一种microRNA及其靶基因在结直肠癌中的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，具体是一种microrna及其靶基因在结直肠癌中的应用。

背景技术：

结直肠癌(colorectalcancer：crc)是世界范围内排名第三位的癌症，是一种来源于腺上皮的恶性肿瘤。由于国家经济水平和物质水平的不断提高，人们的饮食习惯与饮食结构发生了较大的变化，同时老龄化群体不断壮大，导致我国结直肠癌发病率显著增长，极大的危害居民健康，影响其生活质量。

micrornas(mirnas)属于一类非编码rna，在真核细胞内被发现，由19-25个核苷酸组成。mir-149是最近几年来研究比较多的一个mirna，作为抑癌基因参与调控肝癌、乳腺癌、胃癌、神经细胞瘤等多种癌症的发生及发展过程，同时，也可以作为多种癌症筛选的生物标注物及预后因子。然而，mir-149对于结直肠癌的研究还比较少。

因此，如何较好地将microrna及其靶基因应用于医学生物学领域，是目前肿瘤生物学领域需要解决的一大难题。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种microrna及其靶基因在结直肠癌中的应用，具体内容如下：

一种microrna及其靶基因在结直肠癌中的应用，所述microrna是mir-149，所述靶基因是靶基因stat3。

发明人采用荧光素酶实验，发现mir-149可与stat33’utr互补结合，证实了stat3是mir-149的一个靶基因，stat3在crc患者肿瘤组织以及crc细胞中表达量显著高于正常组织和细胞。采用体外细胞法分析了mir-149及其靶基因对crc细胞的影响。结果发现mir-149通过靶向stat3抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移。另外，mir-149通过靶向stat3促进结直肠癌细胞的凋亡。因此，mir-149及其靶基因stat3是结直肠癌治疗的一个靶标。

所述在结直肠癌中的应用，是在制备预防或治疗结直肠癌相关疾病的产品或药品中的应用。mir-149通过作用于stat3促进结直肠癌的转移以及结直肠癌细胞的迁移，这为结直肠癌的治疗提供一种新思路。

所述在结直肠癌中的应用，是在降低结直肠癌细胞的增殖能力方面的应用。发明人采用细胞增殖检测，证实mir-149可以通过靶向stat3抑制结直肠癌细胞的增殖，可用在降低结直肠癌细胞的增殖能力方面。

所述在结直肠癌中的应用，是在降低结直肠癌细胞的侵袭能力方面的应用。发明人采用细胞侵袭检测，证实mir-149通过靶向stat3抑制结直肠癌细胞的侵袭，可用在降低结直肠癌细胞的侵袭能力方面。

所述在结直肠癌中的应用，是在抑制结直肠癌细胞的迁移方面的应用。发明人采用细胞划痕检测，证实mir-149通过靶向stat3抑制结直肠癌细胞的迁移，可用在降低结直肠癌细胞的迁移能力方面。

所述在结直肠癌中的应用，是在促进结直肠癌细胞的凋亡方面的应用。发明人采用细胞凋亡检测，证实mir-149通过靶向stat3促进结直肠癌细胞的凋亡，可用在促进结直肠癌细胞的凋亡方面。

所述在结直肠癌中的应用，是在结直肠癌细胞的预防、诊断的应用。mirnas是近年来生物学研究的热点之一，而在肿瘤学领域则发现mirnas基因多位于一些脆性位点区，这些区域与肿瘤的发生密切相关的，因而提示mirnas可能在肿瘤发生发展过程中发挥重要作。由于不同患者个体间mirnas的表达水平差异较小，mirnas的检测方法也简单易行。因此，mirnas可作为肿瘤的理想生物标志物，对于肿瘤的检测和筛查具有重要的意义。由于stat3在crc患者肿瘤组织以及crc细胞中表达量显著高于正常组织和细胞，因此，mir-149，及其靶基因stat3可用于肿瘤的预防、诊断和治疗。

