一种软骨诱导性基质材料的制备方法与应用与流程

本发明属于组织诱导性生物材料制备
技术领域：
，具体涉及一种软骨诱导性基质材料的制备方法与应用。
背景技术：
：组织诱导性材料是由中国科学家提出并得到国际社会认可的生物材料专有名词，由此开创的研究方向和研究内容已成为二十一世纪国际生物医学材料领域的热点和重点。以骨诱导人工骨为代表的组织诱导性材料已经获得广泛的研究并取得重要成果，已经有大量的临床实践证明其良好疗效。软骨缺损的修复是一个长期困扰临床的难题，软骨诱导性材料为软骨缺损修复提供了新的思路和途径。基于仿生学的原理和方法，以胶原、透明质酸为代表的天然高分子材料是软骨诱导性材料的主要研究对象。其中，胶原作为一种天然的结构蛋白质受到广泛的关注，已有大量的研究将胶原制备成海绵、薄膜、水凝胶等形式应用于组织工程支架材料。如：专利文献cn104645403a公开了一种胶原蛋白海绵的制备方法，该制备方法包括将胶原蛋白粉配制成浓度为5～8mg/ml的胶原蛋白溶液，接着放置在-80℃下真空冷冻干燥48h，然后加入ph为3～6的由体积分数分别为1～5％缩水甘油醚和10～40％乙醇配制成的交联溶液中，于4℃下浸泡48h，清洗后在压缩状态下在-80℃真空冷冻干燥，包装后用60co辐照灭菌，得到胶原蛋白海绵产品。专利文献cn104338175a公开了一种鱼皮胶原蛋白海绵的制备方法，该制备方法包括前处理、酸溶、盐析、透析纯化、超滤膜浓缩，浓缩后的胶液用0.22μm～0.45μm板式膜进行除菌，然后加入0.1～5％(w/v)药用活性炭搅拌后过滤，以去除热源；胶液置于-60℃低温冷冻干燥机冻干，得到胶原蛋白海绵。然而由于胶原是由氨基酸序列组成的大分子蛋白质，具有独特的四级结构，容易在受热、辐照等情况下引起分子链断裂、结构解旋等变化，从而丧失其良好的生物相容性、低免疫原性等特点，并最终导致其植入体内后失去组织诱导性。因此，采用常规的湿热、干热、辐照等灭菌方式会对胶原的性能产生明显的影响而不适用于胶原基组织诱导性基质材料，特别是含有大量水分的胶原水凝胶材料的灭菌。同时，由于胶原是呈纤维状的长链大分子，且溶解后的胶原溶液粘度大，使其难以通过过滤方式达到胶原溶液的有效灭菌。而且，现有的软骨缺损修复以传统难以实现再生的微骨折法或者基于自体软骨细胞体外培养的自体软骨细胞移植术为主，尚未有软骨诱导性基质材料结合干细胞在不添加外源性生长因子的情况下实现软骨缺损再生修复的报道，其原因是多样的，其中缺乏理想的软骨诱导性基质材料是主要因素之一。作为最受广泛关注和研究的天然高分子材料之一，目前的胶原产品通常都要经过适度的化学改性或与其他材料复合，并以冻干等方式获得胶原海绵等含水量很低的产品后，再采用辐照方式灭菌。辐照灭菌除了会导致部分胶原分子链断裂、结构丧失以外，还有可能产生新的交联而改变其微观结构，最终导致胶原产品理化性能的改变和生物学特性的损失，失去组织诱导能力。而且，通过冷冻干燥制备胶原海绵后再进行辐照灭菌，会使制备得到的胶原海绵难以重新溶解或成胶，不能用于制备具有软骨诱导能力的胶原基生物医用材料。技术实现要素：为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种通过过程控制和化学灭菌的方法来制备软骨诱导性基质材料，制备得到的软骨诱导性基质材料具有生物活性高，生物相容性好，生物可降解性和低抗原性的优点，使用该基质材料作为干细胞载体，诱导其成软骨分化可以实现软骨缺损的修复再生，也可以作为组织工程支架材料和软组织填充材料等。