为壳聚糖在乙酸水溶液中能够充分的溶解，虽然可以选择能够溶解壳聚糖的溶剂都很多，但是实验证明选取1％的乙酸水溶液在冻干后能够得到更均匀的多孔型海绵支架，再配合后续的压力具体为0.5公斤～0.8公斤，温度具体为120℃～125℃，处理时间为至少20min的高温高压处理，使复合支架具有了优异的对锂离子缓释的效果，从而起到了良好的促进伤口愈合的作用。

图1是对实施例一、实施例二、实施例三，壳聚糖对照以及control空白对照的试验结果，结果表明实施例中复合支架的孔径为85-245μm；孔率为80％左右；溶胀率为24-28；21天时的天然降解率为40％左右，其中实施例一制备的支架无论在孔隙率、溶胀率、生物降解率、相对dna含量上都具有优异的效果，从对细胞活性的影响上看，不同的氯化锂的浓度对细胞活性的影响有较大的差别，综合其他三项数据来看，氯化锂的浓度在试验数据上没有什么规律可言，其实在浓度大于50mmol/l后试验数据的仍然是没有什么规律性的，图中不再赘述，本发明选取了于50mmol/l的浓度达到了突出的意料不到的效果。

图2是用实施例一制备的复合支架、壳聚糖对照以及空白对照观察在动物水平上的促愈合效果，由结果可以看出，实施例一制备的复合生物支架敷料具备优异的伤口愈合效果，并且能够实现促进创面少瘢痕性愈合，除此之外在临床实验上的效果能够达到动物实验效果的95％以上。

为了证明通过包裹小分子化合物氯化锂实现了对其进行缓慢释放，能够促进伤口的愈合，用实施例一制备的复合支架、壳聚糖对照以及空白对照进行了相对伤口愈合速度以及相对表皮生长量的实验，实验结果显示复合支架在伤口愈合过程中通过持续激活wnt信号通路，达到了促进伤口愈合的目的。通过组织he染色的方法，我们对不同处理组进行了伤口愈合的对比，结果如图3所示，复合支架组的伤口愈合率比对照组在第三天时提高了66.59％，第五天时提高了179.21％，第七天时提高了148.67％，第十天时提高了39.49％。

本发明的复合支架对新生表皮有明显的促生长作用，如图4结果显示，复合支架组比对照组的新生表皮的生长量在伤后第三天提高了59.98％，第五天提高了64.41％，第七天提高了65.64％。

综上所述，复合支架可以很好的促进创伤后的伤口愈合，无论是从伤口愈合速度上，还是促进表皮生长速度上面，都发挥了十分优秀的促修复作用。是一种良好的促伤口愈合材料。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。