与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：

(1)发明人研究发现，mir-149属于甲基化较为敏感的microrna，在结直肠癌中，发挥着抑癌基因的作用。如mir-149通过下调wfdc2基因编码的人类附睾蛋白4(humanepididymisprotein4，he4)的表达，调控结直肠癌患者对不同放射性辐射治疗的敏感性。

(2)发明人发现了mir-149在结直肠癌患者及crc细胞中表达水平显著低于正常的组织与结直肠上皮细胞，mir-149低表达暗示结直肠癌患者的不良预后。mir-149通过作用于stat3促进结直肠癌的转移以及结直肠癌细胞的迁移，这为结直肠癌的治疗提供一种新思路。

(3)发明人采用荧光素酶实验证实了stat3是mir-149的一个靶基因，stat3在crc患者肿瘤组织以及crc细胞中表达量显著高于正常组织和细胞。采用体外细胞法分析了mir-149及其靶基因对crc细胞的影响。结果发现mir-149通过靶向stat3抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移。另外，mir-149通过靶向stat3促进结直肠癌细胞的凋亡。因此，mir-149及其靶基因stat3可以作为结直肠癌治疗的一个靶标。

附图说明

图1是mir-149在结直肠癌细胞的表达。**p<0.01，与fhc组相比。

图2是mir-149在结直肠癌组织中的表达。**p<0.01,与正常组织相比。

图3是荧光酶素活性检测mir-149对stat3靶序列的调控作用。**p<0.01，与3‘utrcontrol组相比。

图4是mir-149负向调控stat3的表达。a：荧光实时定量pcr检测stat3mrna表达水平；b-c：westernblot检测stat3蛋白表达水平。**p<0.01，与各自mir-nc组相比较。

图5是cck-8法检测结直肠癌细胞的增殖。

图6是transwell法检测结直肠癌细胞的侵袭。**p<0.01，与各自mir-nc组相比，##p<0.01，与各自mimics+pegfp/stat3组相比。

图7是划痕法检测结直肠癌细胞的迁移。**p<0.01，与各自mir-nc组相比，##p<0.01，与各自mimics+pegfp/stat3组相比。

图8是流式细胞法检测结直肠癌细胞的凋亡。**p<0.01，与mir-nc组相比，##p<0.01，与mimics+pegfp/stat3组相比。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例

实验方法

(1)组织样本

收集结直肠癌患者组织样本100例，离体的组织样本立即经液氮速冻，保存在-80℃超低温冰箱。组织样本经组织病理学检验，确认为结直肠癌组织。

(2)细胞培养

sw620、ls174t及正常的人结肠上皮细胞fhc来自中国科学院上海细胞库。crc细胞培养在含有10％胎牛血清rpmi1640培养基中，恒温培养。恒温培养条件为5％co2、37℃。

(3)rna抽提及荧光实时定量pcr

取组织样本500mg，液氮研磨成粉末状并转移至ep管中，加入1mltrizol，震荡混匀，冰上静置5min。4℃12000rpm离心10min。上清液转移至新的ep管中，冰上静置15min。加入0.2ml氯仿剧烈，颠倒15s，然后冰上静置5min。4℃12000rpm离心15min。将上清转移至另一新的ep管中。加入等体积的异丙醇(0.5ml)，-20℃静置30min沉淀rna。4℃12000rpm离心10min。加入1ml75％depc处理过的乙醇(预冷)，4℃7500rpm离心5min。加入30μlrnaasefreewater溶解rna。采用琼脂糖凝胶电泳鉴定总rna质量，总rna浓度检测采用分光光度计进行测定。提取的总rna进行反转录反应。实时荧光定量pcr反应检测并结合2-△△ct法分析mir-149表达量。

步骤(3)中，rna抽提试剂为trizol(美国invitrogen公司)；反转录试剂盒与实时荧光定量pcr试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司；pcr引物购自苏州吉玛基因股份有限公司合成。引物对照序列为u6；mir-149-rt序列为(5’---3’)