本发明提供了一种软骨诱导性基质材料的制备方法，包括以下步骤：s1将小牛皮进行脱毛、分割、脱脂和脱重金属预处理；s2将步骤s1预处理后的小牛皮进行灭菌、酸浸泡、酶消化处理，得胶原上清液；s3将步骤s2得到的胶原上清液进行盐析、纯化，得胶原粗品；s4将步骤s3得到的胶原粗品进行透析，得胶原纯品；s5将步骤s4得到的胶原纯品与中和剂混合，得软骨诱导性基质材料。进一步地，所述步骤s1的小牛皮为来源于新宰杀的经检验检疫且可溯源的小牛。进一步地，所述步骤s1的预处理的具体步骤为：a脱毛：采用机械方法刮除毛及表皮等杂物后充分清洗；b分割：将脱毛后的小牛皮采用切割粉碎机切割成1mm3的小块；c脱脂：将切割后的小牛皮加入到体积比为1:1的氯仿和乙醇的脱脂液中脱脂，所述脱脂液与切割后的小牛皮的重量比为(5～10):1，在4℃摇床上震荡8～12h后更换脱脂液；重复脱脂2～4次后，将脱脂后的小牛皮加入到无水乙醇中清洗，所述无水乙醇与脱脂后的小牛皮的重量比为(5～20):1，在4℃摇床上震荡8～12h后更换无水乙醇，重复清洗2～4次后，用纯化水清洗3～5次，每次10～30min，得脱脂后小牛皮；d脱重金属：将步骤c得到的脱脂后的小牛皮加入到0.01～0.05mol/l的ph为10.5～11.0的edta-na2溶液中，所述edta-na2溶液的与脱脂后小牛皮的重量比为(5～10):1，在4℃摇床上震荡12～24h后，用10wt％的nacl清洗2～4次，每次2～6h；接着用纯化水清洗3～5次，每次10～60min，即得。进一步地，所述步骤s2的具体步骤为：a灭菌：将步骤s1预处理后的小牛皮加入到含有0.5～2mol/l氯化钠的0.1～0.5％过氧乙酸溶液的混合液中，所述混合液与预处理后的小牛皮的重量比为(10～50):1，在4℃摇床上震荡5～24h后，用无菌注射水充分清洗至中性；b酸浸泡：在无菌洁净环境下，将步骤a灭菌后的小牛皮加入到0.3～1.0mol/l无菌醋酸溶液中，调节ph为2.2～3.0，所述无菌醋酸溶液与灭菌后小牛皮的重量比为(20～60):1；c酶消化：将无菌胃蛋白酶溶于0.5mol/l醋酸，得到的胃蛋白酶溶液加入到步骤b的酸浸泡液中，所述胃蛋白酶的添加量为步骤b酸浸泡的小牛皮总重量的0.2～1.0％，在4℃摇床上连续震荡4～10天后，离心，收集上清液，得胶原上清液。进一步地，所述步骤s3的具体步骤为：i将步骤s2得到的胶原上清液用氢氧化钠溶液调节ph为6.5～7.5，加入4mol/l的无菌氯化钠溶液，使氯化钠浓度达到1～2mol/l，搅拌均匀，静置，离心，收集沉淀；ii将步骤i得到的沉淀加入0.5mol/l的醋酸溶液中完全溶解，离心，收集上清液，重复步骤i2～3次，得胶原粗品。进一步地，所述步骤s4中的透析步骤为：将步骤s3得到的胶原粗品加入到含有0.5～2mol/l氯化钠的0.1～0.5％过氧乙酸溶液的混合液中，所述混合液的添加量是胶原粗品重量的10～50倍，在4℃摇床上震荡5～24h后，用无菌注射水充分清洗至中性；移至无菌透析袋中使用0.1～0.5mol/l的无菌醋酸或0.001-0.01mol/l的无菌盐酸溶液充分透析，得浓度为0.5-3.5wt％的胶原纯品。进一步地，所述步骤s5中与中和剂的混合，包括以下步骤：步骤一：将步骤s4制备得到的胶原纯品离心脱泡后采用真空预灌封方法在无菌条件下灌装0.5～0.9ml于1ml或3ml鲁尔注射器，得胶原注射器；步骤二：将含1mmol/l～4.5mol/l氢氧化钠的10～200mmol/l磷酸盐缓冲液的中和剂，采用真空预灌封方法在无菌条件下灌装0.1～0.5ml于1ml鲁尔注射器，得中和剂注射器；步骤三：使用前，将步骤一得到的胶原注射器与步骤二得到的中和剂注射器用两通或三通连接器连通后快速互推混合，使胶原液的终浓度为0.2～2.0wt％，磷酸盐缓冲液的终浓度为10～20mmol/l，ph值为6.5～7.5，即得软骨诱导性基质材料。另外，本发明还提供了所述的软骨诱导性基质材料的制备方法制备得到的软骨诱导性基质材料在制备组织诱导性生物医用材料中的应用，可作为干细胞载体，诱导其成软骨分化实现软骨缺损的修复再生，也可以作为组织工程支架材料和软组织填充材料等。与现有技术相比，本发明提供的软骨诱导性基质材料的制备方法具有以下优势：(1)本发明提供的软骨诱导性基质材料的制备方法是采用过程控制和化学灭菌相结合的方式制备无菌无热源的诱导性基质材料，可以作为生物医用材料的起始原料或组成部分使用；(2)采用本发明提供的软骨诱导性基质材料的制备方法制备得到的软骨诱导性基质材料，可以作为干细胞载体，在不添加外源性生长因子的情况下诱导其成软骨分化实现软骨缺损的修复再生，也可以作为组织工程支架材料和软组织填充材料等。附图说明：图1为实施例1制得的软骨诱导性材料的圆二色谱图；图2为实施例2制得的软骨诱导性材料的圆二色谱图；图3为实施例3制得的软骨诱导性材料的圆二色谱图；图4为实施例2步骤s4制得的胶原纯品的电泳图；图5为软骨诱导性基质材料诱导干细胞成软骨分化图。具体实施方式：以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。实施例1、一种软骨诱导性基质材料的制备s1将小牛皮进行脱毛、分割、脱脂和脱重金属预处理，具体操作为：a脱毛：采用机械方法刮除毛及表皮等杂物后充分清洗；b分割：将脱毛后的小牛皮采用切割粉碎机切割成1mm3的小块；c脱脂：将切割后的小牛皮加入到体积比为1:1的氯仿和乙醇的脱脂液中脱脂，所述脱脂液与切割后的小牛皮的重量比为6:1，在4℃摇床上震荡12h后更换脱脂液；重复脱脂4次后，将脱脂后的小牛皮加入到无水乙醇中清洗，所述无水乙醇与脱脂后的小牛皮的重量比为10:1，在4℃摇床上震荡12h后更换无水乙醇，重复清洗4次后，用纯化水清洗5次，每次10min，得脱脂后小牛皮；d脱重金属：将步骤c得到的脱脂后的小牛皮加入到0.02mol/l的ph为10.5的edta-na2溶液中，所述edta-na2溶液的与脱脂后小牛皮的重量比为6:1，在4℃摇床上震荡24h后，用10wt％的nacl清洗4次，每次2h；接着用纯化水清洗5次，每次10min，即得。s2将步骤s1预处理后的小牛皮进行灭菌、酸浸泡、酶消化处理，得胶原上清液，具体操作为：a灭菌：将步骤s1预处理后的小牛皮加入到含有0.8mol/l氯化钠的0.2％过氧乙酸溶液的混合液中，所述混合液与预处理后的小牛皮的重量比为20:1，在4℃摇床上震荡20h后，用无菌注射水充分清洗至中性；b酸浸泡：在无菌洁净环境下，将步骤a灭菌后的小牛皮加入到0.4mol/l无菌醋酸溶液中，调节ph为2.2，所述无菌醋酸溶液与灭菌后小牛皮的重量比为30:1；c酶消化：将无菌胃蛋白酶溶于0.5mol/l醋酸，得到的胃蛋白酶溶液加入到步骤b的酸浸泡液中，所述胃蛋白酶的添加量为步骤b酸浸泡的小牛皮总重量的0.4％，在4℃摇床上连续震荡10天后，离心，收集上清液，得胶原上清液。s3将步骤s2得到的胶原上清液进行盐析、纯化，得胶原粗品，具体操作为：i将步骤s2得到的胶原上清液用氢氧化钠溶液调节ph为6.5，加入4mol/l的无菌氯化钠溶液，使氯化钠浓度达到1mol/l，搅拌均匀，静置，离心，收集沉淀；ii将步骤i得到的沉淀加入0.5mol/l的醋酸溶液中完全溶解，离心，收集上清液，重复步骤i2次，得胶原粗品。