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacgggagt；mir-149-f序列为(5’---3’)ggctctggctccgtgtctt；mir-149-r序列为(5’---3’)cagtgcagggtccgaggtatt；u6-rt序列为(5’---3’)

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacaaaaat；u6-f序列为(5’---3’)caaattcgtgaagcgttccata；u6-r序列为(5’---3’)agtgcagggtccgaggtattc。

(4)双荧光素酶报告基因检测

将stat3基因完整的3‘utr构建到pgl3promotor载体上。定点突变试剂盒进行3‘utr位点的直接突变。将构建好的pgl3/stat3wt、pgl3/stat3mut报告载体分别与mir-149mimics、mir-149-nc共转染到sw620细胞中，48h后裂解细胞，双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。

步骤(4)中，pgl3promotor载体来自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。mir-149mimics序列为(5’---3’)

ucuggcuccgugucuucacuccc；mir-149-nc序列为(5’---3’)gggagugaagacacggagccaga，序列由广州市锐博生物科技有限公司提供。

(5)细胞转染

采用pcr方法扩增人stat3基因(nm_139276.2)开放阅读框(openreadingframe，orf)，pcr产物纯化后构建到表达载体pegfp-c1上，重组质粒命名为pegfp/stat3。取对数生长期的sw620、ls174t细胞接种于6孔板中培养24h，利用lipofectamine2000分别转染mir-149mimics、质粒pegfp/stat3以及各自的对照序列或载体于细胞中，平行重复三组。sw620、ls174t细胞浓度为5×10⁵个/孔。

(6)细胞增殖检测

转染后的sw620、ls174t细胞悬浮于cck-8溶液中，在37℃恒温培养箱中培养4h，450nm处检测光密度od值。cck-8溶液浓度为10％。

(7)细胞侵袭检测

消化转染后的sw620、ls174t细胞，重悬于无血清培养基中，接种到覆盖的transwell上层小室内。24h后取出小室，甲醛和乙酸的混合液固定细胞15min，pbs清洗，擦去未穿过小室膜的细胞。结晶紫进行染色，染色后使用pbs冲洗。随机选择3个视野显微镜下进行拍照计数，计算每个视野下平均发生侵袭的细胞数目。其中matrigel终浓度为1mg/ml。

(8)细胞划痕

转染后的sw620、ls174t细胞，加入到6孔板，过夜培养。用10μl的枪头在单层细胞上划横线，pbs洗3次，洗去脱落的细胞。显微镜下拍照并计算划痕的宽度，培养24h后再取出进行拍照并再次测量划痕的宽度。其中各组待测细胞悬液浓度为1×10⁶个/ml。

(9)细胞凋亡检测

pbs洗涤各组待测细胞，采用1×bindingbuffer将各组细胞稀释成1×10⁶个/ml的细胞悬液。加入annexinv-fluoresceinisothiocyanate(fitc)至各组细胞悬液中，室温下轻轻混匀，孵育10min。加入碘化丙啶(propidiumiodide，pi)，继续室温下孵育5min。利用流式细胞仪对各组染色的细胞进行检测。

(10)蛋白质免疫印迹

pbs清洗转染后的crc细胞，ripa裂解液裂解细胞。采用bca法测定蛋白浓度。sds-page电泳检测提取的蛋白，转膜后加入脱脂牛奶进行封闭。加入一抗，4℃孵育过夜，tbst缓冲液洗膜。加入二抗，室温孵育1h，进行显影。其中，ripa裂解液成份为：50mmtris-cl、150mmnacl、1％tritonx-100、0.1％sds；脱脂牛奶浓度为5％。