s4将步骤s3得到的胶原粗品进行透析，具体操作为：将步骤s3得到的胶原粗品加入到含有0.8mol/l氯化钠的0.2％过氧乙酸溶液的混合液中，所述混合液的添加量是胶原粗品重量的20倍，在4℃摇床上震荡20h后，用无菌注射水充分清洗至中性；移至无菌透析袋中使用0.2mol/l的无菌醋酸充分透析，得浓度为1.2wt％的胶原纯品；s5将步骤s4得到的胶原纯品用无菌0.5mol/l醋酸调节浓度为1.5wt％，离心脱泡后无菌条件下真空灌装0.7ml至1ml预灌封注射器，得胶原注射器；配制含0.95mol/lnaoh的33mmol/l磷酸盐缓冲液中和剂，经过滤灭菌后无菌条件下真空灌装0.3ml至1ml预灌封注射器，得中和剂注射器；使用前，将步骤一得到的胶原注射器与步骤二得到的中和剂注射器用两通或三通连接器连通后快速互推混合，使胶原液的终浓度为1.0wt％，磷酸盐缓冲液的终浓度为10mmol/l，ph值为7.0，即得软骨诱导性基质材料。实施例2、一种软骨诱导性基质材料的制备s1将小牛皮进行脱毛、分割、脱脂和脱重金属预处理，具体操作为：a脱毛：采用机械方法刮除毛及表皮等杂物后充分清洗；b分割：将脱毛后的小牛皮采用切割粉碎机切割成1mm3的小块；c脱脂：将切割后的小牛皮加入到体积比为1:1的氯仿和乙醇的脱脂液中脱脂，所述脱脂液与切割后的小牛皮的重量比为8:1，在4℃摇床上震荡10h后更换脱脂液；重复脱脂3次后，将脱脂后的小牛皮加入到无水乙醇中清洗，所述无水乙醇与脱脂后的小牛皮的重量比为15:1，在4℃摇床上震荡10h后更换无水乙醇，重复清洗3次后，用纯化水清洗4次，每次20min，得脱脂后小牛皮；d脱重金属：将步骤c得到的脱脂后的小牛皮加入到0.04mol/l的ph为10.8的edta-na2溶液中，所述edta-na2溶液的与脱脂后小牛皮的重量比为8:1，在4℃摇床上震荡16h后，用10wt％的nacl清洗3次，每次4h；接着用纯化水清洗4次，每次20min，即得。s2将步骤s1预处理后的小牛皮进行灭菌、酸浸泡、酶消化处理，得胶原上清液，具体操作为：a灭菌：将步骤s1预处理后的小牛皮加入到含有1.2mol/l氯化钠的0.4％过氧乙酸溶液的混合液中，所述混合液与预处理后的小牛皮的重量比为30:1，在4℃摇床上震荡15h后，用无菌注射水充分清洗至中性；b酸浸泡：在无菌洁净环境下，将步骤a灭菌后的小牛皮加入到0.6mol/l无菌醋酸溶液中，调节ph为2.6，所述无菌醋酸溶液与灭菌后小牛皮的重量比为40:1；c酶消化：将无菌胃蛋白酶溶于0.5mol/l醋酸，得到的胃蛋白酶溶液加入到步骤b的酸浸泡液中，所述胃蛋白酶的添加量为步骤b酸浸泡的小牛皮总重量的0.6％，在4℃摇床上连续震荡8天后，离心，收集上清液，得胶原上清液。s3将步骤s2得到的胶原上清液进行盐析、纯化，得胶原粗品，具体操作为：i将步骤s2得到的胶原上清液用氢氧化钠溶液调节ph为7.2，加入4mol/l的无菌氯化钠溶液，使氯化钠浓度达到1.5mol/l，搅拌均匀，静置，离心，收集沉淀；ii将步骤i得到的沉淀加入0.5mol/l的醋酸溶液中完全溶解，离心，收集上清液，重复步骤i3次，得胶原粗品。s4将步骤s3得到的胶原粗品进行透析，具体操作为：将步骤s3得到的胶原粗品加入到含有1.2mol/l氯化钠的0.4％过氧乙酸溶液的混合液中，所述混合液的添加量是胶原粗品重量的30倍，在4℃摇床上震荡15h后，用无菌注射水充分清洗至中性；移至无菌透析袋中使用0.008mol/l的无菌盐酸溶液充分透析，得浓度为2.2wt％的胶原纯品；s5将步骤s4得到的胶原纯品用无菌1mmol/l盐酸调节浓度为2.0wt％，离心脱泡后无菌条件下真空灌装0.6ml至1ml预灌封注射器，得胶原注射器；配制含0.15mmol/lnaoh的25mmol/l磷酸盐缓冲液中和剂，经过滤灭菌后无菌条件下真空灌装0.4ml至1ml预灌封注射器，得中和剂注射器；使用前，将步骤一得到的胶原注射器与步骤二得到的中和剂注射器用两通或三通连接器连通后快速互推混合，使胶原液的终浓度为1.2wt％，磷酸盐缓冲液的终浓度为15mmol/l，ph值为7.5，即得软骨诱导性基质材料。实施例3、一种软骨诱导性基质材料的制备s1将小牛皮进行脱毛、分割、脱脂和脱重金属预处理，具体操作为：a脱毛：采用机械方法刮除毛及表皮等杂物后充分清洗；b分割：将脱毛后的小牛皮采用切割粉碎机切割成1mm3的小块；c脱脂：将切割后的小牛皮加入到体积比为1:1的氯仿和乙醇的脱脂液中脱脂，所述脱脂液与切割后的小牛皮的重量比为10:1，在4℃摇床上震荡8h后更换脱脂液；重复脱脂2次后，将脱脂后的小牛皮加入到无水乙醇中清洗，所述无水乙醇与脱脂后的小牛皮的重量比为20:1，在4℃摇床上震荡8h后更换无水乙醇，重复清洗2次后，用纯化水清洗3次，每次30min，得脱脂后小牛皮；d脱重金属：将步骤c得到的脱脂后的小牛皮加入到0.05mol/l的ph为11.0的edta-na2溶液中，所述edta-na2溶液的与脱脂后小牛皮的重量比为10:1，在4℃摇床上震荡12h后，用10wt％的nacl清洗2次，每次2h；接着用纯化水清洗3次，每次30min，即得。s2将步骤s1预处理后的小牛皮进行灭菌、酸浸泡、酶消化处理，得胶原上清液，具体操作为：a灭菌：将步骤s1预处理后的小牛皮加入到含有1.6mol/l氯化钠的0.5％过氧乙酸溶液的混合液中，所述混合液与预处理后的小牛皮的重量比为(10～50):1，在4℃摇床上震荡5～24h后，用无菌注射水充分清洗至中性；b酸浸泡：在无菌洁净环境下，将步骤a灭菌后的小牛皮加入到0.8mol/l无菌醋酸溶液中，调节ph为3.0，所述无菌醋酸溶液与灭菌后小牛皮的重量比为50:1；c酶消化：将无菌胃蛋白酶溶于0.5mol/l醋酸，得到的胃蛋白酶溶液加入到步骤b的酸浸泡液中，所述胃蛋白酶的添加量为步骤b酸浸后的小牛皮总重量的0.8％，在4℃摇床上连续震荡5天后，离心，收集上清液，得胶原上清液。s3将步骤s2得到的胶原上清液进行盐析、纯化，得胶原粗品，具体操作为：i将步骤s2得到的胶原上清液用氢氧化钠溶液调节ph为7.5，加入4mol/l的无菌氯化钠溶液，使氯化钠浓度达到2mol/l，搅拌均匀，静置，离心，收集沉淀；ii将步骤i得到的沉淀加入0.5mol/l的醋酸溶液中完全溶解，离心，收集上清液，重复步骤i3次，得胶原粗品。s4将步骤s3得到的胶原粗品进行透析，具体操作为：将步骤s3得到的胶原粗品加入到含有1.6mol/l氯化钠的0.5％过氧乙酸溶液的混合液中，所述混合液的添加量是胶原粗品重量的40倍，在4℃摇床上震荡5～24h后，用无菌注射水充分清洗至中性；移至无菌透析袋中使用0.4mol/l的无菌醋酸充分透析，得浓度为3.2wt％的胶原纯品；s5将步骤s4得到的胶原纯品用无菌0.4mol/l醋酸调节浓度为2.0wt％，离心脱泡后无菌条件下真空灌装2.0ml至3ml预灌封注射器，得胶原注射器；配制含1.25mol/lnaoh的50mmol/l磷酸盐缓冲液中和剂，经过滤灭菌后无菌条件下真空灌装0.5ml至1ml预灌封注射器，得中和剂注射器；使用前，将步骤一得到的胶原注射器与步骤二得到的中和剂注射器用两通或三通连接器连通后快速互推混合，使胶原液的终浓度为1.6wt％，磷酸盐缓冲液的终浓度为10mmol/l，ph值为7.0，即得软骨诱导性基质材料。