(11)数据处理方法

采用spss16.0统计软件进行数据的统计学分析。计量资料以x±s表示。组间数据差异采用双侧样本的student'st检验。p<0.05为差异具有统计学意义。

实验结果：

步骤(3)所得结果，mir-149在结直肠癌细胞中表达模式，具体内容如下：

实时q-pcr方法检测结直肠癌细胞sw620、ls174t中mir-149表达水平。结果显示mir-149的表达在结直肠癌细胞系sw620、ls174t中明显低于正常的结肠上皮细胞fhc，差异具有显著性(p<0.01)(图1)。

步骤(4)所得结果，mir-149靶向结合stat3，具体内容如下：

将构建的野生型stat33‘utr与突变型stat33‘utr荧光报告载体分别与mir-149共转染到sw620细胞后，检测荧光素酶活性，结果如图2所示，过表达mir-149后能够下调野生型stat33‘utr的荧光素酶活性(p<0.01)，而转染突变型stat33‘utr的荧光素酶活性没有发生明显变化。这些实验结果暗示mir-149可与stat33’utr互补结合。

步骤(5)所得结果，mir-149抑制结直肠癌细胞stat3的表达，具体内容如下：

mir-149mimics转染结直肠癌细胞，检测stat3的表达水平。q-pcr及westernblot检测结果均表明，转染mir-149mimics的sw620与ls174t细胞中stat3mrna与蛋白表达水平较mir-nc组发生了显著降低(p<0.01)(图3)。

步骤(6)所得结果，mir-149通过靶向stat3抑制结直肠癌细胞的增殖，具体内容如下：

mir-149mimics、mimics-nc以及mir-149mimics+pegfp/stat3转染至sw620细胞后，cck-8法分析细胞增殖特点。结果发现，mir-149mimic组细胞增殖倍数显著低于mir-nc(p<0.05)；与mir-149mimic组相比，mir-149mimics+pegfp/stat3组细胞增殖倍数显著增加(p<0.05)(图4)。这些结果表明，mir-149通过靶向stat3抑制结直肠癌细胞的增殖。

步骤(7)所得结果，mir-149通过靶向stat3抑制结直肠癌细胞的侵袭，具体内容如下：

transwell法检测了结直肠癌细胞侵袭情况。如图5所示，每个视野下的侵袭细胞数在mir-149mimic组内显著低于mir-nc组(p<0.01)；mimics+pegfp/stat3组每个视野下的侵袭细胞数高于mir-149mimic组(p<0.01)。因此，mir-149可靶向stat3抑制结直肠癌细胞的侵袭。

步骤(8)所得结果，mir-149通过靶向stat3抑制结直肠癌细胞的迁移，具体内容如下：

结直肠癌细胞进行细胞划痕实验分析，如图6细胞愈合结果显示，在结直肠癌细胞sw620和ls174t细胞中，转染mir-149组细胞迁移显著低于mir-nc组细胞(p<0.01)。相反，mimics+pegfp/stat3组细胞的迁移显著高于mir-149mimics组(p<0.01)。因此，mir-149靶向stat3可抑制结直肠癌细胞的迁移。

步骤(9)所得结果，mir-149通过靶向stat3促进结直肠癌细胞的凋亡，具体内容如下：

流式细胞法分析了转染mir-nc、mimics-nc、mir-149mimics+pegfp/stat3各组细胞凋亡情况。结果如图7所示，mir-149mimic组的细胞凋亡率显著高于mir-nc组(p<0.01)，而mimics+pegfp/stat3组细胞凋亡则显著低于mir-149mimics组(p<0.01)。由此可见，mir-149可通过靶向stat3促进结直肠癌细胞的凋亡。

以上结果表明，stat3是mir-149的一个靶基因，stat3在crc患者肿瘤组织以及crc细胞中表达量显著高于正常组织和细胞；mir-149通过靶向stat3抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移。另外，mir-149通过靶向stat3促进结直肠癌细胞的凋亡。因此，mir-149及其靶基因stat3是结直肠癌治疗的一个靶标。

最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。