试验例一、软骨诱导性基质材料的质量检测试验1、试验材料：实施例1、实施例2、实施例3中s4步骤得到的胶原纯品。2、试验方法：检测实施例1、实施例2、实施例3中s4步骤得到的胶原纯品的产率，微生物含量和重金属含量。其中采用称重法测定胶原纯品的产率，采用《中华人民共和国药典》(2015年版)四部附录1101无菌检查法进行微生物污染检查，采用《中华人民共和国药典》(2015年版)四部附录0821重金属检查法测定重金属含量。3、试验结果：试验结果如表1所示。表1胶原纯品的质量检测试验胶原产率(％)无菌检查重金属含量实施例182合格≤10μg/g实施例288合格≤10μg/g实施例380合格≤10μg/g由表1可知，采用本发明提供的软骨诱导性基质材料的制备方法制备得到的胶原产率大于80％，无菌无热源，且不含重金属。试验例二、软骨诱导性基质材料的稳定性1、试验材料：实施例1、实施例2、实施例3中s4步骤得到的胶原纯品。2、测定方法：检测实施例1、实施例2、实施例3中s4步骤得到的胶原纯品的稳定性，采用圆二色谱表征胶原的结构并反映不同批次间的稳定性。3、试验结果：试验结果如图1、图2和图3所示，其中实施例1制得的软骨诱导性材料的圆二色谱图如图1所示，实施例2制得的软骨诱导性材料的圆二色谱图如图2所示，实施例3制得的软骨诱导性材料的圆二色谱图如图3所示。采用本发明提供的软骨诱导性基质材料的制备方法制备得到的胶原具有典型的左手螺旋结构，符合i型胶原的结构特征；同时，不同批次间的特征谱带峰位置和相对强度一致，表明制备工艺和产品结构具有良好的稳定性。试验例三、软骨诱导性基质材料的纯度检测试验1、试验材料：实施例2步骤s4制备得到的胶原纯品。2、试验方法：采用4％的浓缩胶浓度和7％的分离胶浓度的sds-page凝胶电泳鉴定实施例2获得的胶原纯品。3、试验结果：试验结果如图4所示。由图4可知，将胶原与标样蛋白maker比较，可以看出本发明制备得到的胶原纯度高，分子量符合i型胶原特征且分布集中，不同批次间无差异，质量优异且稳定。试验例四、软骨诱导性基质材料诱导干细胞成软骨分化试验1、试验材料：实施例1、实施例2、实施例3制备得到的软骨诱导性基质材料，体外扩增传代的兔骨髓间充质干细胞(p2或p3)。2、试验方法：将兔骨髓间充质干细胞分散于少量培养基中，得到细胞悬液并转移至无菌注射器后与软骨诱导性基质材料注射器通过两通或者三通连接器连通后快速互推混合，使细胞均匀分散于软骨诱导性基质材料中得到细胞材料复合物，细胞密度达到5×105-1×107个/ml；将上述细胞材料复合物推入圆柱形模具并置于37℃培养箱中20min，使胶原充分自组装成胶后转移到细胞培养板中，加入培养液(含有10％胎牛血清和1％双抗的α-mem培养液)于培养箱中常规培养条件下进行培养；分别于体外培养1d、7d、14d、21d和27d取样进行组织学分析。3、试验结果：试验结果如图5所示。由图5可知，干细胞在软骨诱导性基质材料中形态逐步发生变化，在培养14d开始观察到明显的多糖易染区域并逐步增强，证明干细胞成软骨细胞分化且实现功能表达，表明基质材料具有成软骨诱导性。当前第1页12